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脳科学辞典 - 利用者の投稿記録 [ja]
2026-04-12T16:23:31Z
利用者の投稿記録
MediaWiki 1.43.8
https://bsd.neuroinf.jp/w/index.php?title=%E5%8F%8C%E6%96%B9%E5%90%91%E6%80%A7%E3%82%B7%E3%83%8A%E3%83%97%E3%82%B9&diff=37749
双方向性シナプス
2017-06-08T14:19:02Z
<p>Hkasai: </p>
<hr />
<div><div align="right"> <br />
<font size="+1">[http://researchmap.jp/ryoiwata/ 岩田 遼]、[http://researchmap.jp/takeshi.imai 今井 猛]</font><br><br />
''独立行政法人理化学研究所 発生・再生科学総合研究センター 感覚神経回路形成研究チーム''<br><br />
DOI：<selfdoi /> 原稿受付日：2017年5月13日 原稿完成日：2015年2月27日<br><br />
担当編集委員：[http://researchmap.jp/haruokasai 河西 春郎]（東京大学 大学院医学系研究科）<br><br />
</div><br />
<br />
英：reciprocal synapse 独：reziproke Synapse 仏：synapse réciproque<br />
<br />
同義語：相反性シナプス<br />
{{box|text= [[シナプス]]は、神経情報を出力する側と入力される側の２つの神経細胞の間に形成されるが、この２つの神経細胞が同時に逆方向のシナプスを持つ場合、これを双方向性シナプスまたは相反性シナプスという。双方向性シナプスは２本の樹状突起の間、または樹状突起と[[軸索]]の間に形成されるものが知られている。[[嗅球]]や網膜では、双方向性シナプスは側方抑制などの機能を担い、感覚刺激に対する応答特異性を調節する。}}<br />
<br />
==双方向性シナプスとは ==<br />
[[シナプス]]は、神経情報を出力する側と入力される側の２つの神経細胞の間に形成されるが、この２つの神経細胞が同時に逆方向のシナプスを持つ場合、これを双方向性シナプスまたは相反性シナプスという（'''図1'''）。２本の樹状突起の間、または樹状突起と[[軸索]]の間に形成されるものが知られている。1960年代に[[嗅球]]と[[網膜]]で独立に発見された<ref><pubmed> 19686140 </pubmed></ref>。<br />
[[Image:Reciden.gif|thumb|right|340px|<b>図1. 双方向シナプス</b><br />猫の[[外側膝状体]]における双方向性シナプス。D1、D2は２本の[[樹状突起]]、Aは軸索を示し、2本の矢印は各シナプスの方向を示している。[http://synapseweb.clm.utexas.edu/dendro-dendritic-synapses-cat-thalamus Synapseweb]より。<br>Kristen Harris博士の許可を得て転載。]]<br />
<br />
== 嗅球 ==<br />
=== 構造 ===<br />
[[嗅球]]の[[僧帽細胞]]（mitral cell）・[[房飾細胞]]（tufted cell）は、単一の[[主樹状突起]]（primary dendrite）により[[糸球体]]から興奮性入力を受け入れる（[[嗅球]]を参照）。<br />
<br />
その一方、複数の[[側方樹状突起]]（lateral dendrite）は[[外網状層]]に広く伸びて、[[顆粒細胞]]（granule cell）の[[樹状突起スパイン]]との間で樹状突起間シナプスを作る（'''図2'''）。この樹状突起間シナプスの多くは双方向性であり、[[樹状突起間双方向性シナプス]]（dendrodendritic reciprocal synapse）と呼ばれる。僧帽細胞・房飾細胞から顆粒細胞へのシナプスは[[グルタミン酸]]性の[[興奮性シナプス]]であり、その逆方向のシナプスは[[GABA]]性の[[抑制性シナプス]]である。<br />
<br />
[[嗅球]]では、[[傍糸球体細胞]]（periglomerular cell）も、僧帽細胞・房飾細胞の主樹状突起との間に樹状突起間双方向性シナプスをつくる（'''図2'''）。<br />
<br />
傍糸球体細胞は[[嗅神経細胞]]（olfactory sensory neuron）から興奮性入力を受け入れるとともに、嗅神経細胞に対してシナプス前抑制を行う。しかし、電子顕微鏡観察では嗅神経細胞[[シナプス前終末]]へと入力するシナプス構造が認められないため<ref><b>Gordon M Shepherd, Wei R Chen, Charles A Greer</b><br />Chapter 5: Olfactory Bulb.<br />In: The synaptic organization of the brain 5th ed.(Shepherd GM ed). <i>Oxford University Press</i>, 2004</ref>、他の例の様に単一シナプスレベルで双方向性シナプスが形成されているわけではない。<br />
<br />
[[Image:Takeshiimai_Fig_2.jpg|thumb|right|340px|<b>図2. 嗅球の双方向性シナプス</b><br />[[嗅球]]では、僧帽細胞・房飾細胞の側方樹状突起と顆粒細胞の間で樹状突起間双方向性シナプスが形成される。また、僧帽細胞・房飾細胞の主樹状突起と傍糸球体細胞の間にも樹状突起間双方向性シナプスが形成される。赤色の矢印は[[興奮性シナプス]]、青色の矢印は[[抑制性シナプス]]を示す。]]<br />
<br />
=== 匂い情報処理における機能 ===<br />
僧帽細胞・房飾細胞が反応する[[匂い]]分子の種類（分子受容範囲）は、嗅覚受容体のリガンド結合特性を引き継ぎつつ（[[嗅球]]を参照）、顆粒細胞を介した[[側方抑制]]により修飾される。<br />
<br />
僧帽細胞・房飾細胞からの入力によって興奮した顆粒細胞は、入力元のみならず、接続している他の僧帽細胞・房飾細胞に対しても抑制性の出力を行う（'''図3'''）。この側方抑制により、同じ匂いに反応する僧帽細胞・房飾細胞の間でコントラストが強まり、応答特異性が向上する（分子受容範囲が狭まる）<ref><pubmed> 7724568 </pubmed></ref><ref name=ref4><pubmed> 10531048 </pubmed></ref>。<br />
<br />
しかしながら、この側方抑制は網膜のように必ずしも近傍の細胞間で起きるわけではなく、どのような接続特異性があるのかよく分かっていない<ref><pubmed> 21692659 </pubmed></ref>。このため、その主要な機能については、応答特異性のチューニングであるという説に対して、むしろ非選択的な側方抑制に基づくゲインコントロールであるという可能性も指摘されている<ref name=ref6><b>Liqun Luo</b><br />Chapter 6: Olfaction, taste, audition, and somatosensation.<br />In: Principles of neurobiology. <i>Garland Science</i>, 2015</ref>。<br />
<br />
この他、顆粒細胞の樹状突起間双方向性シナプスでは、[[ガンマ]]波長帯（30-100 Hz）の[[神経振動]]が発生し<ref name=ref4 />、僧帽細胞・房飾細胞の[[同期活動]]や[[嗅皮質]]への情報の転送に重要であると考えられている。<br />
<br />
なお、[[嗅球]]における側方抑制では、糸球体層の[[短軸索細胞]]（short axon cell）が異なる糸球体同士を接続する<ref><pubmed> 20089927 </pubmed></ref>。この側方抑制は近傍の糸球体のうち一部の糸球体に対してのみ選択的に出力すると推定されるが<ref><pubmed> 27346531 </pubmed></ref>、その機能については未だ不明な点が多く、今後の解明が待たれる。<br />
<br />
== 網膜==<br />
[[Image:Takeshiimai_Fig_3.jpg|thumb|right|250px|<br />
<b>図3. 網膜の双方向性シナプス</b><br />網膜では、視細胞と水平細胞の間、また双極細胞とアマクリン細胞の間に双方向性シナプスが形成される。赤色の矢印は[[興奮性シナプス]]、青色の矢印は[[抑制性シナプス]]を示す。視細胞から双極細胞へのシナプス（黒色の矢印）ではグルタミン酸が放出されるが、ON型およびOFF型の双極細胞においてはそれぞれ抑制性または興奮性の反応を示す。文献<ref name=ref6 />より改変。]]<br />
網膜では、[[外網状層]]において[[視細胞]]（photoreceptor cell）と[[水平細胞]]（horizontal cell）の間で双方向性シナプスが形成される（'''図2'''）。また、[[内網状層]]においても[[双極細胞]]（bipolar cell）と[[アマクリン細胞]]（amacrine cell）の間で双方向性シナプスが形成される。<br />
<br />
網膜における双方向性シナプスは、[[受容野#中心周辺拮抗型受容野|中心周辺拮抗型受容野]]の形成に寄与する<ref><b>Peter Sterling, Jonathan B Demb</b><br />Chapter 6: Retina.<br />In: The synaptic organization of the brain 5th ed.(Shepherd GM ed). <i>Oxford University Press</i>, 2004</ref>。たとえば水平細胞は、樹状突起を側方に伸ばして多くの視細胞と接続し、双方向性シナプスをつくる（'''図3'''）。視細胞は水平細胞に興奮性の出力を行い、逆に水平細胞は視細胞のシナプス前終末に対して抑制性の出力を行う。抑制を受けたシナプス前終末では、視細胞から双極細胞へのグルタミン酸の放出が減少する。水平細胞を介した側方抑制によって、強い光を受容した視細胞と、その周りで弱い光を受容した視細胞の間のコントラストが強化される。こうした中心周辺拮抗型の側方抑制は、網膜において物体の輪郭を検出しやすくしていると考えられる。アマクリン細胞の双方向性シナプスもこうした機能に寄与すると考えられる。<br />
<br />
== その他の脳領域==<br />
<br />
[[視床]]の[[外側膝状体]]<ref><pubmed> 4101880 </pubmed></ref>（'''図1'''）、[[脊髄後角]]の[[膠様質]]<ref><pubmed> 6259218 </pubmed></ref>、また[[視交叉上核]]<ref><pubmed> 1260842 </pubmed></ref>で樹状突起間双方向性シナプスが見つかっているが、その機能はほとんど知られていない。<br />
<br />
== 関連項目 ==<br />
* [[シナプス]]<br />
* [[興奮性シナプス]]<br />
* [[抑制性シナプス]]<br />
* [[嗅球]]<br />
* [[受容野]]<br />
== 参考文献 ==<br />
<references/></div>
Hkasai
https://bsd.neuroinf.jp/w/index.php?title=%E3%82%A8%E3%82%AF%E3%82%BD%E3%82%B5%E3%82%A4%E3%83%88%E3%83%BC%E3%82%B7%E3%82%B9&diff=36934
エクソサイトーシス
2016-12-27T02:06:38Z
<p>Hkasai: </p>
<hr />
<div><div align="right"> <br />
<font size="+1">[http://researchmap.jp/read0067134 高橋 倫子]、[http://researchmap.jp/haruokasai 河西 春郎]</font><br><br />
''東京大学 大学院医学系研究科''<br><br />
DOI：<selfdoi /> 原稿受付日：2013年2月4日 原稿完成日：2013年8月28日<br><br />
担当編集委員：[http://researchmap.jp/Bito 尾藤 晴彦]（東京大学 大学院医学系研究科 神経生化学分野）<br><br />
</div><br />
<br />
英語名：exocytosis 独: Exocytose 仏: exocytose <br> 同義語: 開口放出、分泌、開口分泌 <br />
<br />
{{box|text=<br />
細胞からの[[wikipedia:ja:分泌|分泌]]現象は開口放出により起きることが、[[wikipedia:ja:電子顕微鏡|電子顕微鏡]]で[[シナプス小胞]]や[[分泌小胞]]が発見されたことから提唱された。その要素過程は[[膜融合]]という超微細構造変化にある点が難しい。しかし、現在では、様々の機能的測定や分子生物学的手法により、その解明が進んできた。 <br />
}}<br />
<br />
== 定義 ==<br />
<br />
細胞質の分泌小胞の膜が[[細胞膜]]に融合することにより、小胞内腔と細胞外液が交通し、分泌小胞の内容物が細胞外に放出される現象を開口放出(exocytosis)という。速い[[神経伝達物質]]放出はシナプス小胞の、[[神経ペプチド]]の分泌は大型[[有芯小胞]]の開口放出により起きる。開口放出に伴い小胞の膜やタンパク質が細胞膜に運ばれ、これを回収するため、[[エンドサイトーシス]]が引き続き起きることが多い。開口放出は概念的には調節性と構成的なものに分けられる。調節性の場合、細胞に対する刺激で開口放出が起きるが、その刺激は細胞内[[Ca2+|Ca<sup>2+</sup>]]や[[CAMP]]の濃度上昇を起こすことが多い。 <br />
<br />
== 多様性 ==<br />
[[Image:PVR fig 1.png|thumb|300px|'''図1．開口放出の速さの多様性'''<ref name="ref1"><pubmed> 23073634 </pubmed></ref> ]] <br />
<br />
調節性開口放出の場合には、刺激から開口放出が起きるまでの時間が1ミリ秒以下から100秒以上と10万倍以上に及ぶ<ref name="ref1"><pubmed> 23073634 </pubmed></ref>。この開口放出[[wikipedia:ja:時定数|時定数]]は開口放出を特徴づける大きな機能的指標であり（図1）、分子機構とも深く関連する。1-100ミリ秒で起きる速い開口放出の場合には、小胞と細胞膜が予め近接（ドック）している必要があり、更に、分泌関連タンパク質がある程度会合していることが予想される<ref name="ref1"><pubmed> 23073634 </pubmed></ref>。特に、1ミリ秒以下で開口放出の起きる超高速開口放出(ultrafast exocytosis)は[[シナプス前終末]]の[[アクティブゾーン]]でしか見られない<ref name="ref2"><pubmed>22794257 </pubmed></ref>。一方、100ミリ秒より遅い分泌については、分泌関連タンパク質は会合している必要はなく、また刺激後に小胞がドックするのでも十分間に合う。実際、大型有芯小胞の場合やシナプス小胞でも持続性の開口放出の場合は、刺激後に小胞がドックし、分泌関連タンパク質が会合するのが観察される。シナプス小胞の開口放出でも、持続的な反復刺激に対しては、細胞質に浮いている小胞のリサイクリングが開口放出を律速し、[[活動電位]]と開口放出のミリ秒の同期は消失する（図1）。この場合、持続的な細胞内Ca<sup>2+</sup>上昇が細胞質に浮いている小胞を刺激して開口放出を起こしていることになる。シナプス後部でも、[[長期増強]](LTP)刺激の際には、[[樹状突起]]細胞質にある小胞の開口放出によりグルタミン酸受容体の細胞膜への秒単位の挿入が起きる。 <br />
<br />
[[wikipedia:ja:内分泌細胞|内分泌細胞]]、[[wikipedia:ja:外分泌細胞|外分泌細胞]]や[[wikipedia:ja:血液|血液]]細胞の場合には、表面の小胞の細胞膜への融合だけでなく、膜融合が複数の小胞で複合的に進行することにより（複合型開口放出）、細胞質深層にある小胞がそのままの位置で細胞膜まで運ばれることなく開口放出し、貯蔵された小胞を効率よく放出する現象が見られる。これには、逐次的に内部に進行する様式（逐次開口放出）と先行して細胞質で融合してから開口放出に至る様式（多小胞性開口放出）がある。いずれも、神経でも用いられている可能性が指摘されている。 <br />
<br />
開口放出の初発過程は小胞膜と細胞膜という二つの[[wikipedia:ja:脂質二重膜|脂質二重膜]]の融合であり、この時に形成される脂質二重膜でできた小胞と細胞外を繋ぐ通り道のことを融合細孔(fusion pore)という<ref name="ref3"><pubmed>23245563 </pubmed></ref>。初期融合細孔は直径0.4nm位と推定され、ミリ秒の安定性を持ち、時々、再閉鎖、再開口したり、再閉鎖した結果そのまま小胞がエンドサイトーシスされることもある。直径50nm以下のシナプス小胞の場合、この初期融合細孔の数ミリ秒の開口で、神経伝達物質が放出されると推定される。これに対して、大型有芯小胞からのペプチドの分泌では、初期細孔を通ることはできずに、融合細孔が拡大し、最終的には小胞が細胞膜に平滑化する、完全融合が起きる<ref name="ref4"><pubmed>12193788 </pubmed></ref> 。 <br />
<br />
== 分子機構 ==<br />
<br />
[[Image:PVR figu 8.png|thumb|300px|'''図2．開口放出の多様性'''<br>cisSNARE複合体のNSFによる解離から、開口放出に至る分子過程とエネルギー地図と各分子の関与<ref name="ref1"><pubmed> 23073634 </pubmed></ref> ]] <br />
<br />
=== SNARE複合体 ===<br />
<br />
開口放出の根本過程は細胞膜にある[[T-SNARE分子]]と小胞にある[[V-SNARE]]の会合による（図2）。神経の代表的SNARE分子には、v-SNAREとして[[VAMP2]]、t-SNAREとして[[Syntaxin1|シンタキシン1]]と[[SNAP25]]がある。[[ボツリヌス毒素]]や[[破傷風毒素]]はSNAREを特異的に切断する活性を持ち、切断が起きると速い神経伝達はほぼ完全に阻害される。神経や分泌細胞でもSNAREの他のサブタイプが発現しており、遅い開口放出に関係している。複合化したSNAREは安定で、細胞膜に残りcis-SNARE複合体を形成する。[[NSF]]がSNAPを補因子として[[wikipedia:ATP|ATP]]依存的にSNARE分子を脱解離させる。こうして、遊離SNARE分子は会合するエネルギーを持って準備している。 <br />
<br />
=== プライミング分子 ===<br />
<br />
これらのSNARE分子の生理的な会合には、[[Munc18]]や[[Munc13]]の2つの分子が神経でも分泌細胞でも必須である。Munc18はシンタキシンと高親和性に結合し、シンタキシンの[[wikipedia:ja:分子シャペロン|分子シャペロン]]として働く。この結合状態ではシンタキシンは他のSNAREと結合できない。一方、Munc13はシンタキシンとMunc18の強い結合を解き、SNARE複合体の形成を促進する因子と考えられる。この作用様式がMunc13のサブタイプ(Munc13-1,2,3,4)により異なり、これが[[シナプス]]や分泌細胞の応答特異性に影響している可能性がある。Munc18はSNARE複合体とも結合し、そのサブタイプ(Munc18-a,b,c)によりSNAREサブタイプ特異的に結合能が異なり、SNAREサブタイプ間の結合特異性を決める因子として働く。SNARE分子の会合を促進する因子は[[プライミング分子]]を呼ばれる。Munc13、 Munc18の他に、[[CAPS]]、[[Snapin]]、[[Complexin]]などが知られている。これらの分子は刺激前に働いて準備状態を作ることも、後に働き開口放出の誘発に関係することもある。 <br />
<br />
=== カルシウムセンサー ===<br />
<br />
開口放出にカルシウム感受性を付与する分子（[[カルシウムセンサー]]）としては、[[シナプトタグミン]]や[[Doc2]]などの[[C2ドメイン]]を持つ分子の関与が濃厚である。特に、超高速開口放出にはシナプトタグミン1,2が関係している。これらの分子は、脂質2重膜との間でCa<sup>2+</sup>依存的な結合をする。Ca<sup>2+</sup>依存的な結合が、膜融合の直接的な引き金となっている可能性が高い。これらのCa<sup>2+</sup>センサーはcomplexinを介してSNAREと相互作用する。 <br />
<br />
=== アクティブゾーンタンパク質 ===<br />
<br />
アクティブゾーンには更に幾つかの分子([[Rim]], [[ELKS/CAST]], [[Liprin]], [[Bassoon]], [[Piccolo]], [[Neurexin]]など) が集積しており、この超分子的な集積がアクティブゾーンとしての微細構造を作っていると考えられる。中でも、Rimは[[膜電位依存性カルシウムチャネル]]の集積に関係し、チャネル開口部にできる高濃度カルシウム領域（[[カルシウムドメイン]]）による開口放出の高速調節に必須と考えられる。アクティブゾーンで見られる超高速開口放出には、SNARE分子が拡散的に会合する余裕はなく、既に近接して[[Trans-SNARE複合体|''trans''-SNARE複合体]]を形成していると考えられる。一方、SNAREが既に会合しきっていたのでは、刺激後に膜融合に必要な力が説明されないので、SNAREは特有な不安定な複合体状態をとっており、そのために超分子構造が使われていると考えられる。 <br />
<br />
=== 超高速開口放出と遅い開口放出 ===<br />
<br />
シナプスの超高速開口放出では、刺激後放出に至る時間が短いので、小胞はアクティブゾーン細胞膜にドックし、次に、プライミングという分子過程を経て、分泌準備完了状態となり、Ca<sup>2+</sup>刺激で膜融合が起きると考えるのが自然である。この分子的準備完了状態は正確にはどういうものか未解明である。この超高速開口放出が開口放出がモデルとして用いられ、普通の遅い開口放出も同一機転で起きることが想定されることが多い。 <br />
<br />
しかしながら、100ミリ秒より遅い普通の開口放出については、SNAREが拡散的に会合する時間があり、遅い開口放出は、刺激後にSNAREの拡散的な会合が起きれば、最も自然に説明される。遅い開口放出の刺激前の状態としては、t-SNAREだけ複合化した状態（binary-SNARE状態）やSNARE分子が全部分離した状態（unitary-SNARE状態）、更には、[[Cis-SNARE|''cis''-SNARE]]である状態が考えられている（図2）。この場合のCa<sup>2+</sup>依存性には、細胞質の小胞が細胞膜に移動したり、会合していないSNARE分子が会合し複合体を形成しやすくする機構が関与する。 <br />
<br />
更に、SNAREの[[リン酸化]]により、複合化が調節されている場合や、cAMPやCa<sup>2+</sup>刺激により、細胞質の小胞の運動性が増す。シナプス小胞の持続的分泌や自発的分泌では後者の機構の関与が考えられる。 <br />
<br />
== 関連項目 ==<br />
<br />
*[[SNARE複合体]]<br />
*[[アクティブゾーン]] <br />
*[[シナプス小胞]] <br />
*[[シナプス伝達]] <br />
*[[有芯小胞]]<br />
<br />
== 参考文献 ==<br />
<br />
<references /></div>
Hkasai
https://bsd.neuroinf.jp/w/index.php?title=%E3%83%88%E3%83%BC%E3%82%AF:%E6%80%A7%E8%85%BA%E5%88%BA%E6%BF%80%E3%83%9B%E3%83%AB%E3%83%A2%E3%83%B3&diff=36933
トーク:性腺刺激ホルモン
2016-12-27T01:32:05Z
<p>Hkasai: </p>
<hr />
<div><br />
岡先生 2016.12.27.<br />
ご執筆ありがとうございました。<br />
研究面や歴史が勉強になります。<br />
一方、FSH, LH (TSHも？)の受容体の性質やその下流シグナル、そしてその組織への作用と関係について、「性線に対する作用」の項にわかっている範囲で記載いただき、どこから先がわからないか記載いただくとより全体像が見えるかと思いました。<br />
この部分のご加筆をお願いできますでしょうか。<br />
<br />
どうぞ、よろしくお願いいたします。<br />
<br />
河西春郎</div>
Hkasai
https://bsd.neuroinf.jp/w/index.php?title=%E3%83%88%E3%83%BC%E3%82%AF:%E6%80%A7%E8%85%BA%E5%88%BA%E6%BF%80%E3%83%9B%E3%83%AB%E3%83%A2%E3%83%B3&diff=36932
トーク:性腺刺激ホルモン
2016-12-27T01:30:42Z
<p>Hkasai: </p>
<hr />
<div><br />
岡先生 2016.12.27.<br />
ご執筆ありがとうございました。<br />
研究面や歴史が勉強になります。<br />
一方、FSH, LH (TSHも？)の受容体の性質やその下流シグナル、そしてその組織への作用と関係について、わかっている範囲で記載いただき、どこから先がわからないか記載いただくとより全体像が見えるかと思いました。<br />
これは、場合によっては「性線に対する作用」の前に別に記載していただいても良いかと思います。この部分のご加筆をお願いできますでしょうか。<br />
<br />
どうぞ、よろしくお願いいたします。<br />
<br />
河西春郎</div>
Hkasai
https://bsd.neuroinf.jp/w/index.php?title=%E3%83%88%E3%83%BC%E3%82%AF:%E6%80%A7%E8%85%BA%E5%88%BA%E6%BF%80%E3%83%9B%E3%83%AB%E3%83%A2%E3%83%B3&diff=36931
トーク:性腺刺激ホルモン
2016-12-27T01:28:08Z
<p>Hkasai: </p>
<hr />
<div><br />
岡先生 2016.12.27.<br />
ご執筆ありがとうございました。<br />
研究面や歴史が勉強になります。<br />
一方、FSH, LH (TSHも？)の受容体の性質やその下流シグナル、そしてその組織への作用と関係について、わかっている範囲で記載いただき、どこから先がわからないか記載いただくとより全体像が見えるかと思いました。<br />
この部分のご加筆をお願いできますでしょうか。<br />
<br />
どうぞ、よろしくお願いいたします。<br />
<br />
河西春郎</div>
Hkasai
https://bsd.neuroinf.jp/w/index.php?title=%E3%83%88%E3%83%BC%E3%82%AF:%E6%80%A7%E8%85%BA%E5%88%BA%E6%BF%80%E3%83%9B%E3%83%AB%E3%83%A2%E3%83%B3&diff=36930
トーク:性腺刺激ホルモン
2016-12-27T01:26:47Z
<p>Hkasai: ページの作成:「 岡先生 2016.12.27. ご執筆ありがとうございました。 研究面や歴史が勉強になります。 一方、FSH, LHの受容体の性質やその下流...」</p>
<hr />
<div><br />
岡先生 2016.12.27.<br />
ご執筆ありがとうございました。<br />
研究面や歴史が勉強になります。<br />
一方、FSH, LHの受容体の性質やその下流シグナル、そしてその組織への作用と関係について、わかっている範囲で記載いただき、どこから先がわからないか記載いただくとより全体像が見えるかと思いました。<br />
この部分のご加筆をお願いできますでしょうか。<br />
<br />
どうぞ、よろしくお願いいたします。<br />
<br />
河西春郎</div>
Hkasai
https://bsd.neuroinf.jp/w/index.php?title=%E6%80%A7%E8%85%BA%E5%88%BA%E6%BF%80%E3%83%9B%E3%83%AB%E3%83%A2%E3%83%B3&diff=36929
性腺刺激ホルモン
2016-12-27T01:15:06Z
<p>Hkasai: </p>
<hr />
<div><div align="right"> <br />
<font size="+1">[http://researchmap.jp/read0007804 岡良隆]</font><br><br />
''東京大学大学院理学系研究科生物科学専攻''<br><br />
DOI：<selfdoi /> 原稿受付日：2016年6月9日 原稿完成日：2016年月日<br><br />
担当編集委員：[http://researchmap.jp/haruokasai 河西 春郎]（東京大学 大学院医学系研究科）<br><br />
</div><br />
<br />
英語名：Gonadotrop(h)ic hormones (Gonadotrop(h)ins)； 英国式ではhを入れ、米国式では入れない<br />
<br />
{{box|text=<br />
繁殖期を迎えた脊椎動物の性腺（生殖腺）は、日長や温度などに依存して発達し、雌雄それぞれの配偶子（卵と精子）を形成すると共に、雌は卵巣から雄は精巣から、それぞれの性ホルモン（雌は主にエストロジェン、雄は主にアンドロジェン）を分泌するようになる。この時、性腺の発達は、脳の情報処理システムが外界の環境の情報を適切に処理し、それを主に視床下部ニューロンに伝え、さらにその情報を脳下垂体という脳と内分泌系のインターフェースに伝えて、脳下垂体ホルモンを放出させ、末梢の生殖腺を刺激することにより始まる。この時に脳下垂体から放出され、生殖腺を刺激するタンパク質ホルモンを性腺刺激ホルモン（＝医学・農学用語；動物学用語では、生殖腺刺激ホルモン）とよぶ。<br />
}}<br />
<br />
==ファミリーと構造==<br />
[[image:性腺刺激ホルモン1.png|thumb|350px|'''図1.視床下部GnRHニューロンと脳下垂体ゴナドトロフ''']]<br />
<br />
性腺刺激ホルモンは、一般に[[黄体形成ホルモン]]（luteinizing hormone: LH）と[[濾胞刺激ホルモン]]（または[[卵胞刺激ホルモン]]、[[follicle stimulating hormone]]: [[FSH]]）の2種類よりなることが知られている。両者共に、αサブユニットとβサブユニットの2つのサブユニットが[[wj:非共有結合|非共有結合]]によりヘテロ2量体を形成することにより作られており、糖を20％前後含む[[wj:糖タンパク質|糖タンパク質]]である。<br />
<br />
2種の性腺刺激ホルモンの他にも、[[甲状腺刺激ホルモン]]（thyroid stimulating hormone: TSH）がある。興味あることに、これら3種類の糖タンパク質ホルモンのαサブユニットは、実は共通したタンパク質であり、それぞれのホルモンの特性（受容体との結合特性や生理活性）は、2量体を形成するβサブユニットにより決定されている。このことは、[[wj:ヤツメウナギ|ヤツメウナギ]]などの[[wj:円口類|円口類]]以外のいわゆる[[wj:顎口類|顎口類]]においては、報告されているすべての[[動物]]が保有しており、[[脊椎動物]]の生殖を制御するホルモンに共通する基本的な仕組みのひとつである。<br />
<br />
==発現==<br />
性腺刺激ホルモンは脳下垂体に発現する。歴史的には、性腺刺激ホルモン産生細胞（ゴナドトロフ）は、色素による脳下垂体細胞の分類からは、塩基性色素に好染する[[wj:好塩基性細胞|好塩基性細胞]]として分類されていた。<br />
<br />
興味深いことに、[[ほ乳類]]などではLHとFSHを産生する細胞が同一であるが、[[wj:真骨魚類|真骨魚類]]などではLH産生細胞とFSH産生細胞が別の細胞になっていて、脳下垂体中の分布も明瞭に異なっている。また、真骨魚類では、性腺刺激ホルモン産生細胞以外の脳下垂体ホルモン産生細胞も比較的整然と分布域がコンパートメント化されている。さらに、[[性腺刺激ホルモン放出ホルモン]] ([[GnRH]])[[ニューロン]]（後述）が脳下垂体に直接[[軸索]]投射していて、脳下垂体と脳の機能的関係を保ったまま全脳 ''in vitro''標本を用いた解析も可能なため、脳下垂体細胞の脳による制御の研究を行うには大変適している（図1）。<br />
<br />
==機能==<br />
=== 受容体 ===<br />
<br />
===生殖腺に対する作用===<br />
上述したように、FSHとLHは、それぞれ、主に[[ヒト]]における作用という観点から「濾胞刺激ホルモン」「黄体形成ホルモン」と呼ばれているが、FSHは[[精巣]]では精子形成に、[[卵巣]]では主に[[wj:ろ胞|ろ胞]]の発達に対して作用があり、LHは主に精巣では[[wj:間質ライディヒ細胞|間質ライディヒ細胞]]の[[アンドロゲン]][[分泌]]を刺激し、卵巣では[[wj:排卵|排卵]]を促すはたらきをもつと考えられてきた。<br />
<br />
さらに、ほ乳類においては、LHの血中レベルが数10分ないし数時間の周期でパルス状に変動する、いわゆるパルス状分泌という現象が知られており、このパルス頻度が性腺の活動を制御していると考えられている。一方で、雌の排卵前の特定の時期には一過性のLHの大量放出（サージ状放出とよばれる）が起き、これが排卵の引き金になることが多くの動物種で知られている。このように、LHはほ乳類においては、パルスとサージという異なる分泌パターンを介して、性腺の活動と排卵の両者を調節しているらしい。最近の、[[マウス]]を用いたLHやFSHの遺伝子ノックアウト動物の解析から、LHやFSHの機能に関しては、さらに理解が進んできている<ref name=ref1><pubmed>15569941</pubmed></ref> <ref name=ref2><pubmed>9020850</pubmed></ref>。<br />
<br />
しかしながら、ほ乳類以外の脊椎動物においては、こうした解析がこれまでほとんど行われてこず、LHやFSHの生理作用や調節機構がほ乳類と共通しているかどうかについては不明であった。ごく最近になって、[[TALEN]]や[[CRISPR]]などの、いわゆる[[ゲノム編集]]技術の目覚ましい発展により、[[ゼブラフィッシュ]]<ref name=ref3><pubmed> 25993524</pubmed></ref>やメダカ<ref name=ref4>'''Takahashi, A., Kanda, S., Abe, T., and Oka, Y.'''<br>Evolution of the hypothalamic-pituitary-gonadal axis regulation in vertebrates revealed by knockout medaka (submitted). <br>2016</ref>などの小型動物を使って[[遺伝子ノックアウト動物]]の作成が比較的容易にできるようになり、ほ乳類以外の脊椎動物におけるLHやFSHの機能も詳細に解析できるようになりつつある。それらの結果からは、おおまかにいって、雌ではFSHは卵胞発育過程を促し、LHは排卵の引き金を引く、という機能の分業が行われているらしく、真骨魚類とは進化の過程が大きく異なるほ乳類では、LHのパルス状分泌という現象が見られるようになったために、後期卵胞発育の過程が、LHによって、環境要因による微妙な調節を受けられるようになったのではないかと考えられる<ref name=ref2 />。<br />
<br />
===中枢神経系による性腺刺激ホルモンの調節===<br />
[[image:性腺刺激ホルモン2.png|thumb|350px|'''図2.GFP標識されたGnRHニューロンの蛍光顕微鏡像'''<br><ref name=ref12><pubmed>16293668</pubmed></ref>を改変]]<br />
<br />
生殖をはじめとする体の自律的な機能が脳下垂体から分泌されるホルモンによって調節され、その脳下垂体ホルモンが、脳の[[視床下部]]に存在する因子によって制御されているという考えは、1970年代までに既に生まれていたようである。そのような背景の中、1977年に、[[wj:アルフレッド・ギルマン|ギルマン]]らの研究グループと[[wj:アンドルー・ウィクター・シャリー|シャリー]]らの研究グループが熾烈な戦いの後に、両者ほぼ同時期に、視床下部に存在する、そのような機能をもつ因子を発見し、ノーベル医学生理学賞を受賞した。（<u>編集部コメント：ギルマンのノーベル賞はGタンパク質共役受容体に対するものだったと思います。この表現で良いかご検討ください</u>）<br />
<br />
このような因子のうち生殖の中枢制御を担うものは10個のアミノ酸からなるペプチドホルモンであり、性腺刺激ホルモン放出ホルモンとよばれた（特に、LH放出を促進する機能に注目して、当時はLHRHとよばれた；RHはreleasing hormone=放出ホルモンの略）。その後、LHRHはFSHの放出も促進するのではないかという実験的な証拠から、GnRH（gonadotropin-releasing hormone）とよばれるようになった。GnRHは視床下部GnRHニューロンで産生され、脳底の正中隆起とよばれる部位の脳下垂体門脈血中に放出され、脳下垂体前葉に運ばれて性腺刺激ホルモン放出を促進する、いわゆる向下垂体ホルモン（hypophysiotropic hormone）のひとつとしてほ乳類で最初に発見された（図１左図参照）。なお、このホルモンの発見の後に、1990年代から[[免疫組織化学]]およびin situ hybridization （ISH）を用いた形態学的な研究がなされ、脊椎動物脳内では、形態的・機能的に異なる3つのGnRH神経系が存在しているという基本的コンセンサスが得られている（「[[性行動の神経回路]]」参照）<ref name=ref5>'''岡良隆'''<br>環境に適応した行動を発言させる脊椎動物神経系・内分泌系のしくみ<br>in 行動とコミュニケーション, 岡・蟻川, Editors. <br>''シリーズ21世紀の動物科学'': 東京. p. 197-226. 1998</ref> <ref name=ref6><pubmed>7636018</pubmed></ref> <ref name=ref7>'''T. Karigo, and Y. Oka'''<br>Frontiers in Endocrinology “Biology of Gonadotropin-Releasing Hormone Neurons”<br>4, 177. 2013 (Article 177, 1-10)</ref>。<br />
<br />
向下垂体ホルモンとしてのGnRHペプチドを産生する視床下部GnRHニューロンは、[[ラット]]・マウスをはじめとするほ乳類の実験動物では、細胞体が10ミクロン前後しかない上に、数少ないニューロンが散在的に視索前野に分布しているため、ごく最近まで、その神経生理学的な記録や解析はほとんどされていなかった<ref name=ref7 />。ところが、1999年以降立て続けにGnRHニューロンが[[GFP]]標識された[[トランスジェニックマウス]]やラットが作成され、脳スライスを用いて単一GnRHニューロンの神経生理学的な解析が可能になった<ref name=ref8><pubmed>10066257</pubmed></ref> <ref name=ref9><pubmed>10614664 </pubmed></ref> <ref name=ref10><pubmed>12960038</pubmed></ref> <ref name=ref11><pubmed> 14617578</pubmed></ref>。しかしながら、トランスジェニックマウスやラットの脳を用いてGnRHニューロンの電気生理学的解析も、脳を薄く切った脳スライスを用いた実験しかできないため、実際に脳内で単一のGnRHニューロンの電気活動が排卵周期に一致して変動するのかどうかについては不明である。これに対して、小型で透明性の高い脳をもち、長日条件を[[模倣]]した光周期条件で飼育すると毎日規則的に産卵をするメダカを用いた研究が最近可能になった<ref name=ref12><pubmed>16293668</pubmed></ref> <ref name=ref13><pubmed>22544888</pubmed></ref>。メダカなどの非ほ乳類ではGnRHニューロンの細胞体は視索前野（POA）とよばれる脳部位に存在し、真骨魚類では直接下垂体前葉に投射軸索投射する（図1右図）。したがって、GnRHニューロンをGFP標識すると、メダカでは細胞体から樹状突起、軸索、そして脳下垂体内の[[軸索終末]]までの全てを、生きたまま取りだした丸ごとの脳（全脳''in vitro''標本）を蛍光顕微鏡観察することで見ることができる（図2）。この脳標本では、GnRHニューロンに対して[[シナプス]]入力する神経回路も生きたままの状態で保って、電気生理学的解析を行うことが可能である。こうした特長を活かして、Karigoらは、1日1回の排卵周期に対応するようなGnRHニューロンの自発的な活動電位発火の頻度の周期的変動を見出した<ref name=ref13 />。ほ乳類などではこのような実験は物理的に行い難いのだが、おそらく、個々のGnRHニューロンの活動は、動物の排卵周期に応じたような周期的な変動を示していると想像される。GnRHニューロンの周期的な活動の変動がどのような脳内機構により生じるのかについては現在まだ不明だが、メダカの全脳''in vitro''標本を用いて各種の遺伝学的ツールと生理学的解析結果を、マウス・ラットなどにおける解析結果と合わせて考慮することにより、今後、性腺刺激ホルモン分泌の中枢制御に関する、脊椎動物を通じて共通したしくみの理解が深まるものと期待される。<br />
<br />
==関連項目==<br />
*[[ステロイドホルモン]]<br />
*[[神経ペプチド]]<br />
*[[性行動の神経回路]]<br />
<br />
==参考文献==<br />
<references /></div>
Hkasai
https://bsd.neuroinf.jp/w/index.php?title=%E5%B0%8F%E8%83%9E%E3%82%B0%E3%83%AB%E3%82%BF%E3%83%9F%E3%83%B3%E9%85%B8%E3%83%88%E3%83%A9%E3%83%B3%E3%82%B9%E3%83%9D%E3%83%BC%E3%82%BF%E3%83%BC&diff=34404
小胞グルタミン酸トランスポーター
2016-02-07T11:42:22Z
<p>Hkasai: </p>
<hr />
<div><div align="right"> <br />
<font size="+1">[http://researchmap.jp/read0148418 高森 茂雄]</font><br><br />
''同志社大学 脳科学研究科''<br><br />
DOI：<selfdoi /> 原稿受付日：2016年1月28日 原稿完成日：2016年月日<br><br />
担当編集委員：[http://researchmap.jp/haruokasai 河西 春郎]（東京大学 大学院医学系研究科）<br><br />
</div><br />
<br />
英語名：vesicular glutamate transporter<br />
<br />
英語略語名：VGLUT（ヴィ・グルット）<br />
<br />
同義語：小胞性グルタミン酸トランスポーター、小胞型グルタミン酸トランスポーター<br />
<br />
{{box|text=<br />
哺乳類中枢神経系における興奮性シナプス伝達の多くはグルタミン酸（glutamate, glutamic acid）を介して行なわれる。実に、哺乳類脳内の約8割のニューロンがグルタミン酸を放出する。グルタミン酸は、体内の全ての細胞内に比較的高濃度で存在しているため、ニューロンがグルタミン酸を放出するためには、分泌小胞であるシナプス小胞内腔にグルタミン酸が濃縮される必要がある。グルタミン酸をシナプス小胞に輸送するトランスポーターが小胞型グルタミン酸トランスポーター（VGLUT; vesicular glutamate transporter）であり、これまで哺乳類では3つのアイソフォームが同定されている。VGLUTは、液胞型プロトンATPaseによって形成されるプロトン電気化学勾配を駆動力として、グルタミン酸を小胞内に濃縮する。Na<sup>+</sup>勾配を駆動力としてグルタミン酸を輸送する形質膜型のグルタミン酸トランスポーターとはアミノ酸配列の相同性がない。近年、各VGLUTアイソフォームのノックアウトマウスの解析から、VGLUTがグルタミン酸放出に必須の因子であることや、各々のVGLUTを使ったグルタミン酸神経回路の生理的な重要性が明らかになってきた。<br />
}}<br />
{{GNF_Protein_box<br />
| Name = Solute carrier family 17 (vesicular glutamate transporter), member 7<br />
| image = <br />
| image_source = <br />
| PDB = <br />
| HGNCid = 16704<br />
| MGIid = <br />
| Symbol = SLC17A7<br />
| AltSymbols =; BNPI; VGLUT1<br />
| IUPHAR = <br />
| ChEMBL = <br />
| OMIM = 605208<br />
| ECnumber = <br />
| Homologene = 113454<br />
| GeneAtlas_image1 = PBB_GE_SLC17A7_204230_s_at_tn.png<br />
| GeneAtlas_image2 = PBB_GE_SLC17A7_204229_at_tn.png<br />
| GeneAtlas_image3 = <br />
| Protein_domain_image = <br />
| Function = {{GNF_GO|id=GO:0005313 |text = L-glutamate transmembrane transporter activity}} {{GNF_GO|id=GO:0005315 |text = inorganic phosphate transmembrane transporter activity}} {{GNF_GO|id=GO:0008068 |text = extracellular-glutamate-gated chloride channel activity}} {{GNF_GO|id=GO:0015319 |text = sodium:inorganic phosphate symporter activity}} {{GNF_GO|id=GO:0015321 |text = sodium-dependent phosphate transmembrane transporter activity}}<br />
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| Hs_EntrezGene = 57030<br />
| Hs_Ensembl = ENSG00000104888<br />
| Hs_RefseqmRNA = NM_020309<br />
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| Hs_GenLoc_db = hg38<br />
| Hs_GenLoc_chr = 19<br />
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| Hs_GenLoc_end = 49442360<br />
| Hs_Uniprot = Q9P2U7<br />
| Mm_EntrezGene = 72961<br />
| Mm_Ensembl = ENSMUSG00000070570<br />
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| Mm_GenLoc_db = mm10<br />
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| Mm_GenLoc_start = 45163921<br />
| Mm_GenLoc_end = 45176138<br />
| Mm_Uniprot = Q3TXX4<br />
| path = PBB/57030<br />
}}<br />
<br />
{{GNF_Protein_box<br />
| Name = Solute carrier family 17 (vesicular glutamate transporter), member 8<br />
| image = <br />
| image_source = <br />
| PDB = <br />
| HGNCid = 20151<br />
| MGIid = 3039629<br />
| Symbol = SLC17A8<br />
| AltSymbols =; DFNA25; VGLUT3<br />
| IUPHAR = yes<br />
| ChEMBL = <br />
| OMIM = 607557<br />
| ECnumber = <br />
| Homologene = 13584<br />
| GeneAtlas_image1 = <br />
| GeneAtlas_image2 = <br />
| GeneAtlas_image3 = <br />
| Protein_domain_image = <br />
| Function = {{GNF_GO|id=GO:0005313 |text = L-glutamate transmembrane transporter activity}} {{GNF_GO|id=GO:0015293 |text = symporter activity}}<br />
| Component = {{GNF_GO|id=GO:0016021 |text = integral component of membrane}} {{GNF_GO|id=GO:0030054 |text = cell junction}} {{GNF_GO|id=GO:0030672 |text = synaptic vesicle membrane}} {{GNF_GO|id=GO:0043005 |text = neuron projection}}<br />
| Process = {{GNF_GO|id=GO:0006811 |text = ion transport}} {{GNF_GO|id=GO:0006814 |text = sodium ion transport}} {{GNF_GO|id=GO:0006836 |text = neurotransmitter transport}} {{GNF_GO|id=GO:0007605 |text = sensory perception of sound}} {{GNF_GO|id=GO:0055085 |text = transmembrane transport}} {{GNF_GO|id=GO:0089711 |text = L-glutamate transmembrane transport}}<br />
| Hs_EntrezGene = 246213<br />
| Hs_Ensembl = ENSG00000179520<br />
| Hs_RefseqmRNA = NM_001145288<br />
| Hs_RefseqProtein = NP_001138760<br />
| Hs_GenLoc_db = hg38<br />
| Hs_GenLoc_chr = 12<br />
| Hs_GenLoc_start = 100357079<br />
| Hs_GenLoc_end = 100422059<br />
| Hs_Uniprot = Q8NDX2<br />
| Mm_EntrezGene = 216227<br />
| Mm_Ensembl = ENSMUSG00000019935<br />
| Mm_RefseqmRNA = NM_182959<br />
| Mm_RefseqProtein = NP_892004<br />
| Mm_GenLoc_db = mm10<br />
| Mm_GenLoc_chr = 10<br />
| Mm_GenLoc_start = 89574020<br />
| Mm_GenLoc_end = 89621253<br />
| Mm_Uniprot = Q8BFU8<br />
| path = PBB/246213<br />
}}<br />
<br />
==サブファミリー==<br />
哺乳類では3つのVGLUT（[[VGLUT1]], [[VGLUT2|2]], [[VGLUT3|3]]）が同定されている<ref name=ref1><pubmed>10938000</pubmed></ref> <ref name=ref2><pubmed>16765470</pubmed></ref> <ref name=ref3><pubmed>11001057</pubmed></ref>。これらは[[I型リン酸トランスポーターファミリー]]に属し、現にVGLUT1とVGLUT2は、形質膜に存在し[[リン酸]]を輸送するトランスポーターとしてクローニングされ、それぞれBNPI, DNPIと呼ばれていた<ref name=ref4><pubmed>10820226</pubmed></ref> <ref name=ref5><pubmed>8202535</pubmed></ref>。<br />
<br />
現在の分類では、SLC17ファミリーに属し、VGLUT1, 2, 3はそれぞれ[[SLC17A7]], [[SLC17A6|A6]], [[SLC17A8|A8]]と呼ばれる。同じファミリーの[[Sialin]]（[[SLC17A5]]）は[[リソソーム]]からの[[シアル酸]]排出に関わるトランスポーターとして知られるが<ref name=ref6><pubmed>15510212</pubmed></ref>、最近、グルタミン酸や[[アスパラギン酸]]輸送活性を持つことが示され[[VEAT]]（vesicular excitatory amino acid transporter）と名付けられた<ref name=ref7><pubmed>18695252</pubmed></ref>。しかしながら、sialin/VEATがグルタミン酸やアスパラギン酸を介したシナプス伝達に関わっているか否かは議論の的となっている<ref name=ref8><pubmed>26180193</pubmed></ref>。<br />
<br />
==構造==<br />
VGLUTは約560個のアミノ酸からなる分子量約65kDaのタンパク質で、10~12個の膜貫通部位を持っている。N末端、C末端ともに細胞質側に位置しており、その部分のアミノ酸配列がアイソフォーム間で多様性に富む。第1膜貫通部位と第2膜貫通部位の間のループ領域は小胞内腔側に位置し、N型の糖鎖修飾を受けている<ref name=ref9><pubmed>12151341</pubmed></ref>。VGLUT1のC末端にはProline-rich domainが存在し、[[エンドサイトーシス]]関連タンパク質である[[エンドフィリン]]と結合し、高頻度刺激時におけるVGLUT1タンパク質の効率的なエンドサイトーシスに関与していることが示唆されている<ref name=ref10><pubmed>16815333</pubmed></ref>。VGLUT1~3のグルタミン酸取込み活性には大きな違いが認められていない。<br />
<br />
==発現分布==<br />
[[image:小胞グルタミン酸トランスポーター1.png|thumb|350px|'''図1．3つのVGLUTアイソフォームの脳内分布の概要'''<br>哺乳類脳内には3つのVGLUTアイソフォームが発現している。mRNAの発現パターンを見ると、VGLUT1とVGLUT2は相補的に発現しているのに対して、VGLUT3の発現はごく一部の細胞に限局している。参考文献<ref name=ref11><pubmed>15102489</pubmed></ref>より改訂。]]<br />
<br />
通常グルタミン酸を放出しないニューロンにVGLUTを発現させるとグルタミン酸放出が喚起されることから、今日ではグルタミン酸作動性ニューロンの神経終末マーカーとして、抗VGLUT抗体が広く使用されている。<br />
<br />
興味深いことに、成体の脳においてVGLUT1とVGLUT2は異なるニューロンに発現している（図1）<ref name=ref11><pubmed>15102489</pubmed></ref> <ref name=ref12><pubmed>15118123</pubmed></ref> <ref name=ref13><pubmed>11985876</pubmed></ref>。VGLUT1は主に[[大脳皮質]]・[[海馬]]に、VGLUT2は[[視床]]・[[視床下部]][[腹内側核]]・[[扁桃体]]に発現が認められる。また、小脳においては、平行繊維がVGLUT1を、登上繊維がVGLUT2を発現するなど、ここでも相補的な発現パターンを示す。一方、例外的にVGLUT1とVGLUT2の両方を発現するニューロンや、発達過程でアイソフォームの発現量が変化する例も報告されている<ref name=ref14><pubmed>12823463</pubmed></ref>。また、脳以外では、[[膵臓]]の[[α細胞]]や[[β細胞]]、[[松果体]]、[[精子]]頭部の[[アクロソーム]]での発現が確認されており、末梢器官におけるグルタミン酸シグナリングの重要性が示唆されている<ref name=ref15><pubmed>15047716</pubmed></ref>。<br />
<br />
主要なVGLUTアイソフォームであるVGLUT1,2に比べて、VGLUT3を発現しているニューロンは極めて少ない<ref name=ref16><pubmed>12388773</pubmed></ref> <ref name=ref17><pubmed>12097496</pubmed></ref>。興味深いことに、VGLUT3は従来グルタミン酸作動性ニューロンと思われていなかったニューロン、例えば海馬や大脳皮質の[[GABA]]作動性ニューロンや[[モノアミン]]作動性ニューロンでの発現が認められることから、グルタミン酸とGABAやドーパミンの共放出が示唆された。また、VGLUT3は神経終末のみならず、一部の細胞では[[細胞体]]や[[樹状突起]]での発現が認められることから、ポストシナプス側からのグルタミン酸放出による逆行性シグナル伝達を担う可能性が指摘されている。[[肝臓]]や[[腎臓]]においても発現が検出されているが、その生理機能は不明である。<br />
<br />
==機能==<br />
===グルタミン酸輸送機構===<br />
[[image:小胞グルタミン酸トランスポーター2.png|thumb|350px|'''図2．興奮性シナプス終末におけるシナプス小胞グルタミン酸再充填機構'''<br>興奮性神経伝達物質であるグルタミン酸は、シナプス終末の細胞質に存在するPAG(phosphate-activated glutaminase)の働きにより、グルタミン酸から作られる。VGLUTによるグルタミン酸輸送は、液胞型プロトンATPaseが形成するプロトン電気化学勾配によって駆動されるが、輸送メカニズムの詳細は不明である。特にCl<sup>–</sup>の役割については2つの説が提唱されており、VGLUTが持つCl<sup>–</sup>透過性が輸送活性を制御する説（上）と、Cl<sup>–</sup>がVGLUTに直接結合することによりVGLUTが活性化されるとする説（下）がある。また、VGLUTがグルタミン酸／H+対向輸送体なのか、膜電位駆動型グルタミン酸単輸送体なのかは定かではない。]]<br />
<br />
[[プロトン]]の[[電気化学勾配]]を駆動力としてグルタミン酸をシナプス小胞内への輸送する<ref name=ref28><pubmed>17880890</pubmed></ref>。[[小胞膜]]に存在する[[液胞型プロトンATPase]]は、ATP加水分解のエネルギーを使って細胞質から小胞内腔にプロトンを運ぶことにより、膜電位勾配（小胞内が+）とpH勾配（小胞内が酸性）を形成する。哺乳類脳から精製したシナプス小胞を使った生化学的取込み測定の結果から、グルタミン酸の輸送は主に膜電位勾配によって駆動されると考えられているが、その詳細なメカニズムはいまだに不明である（図2）。<br />
<br />
一方、輸送の駆動力である膜電位勾配とpH勾配は、小胞膜上にある[[塩化物イオンチャネル]]の活性によって調節されるが、その分子実態は諸説ある。電位依存性Cl<sup>–</sup>チャネルファミリーの[[ClC-3]]とする説<ref name=ref29><pubmed> 11182090</pubmed></ref>と、VGLUT自体がチャネル活性を持つとする説である<ref name=ref1 /> <ref name=ref30><pubmed>19169251</pubmed></ref>。また、塩化物イオンがVGLUTに直接結合し、グルタミン酸輸送活性を調整するという仮説も提唱されており<ref name=ref31><pubmed>8226829</pubmed></ref> <ref name=ref32><pubmed>20920794</pubmed></ref>、Cl<sup>–</sup>はプロトン電気化学勾配とVGLUTの両方を修飾している可能性が示唆されている。<br />
<br />
脳から精製したシナプス小胞のグルタミン酸再充填の時定数は数分程度であるが、[[ヘルド杯状シナプス]]においては、室温で測定した場合、再充填の時定数15秒程度であることが報告されている<ref name=ref33><pubmed>23141063</pubmed></ref>。また、輸送速度は、細胞質のCl<sup>–</sup>濃度によって修飾されること、生後発達過程で徐々に速くなること等が示された。<br />
<br />
===遺伝子改変マウスと生理機能===<br />
====VGLUT1====<br />
VGLUT1ノックアウトマウスは、生後2~3週齢までは野生型と区別がつかないが、その後急激に成長が遅滞し死に到る<ref name=ref12 /> <ref name=ref18><pubmed>15103023</pubmed></ref>。この時期に食餌を人工的に行なうと、1年以上生存するとの報告もある<ref name=ref12 /> <ref name=ref30><pubmed>19169251</pubmed></ref>。死に至る直前のVGLUT1ノックアウトマウスは、異常な[[驚愕反射]]を呈する。<br />
<br />
VGLUT1マウス由来の海馬[[初代培養]]細胞や海馬[[スライス標本]]では、グルタミン酸による[[興奮性]]神経伝達のほとんどが消失する。幼弱期に若干残存する活性は、おそらくVGLUT2の一過性な発現によると考えられている。VGLUT1のヘテロマウスから得られた神経標本での電気生理学的測定では、刺激に応答したグルタミン酸シナプス伝達や小胞内グルタミン酸量を反映する[[miniature EPSC]]の振幅は減少しないが<ref name=ref12 /> <ref name=ref18 />、[[長期増強]]（[[LTP]]）の減弱が見られる<ref name=ref19><pubmed>17241289</pubmed></ref>。また、[[モーリス水迷路試験]]における[[逆転学習]]の低下、[[不安]]傾向や[[鬱症]]状などを呈することから、VGLUT1の発現減少が脳機能に何らかの役割を果たすと考えられている<ref name=ref19 /> <ref name=ref20><pubmed>24037344</pubmed></ref>。<br />
<br />
====VGLUT2====<br />
VGLUT2ノックアウトマウスは生後直後に、呼吸不能により死亡する。したがって、脳幹部位のVGLUT2陽性ニューロンが呼吸を支えるグルタミン酸シナプス伝達を担っていると考えられる<ref name=ref21><pubmed>17108179</pubmed></ref> <ref name=ref22><pubmed>17122055</pubmed></ref>。また、VGLUT2の[[コンディショナル・ノックアウトマウス]]も精力的に作成され、視床下部腹内側核や大脳皮質及び扁桃体のVGLUT2が欠損すると、それぞれ低血糖反応の低下や[[多動]]を含む[[統合失調症]]様の行動異常を示すことが明らかになった<ref name=ref23><pubmed>17488640</pubmed></ref> <ref name=ref24><pubmed>19228977</pubmed></ref>。また、VGLUT2のヘテロマウスの解析結果から、視床においてVGLUT2が司るグルタミン酸性神経回路が[[神経因性疼痛]]の発現に関与していることが示唆された<ref name=ref21 />。また、VGLUT2ヘテロマウスではminiature EPSCの振幅低下が検出され、VGLUT1ヘテロマウスの解析結果と一致しない。<br />
<br />
====VGLUT3====<br />
VGLUT3ノックアウトマウスは、一見正常に産まれるが、聴覚障害を呈するのみならず、[[不安]]傾向の増大や[[てんかん]]を呈する。また、[[wj:炎症|炎症]]や機械的な傷害に対する[[痛み]]の感受性が低下することから、VGLUT3が司る神経回路が痛みの受容に関与することが示唆された<ref name=ref25><pubmed>20147547</pubmed></ref> <ref name=ref26><pubmed>18215623</pubmed></ref> <ref name=ref27><pubmed>19915548</pubmed></ref>。<br />
<br />
==参考文献==<br />
<references /></div>
Hkasai
https://bsd.neuroinf.jp/w/index.php?title=%E3%83%88%E3%83%BC%E3%82%AF:%E4%BD%9C%E5%8B%95%E8%96%AC&diff=33413
トーク:作動薬
2016-01-10T05:16:40Z
<p>Hkasai: ページの作成:「 金子先生 わかりやすく、詳細な解説のご執筆ありがとうございました。 一つだけ、気になったのは、アロステリック効果に...」</p>
<hr />
<div><br />
<br />
金子先生<br />
<br />
わかりやすく、詳細な解説のご執筆ありがとうございました。<br />
一つだけ、気になったのは、アロステリック効果によるヒル係数、ヒルプロっトなどが見つからないことです。<br />
<br />
もし、ご加筆いただければ幸いに存じます。<br />
<br />
河西春郎</div>
Hkasai
https://bsd.neuroinf.jp/w/index.php?title=%E3%83%88%E3%83%BC%E3%82%AF:%E3%82%AB%E3%83%AB%E3%82%B7%E3%82%A6%E3%83%A0%E6%8C%87%E7%A4%BA%E8%96%AC&diff=31039
トーク:カルシウム指示薬
2015-07-27T11:38:54Z
<p>Hkasai: </p>
<hr />
<div><br />
編集部からのコメント<br />
<br />
*本項目はおそらくgenetically encoded [[CA2|Ca2]]+ sensorも御解説いただく事を想定して中井先生に依頼したのではないかと思います。追加記述（この項目か、別立てでも）をお願いしてはいかがでしょうか。<br />
<br />
河西からのコメント 2015.7.27.<br />
<br />
中井先生 <br />
<br />
ご丁寧な解説ありがとうございました。<br />
<br />
編集部からのコメントにありますように、カルシウム指示蛋白も含めて書いていただえれば幸いです。別項目にしていただく方がよろしいとお考えでしたらその様にしていただいてかまいません。<br />
<br />
続々と新しいカルシウム指示薬（合成、蛋白）が発表される中で網羅的な解説は困難かと存じますが、できるだけ現在よく使われているものについては比較表をお付けいただければ幸いです。<br />
<br />
また、使用上の注意点なども専門家の立場からご加筆いただけないでしょうか。<br />
<br />
どうぞ、よろしくお願いいたします。<br />
<br />
河西</div>
Hkasai
https://bsd.neuroinf.jp/w/index.php?title=%E3%83%88%E3%83%BC%E3%82%AF:%E3%82%AB%E3%83%AB%E3%82%B7%E3%82%A6%E3%83%A0%E6%8C%87%E7%A4%BA%E8%96%AC&diff=31038
トーク:カルシウム指示薬
2015-07-27T11:25:26Z
<p>Hkasai: ページの作成:「 編集部からのコメント *本項目はおそらくgenetically encoded Ca2+ sensorも御解説いただく事を想定して中井先生に依頼したの...」</p>
<hr />
<div><br />
編集部からのコメント<br />
<br />
*本項目はおそらくgenetically encoded [[CA2|Ca2]]+ sensorも御解説いただく事を想定して中井先生に依頼したのではないかと思います。追加記述（この項目か、別立てでも）をお願いしてはいかがでしょうか。<br />
<br />
河西からのコメント 2015.7.27.<br />
<br />
中井先生 ご丁寧な解説ありがとうございました。編集部からのコメントにありますように、この項には[[カルシウム]]指示蛋白も含めて書いていただけると幸いです。<br />
<br />
続々と新しいカルシウム指示薬（合成、蛋白）が発表される中で網羅的な解説は困難かと存じますが、できるだけ現在使われているものの比較表をお付けいただければ幸いです。<br />
<br />
河西</div>
Hkasai
https://bsd.neuroinf.jp/w/index.php?title=%E3%83%88%E3%83%BC%E3%82%AF:%E8%BB%B8%E7%B4%A2&diff=28532
トーク:軸索
2014-12-18T09:08:28Z
<p>Hkasai: </p>
<hr />
<div>==編集 林 作業記録==<br />
*内部リンク、外部リンク作成<br />
*サブタイトルから「軸索」を除く<br />
*関連項目作成<br />
*他細部修正<br />
*図があればと思います<br />
*活動電位の発生、伝播、シナプス前部構造についてももう少し記述が有ってもと思います。<br />
<br />
--[[利用者:WikiSysop|Yasunori Hayashi]] ([[利用者・トーク:WikiSysop|トーク]]) 2014年9月6日 (土) 09:20 (JST)<br />
==編集 林 作業記録2==<br />
*見出し付け直し。本文細部修正。<br />
--[[利用者:WikiSysop|Yasunori Hayashi]] ([[利用者・トーク:WikiSysop|トーク]]) 2014年9月8日 (月) 09:08 (JST)<br />
*一つの細胞から出る突起の本数は、"神経突起の分類"とは関係ありません。<br />
*参考情報として小文字を指定していた原稿を、全て大文字化にして本文化するなど、こちらの意図と異なる編集が複数みられたので、注釈は注釈として分けて、どの部分に対する注釈なのかを明示するように変更しました。<br />
--[[利用者:Masahikokawagishi|Masahikokawagishi]] ([[利用者・トーク:Masahikokawagishi|トーク]]) 2014年9月8日 (月) 15:52 (JST)<br />
<br />
--査読 河西 --<br />
<br />
充実した解説ありがとうございました。<br />
査読が遅れて大変申し訳ございません。<br />
<br />
私も図がある方がいいと思いました。お手数ですがよろしくお願いいたします。<br />
<br />
「一方、中枢神経系では、オリゴデンドロサイトの細胞体は、髓鞘により被覆する軸索からやや離れて存在するため、無鞘線維に分類される。」の部分がよく理解できません。有鞘無鞘という言葉はあまりつかいませんので、たとえば、「大脳皮質灰白質内の軸索の多くは無髄となり、また、無鞘である。」などの例とともに記載いただくとわかりやすいかと思いました。<br />
<br />
軸索の太さや伝道速度による分類は、あった方がいいと思います。可能でしたら中枢神経ではどうなっているのかを解説していただくと有用かと存じます。<br />
<br />
以上、どうぞ、よろしくお願いいたします。<br />
<br />
河西春郎</div>
Hkasai
https://bsd.neuroinf.jp/w/index.php?title=%E3%83%88%E3%83%BC%E3%82%AF:%E5%B0%8F%E8%83%9EGABA%E3%83%88%E3%83%A9%E3%83%B3%E3%82%B9%E3%83%9D%E3%83%BC%E3%82%BF%E3%83%BC&diff=26990
トーク:小胞GABAトランスポーター
2014-06-11T11:07:34Z
<p>Hkasai: /* == 河西 ＝＝＝ */ 新しい節</p>
<hr />
<div>==編集 林 作業記録==<br />
*末梢神経を脳幹・脊髄に、行動異常を運度失調に訂正<br />
*内部リンク、外部リンク作成<br />
*図のタイトルと説明を御願い致します。<br />
<br />
--[[利用者:WikiSysop|Yasunori Hayashi]] ([[利用者・トーク:WikiSysop|トーク]]) 2014年5月1日 (木) 10:39 (JST)<br />
<br />
== == 河西 ＝＝＝ ==<br />
<br />
高森先生<br />
<br />
編集遅くなりすみません。<br />
とてもわかりやすく最新の内容が紹介されておりとても勉強になりました。<br />
<br />
林先生の下記の指摘のうち、「末梢神経を脳幹・脊髄」に変更の所は、もしかすると、抹消神経にも発現している場合は、それについても言及いただければ幸いです。<br />
＝＝林先生 コメント ＝＝<br />
末梢神経を脳幹・脊髄に、行動異常を運度失調に訂正<br />
内部リンク、外部リンク作成<br />
図のタイトルと説明を御願い致します。<br />
＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝<br />
<br />
本文中の解説 「[[GABA]]とCl–を1：2で輸送する共輸送体であるとする新しい仮説が提唱された[19]（図1）」と実際の図１が対応していないように見えますので、図の説明とともに、この部分の改訂も加えていただければ幸いです。<br />
<br />
どうぞ、よろしくお願いいたします。<br />
<br />
河西春郎</div>
Hkasai
https://bsd.neuroinf.jp/w/index.php?title=%E3%83%88%E3%83%BC%E3%82%AF:%E8%A8%98%E6%86%B6%E7%97%95%E8%B7%A1&diff=25843
トーク:記憶痕跡
2014-04-10T05:31:53Z
<p>Hkasai: /* 編集 完成 */ 新しい節</p>
<hr />
<div>==編集 林 作業記録==<br />
*内部リンク・外部リンク作成<br />
*辞書としての性質から、研究の歴史を辿るよりも事実を中心とした記述の方が読みやすいかと思います。<br />
*小見出しを御願いします。<br />
*抄録を御願い致します。<br />
*記憶痕跡=神経[[細胞集成体]]と読めますが、[[シナプス]]も記憶痕跡の最小単位かと思います。<br />
<br />
--[[利用者:WikiSysop|Yasunori Hayashi]] 2013年5月6日 (月) 11:12 (JST)<br />
<br />
<br />
<br />
鈴木章円先生、大川宜昭先生、井ノ口馨先生<br />
<br />
とても丁寧な解説ありがとございます。勉強になります。<br />
林先生のコメントにもありますが、<br />
特定の神経細胞のセットがなぜ痕跡になるのかを考えていくと、結合に関するより小さな構造、細胞全体だけでなく、シナプスを考える必要があることを付け加えていただいた方がLTPともつながりわかりやすくなるように思いました。<br />
<br />
また、図３の中の文字は小さすぎて拡大しても見えませんので、読みやすいような大きさにしていただければ幸いです。<br />
<br />
お手数ですが、ご改訂よろしくお願いいたします。<br />
<br />
河西春郎<br />
<br />
==編集 林 作業記録２==<br />
*新たに記述された部分にないブリンク、外部リンク追加。<br />
<br />
--[[利用者:WikiSysop|Yasunori Hayashi]] ([[利用者・トーク:WikiSysop|トーク]]) 2014年4月9日 (水) 18:06 (JST)<br />
<br />
== 編集 完成 ==<br />
<br />
鈴木章円先生、大川宜昭先生、井ノ口馨先生<br />
<br />
お忙しい中、ご改訂ありがとうございました。<br />
これにて完成とさせていただきます。<br />
今後もよろしくお願いいたします。<br />
<br />
河西春郎</div>
Hkasai
https://bsd.neuroinf.jp/w/index.php?title=%E3%83%88%E3%83%BC%E3%82%AF:%E5%B0%8F%E8%83%9E%E3%82%A2%E3%82%BB%E3%83%81%E3%83%AB%E3%82%B3%E3%83%AA%E3%83%B3%E3%83%88%E3%83%A9%E3%83%B3%E3%82%B9%E3%83%9D%E3%83%BC%E3%82%BF%E3%83%BC&diff=25277
トーク:小胞アセチルコリントランスポーター
2014-03-10T08:57:39Z
<p>Hkasai: /* 河西コメント */ 新しい節</p>
<hr />
<div>==編集 林 作業記録==<br />
*PBB作成、挿入。<br />
*内部リンク、外部リンク作成。<br />
*高親和性[[コリン]]トランスポーターについてはどうでしょうか。<br />
<br />
--[[利用者:WikiSysop|Yasunori Hayashi]] ([[利用者・トーク:WikiSysop|トーク]]) 2014年2月27日 (木) 22:32 (JST)<br />
<br />
== 河西コメント ==<br />
<br />
奥田先生<br />
<br />
とてもわかりやすくよく書けています。<br />
林先生もご指摘の様に、コリントランスポータにつきましても解説を付記していただき、<br />
見出しを[[検索]]可能にしていただけないでしょうか。<br />
<br />
河西</div>
Hkasai
https://bsd.neuroinf.jp/w/index.php?title=%E9%AB%84%E9%9E%98&diff=24074
髄鞘
2013-12-06T19:26:29Z
<p>Hkasai: </p>
<hr />
<div><div align="right"> <br />
<font size="+1">吉村 武、[http://researchmap.jp/read0182659 池中 一裕]</font><br><br />
''自然科学研究機構生理学研究所 分子生理研究系 分子神経生理研究部門''<br><br />
DOI [[XXXX]]/XXXX 原稿受付日：2012年2月3日 原稿完成日：2013年12月7日<br><br />
担当編集委員：[http://researchmap.jp/haruokasai 河西 春郎]（東京大学 大学院医学系研究科）<br><br />
</div><br />
<br />
英語名：myelin, myelin sheath, medullary sheath 独：Myelin 仏：myéline<br />
<br />
同義語：[[ミエリン]]、ミエリン鞘 <br />
<br />
{{box|text=<br />
髄鞘は[[神経細胞]]の[[軸索]]を何重にも取り囲んでいる密な膜構造である。髄鞘は[[wikipedia:ja:脂質|脂質]]に富み[[wikipedia:ja:絶縁体|絶縁体]]として働く。髄鞘は導線を覆うビニール管のように軸索全体を覆っているのではなく、一定の間隔を開けている。隙間は[[ランビエ絞輪]]（node of Ranvier）と呼ばれ、この部分でしか[[活動電位]]を発生させることができない。ゆえに、髄鞘化されていない軸索では活動電位は連続的に伝わるが、髄鞘化された軸索では活動電位はランビエ絞輪の部分のみを経由して飛び飛びに伝わる。このような現象を[[跳躍伝導]]と呼び、髄鞘の存在によって[[伝導]]速度の上昇が可能となる。髄鞘を形成しているのは[[グリア細胞]]（神経膠細胞、glial cell）であり、中枢神経系では[[オリゴデンドロサイト]]（[[希突起膠細胞]]、oligodendrocyte）、末梢神経系では[[シュワン細胞]]（Schwann cell）によって形成される。髄鞘は単に絶縁体として働くだけでなく、軸索との間に緊密な相互作用を行い、様々な神経機能を調節している。[[脱髄疾患]]や[[髄鞘形成不全]]では種々の神経症状を呈し、致死性の場合もある。<br />
}}<br />
<br />
[[Image:Takeshiyoshimura fig 1.jpg|thumb|right|350px|'''図1．髄鞘を形成するグリア細胞'''<br>髄鞘は A) 中枢神経系ではオリゴデンドロサイト、B) 末梢神経系ではシュワン細胞により形成される。中枢、末梢神経系ともに髄鞘は均一に軸索を覆うのではなく、髄鞘間の隙間がある。これをランビエ絞輪と呼び、アストロサイトなど他のグリア細胞が接触して神経活動をモニターしていると考えられている。]]<br />
== 髄鞘とは ==<br />
髄鞘はmedullary sheathの訳語であり、「髄質の神経線維が持っている鞘」のことである。英語名はmyelinがよく使われており、1854年に[[wikipedia:Rudolf Virchow|R. Virchow]]博士により発見され命名された<ref>'''Virchow R.'''<br>Über das ausgebreitete Vorkommen einer dem Nervenmark analogen Substanz in den tierischen Geweben.<br>''Virchows Arch. Pathol. Anat.'', 6, 562–572, 1854</ref>。髄鞘は脂質が主成分であるため、神経細胞の軸索を外部から電気的に遮断する絶縁体として機能する<ref>'''北村邦男'''<br>脳と神経 分子神経生物科学入門, 金子章道・河村光毅・植村慶一 編, ミエリン<br>''共立出版（東京）'', p. 216-224, 1999</ref><ref>'''石橋智子、馬場広子、池中一裕'''<br>[[脳神経]]科学, 伊藤正男 監修, 金澤一郎・篠田義一・廣川信隆・御子柴克彦・宮下保司 編集, ミエリンとミエリン形成<br>''三輪書店（東京）'', p. 117-127, 2003</ref><ref>'''渡辺雅彦'''<br>みる見るわかる 脳・神経科学入門講座 改訂版 前編<br>''羊土社（東京）'', 2008</ref>。髄鞘は脂質に富む[[細胞膜]]の多重層構造であるため白色に見える。[[脳]]や[[脊髄]]の切断面を観察すると、やや桃色を帯びた灰白色の部分（[[灰白質]]）と白色の部分（[[白質]]）を明瞭に区別することができる。灰白質は神経細胞の[[細胞体]]が密集した部分であり、これらの神経細胞から伸びた軸索が通る部分が白質である。白質には[[有髄神経]]線維が多く存在するため白色に見える。<br />
<br />
軸索は多数の髄鞘で隈無く覆われているわけではない。髄鞘の長さは0.1〜1 mm程度であり、髄鞘間には隙間がある。この隙間はランビエ絞輪と呼ばれる（図1）。軸索は神経細胞の細胞体の[[軸索小丘]]（axon hillock）に始まり、この場所と最初の髄鞘が現れる間の領域は[[軸索起始部]]（axon initial segment）と呼ばれる<ref><pubmed>20631711</pubmed></ref>。軸索起始部とランビエ絞輪は共に活動電位の発生に重要である。軸索起始部で最初の活動電位が生じ、それが隣のランビエ絞輪における活動電位を引き起こす。そして次々に隣のランビエ絞輪の活動電位が引き起こされ、活動電位が髄鞘で絶縁された部分を飛び越えていく。このような現象を跳躍伝導と呼ぶ。この様式は伝導速度を飛躍的に上げ、信号の減衰を防ぎ、長距離の信号伝達を可能にするだけでなく、興奮が軸索の狭い場所に限定されることにより代謝エネルギーの節約にも役立っている。<br />
<br />
== 形成する細胞 ==<br />
<br />
[[Image:Takeshiyoshimura fig 2.jpg|thumb|right|350px|<b>図2．髄鞘形成</b><br>A) 一つのオリゴデンドロサイトは数本から数十本の突起を伸ばし、多くの軸索に髄鞘を形成する。それに対し、B) 一つのシュワン細胞は一本の軸索にしか髄鞘を形成しない。]] <br />
<br />
髄鞘を形成しているのはグリア細胞であり、中枢神経系の髄鞘はオリゴデンドロサイト、末梢神経系の髄鞘はシュワン細胞によって形成される（図1）。中枢神経系では1つのオリゴデンドロサイトが複数の突起を出し、突起毎に1本の軸索を認識して何重にも軸索を取り囲んだ後、細胞質成分を押し出して密な膜構造（髄鞘）を形成する（図2）。それに対して、末梢神経系ではシュワン細胞そのものが軸索を取り囲む。1つのシュワン細胞は軸索束を取り囲んだ後、1本の軸索を選別して、その1本の軸索で髄鞘を形成する<ref><pubmed>22192173</pubmed></ref>。末梢神経系の髄鞘ではシュワン細胞の細胞質が髄鞘の中に取り残された部分（シュミット・ランターマンの切痕）がある（図3）。 <br />
<br />
[[Image:Takeshiyoshimura fig 3.jpg|thumb|right|350px|<b>図3．長軸方向に切った髄鞘の模式図</b><br>図1の破線部分を長軸方向に切った模式図。上半分が中枢神経系髄鞘で下半分が末梢神経系髄鞘。]] <br />
<br />
中枢神経系のランビエ絞輪には[[アストロサイト]]が突起を伸ばして接触しているが、末梢神経系ではシュワン細胞の微小突起が覆っている。また、末梢神経系の髄鞘は[[基底膜]]で覆われているが、中枢神経系の髄鞘にはそれが見られない。<br />
<br />
== 成分と構造 ==<br />
<br />
髄鞘は[[細胞形質膜]]の多層構造体であるため、他の多くの細胞の[[形質膜]]や細胞内小胞膜と比べてタンパク質成分が少ない。脂質が約70〜80%（乾燥重量比）程度を占め、残り約20〜30%がタンパク質である。このため、髄鞘は他の膜よりも比重が軽いため[[wikipedia:Differential_centrifugation#Sucrose_gradient_centrifugation|ショ糖密度勾配遠心法]]により他の膜と分離して調整することができる。髄鞘を構成する主な脂質は糖脂質[[wikipedia:Galactocerebroside|ガラクトセレブロシド]]とその硫酸化誘導体[[wikipedia:Sulfatide|スルファチド]]である<ref><pubmed>9530920</pubmed></ref>。中枢神経系と末梢神経系では髄鞘を産生するグリア細胞が異なり、髄鞘を構築する様式も異なるので、これらの髄鞘を構成するタンパク質の多くは異なる。しかし、中には共通して存在するタンパク質もある。中枢神経系の髄鞘では[[PLP]]と[[MBP]]が主成分のタンパク質であり、その他に[[MOG]]、[[MAG]]、[[CNPase]]などが存在する。末梢神経系の髄鞘では[[P0]]と[[P2]]が主成分のタンパク質であり、[[PMP22]]、[[Mag|MAG]]、CNPaseなども発現している。<br />
<br />
近年、軸索と髄鞘の間では絶えず活発な情報交換が行なわれていることが示されたため、髄鞘は単に絶縁体として働くだけでなく、[[軸索輸送]]や軸索径の調節などに重要な役割を担うことが明らかとなってきた<ref name="ref8"><pubmed>18558866</pubmed></ref><ref name="ref9"><pubmed>18538868</pubmed></ref><ref name="ref10"><pubmed>20216548</pubmed></ref>。髄鞘の重要な働きの1つとして、軸索の機能的ドメイン形成がある<ref><pubmed>14682359</pubmed></ref>。[[有髄神経]]の軸索は髄鞘が取り巻くことによって、ランビエ絞輪・[[パラノード]]・[[ジャクスタパラノード]]・[[インターノード]]といったそれぞれに特徴的形態を持つ4つのドメインに分けられる（図3）。これらの各ドメインは、[[イオンチャネル]]や[[接着分子]]などの膜タンパク質がドメイン特異的に集積することにより、形態的のみならず機能的にも異なっている。ランビエ絞輪には活動電位発生に関わる[[電位依存性ナトリウムチャネル]]、ジャクスタパラノードには[[電位依存性カリウムチャネル]]がそれぞれ集積している。この2つのチャネルを隔てるパラノード部分には、軸索と髄鞘の間に作られたパラノーダルジャンクションと呼ばれる細胞間結合が存在する。このジャンクション形成は軸索の機能ドメインの維持に必要であり、[[Caspr]]や[[contactin]]、[[NF155]]などがジャンクション形成に重要である。 <br />
<br />
== 脱髄疾患および髄鞘形成不全 ==<br />
<br />
脱髄疾患（demyelinating disease）は神経疾患の1種で、有髄神経の髄鞘が障害されることで起こる疾患であり、いったん髄鞘が形成された後に障害される疾患のことを示す<ref name="ref8" />。髄鞘の消失により神経伝導速度が遅くなり、様々な神経症状が引き起こされる。脱髄が起こる場所により症状は千差万別であり、手足のしびれや運動麻痺、[[感覚]]麻痺、[[視力]]障害などが起こる。中枢神経系の脱髄疾患には日本で特定疾患に認定されている[[多発性硬化症]]（multiple sclerosis; MS）や[[白質ジストロフィー]]（leukodystrophy）などがある。末梢神経系の脱髄疾患には日本で特定疾患に認定されている[[ギラン・バレー症候群]]（Guillain-Barré syndrome; GBS）や[[慢性炎症性脱髄性多発神経炎]]（Chronic inflammatory demyelinating polyneuropathy; CIDP）、[[シャルコー・マリー・トゥース病]]（Charcot-Marie-Tooth disease; CMT）などがある。遺伝子変異などが原因で最初から髄鞘形成が不完全になることは[[髄鞘形成不全]]（dysmyelination）と言う。髄鞘形成不全と関連づけられている疾患として、ある種の[[白質ジストロフィー]]などが挙げられる<ref name="ref10" />。また、最近の研究により[[統合失調症]]（schizophrenia）との関連が示唆されている<ref name="ref9" /><ref name="ref10" />。 <br />
<br />
== 髄鞘を持つ動物 ==<br />
<br />
[[Image:Takeshiyoshimura fig 4.jpg|thumb|right|350px|'''図4．髄鞘を持つ動物の系統樹''']]<br />
<br />
神経系において情報を高速処理するために、伝導速度を上げることは重要である。このため、進化の過程で神経系は2つの仕組みを獲得してきた。1つは、軸索の直径を巨大化させることである。例として[[wikipedia:ja:イカ|イカ]]の[[巨大軸索]]が挙げられる。もう1つは髄鞘を持つことである。多くの動物種がこれらの仕組みを利用している。髄鞘は[[wikipedia:ja:ヤツメウナギ|ヤツメウナギ]]や[[wikipedia:ja:ヌタウナギ|ヌタウナギ]]などの[[wikipedia:ja:脊椎動物|脊椎動物]]として最も古い[[wikipedia:ja:無顎類|無顎類]]に属する[[wikipedia:ja:円口類|円口類]]を除く脊椎動物に存在し、[[wikipedia:ja:軟骨魚類|軟骨魚類]]以降の脊椎動物が持つ特徴的な構造体と考えられてきた。しかし、平行進化によって[[wikipedia:ja:無脊椎動物|無脊椎動物]]の中には髄鞘様の構造を持つものが存在する（図4）。[[wikipedia:ja:エビ|エビ]]や[[wikipedia:ja:ミミズ|ミミズ]]、ある種の[[wikipedia:ja:ミジンコ|ミジンコ]]の仲間などが髄鞘様の構造を有する<ref><pubmed>17208176</pubmed></ref>。 <br />
<br />
== 関連語 ==<br />
<br />
*[[グリア細胞]]<br />
<br />
*[[オリゴデンドロサイト]]<br />
<br />
*[[シュワン細胞]]<br />
<br />
*[[活動電位]]<br />
<br />
*[[有髄神経]]<br />
<br />
*[[軸索]]<br />
<br />
*[[ランビエ絞輪]]<br />
<br />
== 参考文献 ==<br />
<br />
<references /></div>
Hkasai
https://bsd.neuroinf.jp/w/index.php?title=%E3%83%88%E3%83%BC%E3%82%AF:%E8%88%88%E5%A5%AE%E6%80%A7%E3%82%B7%E3%83%8A%E3%83%97%E3%82%B9&diff=23222
トーク:興奮性シナプス
2013-10-02T15:43:07Z
<p>Hkasai: /* 査読終了河西 */ 新しい節</p>
<hr />
<div>==編集 林 作業記録==<br />
*内部リンク・外部リンク作成<br />
<br />
--[[利用者:WikiSysop|Yasunori Hayashi]] ([[利用者・トーク:WikiSysop|トーク]]) 2013年7月28日 (日) 04:23 (JST)<br />
<br />
== 査読 河西 ==<br />
<br />
酒井先生、八尾先生<br />
<br />
わかりやすい解説ありがとうございました。<br />
簡単に可塑性（短期・長期）について触れていただけないでしょうか。<br />
小胞の大きさは30nmのものがありますので、範囲を直しました。<br />
<br />
どうぞ、よろしくお願いいたします。<br />
<br />
河西春郎<br />
<br />
== 査読終了河西 ==<br />
<br />
酒井先生<br />
<br />
改訂ありがとうございました。<br />
よくまとまっていると感心しました。<br />
<br />
これで完成といたしたいと存じます。<br />
今後もよろしくお願いいたします。<br />
<br />
河西</div>
Hkasai
https://bsd.neuroinf.jp/w/index.php?title=%E3%82%A8%E3%82%AF%E3%82%BD%E3%82%B5%E3%82%A4%E3%83%88%E3%83%BC%E3%82%B7%E3%82%B9&diff=22430
エクソサイトーシス
2013-08-15T07:22:19Z
<p>Hkasai: </p>
<hr />
<div>英語名：exocytosis 独: Exocytose 仏: exocytose <br> 同義語: 開口放出、分泌、開口分泌 <br />
<br />
細胞からの[[wikipedia:ja:分泌|分泌]]現象は開口放出により起きることが、[[wikipedia:ja:電子顕微鏡|電子顕微鏡]]で[[シナプス小胞]]や[[分泌小胞]]が発見されたことから提唱された。その要素過程は[[膜融合]]という超微細構造変化にある点が難しい。しかし、現在では、様々の機能的測定や分子生物学的手法により、その解明が進んできた。 <br />
<br />
== 定義 ==<br />
<br />
細胞質の分泌小胞の膜が[[細胞膜]]に融合することにより、小胞内腔と細胞外液が交通し、分泌小胞の内容物が細胞外に放出される現象を開口放出(exocytosis)という。速い[[神経伝達物質]]放出はシナプス小胞の、[[神経ペプチド]]の分泌は大型[[有芯小胞]]の開口放出により起きる。開口放出に伴い小胞の膜やタンパク質が細胞膜に運ばれ、これを回収するため、[[エンドサイトーシス]]が引き続き起きることが多い。開口放出は概念的には調節性と構成的なものに分けられる。調節性の場合、細胞に対する刺激で開口放出が起きるが、その刺激は細胞内[[Ca2+|Ca<sup>2+</sup>]]や[[CAMP]]の濃度上昇を起こすことが多い。 <br />
<br />
== 多様性 ==<br />
[[Image:PVR fig 1.png|thumb|300px|'''図1．開口放出の速さの多様性'''<ref name="ref1"><pubmed> 23073634 </pubmed></ref> ]] <br />
<br />
調節性開口放出の場合には、刺激から開口放出が起きるまでの時間が1ミリ秒以下から100秒以上と10万倍以上に及ぶ<ref name="ref1"><pubmed> 23073634 </pubmed></ref>。この開口放出[[wikipedia:ja:時定数|時定数]]は開口放出を特徴づける大きな機能的指標であり（図1）、分子機構とも深く関連する。1-100ミリ秒で起きる速い開口放出の場合には、小胞と細胞膜が予め近接（ドック）している必要があり、更に、分泌関連タンパク質がある程度会合していることが予想される<ref name="ref1"><pubmed> 23073634 </pubmed></ref>。特に、1ミリ秒以下で開口放出の起きる超高速開口放出(ultrafast exocytosis)は[[シナプス前終末]]の[[アクティブゾーン]]でしか見られない<ref name="ref2"><pubmed>22794257 </pubmed></ref>。一方、100ミリ秒より遅い分泌については、分泌関連タンパク質は会合している必要はなく、また刺激後に小胞がドックするのでも十分間に合う。実際、大型有芯小胞の場合やシナプス小胞でも持続性の開口放出の場合は、刺激後に小胞がドックし、分泌関連タンパク質が会合するのが観察される。シナプス小胞の開口放出でも、持続的な反復刺激に対しては、細胞質に浮いている小胞のリサイクリングが開口放出を律速し、[[活動電位]]と開口放出のミリ秒の同期は消失する（図1）。この場合、持続的な細胞内Ca<sup>2+</sup>上昇が細胞質に浮いている小胞を刺激して開口放出を起こしていることになる。シナプス後部でも、[[長期増強]](LTP)刺激の際には、[[樹状突起]]細胞質にある小胞の開口放出によりグルタミン酸受容体の細胞膜への秒単位の挿入が起きる。 <br />
<br />
[[wikipedia:ja:内分泌細胞|内分泌細胞]]、[[wikipedia:ja:外分泌細胞|外分泌細胞]]や[[wikipedia:ja:血液|血液]]細胞の場合には、表面の小胞の細胞膜への融合だけでなく、膜融合が複数の小胞で複合的に進行することにより（複合型開口放出）、細胞質深層にある小胞がそのままの位置で細胞膜まで運ばれることなく開口放出し、貯蔵された小胞を効率よく放出する現象が見られる。これには、逐次的に内部に進行する様式（逐次開口放出）と先行して細胞質で融合してから開口放出に至る様式（多小胞性開口放出）がある。いずれも、神経でも用いられている可能性が指摘されている。 <br />
<br />
開口放出の初発過程は小胞膜と細胞膜という二つの[[wikipedia:ja:脂質二重膜|脂質二重膜]]の融合であり、この時に形成される脂質二重膜でできた小胞と細胞外を繋ぐ通り道のことを融合細孔(fusion pore)という<ref name="ref3"><pubmed>23245563 </pubmed></ref>。初期融合細孔は直径0.4nm位と推定され、ミリ秒の安定性を持ち、時々、再閉鎖、再開口したり、再閉鎖した結果そのまま小胞がエンドサイトーシスされることもある。直径50nm以下のシナプス小胞の場合、この初期融合細孔の数ミリ秒の開口で、神経伝達物質が放出されると推定される。これに対して、大型有芯小胞からのペプチドの分泌では、初期細孔を通ることはできずに、融合細孔が拡大し、最終的には小胞が細胞膜に平滑化する、完全融合が起きる<ref name="ref4"><pubmed>12193788 </pubmed></ref> 。 <br />
<br />
== 分子機構 ==<br />
<br />
[[Image:PVR figu 8.png|thumb|300px|'''図2．開口放出の多様性'''<br>cisSNARE複合体のNSFによる解離から、開口放出に至る分子過程とエネルギー地図と各分子の関与<ref name="ref1"><pubmed> 23073634 </pubmed></ref> ]] <br />
<br />
=== SNARE複合体 ===<br />
<br />
開口放出の根本過程は細胞膜にある[[T-SNARE分子]]と小胞にある[[V-SNARE]]の会合による（図2）。神経の代表的SNARE分子には、v-SNAREとして[[VAMP2]]、t-SNAREとして[[Syntaxin1|シンタキシン1]]と[[SNAP25]]がある。[[ボツリヌス毒素]]や[[破傷風毒素]]はSNAREを特異的に切断する活性を持ち、切断が起きると速い神経伝達はほぼ完全に阻害される。神経や分泌細胞でもSNAREの他のサブタイプが発現しており、遅い開口放出に関係している。複合化したSNAREは安定で、細胞膜に残りcis-SNARE複合体を形成する。[[NSF]]がSNAPを補因子として[[wikipedia:ATP|ATP]]依存的にSNARE分子を脱解離させる。こうして、遊離SNARE分子は会合するエネルギーを持って準備している。 <br />
<br />
=== プライミング分子 ===<br />
<br />
これらのSNARE分子の生理的な会合には、[[Munc18]]や[[Munc13]]の2つの分子が神経でも分泌細胞でも必須である。Munc18はシンタキシンと高親和性に結合し、シンタキシンの[[wikipedia:ja:分子シャペロン|分子シャペロン]]として働く。この結合状態ではシンタキシンは他のSNAREと結合できない。一方、Munc13はシンタキシンとMunc18の強い結合を解き、SNARE複合体の形成を促進する因子と考えられる。この作用様式がMunc13のサブタイプ(Munc13-1,2,3,4)により異なり、これが[[シナプス]]や分泌細胞の応答特異性に影響している可能性がある。Munc18はSNARE複合体とも結合し、そのサブタイプ(Munc18-a,b,c)によりSNAREサブタイプ特異的に結合能が異なり、SNAREサブタイプ間の結合特異性を決める因子として働く。SNARE分子の会合を促進する因子は[[プライミング分子]]を呼ばれる。Munc13、 Munc18の他に、[[CAPS]]、[[Snapin]]、[[Complexin]]などが知られている。これらの分子は刺激前に働いて準備状態を作ることも、後に働き開口放出の誘発に関係することもある。 <br />
<br />
=== カルシウムセンサー ===<br />
<br />
開口放出にカルシウム感受性を付与する分子（[[カルシウムセンサー]]）としては、[[シナプトタグミン]]や[[Doc2]]などの[[C2ドメイン]]を持つ分子の関与が濃厚である。特に、超高速開口放出にはシナプトタグミン1,2が関係している。これらの分子は、脂質2重膜との間でCa<sup>2+</sup>依存的な結合をする。Ca<sup>2+</sup>依存的な結合が、膜融合の直接的な引き金となっている可能性が高い。これらのCa<sup>2+</sup>センサーはcomplexinを介してSNAREと相互作用する。 <br />
<br />
=== アクティブゾーンタンパク質 ===<br />
<br />
アクティブゾーンには更に幾つかの分子([[Rim]], [[ELKS/CAST]], [[Liprin]], [[Bassoon]], [[Piccolo]], [[Neurexin]]など) が集積しており、この超分子的な集積がアクティブゾーンとしての微細構造を作っていると考えられる。中でも、Rimは[[膜電位依存性カルシウムチャネル]]の集積に関係し、チャネル開口部にできる高濃度カルシウム領域（[[カルシウムドメイン]]）による開口放出の高速調節に必須と考えられる。アクティブゾーンで見られる超高速開口放出には、SNARE分子が拡散的に会合する余裕はなく、既に近接して[[Trans-SNARE複合体|''trans''-SNARE複合体]]を形成していると考えられる。一方、SNAREが既に会合しきっていたのでは、刺激後に膜融合に必要な力が説明されないので、SNAREは特有な不安定な複合体状態をとっており、そのために超分子構造が使われていると考えられる。 <br />
<br />
=== 超高速開口放出と遅い開口放出 ===<br />
<br />
シナプスの超高速開口放出では、刺激後放出に至る時間が短いので、小胞はアクティブゾーン細胞膜にドックし、次に、プライミングという分子過程を経て、分泌準備完了状態となり、Ca<sup>2+</sup>刺激で膜融合が起きると考えるのが自然である。この分子的準備完了状態は正確にはどういうものか未解明である。この超高速開口放出が開口放出がモデルとして用いられ、普通の遅い開口放出も同一機転で起きることが想定されることが多い。 <br />
<br />
しかしながら、100ミリ秒より遅い普通の開口放出については、SNAREが拡散的に会合する時間があり、遅い開口放出は、刺激後にSNAREの拡散的な会合が起きれば、最も自然に説明される。遅い開口放出の刺激前の状態としては、t-SNAREだけ複合化した状態（binary-SNARE状態）やSNARE分子が全部分離した状態（unitary-SNARE状態）、更には、[[Cis-SNARE|''cis''-SNARE]]である状態が考えられている（図2）。この場合もCa<sup>2+</sup>依存性はシナプトタグミンと細胞膜の結合によりSNARE分子が会合し複合体を形成しやすくない機構が関与し得る。 <br />
<br />
更に、SNAREの[[リン酸化]]により、複合化が調節されている場合や、cAMPやCa<sup>2+</sup>刺激により、細胞質の小胞の運動性が増す。シナプス小胞の持続的分泌や自発的分泌では後者の機構の関与が考えられる。 <br />
<br />
== 関連項目 ==<br />
<br />
*[[SNARE複合体]]<br />
*[[アクティブゾーン]] <br />
*[[シナプス小胞]] <br />
*[[シナプス伝達]] <br />
*[[有芯小胞]]<br />
<br />
== 参考文献 ==<br />
<br />
<references /> <br />
<br />
<br> （執筆者：高橋倫子、河西春郎 担当編集委員：尾藤晴彦）</div>
Hkasai
https://bsd.neuroinf.jp/w/index.php?title=%E3%83%88%E3%83%BC%E3%82%AF:%E8%88%88%E5%A5%AE%E6%80%A7%E3%82%B7%E3%83%8A%E3%83%97%E3%82%B9&diff=22429
トーク:興奮性シナプス
2013-08-15T07:17:35Z
<p>Hkasai: /* 査読 河西 */ 新しい節</p>
<hr />
<div>==編集 林 作業記録==<br />
*内部リンク・外部リンク作成<br />
<br />
--[[利用者:WikiSysop|Yasunori Hayashi]] ([[利用者・トーク:WikiSysop|トーク]]) 2013年7月28日 (日) 04:23 (JST)<br />
<br />
== 査読 河西 ==<br />
<br />
酒井先生、八尾先生<br />
<br />
わかりやすい解説ありがとうございました。<br />
簡単に可塑性（短期・長期）について触れていただけないでしょうか。<br />
小胞の大きさは30nmのものがありますので、範囲を直しました。<br />
<br />
どうぞ、よろしくお願いいたします。<br />
<br />
河西春郎</div>
Hkasai
https://bsd.neuroinf.jp/w/index.php?title=%E8%88%88%E5%A5%AE%E6%80%A7%E3%82%B7%E3%83%8A%E3%83%97%E3%82%B9&diff=22428
興奮性シナプス
2013-08-15T07:08:07Z
<p>Hkasai: </p>
<hr />
<div><div align="right"> <br />
<font size="+1">[http://researchmap.jp/hippocampus-sak 酒井 誠一郎]</font><br><br />
''独立行政法人理化学研究所 脳科学総合研究センター''<br><br />
<font size="+1">[http://researchmap.jp/kurokan 八尾 寛]</font><br><br />
''東北大学 生命科学研究科''<br><br />
DOI [[XXXX]]/XXXX 原稿受付日：2013年7月16日 原稿完成日：2013年月日<br><br />
担当編集委員：[http://researchmap.jp/haruokasai 河西 春郎]（東京大学 大学院医学系研究科）<br><br />
</div><br />
<br />
英：excitatory synapse、独：exzitatorische Synapse、仏：synapses excitatrices<br />
<br />
{{box|text=<br />
興奮性[[シナプス]]とは、シナプス伝達によってシナプス後細胞を[[脱分極]]させ、[[活動電位]]の発火を促進するシナプス結合のことである。興奮性シナプスを形成するシナプス前細胞は、[[興奮性ニューロン]]と呼ばれる。<br />
}}<br />
<br />
==興奮性シナプスとは==<br />
{| class="wikitable" style="float:right"<br />
|+ 表1．''主な興奮性伝達物質と興奮性ニューロンの分布''<br />
|-<br />
| colspan="2" | '''末梢神経系'''<br />
|-<br />
| [[アセチルコリン]] || 運動神経、[[交感神経]][[節前線維]]、[[副交感神経]]<br />
|-<br />
| [[ノルアドレナリン]] || 交感神経節後線維<br />
|-<br />
| colspan="2" | '''中枢神経系'''<br />
|-<br />
| [[グルタミン酸]] || 中枢神経全般<br />
|-<br />
| colspan="2" | （以下は脳の広範囲に投射し、神経機能を調節）<br />
|-<br />
| アセチル[[コリン]] || [[前脳基底部]]、[[中脳]][[橋被蓋]]<br />
|-<br />
| [[ドーパミン]] || [[黒質]]緻密部、[[中脳腹側被蓋野]]など<br />
|-<br />
| ノルアドレナリン || [[青斑核]]、[[外側被蓋]]<br />
|-<br />
| [[アドレナリン]] || [[孤束核]]、背側[[縫線核]]<br />
|-<br />
| [[セロトニン]] || [[縫線核]]<br />
|-<br />
|}<br />
<br />
興奮性シナプスとは、シナプス後細胞の活動電位発生を促進させるシナプスのことである。興奮性のシナプス伝達によってシナプス後細胞が脱分極し、膜電位が[[閾値]]を超えると活動電位が発生する。 [[抑制性シナプス]]は、逆にシナプス後細胞の発火を抑える作用をする。興奮性シナプスを形成する[[シナプス前]]細胞を興奮性ューロン、抑制性シナプスを形成するシナプス前細胞を[[抑制性ニューロン]]と呼ぶ。<br />
<br />
シナプスは、[[ギャップ結合]]を介して電気シグナルを直接伝える[[電気シナプス]]と[[神経伝達物質]]を介して伝達を行う[[化学シナプス]]に分類される。いずれもシナプス前細胞の興奮をシナプス後細胞へと伝達するが、興奮性シナプスといった場合には興奮性の化学シナプスのことを指すことが多い。<br />
<br />
興奮性の化学シナプスでは、[[シナプス前終末]]から放出された神経伝達物質がシナプス後膜上の[[受容体]]に結合することでシナプス後細胞が脱分極する。神経細胞から放出され、作用する物質としての神経伝達物質の種類は100種類以上にも及ぶが、哺乳類の中枢神経系では[[グルタミン酸]]が、末梢神経系では[[アセチルコリン]]と[[ノルアドレナリン]]が主な興奮性神経伝達物質として用いられている（表1）。同じ神経伝達物質でも、シナプス後膜上の受容体の種類が違えばその作用も異なる。例えばアセチルコリンは、[[ニコチン受容体]]に結合するとシナプス後細胞を興奮させるが、[[ムスカリン受容体]]はサブタイプによって興奮作用を示すものと抑制作用を示すものがある<ref><pubmed> 6113545 </pubmed></ref> <ref><pubmed> 9647869 </pubmed></ref>。<br />
<br />
==構造==<br />
[[ファイル:興奮性シナプス.jpg|thumb|300 px|'''図1．興奮性シナプスの構造とシナプス伝達課程''']]<br />
<br />
興奮性の化学シナプスの基本的な構造は、神経伝達物質を内包する[[シナプス小胞]]がシナプス前終末に集積し、[[シナプス間隙]]を挟んで[[シナプス伝達物質|伝達物質]][[受容体]]の並ぶシナプス後膜と相対している（図1）。シナプス前終末には神経伝達が放出される[[アクティブゾーン]]があり、直径30-50 nmのシナプス小胞とともに、伝達物質の[[開口放出]]に必要な[[電位依存性カルシウムチャネル]]や[[SNAREタンパク質]]が集積している<ref><pubmed> 16336742 </pubmed></ref>。シナプス間隙はシナプス前終末と後細胞間の12-20 nmの隙間であり、開口放出された神経伝達物資はシナプス間隙を拡散してシナプス後膜上の受容体に結合する。<br />
<br />
シナプス後膜の直下にはシナプスの構造タンパク質や調節タンパク質が集積した[[シナプス後肥厚]]（postsynaptic [[density]]; [[PSD]]）と呼ばれる構造がある。興奮性シナプスはシナプス後肥厚が発達し、電子顕微鏡像において顕著に観察される<ref><pubmed> 13829103 </pubmed></ref>。<br />
<br />
興奮性シナプスの形態は、脳の多くの領域で見られるボタン状シナプスの他、[[網膜神経回路|網膜]]の[[リボンシナプス]]や、[[脳幹]]や[[毛様体神経節]]で見られる[[杯状シナプス]]など多岐にわたる<ref><pubmed> 16932936 </pubmed></ref>。ボタン状シナプスは、[[樹状突起]]に1 μm以下の間隔で密に並んだ[[スパイン]]と呼ばれる微細な突起にシナプスを形成している。多くの場合、単一のボタン状シナプスの入力による脱分極は大きくないが、一つの神経細胞に数千から数万も存在するスパインへのシナプス入力の加算によってシナプス後細胞で活動電位が発生する。アクティブゾーンに特殊な構造を持つリボンシナプス<ref><pubmed> 12575947 </pubmed></ref>や単一シナプスに複数のアクティブゾーンを持つ杯状シナプス<ref><pubmed> 12486149 </pubmed></ref>は、一度に多数のシナプス小胞が開口放出され、シナプス後細胞を強く興奮させる。<br />
<br />
==シナプス伝達過程==<br />
シナプス前細胞で発生した活動電位は[[軸索]]を伝播し、シナプス前終末に到達する。シナプス前終末では、活動電位による脱分極で[[電位依存性カルシウムチャネル]]が開き、[[カルシウムイオン]]が細胞内に流入する。カルシウムイオンが引き金となってアクティブゾーンに係留されていたシナプス小胞が[[細胞膜]]に融合し、シナプス小胞に内包されていた神経伝達物質がシナプス間隙に開口放出される。<br />
<br />
開口放出された神経伝達物質はシナプス間隙を拡散し、シナプス後細胞膜上の受容体に結合する。[[イオンチャネル共役型受容体]]の場合は、神経伝達物質の結合によって即座に[[イオンチャネル]]が開き、[[ナトリウム]]や[[カルシウム]]といった陽イオンが細胞内に流入することでシナプス後細胞が脱分極する。[[代謝活性型受容体]]の場合は、受容体への神経伝達物質結合によって[[GTP結合蛋白|Gタンパク質]]を介した細胞内シグナルが働き、受容体とは別に存在する[[カリウムチャネル]]等の開口状態が変化することで遅い時間スケールでの脱分極が起こる。<br />
<br />
==電気生理==<br />
興奮性シナプスにおいて神経伝達物質がイオンチャネル共役型受容体に結合すると陽イオンの[[wikipedia:ja:コンダクタンス|コンダクタンス]]が増加する。[[静止膜電位]]付近では、これら受容体の[[反転電位]]より細胞の[[膜電位]]は低いので、細胞外の陽イオンがシナプス後細胞に流入し膜電位は脱分極する。この膜電位変化を興奮性[[シナプス後電位]]（excitatory postsynaptic potential; EPSP）という。このとき電流は細胞の内側に向かって流れ、この内向きの電流を興奮性[[シナプス後電流]]（excitatory postsynaptic current; EPSC）と呼ぶ。また、細胞膜を横切って電流が流れることで細胞外電場にも変化が生じるので、興奮性[[シナプス後場電位]]（field EPSP; fEPSP）として観測することができる。<br />
<br />
代謝活性型受容体では、カリウムコンダクタンスの低下による[[遅いシナプス後電位]]と細胞膜の電気抵抗の増加が観察される。<br />
<br />
==関連項目==<br />
*[[興奮性ニューロン]] <br />
*[[シナプス]] <br />
*[[神経伝達物質]]<br />
*[[抑制性シナプス]]<br />
*[[シナプス後肥厚]]<br />
*[[長期増強]]<br />
*[[長期抑圧]]<br />
<br />
==参考文献==<br />
<references/></div>
Hkasai
https://bsd.neuroinf.jp/w/index.php?title=%E8%88%88%E5%A5%AE%E6%80%A7%E3%82%B7%E3%83%8A%E3%83%97%E3%82%B9&diff=22427
興奮性シナプス
2013-08-15T07:05:13Z
<p>Hkasai: </p>
<hr />
<div><div align="right"> <br />
<font size="+1">[http://researchmap.jp/hippocampus-sak 酒井 誠一郎]</font><br><br />
''独立行政法人理化学研究所 脳科学総合研究センター''<br><br />
<font size="+1">[http://researchmap.jp/kurokan 八尾 寛]</font><br><br />
''東北大学 生命科学研究科''<br><br />
DOI [[XXXX]]/XXXX 原稿受付日：2013年7月16日 原稿完成日：2013年月日<br><br />
担当編集委員：[http://researchmap.jp/haruokasai 河西 春郎]（東京大学 大学院医学系研究科）<br><br />
</div><br />
<br />
英：excitatory synapse、独：exzitatorische Synapse、仏：synapses excitatrices<br />
<br />
{{box|text=<br />
興奮性[[シナプス]]とは、シナプス伝達によってシナプス後細胞を[[脱分極]]させ、[[活動電位]]の発火を促進するシナプス結合のことである。興奮性シナプスを形成するシナプス前細胞は、[[興奮性ニューロン]]と呼ばれる。<br />
}}<br />
<br />
==興奮性シナプスとは==<br />
{| class="wikitable" style="float:right"<br />
|+ 表1．''主な興奮性伝達物質と興奮性ニューロンの分布''<br />
|-<br />
| colspan="2" | '''末梢神経系'''<br />
|-<br />
| [[アセチルコリン]] || 運動神経、[[交感神経]][[節前線維]]、[[副交感神経]]<br />
|-<br />
| [[ノルアドレナリン]] || 交感神経節後線維<br />
|-<br />
| colspan="2" | '''中枢神経系'''<br />
|-<br />
| [[グルタミン酸]] || 中枢神経全般<br />
|-<br />
| colspan="2" | （以下は脳の広範囲に投射し、神経機能を調節）<br />
|-<br />
| アセチル[[コリン]] || [[前脳基底部]]、[[中脳]][[橋被蓋]]<br />
|-<br />
| [[ドーパミン]] || [[黒質]]緻密部、[[中脳腹側被蓋野]]など<br />
|-<br />
| ノルアドレナリン || [[青斑核]]、[[外側被蓋]]<br />
|-<br />
| [[アドレナリン]] || [[孤束核]]、背側[[縫線核]]<br />
|-<br />
| [[セロトニン]] || [[縫線核]]<br />
|-<br />
|}<br />
<br />
興奮性シナプスとは、シナプス後細胞の活動電位発生を促進させるシナプスのことである。興奮性のシナプス伝達によってシナプス後細胞が脱分極し、膜電位が[[閾値]]を超えると活動電位が発生する。 [[抑制性シナプス]]は、逆にシナプス後細胞の発火を抑える作用をする。興奮性シナプスを形成する[[シナプス前]]細胞を興奮性ューロン、抑制性シナプスを形成するシナプス前細胞を[[抑制性ニューロン]]と呼ぶ。<br />
<br />
シナプスは、[[ギャップ結合]]を介して電気シグナルを直接伝える[[電気シナプス]]と[[神経伝達物質]]を介して伝達を行う[[化学シナプス]]に分類される。いずれもシナプス前細胞の興奮をシナプス後細胞へと伝達するが、興奮性シナプスといった場合には興奮性の化学シナプスのことを指すことが多い。<br />
<br />
興奮性の化学シナプスでは、[[シナプス前終末]]から放出された神経伝達物質がシナプス後膜上の[[受容体]]に結合することでシナプス後細胞が脱分極する。神経細胞から放出され、作用する物質としての神経伝達物質の種類は100種類以上にも及ぶが、哺乳類の中枢神経系では[[グルタミン酸]]が、末梢神経系では[[アセチルコリン]]と[[ノルアドレナリン]]が主な興奮性神経伝達物質として用いられている（表1）。同じ神経伝達物質でも、シナプス後膜上の受容体の種類が違えばその作用も異なる。例えばアセチルコリンは、[[ニコチン受容体]]に結合するとシナプス後細胞を興奮させるが、[[ムスカリン受容体]]はサブタイプによって興奮作用を示すものと抑制作用を示すものがある<ref><pubmed> 6113545 </pubmed></ref> <ref><pubmed> 9647869 </pubmed></ref>。<br />
<br />
==構造==<br />
[[ファイル:興奮性シナプス.jpg|thumb|300 px|'''図1．興奮性シナプスの構造とシナプス伝達課程''']]<br />
<br />
興奮性の化学シナプスの基本的な構造は、神経伝達物質を内包する[[シナプス小胞]]がシナプス前終末に集積し、[[シナプス間隙]]を挟んで[[シナプス伝達物質|伝達物質]][[受容体]]の並ぶシナプス後膜と相対している（図1）。シナプス前終末には神経伝達が放出される[[アクティブゾーン]]があり、直径40-50 nmのシナプス小胞とともに、伝達物質の[[開口放出]]に必要な[[電位依存性カルシウムチャネル]]や[[SNAREタンパク質]]が集積している<ref><pubmed> 16336742 </pubmed></ref>。シナプス間隙はシナプス前終末と後細胞間の12-20 nmの隙間であり、開口放出された神経伝達物資はシナプス間隙を拡散してシナプス後膜上の受容体に結合する。<br />
<br />
シナプス後膜の直下にはシナプスの構造タンパク質や調節タンパク質が集積した[[シナプス後肥厚]]（postsynaptic [[density]]; [[PSD]]）と呼ばれる構造がある。興奮性シナプスはシナプス後肥厚が発達し、電子顕微鏡像において顕著に観察される<ref><pubmed> 13829103 </pubmed></ref>。<br />
<br />
興奮性シナプスの形態は、脳の多くの領域で見られるボタン状シナプスの他、[[網膜神経回路|網膜]]の[[リボンシナプス]]や、[[脳幹]]や[[毛様体神経節]]で見られる[[杯状シナプス]]など多岐にわたる<ref><pubmed> 16932936 </pubmed></ref>。ボタン状シナプスは、[[樹状突起]]に1 μm以下の間隔で密に並んだ[[スパイン]]と呼ばれる微細な突起にシナプスを形成している。多くの場合、単一のボタン状シナプスの入力による脱分極は大きくないが、一つの神経細胞に数千から数万も存在するスパインへのシナプス入力の加算によってシナプス後細胞で活動電位が発生する。アクティブゾーンに特殊な構造を持つリボンシナプス<ref><pubmed> 12575947 </pubmed></ref>や単一シナプスに複数のアクティブゾーンを持つ杯状シナプス<ref><pubmed> 12486149 </pubmed></ref>は、一度に多数のシナプス小胞が開口放出され、シナプス後細胞を強く興奮させる。<br />
<br />
==シナプス伝達過程==<br />
シナプス前細胞で発生した活動電位は[[軸索]]を伝播し、シナプス前終末に到達する。シナプス前終末では、活動電位による脱分極で[[電位依存性カルシウムチャネル]]が開き、[[カルシウムイオン]]が細胞内に流入する。カルシウムイオンが引き金となってアクティブゾーンに係留されていたシナプス小胞が[[細胞膜]]に融合し、シナプス小胞に内包されていた神経伝達物質がシナプス間隙に開口放出される。<br />
<br />
開口放出された神経伝達物質はシナプス間隙を拡散し、シナプス後細胞膜上の受容体に結合する。[[イオンチャネル共役型受容体]]の場合は、神経伝達物質の結合によって即座に[[イオンチャネル]]が開き、[[ナトリウム]]や[[カルシウム]]といった陽イオンが細胞内に流入することでシナプス後細胞が脱分極する。[[代謝活性型受容体]]の場合は、受容体への神経伝達物質結合によって[[GTP結合蛋白|Gタンパク質]]を介した細胞内シグナルが働き、受容体とは別に存在する[[カリウムチャネル]]等の開口状態が変化することで遅い時間スケールでの脱分極が起こる。<br />
<br />
==電気生理==<br />
興奮性シナプスにおいて神経伝達物質がイオンチャネル共役型受容体に結合すると陽イオンの[[wikipedia:ja:コンダクタンス|コンダクタンス]]が増加する。[[静止膜電位]]付近では、これら受容体の[[反転電位]]より細胞の[[膜電位]]は低いので、細胞外の陽イオンがシナプス後細胞に流入し膜電位は脱分極する。この膜電位変化を興奮性[[シナプス後電位]]（excitatory postsynaptic potential; EPSP）という。このとき電流は細胞の内側に向かって流れ、この内向きの電流を興奮性[[シナプス後電流]]（excitatory postsynaptic current; EPSC）と呼ぶ。また、細胞膜を横切って電流が流れることで細胞外電場にも変化が生じるので、興奮性[[シナプス後場電位]]（field EPSP; fEPSP）として観測することができる。<br />
<br />
代謝活性型受容体では、カリウムコンダクタンスの低下による[[遅いシナプス後電位]]と細胞膜の電気抵抗の増加が観察される。<br />
<br />
==関連項目==<br />
*[[興奮性ニューロン]] <br />
*[[シナプス]] <br />
*[[神経伝達物質]]<br />
*[[抑制性シナプス]]<br />
*[[シナプス後肥厚]]<br />
*[[長期増強]]<br />
*[[長期抑圧]]<br />
<br />
==参考文献==<br />
<references/></div>
Hkasai
https://bsd.neuroinf.jp/w/index.php?title=%E7%B5%90%E5%90%88%E5%AE%9A%E6%95%B0&diff=21683
結合定数
2013-07-13T12:07:52Z
<p>Hkasai: </p>
<hr />
<div>英語名：Binding constant <br />
<br />
同義語：会合定数 Association constant、親和定数 Affinity constant <br />
<br />
結合定数とは、ある分子Aと別の分子Bが[[wikipedia:ja:非共有結合|非共有結合]]（[[wikipedia:ja:水素結合|水素結合]]、[[wikipedia:ja:疎水結合|疎水結合]]、[[wikipedia:ja:イオン結合|イオン結合]]など）により結合／解離の[[wikipedia:ja:平衡反応|平衡反応]]を生じる場合に、当該分子間の結合力を数値で表す指標である。低分子量化合物（[[生理活性物質]]や薬物など）の[[受容体]]タンパク質や[[wikipedia:ja:血漿|血漿]]タンパク質等への結合の解析、およびタンパク質-タンパク質間相互作用の解析などで用いられる。 <br />
<br />
==定義==<br />
<br />
<math>A + B \rightleftarrows AB</math> ・・・・・(1)<br />
<br />
分子Aと分子Bとの結合／解離について上記(1)の平衡反応が成立する場合、平衡状態における遊離型の分子A、遊離型の分子Bおよび結合型ABのモル濃度をそれぞれ[A]、[B]、[AB]とすると、結合定数K<sub>B</sub>（単位：M<sup>−1</sup>）は以下の式で表される。 <br />
<br />
<math>K_B = \frac{[AB]}{[A][B]} </math> ・・・・・(2) <br />
<br />
==解離定数==<br />
<br />
平衡反応(1)を、結合型ABから遊離型のAおよびBへの解離反応（AB ⇄ A + B）として捉えた場合の平衡定数が解離定数K<sub>D</sub>（単位：M）である。すなわち、結合定数の逆数が解離定数となる。 <br />
<br />
<math>K_D = \frac{1}{K_B} = \frac{[A][B]}{[AB]}</math><br />
<br />
受容体等のタンパク質に対する[[リガンド]]の結合の解析においては、一般に結合定数よりも解離定数のほうがよく用いられる。また解離定数は、[[wikipedia:ja:酸|酸]]／[[wikipedia:ja:塩基|塩基]]の解離反応（[[wikipedia:ja:イオン化反応|イオン化反応]]：例えばCH<sub>3</sub>COOH ⇄ H<sup>+</sup> + CH<sub>3</sub>COO<sup>−</sup>）を記述する際にも用いられる。 <br />
<br />
==結合定数／解離定数の求め方==<br />
<br />
===Scatchardプロット === <br />
[[Image:1-scatch.jpg|thumb|250px|'''図1．Scatchardプロットの一例''']]<br />
<br />
受容体等のタンパク質へのリガンドの結合を解析する際に用いられてきた古典的手法である<ref>'''田中千賀子、加藤隆一編'''<br>NEW薬理学 改訂第6版<br>''南江堂（東京）'':2011</ref>。受容体Bに対するリガンドAの結合を考えるとき、受容体総濃度B<sub>max</sub> = (非結合型のBの濃度) + (Aの結合したBの濃度) = [B] + [AB]であり、これを式(2)に代入すると <br />
<br />
<math>K_B = \frac{[AB]}{[A](B_{max}-[AB])} </math><br />
<br />
これを変形すると <br />
<br />
<math>\frac{[AB]}{[A]} = K_B(B_{max}-[AB])</math> ・・・・・(3) <br />
<br />
Scatchard解析では慣例的に以下の記号を用いる。 <br />
<br />
B（Boundの意）：リガンドA-受容体Bの複合体の濃度(= [AB]) <br />
<br />
F (Freeの意)：遊離型のリガンドAの濃度 (= [A]) <br />
<br />
これらの記号を用いると、式(3)は以下のように書き換えられる。 <br />
<br />
<math>\frac{B}{F} = K_B(B_{max}-B)</math><br />
<br />
Bを横軸、B／Fを縦軸にとると直線関係が得られ、その傾き(= −K<sub>B</sub>)よりK<sub>B</sub>が求められる（図1）。性質の異なる複数の結合が存在する場合には、プロットは複数の直線が合成された形の曲線となる。 <br />
<br />
Scatchardプロットの作成に必要なBおよびFの値は、<sup>3</sup>Hや<sup>125</sup>Iなどの放射性同位元素で標識したリガンドを用いた結合実験により測定できる。結合型と遊離型のリガンドを分離する手法としては、低分子量化合物のみを通す[[wikipedia:ja:半透膜|透析膜]]を用いた平衡透析法や、一定以上の分子量のものを通さない[[wikipedia:ja:逆浸透膜|限外ろ過膜]]を用いた限外ろ過法などがある。 <br />
<br />
===等温滴定熱量測定=== <br />
[[Image:2-ITC.jpg|thumb|250px|'''図2．等温滴定熱量測定により得られる結合等温線の一例''']] <br />
<br />
Isothermal titration calorimetry (ITC) <ref>'''織田昌幸'''<br>等温滴定熱測定.<br>''蛋[[白質]]科学会アーカイブ #30'':2008</ref><br />
<br />
分子同士が結合する際に発生する（もしくは吸収される）微小な熱量を一定温度下で測定することにより、当該分子間相互作用の[[wikipedia:ja:熱力学|熱力学]]的プロファイル（結合定数を含む）を精度良く得る手法である。測定対象分子の化学修飾や固定化が不要であり、自然な状態に近い条件下での測定が可能である。実際の測定では、一方の分子の溶液に他方の分子の溶液を一定量ずつ滴下し、その際に生じた熱量変化を測定することで結合等温線（図2）が得られる。この曲線の回帰パラメータより結合定数が求められる。<br />
<br />
===表面プラズモン共鳴=== <br />
[[Image:3-SPR.jpg|thumb|250px|'''図3．表面プラズモン共鳴分析の一例''']]<br />
<br />
Surface plasmon resonance (SPR)分析 <ref>'''津本浩平'''<br>タンパク質相互作用解析：等温滴定型熱量測定と表面プラズモン共鳴.<br>''生物工学会誌89(7);391-394'':2011</ref><br />
<br />
センサーチップ上で分子間相互作用をリアルタイムに測定し、分子間の結合／解離のパラメータを得る手法である。金(Au)の薄膜を蒸着させたセンサーチップ上に一方の分子B（リガンド）を固定化しておき、他方の分子A（アナライト）の溶液を一定時間灌流する。AとBの結合によって生じる微量の質量変化をSPRシグナルとして検出し（図3）、その測定値から結合反応（A + B → AB）の速度定数 k<sub>on</sub> を得る。その後、アナライトを含まない[[wikipedia:ja:緩衝液|緩衝液]]を灌流するとSPRシグナルが減衰し、これにより解離反応（AB → A + B）の速度定数 k<sub>off</sub> が得られる。このとき、結合定数 K<sub>B</sub> = k<sub>on</sub>／k<sub>off</sub> である。 <br />
<br />
===定量的Förster resonance energy transfer (FRET) 解析===<br />
<br />
FRETは、タンパク質間相互作用の有無を検出する際に盛んに用いられるようになってきた手法の１つであり、解離定数・結合定数の測定にも応用可能である <ref><pubmed> 22711490 </pubmed></ref><ref><pubmed> 21595867 </pubmed></ref>。対象とする2つの分子それぞれを蛍光色素や蛍光タンパク質（一方が蛍光のドナー、他方が蛍光のアクセプターとなるもの）で標識しておくと、両分子が結合した際にドナー-アクセプター間のFRETが生じる。遊離ドナー由来の蛍光シグナル、遊離アクセプター由来の蛍光シグナル、およびFRETシグナルを定量的に解析することで、当該分子間の結合の解離定数・結合定数を求めることができる。<br />
<br />
== 関連項目 ==<br />
*[[解離定数]] Dissociation constant<br />
<br />
==参考文献==<br />
<references /> <br />
<br />
<br />
（執筆者：香月博志 担当編集委員：河西春郎）</div>
Hkasai
https://bsd.neuroinf.jp/w/index.php?title=%E7%B5%90%E5%90%88%E5%AE%9A%E6%95%B0&diff=21682
結合定数
2013-07-13T12:07:15Z
<p>Hkasai: </p>
<hr />
<div>英語名：Binding constant <br />
<br />
同義語：会合定数 Association constant、親和定数 Affinity constant <br />
<br />
結合定数とは、ある分子Aと別の分子Bが[[wikipedia:ja:非共有結合|非共有結合]]（[[wikipedia:ja:水素結合|水素結合]]、[[wikipedia:ja:疎水結合|疎水結合]]、[[wikipedia:ja:イオン結合|イオン結合]]など）により結合／解離の[[wikipedia:ja:平衡反応|平衡反応]]を生じる場合に、当該分子間の結合力を数値で表す指標である。低分子量化合物（[[生理活性物質]]や薬物など）の[[受容体]]タンパク質や[[wikipedia:ja:血漿|血漿]]タンパク質等への結合の解析、およびタンパク質-タンパク質間相互作用の解析などで用いられる。 <br />
<br />
==定義==<br />
<br />
<math>A + B \rightleftarrows AB</math> ・・・・・(1)<br />
<br />
分子Aと分子Bとの結合／解離について上記(1)の平衡反応が成立する場合、平衡状態における遊離型の分子A、遊離型の分子Bおよび結合型ABのモル濃度をそれぞれ[A]、[B]、[AB]とすると、結合定数K<sub>B</sub>（単位：M<sup>−1</sup>）は以下の式で表される。 <br />
<br />
<math>K_B = \frac{[AB]}{[A][B]} </math> ・・・・・(2) <br />
<br />
==解離定数==<br />
<br />
平衡反応(1)を、結合型ABから遊離型のAおよびBへの解離反応（AB ⇄ A + B）として捉えた場合の平衡定数が解離定数K<sub>D</sub>（単位：M）である。すなわち、結合定数の逆数が解離定数となる。 <br />
<br />
<math>K_D = \frac{1}{K_B} = \frac{[A][B]}{[AB]}</math><br />
<br />
受容体等のタンパク質に対する[[リガンド]]の結合の解析においては、一般に結合定数よりも解離定数のほうがよく用いられる。また解離定数は、[[wikipedia:ja:酸|酸]]／[[wikipedia:ja:塩基|塩基]]の解離反応（[[wikipedia:ja:イオン化反応|イオン化反応]]：例えばCH<sub>3</sub>COOH ⇄ H<sup>+</sup> + CH<sub>3</sub>COO<sup>−</sup>）を記述する際にも用いられる。 <br />
<br />
==結合定数／解離定数の求め方==<br />
<br />
===Scatchardプロット === <br />
[[Image:1-scatch.jpg|thumb|250px|'''図1．Scatchardプロットの一例''']]<br />
<br />
受容体等のタンパク質へのリガンドの結合を解析する際に用いられてきた古典的手法である<ref>'''田中千賀子、加藤隆一編'''<br>NEW薬理学 改訂第6版<br>''南江堂（東京）'':2011</ref>。受容体Bに対するリガンドAの結合を考えるとき、受容体総濃度B<sub>max</sub> = (非結合型のBの濃度) + (Aの結合したBの濃度) = [B] + [AB]であり、これを式(2)に代入すると <br />
<br />
<math>K_B = \frac{[AB]}{[A](B_{max}-[AB])} </math><br />
<br />
これを変形すると <br />
<br />
<math>\frac{[AB]}{[A]} = K_B(B_{max}-[AB])</math> ・・・・・(3) <br />
<br />
Scatchard解析では慣例的に以下の記号を用いる。 <br />
<br />
B（Boundの意）：リガンドA-受容体Bの複合体の濃度(= [AB]) <br />
<br />
F (Freeの意)：遊離型のリガンドAの濃度 (= [A]) <br />
<br />
これらの記号を用いると、式(3)は以下のように書き換えられる。 <br />
<br />
<math>\frac{B}{F} = K_B(B_{max}-B)</math><br />
<br />
Bを横軸、B／Fを縦軸にとると直線関係が得られ、その傾き(= −K<sub>B</sub>)よりK<sub>B</sub>が求められる（図1）。性質の異なる複数の結合が存在する場合には、プロットは複数の直線が合成された形の曲線となる。 <br />
<br />
Scatchardプロットの作成に必要なBおよびFの値は、<sup>3</sup>Hや<sup>125</sup>Iなどの放射性同位元素で標識したリガンドを用いた結合実験により測定できる。結合型と遊離型のリガンドを分離する手法としては、低分子量化合物のみを通す[[wikipedia:ja:半透膜|透析膜]]を用いた平衡透析法や、一定以上の分子量のものを通さない[[wikipedia:ja:逆浸透膜|限外ろ過膜]]を用いた限外ろ過法などがある。 <br />
<br />
===等温滴定熱量測定=== <br />
[[Image:2-ITC.jpg|thumb|250px|'''図2．等温滴定熱量測定により得られる結合等温線の一例''']] <br />
<br />
Isothermal titration calorimetry (ITC) <ref>'''織田昌幸'''<br>等温滴定熱測定.<br>''蛋[[白質]]科学会アーカイブ #30'':2008</ref><br />
<br />
分子同士が結合する際に発生する（もしくは吸収される）微小な熱量を一定温度下で測定することにより、当該分子間相互作用の[[wikipedia:ja:熱力学|熱力学]]的プロファイル（結合定数を含む）を精度良く得る手法である。測定対象分子の化学修飾や固定化が不要であり、自然な状態に近い条件下での測定が可能である。実際の測定では、一方の分子の溶液に他方の分子の溶液を一定量ずつ滴下し、その際に生じた熱量変化を測定することで結合等温線（図2）が得られる。この曲線の回帰パラメータより結合定数が求められる。<br />
<br />
===表面プラズモン共鳴=== <br />
[[Image:3-SPR.jpg|thumb|250px|'''図3．表面プラズモン共鳴分析の一例''']]<br />
<br />
Surface plasmon resonance (SPR)分析 <ref>'''津本浩平'''<br>タンパク質相互作用解析：等温滴定型熱量測定と表面プラズモン共鳴.<br>''生物工学会誌89(7);391-394'':2011</ref><br />
<br />
センサーチップ上で分子間相互作用をリアルタイムに測定し、分子間の結合／解離のパラメータを得る手法である。金(Au)の薄膜を蒸着させたセンサーチップ上に一方の分子B（リガンド）を固定化しておき、他方の分子A（アナライト）の溶液を一定時間灌流する。AとBの結合によって生じる微量の質量変化をSPRシグナルとして検出し（図3）、その測定値から結合反応（A + B → AB）の速度定数 k<sub>on</sub> を得る。その後、アナライトを含まない[[wikipedia:ja:緩衝液|緩衝液]]を灌流するとSPRシグナルが減衰し、これにより解離反応（AB → A + B）の速度定数 k<sub>off</sub> が得られる。このとき、結合定数 K<sub>B</sub> = k<sub>on</sub>／k<sub>off</sub> である。 <br />
<br />
===定量的Förster resonance energy transfer (FRET) 解析===<br />
<br />
FRETは、タンパク質間相互作用の有無を検出する際に盛んに用いられるようになってきた手法の１つであり、解離定数・結合定数の測定にも応用可能である</ref> <ref><pubmed> 22711490 </pubmed></ref><ref><pubmed> 21595867 </pubmed>。対象とする2つの分子それぞれを蛍光色素や蛍光タンパク質（一方が蛍光のドナー、他方が蛍光のアクセプターとなるもの）で標識しておくと、両分子が結合した際にドナー-アクセプター間のFRETが生じる。遊離ドナー由来の蛍光シグナル、遊離アクセプター由来の蛍光シグナル、およびFRETシグナルを定量的に解析することで、当該分子間の結合の解離定数・結合定数を求めることができる。<br />
<br />
== 関連項目 ==<br />
*[[解離定数]] Dissociation constant<br />
<br />
==参考文献==<br />
<references /> <br />
<br />
<br />
（執筆者：香月博志 担当編集委員：河西春郎）</div>
Hkasai
https://bsd.neuroinf.jp/w/index.php?title=%E3%83%88%E3%83%BC%E3%82%AF:%E8%A8%98%E6%86%B6%E7%97%95%E8%B7%A1&diff=20900
トーク:記憶痕跡
2013-06-02T18:27:58Z
<p>Hkasai: </p>
<hr />
<div>==編集 林 作業記録==<br />
*内部リンク・外部リンク作成<br />
*辞書としての性質から、研究の歴史を辿るよりも事実を中心とした記述の方が読みやすいかと思います。<br />
*小見出しを御願いします。<br />
*抄録を御願い致します。<br />
*記憶痕跡=神経[[細胞集成体]]と読めますが、シナプスも記憶痕跡の最小単位かと思います。<br />
<br />
--[[利用者:WikiSysop|Yasunori Hayashi]] 2013年5月6日 (月) 11:12 (JST)<br />
<br />
<br />
<br />
鈴木章円先生、大川宜昭先生、井ノ口馨先生<br />
<br />
とても丁寧な解説ありがとございます。勉強になります。<br />
林先生のコメントにもありますが、<br />
特定の神経細胞のセットがなぜ痕跡になるのかを考えていくと、結合に関するより小さな構造、細胞全体だけでなく、シナプスを考える必要があることを付け加えていただいた方がLTPともつながりわかりやすくなるように思いました。<br />
<br />
また、図３の中の文字は小さすぎて拡大しても見えませんので、読みやすいような大きさにしていただければ幸いです。<br />
<br />
お手数ですが、ご改訂よろしくお願いいたします。<br />
<br />
河西春郎</div>
Hkasai
https://bsd.neuroinf.jp/w/index.php?title=%E3%83%88%E3%83%BC%E3%82%AF:%E8%A8%98%E6%86%B6%E7%97%95%E8%B7%A1&diff=20899
トーク:記憶痕跡
2013-06-02T18:26:57Z
<p>Hkasai: </p>
<hr />
<div>==編集 林 作業記録==<br />
*内部リンク・外部リンク作成<br />
*辞書としての性質から、研究の歴史を辿るよりも事実を中心とした記述の方が読みやすいかと思います。<br />
*小見出しを御願いします。<br />
*抄録を御願い致します。<br />
*記憶痕跡=神経[[細胞集成体]]と読めますが、シナプスも記憶痕跡の最小単位かと思います。<br />
<br />
--[[利用者:WikiSysop|Yasunori Hayashi]] 2013年5月6日 (月) 11:12 (JST)<br />
<br />
<br />
<br />
鈴木章円先生、大川宜昭先生、井ノ口馨先生<br />
<br />
とても丁寧な解説ありがとございます。勉強になります。<br />
林先生のコメントにもありますが、<br />
特定の神経細胞のセットがなぜ痕跡になるのかを考えていくと、結合に関するより小さな構造、細胞全体だけでなく、シナプスを考える必要があることを付け加えていただいた方がLTPともつながりわかりやすくなるように思いました。<br />
<br />
また、図２の中の文字は小さすぎて拡大しても見えませんので、読みやすいような大きさにしていただければ幸いです。<br />
<br />
お手数ですが、ご改訂よろしくお願いいたします。<br />
<br />
河西春郎</div>
Hkasai
https://bsd.neuroinf.jp/w/index.php?title=%E3%83%88%E3%83%BC%E3%82%AF:%E7%B5%90%E5%90%88%E5%AE%9A%E6%95%B0&diff=20898
トーク:結合定数
2013-06-02T18:00:08Z
<p>Hkasai: ページの作成:「 香月先生 大変、明快で具体的な解説ありがとうございました。 結合定数の測定法としては溶液中ではITCがありますが、とて...」</p>
<hr />
<div><br />
香月先生<br />
<br />
大変、明快で具体的な解説ありがとうございました。<br />
結合定数の測定法としては溶液中ではITCがありますが、とても測定が微妙であるということがあり、<br />
FRETを用いる方法もあることもご記載いただけますと助けになるかと存じます。<br />
引用としてはたとえば Takao et al. JN 25(2005)3107 PMID: 15788767 があります。<br />
<br />
お手数で恐縮ですが、この点のご改訂をいただけますと幸いに存じます。<br />
<br />
河西春郎</div>
Hkasai
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FM1-43
2013-04-28T02:15:58Z
<p>Hkasai: /* シナプス前終末における小胞プールの大きさと開口放出確率の測定 */</p>
<hr />
<div>{{Chembox<br />
| ImageFile = FM1-43.png<br />
| ImageSize = 220px<br />
| ImageAlt = <br />
| IUPACName = 3-[4-[2-[4-(dibutylamino)phenyl]ethenyl]pyridin-1-ium-1-yl]propyl-triethylazanium dibromide<br />
| OtherNames = Frie Mao 1-43, SynaptoGreen™ Reagent, SureCN1527120, N-(3-Triethylammoniumpropyl)-4-(p-dibutylaminostyryl)pyridinium, 2Br<br />
| Section1 = {{Chembox Identifiers<br />
| CASNo = 149838-22-2<br />
| PubChem = 2733618<br />
| SMILES =CCCCN(CCCC)C1=CC=C(C=C1)C=CC2=CC=[N+](C=C2)CCC[N+](CC)(CC)CC.[Br-].[Br-] }}<br />
| Section2 = {{Chembox Properties<br />
| Formula = C30H49Br2N3<br />
| MolarMass = 611.53816<br />
| Appearance = <br />
| Density = <br />
| MeltingPt = <br />
| BoilingPt = <br />
| Solubility = }}<br />
| Section3 = {{Chembox Hazards<br />
| MainHazards = <br />
| FlashPt = <br />
| Autoignition = }}<br />
}} <br />
<br />
FM 色素は[[wikipedia:ja:脂質二重層|脂質二重膜]]を可逆的に染める蛍光色素で、[[シナプス前終末]]の機能や[[wikipedia:ja:分泌|分泌]]現象の計測に活用されている。 <br />
<br />
== FM1-43とは ==<br />
<br />
[[Image:Takahashinoriko fig 1.jpg|thumb|250px|'''図1. FM 色素による還流と細胞膜の蛍光標識'''<br>FM 色素液で細胞を還流すると細胞外膜が蛍光を発する。]] Molecular Probe 社の Fei Mao は William J Betz らとともに、[[細胞膜]]を染める一連のスチリル色素を合成した。これらを FM (Fei Mao)色素と呼び、FM1-43 はその代表格である。[[シナプス前終末]]の機能解析や、[[分泌小胞]]の動態解析に広く用いられる。 <br />
<br />
色素の特性として次の3つの性質がある。 <br />
<br />
#水溶液中に存在する場合に比べ、細胞膜に結合すると[[wikipedia:ja:量子効率|量子効率]]が著増し、強い[[wikipedia:ja:蛍光|蛍光]]を出す。 <br />
#[[wikipedia:ja:脂質二重層|脂質二重膜]]を透過しない。 <br />
#[[wikipedia:ja:両親媒性分子|両親媒性]]で可逆的に膜を染める。<br />
<br />
== 分子構造 ==<br />
<br />
[[Image:Takahashinoriko fig 2.jpg|thumb|250px|'''図2. FM 色素群の分子構造'''<br>二重結合の数は色調に、炭素鎖の数は細胞膜との親和性や蛍光強度に関連する。]] 構造は、[[wikipedia:ja:親水性|親水性]]領域、[[wikipedia:ja:二重結合|二重結合]]領域、[[wikipedia:ja:疎水性|疎水性]]炭素鎖領域に分けられる。 <br />
<br />
親水性領域が正の電荷をもつため、膜を通過しない。二重結合の数は蛍光波長に関連する。 <br />
<br />
二重結合が一つの FM1-43、FM1-84、FM2-10 は黄色蛍光を呈し、二重結合が二つの FM4-64、FM5-95 は赤色蛍光を呈する。 <br />
<br />
疎水性炭素鎖の長さは細胞膜の染め方に関連し、長いものほど明るく、一旦膜に組み込まれると離脱しがたい<ref><pubmed> 10202529 </pubmed></ref>。 FM1-43 の炭素鎖数は 4であり、解離時定数τ<sub>diss</sub>は 8 msを示す。より短いFM2-10(炭素鎖数 2)は、比較的離脱しやすい(τ<sub>diss</sub>=6.4 ms)。逆に、より長い FM1-84（炭素鎖数 5）は離脱に時間がかかる(τ<sub>diss</sub>=36 ms)<ref><pubmed> 19580748 </pubmed></ref>。 <br />
<br />
== 蛍光特性 ==<br />
<br />
FM1-43の[[wikipedia:ja:励起状態|励起]]には1光子では波長 480 nm光、2光子では波長 840 nm光が頻用される。 <br />
<br />
蛍光強度は[[wikipedia:ja:リポソーム|リポソーム]]中では 580 nmで最大となる。 <br />
<br />
波長 480nm光の高出力励起（～150 μW）にて[[wikipedia:3,3'-Diaminobenzidine|ジアミノベンチジン]]（DAB）の光変換（photoconversion） を起こす。そのため、[[wikipedia:ja:アルデヒド|アルデヒド]]で固定可能な色素である FM1-43FXと DABを細胞に与え光変換させると、共局在部位で電子密度の高い産物が作られ、[[電子顕微鏡]]観察が可能となる。FM1-43を取り込んだ小胞が、高い電子密度で描出され、微細構造解析に活用されている。<br />
<br />
== 応用例 ==<br />
=== シナプス前終末における小胞プールの大きさと開口放出確率の測定 ===<br />
<br />
[[Image:Takahashinoriko fig 3.jpg|thumb|250px|'''図3. 開口放出に伴う FM 蛍光の変化'''<br>膜融合時、細胞外色素の有無により蛍光変化の様式が異なる。]] <br />
<br />
シナプスを刺激した時にミリ秒で起きる伝達物質放出は、[[活性帯]] ([[active zone]])にドックした小胞が開口放出すると仮想されている。この仮想的な小胞群を[[即時性放出プール]] ([[readily releasable pool]], [[RRP]]）という。[[シナプス小胞]]は開口放出後 30-60秒で細胞内部に[[エンドサイトーシス]]で取り込まれる(図 3左）。更に、シナプス終末内でシナプス小胞に再生されて即時性放出プールに再び至る。これを[[リサイクリング]]と呼び、これに関係する小胞の全体を[[全リサイクリングプール]] ([[total recycling pool]], [[TRP]])という。<br />
<br />
細胞外を FM1-43 で還流中に、長い放出刺激（例 20 Hz、900 発）を与え、[[開口放出]]([[エクソサイトーシス]]）した小胞の膜を染め出し、その後色素を含まない溶液で細胞外を還流し、外膜に結合した色素を wash out すると、TRPの全体が染まる。一方、ちょうど RRPにある小胞を枯渇させる程度の短い放出刺激（例 20 Hz、30 発）を与えて wash outをすると RRPが選択的に染まる。この様な解析から、RRPは TRPの 10-30%程度と推定されており<ref><pubmed> 15044806 </pubmed></ref>、TRPが40個程度の小さなシナプスでは RRPの小胞数は 4-12個となる。<br />
<br />
次に、TRPを染めた小胞に刺激を与えると、シナプス小胞は細胞膜と融合し、FM1-43が細胞外液へ拡散することにより神経終末の蛍光は減弱する（脱染色、destaining 図3右）。この脱染色の時間経過は、小胞の開口放出確率が大きい程速い。定量的には、RRPにある小胞の数を [RRP]、その放出確率を Pvとすると、一回の刺激で放出される小胞の数は平均で Pv [RRP]となる。一方、TRPにある小胞の数を[TRP]、一回の刺激による TRPの蛍光の減弱率をkとすると、一回の刺激で放出される小胞の数は k [TRP]となる。よって、Pv [RRP] = k [TRP] となり、これからPv = k [RRP]/[TRP] という関係式が得られ、終末ごとにRRPにある小胞の放出確率を求めることができる <ref><pubmed>23049481 </pubmed></ref>。この Pvと、一回の刺激によりある終末から開口放出が起きる確率 Pr との間には、RRP内の小胞の放出確率が等しければ<math>Pr=1-(1-Pv)^{[RRP]}</math>という関係がある。Prも FM1-43を用いて直接求めた例がある<ref><pubmed> 9136769 </pubmed></ref> 。<br />
<br />
FM1-43によって染めることができる TRPの小胞は、電子顕微鏡的に終末に存在する小胞の15-20%にすぎない。<ref><pubmed> 15044806 </pubmed></ref>。 電子顕微鏡的には同定されるがリサイクリングされ難いシナプス小胞の群を reserve pool 或いは resting poolと言う。このプールの小胞もゆっくりとしたリサイクリングに関係していることが他の方法によって明らかとなっている<ref><pubmed>21835344 </pubmed></ref>。<br />
<br />
=== シナプス小胞の動態の解析 ===<br />
<br />
開口放出した顆粒はactive zoneの周辺から内部に取り込まれ（[[エンドサイトーシス]]）、再び放出可能となる（[[リサイクル]]）。このリサイクルにかかる時間は、[[海馬]]培養標本では 20-30秒、[[神経筋接合部]]では 60秒と見積もられた。TRPを FM1-43で染めた後、DABを光変換して電顕で見ると染色された小胞は、元来小胞があった領域のほぼ全域に拡散し、core(中央部）への拡散のみが軽度に少なかった。また、リサイクルした小胞は、初めて刺激を受けたプール同様の放出確率を持つことが報告された<ref><pubmed> 1553547 </pubmed></ref> 。<br />
<br />
=== 膜融合様式の解析 ===<br />
<br />
FM色素には、炭素鎖数の異なる複数種類の色素がある。これらが小胞膜を染める頻度を比較することにより、融合細孔の開放時間の長短が識別可能となる。 <br />
<br />
FM2-10やFM1-43色素を用い、小胞膜から離脱する[[完全融合]]型（full fusion）と、離脱しない[[不完全融合]]型（incomplete fusion）の識別が行われた<ref><pubmed> 9707119 </pubmed></ref> <ref><pubmed> 12354398 </pubmed></ref>。 <br />
<br />
=== 開口放出現象の可視化 ===<br />
<br />
FM1-43を[[網膜]][[双極性細胞]]のシナプス小胞に取り込ませて標識し、[[全反射顕微鏡]]で細胞膜直下（～100nm）の観察を行い、単一小胞の開口放出現象の可視化が報告された<ref><pubmed> 10972279 </pubmed></ref> 。 <br />
<br />
また、[[下垂体]][[前葉細胞]] ([[lactotrophs]]) や[[wikipedia:ja:膵島|膵島]]細胞においても、[[ホルモン]]を含む大型[[有芯小胞]]の[[膜融合]]に伴い、開口放出部位においてFM1-43蛍光強度の上昇が報告された <ref><pubmed> 10953007 </pubmed></ref><ref><pubmed>12193788 </pubmed></ref>。 <br />
<br />
=== 分泌小胞の直径測定 ===<br />
<br />
シナプス小胞から大型有芯小胞に至るまで、小胞の直径計測に有効である <ref><pubmed> 16150799 </pubmed></ref>。 <br />
<br />
水溶性色素（赤色[[wikipedia:ja:スルホローダミンB|スルホローダミンB]], SRB）と FM1-43を細胞外液に同時に与え、開口放出を誘発すると、水溶性色素は小胞内部に進入し、FM1-43は細胞外膜から小胞内膜へ拡散するため、開口放出した小胞が両色素で描出される。この際 [[2光子レーザー走査顕微鏡]]で画像を取得し、双方の色素の増加分の比を求めると小胞直径が計算される（直径＝6 ΔSRB/ΔFM1-43）。本法は色素濃度やレンズ特性（[[wikipedia:ja:点拡がり関数|点拡がり関数]]）によらず、シナプス小胞のような光学[[wikipedia:ja:解像度|解像度]]以下の器官の計測にも応用可能である。<br />
<br />
== 関連項目 ==<br />
<br />
*[[開口放出]]（[[エクソサイトーシス]]） <br />
*[[膜融合]] <br />
*[[シナプス]] <br />
*[[分泌]]<br />
<br />
== 参考文献 ==<br />
<br />
<references /><br />
<br />
（執筆者：高橋倫子、河西春郎 担当編集委員：柚崎通介） </div>
Hkasai
https://bsd.neuroinf.jp/w/index.php?title=%E3%83%88%E3%83%BC%E3%82%AF:%E7%B4%B0%E8%83%9E%E6%99%82%E8%A8%88&diff=19968
トーク:細胞時計
2013-04-26T04:48:17Z
<p>Hkasai: </p>
<hr />
<div>==編集 林 コメント==<br />
*参考文献を御願い致します。<br />
*抹消と中枢がそれぞれ時計を持つ生理学的な意義、同期のメカニズム、振動のメカニズムの差異などについては如何でしょうか。<br />
*内部リンク・外部リンク作成<br />
<br />
--[[利用者:WikiSysop|Yasunori Hayashi]] 2013年4月3日 (水) 00:26 (JST)<br />
<br />
== 査読 河西 コメント ==<br />
<br />
鳥居先生<br />
<br />
大変、簡潔にして当を得たご解説ありがとうございました。<br />
林先生のコメントとも合わせまして、できましたら改訂していただきたい点についてリストいたします。<br />
<br />
１）抹消と中枢の時計の分子機構はそれ自身まだ色々論争中だと思いますが、骨子となる誰もが知っていた方がよいようなカスケードやサイクルについて図的にお示しいただけないでしょうか。<br />
２）抹消と中枢がそれぞれ時計を持つ生理学的な意義、同期のメカニズム、振動のメカニズムの差異などについては如何でしょうか。<br />
３）抹消時計がなぜ中枢時計に同期するのかにつきましても、わかっている範囲でお願いいたします。<br />
４）睡眠はそれ自身が問題ですが、睡眠との関係につきましても現在の理解を簡潔に記載していただければ幸いです。<br />
５）参考文献を御願い致します。<br />
<br />
大変、お忙しいところ恐縮ですが、どうぞ、よろしくお願いいたします。<br />
<br />
河西春郎 2013.4.26.</div>
Hkasai
https://bsd.neuroinf.jp/w/index.php?title=%E3%83%88%E3%83%BC%E3%82%AF:%E7%B4%B0%E8%83%9E%E6%99%82%E8%A8%88&diff=19967
トーク:細胞時計
2013-04-26T04:47:05Z
<p>Hkasai: /* 査読 河西 コメント */ 新しい節</p>
<hr />
<div>==編集 林 コメント==<br />
*参考文献を御願い致します。<br />
*抹消と中枢がそれぞれ時計を持つ生理学的な意義、同期のメカニズム、振動のメカニズムの差異などについては如何でしょうか。<br />
*内部リンク・外部リンク作成<br />
<br />
--[[利用者:WikiSysop|Yasunori Hayashi]] 2013年4月3日 (水) 00:26 (JST)<br />
<br />
== 査読 河西 コメント ==<br />
<br />
鳥居先生<br />
<br />
大変、簡潔にして当を得たご解説ありがとうございました。<br />
林先生のコメントとも合わせまして、できましたら改訂していただきたい点についてリストいたします。<br />
<br />
１）抹消と中枢の時計の分子機構はそれ自身まだ色々論争中だと思いますが、骨子となる誰もが知っていた方がよいようなカスケードやサイクルについて図的にお示しいただけないでしょうか。<br />
２）抹消と中枢がそれぞれ時計を持つ生理学的な意義、同期のメカニズム、振動のメカニズムの差異などについては如何でしょうか。<br />
３）抹消時計がなぜ中枢時計に同期するのかにつきましても、わかっている範囲でお願いいたします。<br />
４）睡眠はそれ自身が問題ですが、睡眠との関係につきましても現在の理解を簡潔に記載していただければ幸いです。<br />
５）参考文献を御願い致します。<br />
<br />
大変、お忙しいところ恐縮ですが、どうぞ、よろしくお願いいたします。<br />
<br />
河西春郎</div>
Hkasai
https://bsd.neuroinf.jp/w/index.php?title=%E3%83%88%E3%83%BC%E3%82%AF:%E8%A1%80%E6%B6%B2%E8%84%B3%E9%96%A2%E9%96%80&diff=19966
トーク:血液脳関門
2013-04-26T04:30:42Z
<p>Hkasai: </p>
<hr />
<div>==編集 林 作業記録==<br />
*改行を入れました。内容に照らし適当かご判断下さい。<br />
*一部見出しを変えました。<br />
*本文中、コメントございます。御確認、御対応頂ければ幸いです。<br />
*内部リンク・外部リンク作成。<br />
*表作成。<br />
<br />
--[[利用者:WikiSysop|Yasunori Hayashi]] 2013年3月12日 (火) 17:35 (JST)<br />
<br />
<br />
==編集 河西 作業記録==<br />
<br />
<br />
寺崎先生<br />
<br />
とてもホットなトピックスにわかりやすく詳細な解説ありががとうございました。<br />
最近の展開が勉強でき、幸いでございました。<br />
<br />
林先生のコメントも合わせまして、できれば改訂いただきたい点をリストします。<br />
１）図２，３におきましては、文字が小さすぎて拡大しても読めません。これをなんとか見やすくしていただけますでしょうか。<br />
２）ＢＢＢというとアストロサイトは関係しないのかと、昔の教育を受けた者として思いました。即ち、上皮細胞をクロスしたものはアストロの影響を受けずに、脳脊髄液に広がっていくのでしょうか。この場合、その様にアストロの位置づけを明示していただければ幸いです。<br />
３）ＢＢＢではトラスポーターの関与が現在全面にでているようですが、トランスサイトーシスで説明される可能性のある物質があれば具体的に上げていただければ幸いです。たとえば、インスリンなどはどうなりますでしょう。<br />
４）関連事項をあげていただけますでしょうか。<br />
<br />
それでは、大変、お手数をおかけいたしますが、ご改訂よろしくお願いいたします。<br />
<br />
河西春郎 2013.4.26.</div>
Hkasai
https://bsd.neuroinf.jp/w/index.php?title=%E3%83%88%E3%83%BC%E3%82%AF:%E8%A1%80%E6%B6%B2%E8%84%B3%E9%96%A2%E9%96%80&diff=19965
トーク:血液脳関門
2013-04-26T04:30:01Z
<p>Hkasai: </p>
<hr />
<div>==編集 林 作業記録==<br />
*改行を入れました。内容に照らし適当かご判断下さい。<br />
*一部見出しを変えました。<br />
*本文中、コメントございます。御確認、御対応頂ければ幸いです。<br />
*内部リンク・外部リンク作成。<br />
*表作成。<br />
<br />
--[[利用者:WikiSysop|Yasunori Hayashi]] 2013年3月12日 (火) 17:35 (JST)<br />
<br />
<br />
==編集 河西 作業記録==<br />
<br />
<br />
寺崎先生<br />
<br />
とてもホットなトピックスにわかりやすく詳細な解説ありががとうございました。<br />
最近の展開が勉強でき、幸いでございました。<br />
<br />
林先生のコメントも合わせまして、できれば改訂いただきたい点をリストします。<br />
１）図２，３におきましては、文字が小さすぎて拡大しても読めません。これをなんとか見やすくしていただけますでしょうか。<br />
２）ＢＢＢというとアストロサイトは関係しないのかと、昔の教育を受けた者として思いました。即ち、上皮細胞をクロスしたものはアストロの影響を受けずに、脳脊髄液に広がっていくのでしょうか。この場合、その様にアストロの位置づけを明示していただければ幸いです。<br />
３）ＢＢＢではトラスポーターの関与が現在全面にでているようですが、トランスサイトーシスで説明される可能性のある物質があれば具体的に上げていただければ幸いです。たとえば、インスリンなどはどうなりますでしょう。<br />
４）関連事項をあげていただけますでしょうか。<br />
<br />
それでは、大変、お手数をおかけいたしますが、ご改訂よろしくお願いいたします。<br />
<br />
河西春郎</div>
Hkasai
https://bsd.neuroinf.jp/w/index.php?title=FM1-43&diff=19963
FM1-43
2013-04-25T15:52:58Z
<p>Hkasai: /* シナプス小胞の動態の解析 */</p>
<hr />
<div>{{Chembox<br />
| ImageFile = FM1-43.png<br />
| ImageSize = 220px<br />
| ImageAlt = <br />
| IUPACName = 3-[4-[2-[4-(dibutylamino)phenyl]ethenyl]pyridin-1-ium-1-yl]propyl-triethylazanium dibromide<br />
| OtherNames = Frie Mao 1-43, SynaptoGreen™ Reagent, SureCN1527120, N-(3-Triethylammoniumpropyl)-4-(p-dibutylaminostyryl)pyridinium, 2Br<br />
| Section1 = {{Chembox Identifiers<br />
| CASNo = 149838-22-2<br />
| PubChem = 2733618<br />
| SMILES =CCCCN(CCCC)C1=CC=C(C=C1)C=CC2=CC=[N+](C=C2)CCC[N+](CC)(CC)CC.[Br-].[Br-] }}<br />
| Section2 = {{Chembox Properties<br />
| Formula = C30H49Br2N3<br />
| MolarMass = 611.53816<br />
| Appearance = <br />
| Density = <br />
| MeltingPt = <br />
| BoilingPt = <br />
| Solubility = }}<br />
| Section3 = {{Chembox Hazards<br />
| MainHazards = <br />
| FlashPt = <br />
| Autoignition = }}<br />
}} <br />
<br />
FM 色素は[[wikipedia:ja:脂質二重層|脂質二重膜]]を可逆的に染める蛍光色素で、[[シナプス前終末]]の機能や[[wikipedia:ja:分泌|分泌]]現象の計測に活用されている。 <br />
<br />
== FM1-43とは ==<br />
<br />
[[Image:Takahashinoriko fig 1.jpg|thumb|250px|'''図1．（タイトル：FM 色素による還流と細胞膜の蛍光標識）''' 説明：FM 色素液で細胞を還流すると細胞外膜が蛍光を発する。]] Molecular Probe 社の Fei Mao は William J Betz らとともに、細胞膜を染める一連のスチリル色素を合成した。これらを FM (Fei Mao)色素と呼び、FM1-43 はその代表格である。[[シナプス前終末]]の機能解析や、分泌小胞の動態解析に広く用いられる。 <br />
<br />
色素の特性として次の3つの性質がある。 <br />
<br />
#水溶液中に存在する場合に比べ、細胞膜に結合すると[[wikipedia:ja:量子効率|量子効率]]が著増し、強い[[wikipedia:ja:蛍光|蛍光]]を出す。 <br />
#[[wikipedia:ja:脂質二重層|脂質二重膜]]を透過しない。 <br />
#[[wikipedia:ja:両親媒性分子|両親媒性]]で可逆的に膜を染める。<br />
<br />
== 分子構造 ==<br />
<br />
[[Image:Takahashinoriko fig 2.jpg|thumb|250px|'''図2．（タイトル：FM 色素群の分子構造）''' 説明：二重結合の数は色調に、炭素鎖の数は細胞膜との親和性や蛍光強度に関連する]] 構造は、[[wikipedia:ja:親水性|親水性]]領域、[[wikipedia:ja:二重結合|二重結合]]領域、[[wikipedia:ja:疎水性|疎水性]]炭素鎖領域に分けられる。 <br />
<br />
親水性領域が正の電荷をもつため、膜を通過しない。二重結合の数は蛍光波長に関連する。 <br />
<br />
二重結合が一つの FM1-43、FM1-84、FM2-10 は黄色蛍光を呈し、二重結合が二つの FM4-64、FM5-95 は赤色蛍光を呈する。 <br />
<br />
疎水性炭素鎖の長さは細胞膜の染め方に関連し、長いものほど明るく、一旦膜に組み込まれると離脱しがたい<ref><pubmed> 10202529 </pubmed></ref>。 FM1-43 の炭素鎖数は4であり、解離時定数τ<sub>diss</sub>は8 msを示す。より短いFM2-10(炭素鎖数 2)は、比較的離脱しやすい(τ<sub>diss</sub>=6.4 ms)。逆に、より長い FM1-84（炭素鎖数 5）は離脱に時間がかかる(τ<sub>diss</sub>=36 ms)<ref><pubmed> 19580748 </pubmed></ref>。 <br />
<br />
== 蛍光特性 ==<br />
<br />
FM1-43の[[wikipedia:ja:励起状態|励起]]には1光子では波長480 nm光、2光子では波長840 nm光が頻用される。 <br />
<br />
蛍光強度は[[wikipedia:ja:リポソーム|リポソーム]]中では580 nmで最大となる。 <br />
<br />
波長480nm光の高出力励起（～150 μW）にて[[wikipedia:3,3'-Diaminobenzidine|ジアミノベンチジン]]（DAB）の光変換（photoconversion） を起こす。そのため、[[wikipedia:ja:アルデヒド|アルデヒド]]で固定可能な色素であるFM1-43FX と DABを細胞に与え光変換させると、共局在部位で電子密度の高い産物が作られ、[[電子顕微鏡]]観察が可能となる。FM1-43を取り込んだ小胞が、高い電子密度で描出され、微細構造解析に活用されている。<br />
<br />
== 応用例 ==<br />
<br />
<br />
<br />
==== シナプス前終末における小胞プールの大きさと開口放出確率の測定 ====<br />
<br />
[[Image:Takahashinoriko fig 3.jpg|thumb|250px|'''図3．（タイトル：開口放出に伴う FM 蛍光の変化''' 説明：膜融合時、細胞外色素の有無により蛍光変化の様式が異なる）]] <br />
<br />
シナプスを刺激した時にミリ秒で起きる伝達物質放出は、活性帯にドックした小胞が開口放出すると仮想されている。この仮想的な小胞群を即時性放出プール[[Readily releasable pool]]（RRP）という。[[シナプス小胞]]は開口放出後30-60秒で細胞内部に[[エンドサイトーシス]]で取り込まれる(図 3左）。更に、シナプス終末内でシナプス小胞に再生されて即時性放出プールに再び至る。これをリサイクリングと呼び、これに関係する小胞の全体をリサイクリングプール(recycling pool)、又は放出可能プール(TRP)という。<br />
<br />
細胞外を FM1-43 で還流中に、長い放出刺激（例 20 Hz、900 発）を与え[[開口放出]]([[エクソサイトーシス]]）した小胞の膜を染めた後、細胞外を色素を含まない溶液で還流し、細胞外膜に結合した色素を wash out すると、TRPの全体が染まる。一方、ちょうどRRPにある小胞を枯渇させる程度の短い放出刺激（例 20 Hz、30 発）を与えて負荷後にwash outをするとRRPが選択的に染まる。この様な解析から、RRPはTRPの10-30%でないかと推定されており<ref><pubmed> 15044806 </pubmed></ref>、TRPが40個程度の小さなシナプスではRRPの小胞数は4-12個となる。<br />
<br />
次に、TRPを染めた小胞に刺激を与えると、シナプス小胞は細胞膜と融合し、FM1-43が細胞外液へ拡散することにより神経終末の蛍光は減弱する脱染色（destaining 図3右）。このdestainingの時間経過は、小胞の開口放出確率が大きい程速い。定量的には、RRPにある小胞の数を [RRP]、その放出確率をPvとすると、一回の刺激で放出される小胞の数は平均で Pv [RRP]となる。一方、TRPにある小胞の数を[TRP]、一回の刺激によるTRPの蛍光の減弱率をkとすると、一回の刺激で放出される小胞の数は k [TRP]となる。よって、Pv [RRP] = k [TRP] となり、これからPv = k [RRP]/[TRP] という関係式が得られ、終末ごとにRRPにある小胞の放出確率を求めることができる <ref><pubmed>23049481 </pubmed></ref>。このPvと、一回の刺激である終末から開口放出が起きる確率 Pr との間には、RRP内の小胞の放出確率が等しければ<math>Pr=1-(1-Pv)^{[RRP]}</math>という関係がある。PrもFM1-43を用いて直接求めた例がある<ref><pubmed> 9136769 </pubmed></ref> 。<br />
<br />
FM1-43によって染めることができるTRPの小胞は、電子顕微鏡的に終末に存在する小胞の15-20%である<ref><pubmed> 15044806 </pubmed></ref>。 この電子顕微鏡的に同定されるリサイクリングされ難いシナプス小胞の群をreserve pool 或いは resting poolと言う。このプールの小胞もゆっくりとしたリサイクリングに関係していることが他の方法によって明らかとなっている<ref><pubmed>21835344 </pubmed></ref>。<br />
<br />
==== シナプス小胞の動態の解析 ====<br />
<br />
開口放出した顆粒は[[Active zone]]の周辺から内部に取り込まれ（[[エンドサイトーシス]]）、再び放出可能となる（[[リサイクル]]）。このリサイクルにかかる時間は、[[海馬]]培養標本では 20-30秒、神経筋接合部では 60秒と見積もられた。TRPをFM1-43で染めた後、DABを光変換して電顕で見ると染色された小胞は、元来小胞があった領域のほぼ全域に拡散し、core(中央部）への拡散のみが軽度に少なかった。また、リサイクルした小胞は、初めて刺激を受けたプール同様の放出確率を持つことが報告された<ref><pubmed> 1553547 </pubmed></ref> 。<br />
<br />
=== 膜融合様式の解析 ===<br />
<br />
FM色素には、炭素鎖数の異なる複数種類の色素がある。これらが小胞膜を染める頻度を比較することにより、融合細孔の開放時間の長短が識別可能となる。 <br />
<br />
FM2-10やFM1-43色素を用い、小胞膜から離脱する[[完全融合]]型（full fusion）と、離脱しない[[不完全融合]]型（incomplete fusion）の識別が行われた<ref><pubmed> 9707119 </pubmed></ref> <ref><pubmed> 12354398 </pubmed></ref>。 <br />
<br />
=== 開口放出現象の可視化 ===<br />
<br />
FM1-43を[[網膜]][[双極性細胞]]のシナプス小胞に取り込ませて標識し、[[全反射顕微鏡]]で細胞膜直下（～100nm）の観察を行い、単一小胞の開口放出現象の可視化が報告された<ref><pubmed> 10972279 </pubmed></ref> 。 <br />
<br />
また、[[下垂体]][[前葉細胞]] (lactotrophs) や[[wikipedia:ja:膵島|膵島]]細胞においても、[[ホルモン]]を含む大型[[有芯小胞]]の[[膜融合]]に伴い、開口放出部位においてFM1-43蛍光強度の上昇が報告された <ref><pubmed> 10953007 </pubmed></ref><ref><pubmed>12193788 </pubmed></ref>。 <br />
<br />
=== 分泌小胞の直径測定 ===<br />
<br />
シナプス小胞から大型有芯小胞に至るまで、小胞の直径計測に有効である <ref><pubmed> 16150799 </pubmed></ref>。 <br />
<br />
水溶性色素（赤色[[wikipedia:ja:スルホローダミンB|スルホローダミンB]], SRB）とFM1-43を細胞外液に同時に与え、開口放出を誘発すると、水溶性色素は小胞内部に進入し、FM1-43は細胞外膜から小胞内膜へ拡散するため、開口放出した小胞が両色素で描出される。この際 [[２光子レーザー走査顕微鏡]]で画像を取得し、双方の色素の増加分の比を求めると小胞直径が計算される（直径＝6 ΔSRB/ΔFM1-43）。本法は色素濃度やレンズ特性（[[wikipedia:ja:点拡がり関数|点拡がり関数]]）によらず、シナプス小胞のような光学[[wikipedia:ja:解像度|解像度]]以下の器官の計測にも応用可能である。 <br />
<br />
== 関連項目 ==<br />
<br />
*[[開口放出]]（[[エクソサイトーシス]]） <br />
*[[膜融合]] <br />
*[[シナプス]] <br />
*[[wikipedia:ja:分泌|分泌]]<br />
<br />
== 参考文献 ==<br />
<br />
<references /><br />
<br />
<br>（執筆者：高橋倫子、河西春郎 担当編集委員：柚崎通介） </div>
Hkasai
https://bsd.neuroinf.jp/w/index.php?title=FM1-43&diff=19962
FM1-43
2013-04-25T15:50:56Z
<p>Hkasai: /* 蛍光特性 */</p>
<hr />
<div>{{Chembox<br />
| ImageFile = FM1-43.png<br />
| ImageSize = 220px<br />
| ImageAlt = <br />
| IUPACName = 3-[4-[2-[4-(dibutylamino)phenyl]ethenyl]pyridin-1-ium-1-yl]propyl-triethylazanium dibromide<br />
| OtherNames = Frie Mao 1-43, SynaptoGreen™ Reagent, SureCN1527120, N-(3-Triethylammoniumpropyl)-4-(p-dibutylaminostyryl)pyridinium, 2Br<br />
| Section1 = {{Chembox Identifiers<br />
| CASNo = 149838-22-2<br />
| PubChem = 2733618<br />
| SMILES =CCCCN(CCCC)C1=CC=C(C=C1)C=CC2=CC=[N+](C=C2)CCC[N+](CC)(CC)CC.[Br-].[Br-] }}<br />
| Section2 = {{Chembox Properties<br />
| Formula = C30H49Br2N3<br />
| MolarMass = 611.53816<br />
| Appearance = <br />
| Density = <br />
| MeltingPt = <br />
| BoilingPt = <br />
| Solubility = }}<br />
| Section3 = {{Chembox Hazards<br />
| MainHazards = <br />
| FlashPt = <br />
| Autoignition = }}<br />
}} <br />
<br />
FM 色素は[[wikipedia:ja:脂質二重層|脂質二重膜]]を可逆的に染める蛍光色素で、[[シナプス前終末]]の機能や[[wikipedia:ja:分泌|分泌]]現象の計測に活用されている。 <br />
<br />
== FM1-43とは ==<br />
<br />
[[Image:Takahashinoriko fig 1.jpg|thumb|250px|'''図1．（タイトル：FM 色素による還流と細胞膜の蛍光標識）''' 説明：FM 色素液で細胞を還流すると細胞外膜が蛍光を発する。]] Molecular Probe 社の Fei Mao は William J Betz らとともに、細胞膜を染める一連のスチリル色素を合成した。これらを FM (Fei Mao)色素と呼び、FM1-43 はその代表格である。[[シナプス前終末]]の機能解析や、分泌小胞の動態解析に広く用いられる。 <br />
<br />
色素の特性として次の3つの性質がある。 <br />
<br />
#水溶液中に存在する場合に比べ、細胞膜に結合すると[[wikipedia:ja:量子効率|量子効率]]が著増し、強い[[wikipedia:ja:蛍光|蛍光]]を出す。 <br />
#[[wikipedia:ja:脂質二重層|脂質二重膜]]を透過しない。 <br />
#[[wikipedia:ja:両親媒性分子|両親媒性]]で可逆的に膜を染める。<br />
<br />
== 分子構造 ==<br />
<br />
[[Image:Takahashinoriko fig 2.jpg|thumb|250px|'''図2．（タイトル：FM 色素群の分子構造）''' 説明：二重結合の数は色調に、炭素鎖の数は細胞膜との親和性や蛍光強度に関連する]] 構造は、[[wikipedia:ja:親水性|親水性]]領域、[[wikipedia:ja:二重結合|二重結合]]領域、[[wikipedia:ja:疎水性|疎水性]]炭素鎖領域に分けられる。 <br />
<br />
親水性領域が正の電荷をもつため、膜を通過しない。二重結合の数は蛍光波長に関連する。 <br />
<br />
二重結合が一つの FM1-43、FM1-84、FM2-10 は黄色蛍光を呈し、二重結合が二つの FM4-64、FM5-95 は赤色蛍光を呈する。 <br />
<br />
疎水性炭素鎖の長さは細胞膜の染め方に関連し、長いものほど明るく、一旦膜に組み込まれると離脱しがたい<ref><pubmed> 10202529 </pubmed></ref>。 FM1-43 の炭素鎖数は4であり、解離時定数τ<sub>diss</sub>は8 msを示す。より短いFM2-10(炭素鎖数 2)は、比較的離脱しやすい(τ<sub>diss</sub>=6.4 ms)。逆に、より長い FM1-84（炭素鎖数 5）は離脱に時間がかかる(τ<sub>diss</sub>=36 ms)<ref><pubmed> 19580748 </pubmed></ref>。 <br />
<br />
== 蛍光特性 ==<br />
<br />
FM1-43の[[wikipedia:ja:励起状態|励起]]には1光子では波長480 nm光、2光子では波長840 nm光が頻用される。 <br />
<br />
蛍光強度は[[wikipedia:ja:リポソーム|リポソーム]]中では580 nmで最大となる。 <br />
<br />
波長480nm光の高出力励起（～150 μW）にて[[wikipedia:3,3'-Diaminobenzidine|ジアミノベンチジン]]（DAB）の光変換（photoconversion） を起こす。そのため、[[wikipedia:ja:アルデヒド|アルデヒド]]で固定可能な色素であるFM1-43FX と DABを細胞に与え光変換させると、共局在部位で電子密度の高い産物が作られ、[[電子顕微鏡]]観察が可能となる。FM1-43を取り込んだ小胞が、高い電子密度で描出され、微細構造解析に活用されている。<br />
<br />
== 応用例 ==<br />
<br />
<br />
<br />
==== シナプス前終末における小胞プールの大きさと開口放出確率の測定 ====<br />
<br />
[[Image:Takahashinoriko fig 3.jpg|thumb|250px|'''図3．（タイトル：開口放出に伴う FM 蛍光の変化''' 説明：膜融合時、細胞外色素の有無により蛍光変化の様式が異なる）]] <br />
<br />
シナプスを刺激した時にミリ秒で起きる伝達物質放出は、活性帯にドックした小胞が開口放出すると仮想されている。この仮想的な小胞群を即時性放出プール[[Readily releasable pool]]（RRP）という。[[シナプス小胞]]は開口放出後30-60秒で細胞内部に[[エンドサイトーシス]]で取り込まれる(図 3左）。更に、シナプス終末内でシナプス小胞に再生されて即時性放出プールに再び至る。これをリサイクリングと呼び、これに関係する小胞の全体をリサイクリングプール(recycling pool)、又は放出可能プール(TRP)という。<br />
<br />
細胞外を FM1-43 で還流中に、長い放出刺激（例 20 Hz、900 発）を与え[[開口放出]]([[エクソサイトーシス]]）した小胞の膜を染めた後、細胞外を色素を含まない溶液で還流し、細胞外膜に結合した色素を wash out すると、TRPの全体が染まる。一方、ちょうどRRPにある小胞を枯渇させる程度の短い放出刺激（例 20 Hz、30 発）を与えて負荷後にwash outをするとRRPが選択的に染まる。この様な解析から、RRPはTRPの10-30%でないかと推定されており<ref><pubmed> 15044806 </pubmed></ref>、TRPが40個程度の小さなシナプスではRRPの小胞数は4-12個となる。<br />
<br />
次に、TRPを染めた小胞に刺激を与えると、シナプス小胞は細胞膜と融合し、FM1-43が細胞外液へ拡散することにより神経終末の蛍光は減弱する脱染色（destaining 図3右）。このdestainingの時間経過は、小胞の開口放出確率が大きい程速い。定量的には、RRPにある小胞の数を [RRP]、その放出確率をPvとすると、一回の刺激で放出される小胞の数は平均で Pv [RRP]となる。一方、TRPにある小胞の数を[TRP]、一回の刺激によるTRPの蛍光の減弱率をkとすると、一回の刺激で放出される小胞の数は k [TRP]となる。よって、Pv [RRP] = k [TRP] となり、これからPv = k [RRP]/[TRP] という関係式が得られ、終末ごとにRRPにある小胞の放出確率を求めることができる <ref><pubmed>23049481 </pubmed></ref>。このPvと、一回の刺激である終末から開口放出が起きる確率 Pr との間には、RRP内の小胞の放出確率が等しければ<math>Pr=1-(1-Pv)^{[RRP]}</math>という関係がある。PrもFM1-43を用いて直接求めた例がある<ref><pubmed> 9136769 </pubmed></ref> 。<br />
<br />
FM1-43によって染めることができるTRPの小胞は、電子顕微鏡的に終末に存在する小胞の15-20%である<ref><pubmed> 15044806 </pubmed></ref>。 この電子顕微鏡的に同定されるリサイクリングされ難いシナプス小胞の群をreserve pool 或いは resting poolと言う。このプールの小胞もゆっくりとしたリサイクリングに関係していることが他の方法によって明らかとなっている<ref><pubmed>21835344 </pubmed></ref>。<br />
<br />
==== シナプス小胞の動態の解析 ====<br />
<br />
開口放出した顆粒は[[Active zone]]の周辺から内部に取り込まれ（[[エンドサイトーシス]]）、再び放出可能となる（[[リサイクル]]）。このリサイクルにかかる時間は、[[海馬]]培養標本では 20-30秒、神経筋接合部では 60秒と見積もられた。TRPをFM1-43で染めた後、電顕で見ると染色された小胞は、元来小胞があった領域のほぼ全域に拡散し、core(中央部）への拡散のみが軽度に少なかった。また、リサイクルした小胞は、初めて刺激を受けたプール同様の放出確率を持つことが報告された<ref><pubmed> 1553547 </pubmed></ref> 。<br />
<br />
=== 膜融合様式の解析 ===<br />
<br />
FM色素には、炭素鎖数の異なる複数種類の色素がある。これらが小胞膜を染める頻度を比較することにより、融合細孔の開放時間の長短が識別可能となる。 <br />
<br />
FM2-10やFM1-43色素を用い、小胞膜から離脱する[[完全融合]]型（full fusion）と、離脱しない[[不完全融合]]型（incomplete fusion）の識別が行われた<ref><pubmed> 9707119 </pubmed></ref> <ref><pubmed> 12354398 </pubmed></ref>。 <br />
<br />
=== 開口放出現象の可視化 ===<br />
<br />
FM1-43を[[網膜]][[双極性細胞]]のシナプス小胞に取り込ませて標識し、[[全反射顕微鏡]]で細胞膜直下（～100nm）の観察を行い、単一小胞の開口放出現象の可視化が報告された<ref><pubmed> 10972279 </pubmed></ref> 。 <br />
<br />
また、[[下垂体]][[前葉細胞]] (lactotrophs) や[[wikipedia:ja:膵島|膵島]]細胞においても、[[ホルモン]]を含む大型[[有芯小胞]]の[[膜融合]]に伴い、開口放出部位においてFM1-43蛍光強度の上昇が報告された <ref><pubmed> 10953007 </pubmed></ref><ref><pubmed>12193788 </pubmed></ref>。 <br />
<br />
=== 分泌小胞の直径測定 ===<br />
<br />
シナプス小胞から大型有芯小胞に至るまで、小胞の直径計測に有効である <ref><pubmed> 16150799 </pubmed></ref>。 <br />
<br />
水溶性色素（赤色[[wikipedia:ja:スルホローダミンB|スルホローダミンB]], SRB）とFM1-43を細胞外液に同時に与え、開口放出を誘発すると、水溶性色素は小胞内部に進入し、FM1-43は細胞外膜から小胞内膜へ拡散するため、開口放出した小胞が両色素で描出される。この際 [[２光子レーザー走査顕微鏡]]で画像を取得し、双方の色素の増加分の比を求めると小胞直径が計算される（直径＝6 ΔSRB/ΔFM1-43）。本法は色素濃度やレンズ特性（[[wikipedia:ja:点拡がり関数|点拡がり関数]]）によらず、シナプス小胞のような光学[[wikipedia:ja:解像度|解像度]]以下の器官の計測にも応用可能である。 <br />
<br />
== 関連項目 ==<br />
<br />
*[[開口放出]]（[[エクソサイトーシス]]） <br />
*[[膜融合]] <br />
*[[シナプス]] <br />
*[[wikipedia:ja:分泌|分泌]]<br />
<br />
== 参考文献 ==<br />
<br />
<references /><br />
<br />
<br>（執筆者：高橋倫子、河西春郎 担当編集委員：柚崎通介） </div>
Hkasai
https://bsd.neuroinf.jp/w/index.php?title=FM1-43&diff=19961
FM1-43
2013-04-25T15:50:09Z
<p>Hkasai: /* 蛍光特性 */</p>
<hr />
<div>{{Chembox<br />
| ImageFile = FM1-43.png<br />
| ImageSize = 220px<br />
| ImageAlt = <br />
| IUPACName = 3-[4-[2-[4-(dibutylamino)phenyl]ethenyl]pyridin-1-ium-1-yl]propyl-triethylazanium dibromide<br />
| OtherNames = Frie Mao 1-43, SynaptoGreen™ Reagent, SureCN1527120, N-(3-Triethylammoniumpropyl)-4-(p-dibutylaminostyryl)pyridinium, 2Br<br />
| Section1 = {{Chembox Identifiers<br />
| CASNo = 149838-22-2<br />
| PubChem = 2733618<br />
| SMILES =CCCCN(CCCC)C1=CC=C(C=C1)C=CC2=CC=[N+](C=C2)CCC[N+](CC)(CC)CC.[Br-].[Br-] }}<br />
| Section2 = {{Chembox Properties<br />
| Formula = C30H49Br2N3<br />
| MolarMass = 611.53816<br />
| Appearance = <br />
| Density = <br />
| MeltingPt = <br />
| BoilingPt = <br />
| Solubility = }}<br />
| Section3 = {{Chembox Hazards<br />
| MainHazards = <br />
| FlashPt = <br />
| Autoignition = }}<br />
}} <br />
<br />
FM 色素は[[wikipedia:ja:脂質二重層|脂質二重膜]]を可逆的に染める蛍光色素で、[[シナプス前終末]]の機能や[[wikipedia:ja:分泌|分泌]]現象の計測に活用されている。 <br />
<br />
== FM1-43とは ==<br />
<br />
[[Image:Takahashinoriko fig 1.jpg|thumb|250px|'''図1．（タイトル：FM 色素による還流と細胞膜の蛍光標識）''' 説明：FM 色素液で細胞を還流すると細胞外膜が蛍光を発する。]] Molecular Probe 社の Fei Mao は William J Betz らとともに、細胞膜を染める一連のスチリル色素を合成した。これらを FM (Fei Mao)色素と呼び、FM1-43 はその代表格である。[[シナプス前終末]]の機能解析や、分泌小胞の動態解析に広く用いられる。 <br />
<br />
色素の特性として次の3つの性質がある。 <br />
<br />
#水溶液中に存在する場合に比べ、細胞膜に結合すると[[wikipedia:ja:量子効率|量子効率]]が著増し、強い[[wikipedia:ja:蛍光|蛍光]]を出す。 <br />
#[[wikipedia:ja:脂質二重層|脂質二重膜]]を透過しない。 <br />
#[[wikipedia:ja:両親媒性分子|両親媒性]]で可逆的に膜を染める。<br />
<br />
== 分子構造 ==<br />
<br />
[[Image:Takahashinoriko fig 2.jpg|thumb|250px|'''図2．（タイトル：FM 色素群の分子構造）''' 説明：二重結合の数は色調に、炭素鎖の数は細胞膜との親和性や蛍光強度に関連する]] 構造は、[[wikipedia:ja:親水性|親水性]]領域、[[wikipedia:ja:二重結合|二重結合]]領域、[[wikipedia:ja:疎水性|疎水性]]炭素鎖領域に分けられる。 <br />
<br />
親水性領域が正の電荷をもつため、膜を通過しない。二重結合の数は蛍光波長に関連する。 <br />
<br />
二重結合が一つの FM1-43、FM1-84、FM2-10 は黄色蛍光を呈し、二重結合が二つの FM4-64、FM5-95 は赤色蛍光を呈する。 <br />
<br />
疎水性炭素鎖の長さは細胞膜の染め方に関連し、長いものほど明るく、一旦膜に組み込まれると離脱しがたい<ref><pubmed> 10202529 </pubmed></ref>。 FM1-43 の炭素鎖数は4であり、解離時定数τ<sub>diss</sub>は8 msを示す。より短いFM2-10(炭素鎖数 2)は、比較的離脱しやすい(τ<sub>diss</sub>=6.4 ms)。逆に、より長い FM1-84（炭素鎖数 5）は離脱に時間がかかる(τ<sub>diss</sub>=36 ms)<ref><pubmed> 19580748 </pubmed></ref>。 <br />
<br />
== 蛍光特性 ==<br />
<br />
FM1-43の[[wikipedia:ja:励起状態|励起]]には1光子では波長480 nm光、2光子では波長840 nm光が頻用される。 <br />
<br />
蛍光波長は[[wikipedia:ja:リポソーム|リポソーム]]中にて580 nmで最大となる。 <br />
<br />
波長480nm光の高出力励起（～150 μW）にて[[wikipedia:3,3'-Diaminobenzidine|ジアミノベンチジン]]（DAB）の光変換（photoconversion） を起こす。そのため、[[wikipedia:ja:アルデヒド|アルデヒド]]で固定可能な色素であるFM1-43FX と DABを細胞に与え光変換させると、共局在部位で電子密度の高い産物が作られ、[[電子顕微鏡]]観察が可能となる。FM1-43を取り込んだ小胞が、高い電子密度で描出され、微細構造解析に活用されている。<br />
<br />
== 応用例 ==<br />
<br />
<br />
<br />
==== シナプス前終末における小胞プールの大きさと開口放出確率の測定 ====<br />
<br />
[[Image:Takahashinoriko fig 3.jpg|thumb|250px|'''図3．（タイトル：開口放出に伴う FM 蛍光の変化''' 説明：膜融合時、細胞外色素の有無により蛍光変化の様式が異なる）]] <br />
<br />
シナプスを刺激した時にミリ秒で起きる伝達物質放出は、活性帯にドックした小胞が開口放出すると仮想されている。この仮想的な小胞群を即時性放出プール[[Readily releasable pool]]（RRP）という。[[シナプス小胞]]は開口放出後30-60秒で細胞内部に[[エンドサイトーシス]]で取り込まれる(図 3左）。更に、シナプス終末内でシナプス小胞に再生されて即時性放出プールに再び至る。これをリサイクリングと呼び、これに関係する小胞の全体をリサイクリングプール(recycling pool)、又は放出可能プール(TRP)という。<br />
<br />
細胞外を FM1-43 で還流中に、長い放出刺激（例 20 Hz、900 発）を与え[[開口放出]]([[エクソサイトーシス]]）した小胞の膜を染めた後、細胞外を色素を含まない溶液で還流し、細胞外膜に結合した色素を wash out すると、TRPの全体が染まる。一方、ちょうどRRPにある小胞を枯渇させる程度の短い放出刺激（例 20 Hz、30 発）を与えて負荷後にwash outをするとRRPが選択的に染まる。この様な解析から、RRPはTRPの10-30%でないかと推定されており<ref><pubmed> 15044806 </pubmed></ref>、TRPが40個程度の小さなシナプスではRRPの小胞数は4-12個となる。<br />
<br />
次に、TRPを染めた小胞に刺激を与えると、シナプス小胞は細胞膜と融合し、FM1-43が細胞外液へ拡散することにより神経終末の蛍光は減弱する脱染色（destaining 図3右）。このdestainingの時間経過は、小胞の開口放出確率が大きい程速い。定量的には、RRPにある小胞の数を [RRP]、その放出確率をPvとすると、一回の刺激で放出される小胞の数は平均で Pv [RRP]となる。一方、TRPにある小胞の数を[TRP]、一回の刺激によるTRPの蛍光の減弱率をkとすると、一回の刺激で放出される小胞の数は k [TRP]となる。よって、Pv [RRP] = k [TRP] となり、これからPv = k [RRP]/[TRP] という関係式が得られ、終末ごとにRRPにある小胞の放出確率を求めることができる <ref><pubmed>23049481 </pubmed></ref>。このPvと、一回の刺激である終末から開口放出が起きる確率 Pr との間には、RRP内の小胞の放出確率が等しければ<math>Pr=1-(1-Pv)^{[RRP]}</math>という関係がある。PrもFM1-43を用いて直接求めた例がある<ref><pubmed> 9136769 </pubmed></ref> 。<br />
<br />
FM1-43によって染めることができるTRPの小胞は、電子顕微鏡的に終末に存在する小胞の15-20%である<ref><pubmed> 15044806 </pubmed></ref>。 この電子顕微鏡的に同定されるリサイクリングされ難いシナプス小胞の群をreserve pool 或いは resting poolと言う。このプールの小胞もゆっくりとしたリサイクリングに関係していることが他の方法によって明らかとなっている<ref><pubmed>21835344 </pubmed></ref>。<br />
<br />
==== シナプス小胞の動態の解析 ====<br />
<br />
開口放出した顆粒は[[Active zone]]の周辺から内部に取り込まれ（[[エンドサイトーシス]]）、再び放出可能となる（[[リサイクル]]）。このリサイクルにかかる時間は、[[海馬]]培養標本では 20-30秒、神経筋接合部では 60秒と見積もられた。TRPをFM1-43で染めた後、電顕で見ると染色された小胞は、元来小胞があった領域のほぼ全域に拡散し、core(中央部）への拡散のみが軽度に少なかった。また、リサイクルした小胞は、初めて刺激を受けたプール同様の放出確率を持つことが報告された<ref><pubmed> 1553547 </pubmed></ref> 。<br />
<br />
=== 膜融合様式の解析 ===<br />
<br />
FM色素には、炭素鎖数の異なる複数種類の色素がある。これらが小胞膜を染める頻度を比較することにより、融合細孔の開放時間の長短が識別可能となる。 <br />
<br />
FM2-10やFM1-43色素を用い、小胞膜から離脱する[[完全融合]]型（full fusion）と、離脱しない[[不完全融合]]型（incomplete fusion）の識別が行われた<ref><pubmed> 9707119 </pubmed></ref> <ref><pubmed> 12354398 </pubmed></ref>。 <br />
<br />
=== 開口放出現象の可視化 ===<br />
<br />
FM1-43を[[網膜]][[双極性細胞]]のシナプス小胞に取り込ませて標識し、[[全反射顕微鏡]]で細胞膜直下（～100nm）の観察を行い、単一小胞の開口放出現象の可視化が報告された<ref><pubmed> 10972279 </pubmed></ref> 。 <br />
<br />
また、[[下垂体]][[前葉細胞]] (lactotrophs) や[[wikipedia:ja:膵島|膵島]]細胞においても、[[ホルモン]]を含む大型[[有芯小胞]]の[[膜融合]]に伴い、開口放出部位においてFM1-43蛍光強度の上昇が報告された <ref><pubmed> 10953007 </pubmed></ref><ref><pubmed>12193788 </pubmed></ref>。 <br />
<br />
=== 分泌小胞の直径測定 ===<br />
<br />
シナプス小胞から大型有芯小胞に至るまで、小胞の直径計測に有効である <ref><pubmed> 16150799 </pubmed></ref>。 <br />
<br />
水溶性色素（赤色[[wikipedia:ja:スルホローダミンB|スルホローダミンB]], SRB）とFM1-43を細胞外液に同時に与え、開口放出を誘発すると、水溶性色素は小胞内部に進入し、FM1-43は細胞外膜から小胞内膜へ拡散するため、開口放出した小胞が両色素で描出される。この際 [[２光子レーザー走査顕微鏡]]で画像を取得し、双方の色素の増加分の比を求めると小胞直径が計算される（直径＝6 ΔSRB/ΔFM1-43）。本法は色素濃度やレンズ特性（[[wikipedia:ja:点拡がり関数|点拡がり関数]]）によらず、シナプス小胞のような光学[[wikipedia:ja:解像度|解像度]]以下の器官の計測にも応用可能である。 <br />
<br />
== 関連項目 ==<br />
<br />
*[[開口放出]]（[[エクソサイトーシス]]） <br />
*[[膜融合]] <br />
*[[シナプス]] <br />
*[[wikipedia:ja:分泌|分泌]]<br />
<br />
== 参考文献 ==<br />
<br />
<references /><br />
<br />
<br>（執筆者：高橋倫子、河西春郎 担当編集委員：柚崎通介） </div>
Hkasai
https://bsd.neuroinf.jp/w/index.php?title=FM1-43&diff=19960
FM1-43
2013-04-25T15:48:32Z
<p>Hkasai: /* シナプス前終末における小胞プールの大きさと開口放出確率の測定 */</p>
<hr />
<div>{{Chembox<br />
| ImageFile = FM1-43.png<br />
| ImageSize = 220px<br />
| ImageAlt = <br />
| IUPACName = 3-[4-[2-[4-(dibutylamino)phenyl]ethenyl]pyridin-1-ium-1-yl]propyl-triethylazanium dibromide<br />
| OtherNames = Frie Mao 1-43, SynaptoGreen™ Reagent, SureCN1527120, N-(3-Triethylammoniumpropyl)-4-(p-dibutylaminostyryl)pyridinium, 2Br<br />
| Section1 = {{Chembox Identifiers<br />
| CASNo = 149838-22-2<br />
| PubChem = 2733618<br />
| SMILES =CCCCN(CCCC)C1=CC=C(C=C1)C=CC2=CC=[N+](C=C2)CCC[N+](CC)(CC)CC.[Br-].[Br-] }}<br />
| Section2 = {{Chembox Properties<br />
| Formula = C30H49Br2N3<br />
| MolarMass = 611.53816<br />
| Appearance = <br />
| Density = <br />
| MeltingPt = <br />
| BoilingPt = <br />
| Solubility = }}<br />
| Section3 = {{Chembox Hazards<br />
| MainHazards = <br />
| FlashPt = <br />
| Autoignition = }}<br />
}} <br />
<br />
FM 色素は[[wikipedia:ja:脂質二重層|脂質二重膜]]を可逆的に染める蛍光色素で、[[シナプス前終末]]の機能や[[wikipedia:ja:分泌|分泌]]現象の計測に活用されている。 <br />
<br />
== FM1-43とは ==<br />
<br />
[[Image:Takahashinoriko fig 1.jpg|thumb|250px|'''図1．（タイトル：FM 色素による還流と細胞膜の蛍光標識）''' 説明：FM 色素液で細胞を還流すると細胞外膜が蛍光を発する。]] Molecular Probe 社の Fei Mao は William J Betz らとともに、細胞膜を染める一連のスチリル色素を合成した。これらを FM (Fei Mao)色素と呼び、FM1-43 はその代表格である。[[シナプス前終末]]の機能解析や、分泌小胞の動態解析に広く用いられる。 <br />
<br />
色素の特性として次の3つの性質がある。 <br />
<br />
#水溶液中に存在する場合に比べ、細胞膜に結合すると[[wikipedia:ja:量子効率|量子効率]]が著増し、強い[[wikipedia:ja:蛍光|蛍光]]を出す。 <br />
#[[wikipedia:ja:脂質二重層|脂質二重膜]]を透過しない。 <br />
#[[wikipedia:ja:両親媒性分子|両親媒性]]で可逆的に膜を染める。<br />
<br />
== 分子構造 ==<br />
<br />
[[Image:Takahashinoriko fig 2.jpg|thumb|250px|'''図2．（タイトル：FM 色素群の分子構造）''' 説明：二重結合の数は色調に、炭素鎖の数は細胞膜との親和性や蛍光強度に関連する]] 構造は、[[wikipedia:ja:親水性|親水性]]領域、[[wikipedia:ja:二重結合|二重結合]]領域、[[wikipedia:ja:疎水性|疎水性]]炭素鎖領域に分けられる。 <br />
<br />
親水性領域が正の電荷をもつため、膜を通過しない。二重結合の数は蛍光波長に関連する。 <br />
<br />
二重結合が一つの FM1-43、FM1-84、FM2-10 は黄色蛍光を呈し、二重結合が二つの FM4-64、FM5-95 は赤色蛍光を呈する。 <br />
<br />
疎水性炭素鎖の長さは細胞膜の染め方に関連し、長いものほど明るく、一旦膜に組み込まれると離脱しがたい<ref><pubmed> 10202529 </pubmed></ref>。 FM1-43 の炭素鎖数は4であり、解離時定数τ<sub>diss</sub>は8 msを示す。より短いFM2-10(炭素鎖数 2)は、比較的離脱しやすい(τ<sub>diss</sub>=6.4 ms)。逆に、より長い FM1-84（炭素鎖数 5）は離脱に時間がかかる(τ<sub>diss</sub>=36 ms)<ref><pubmed> 19580748 </pubmed></ref>。 <br />
<br />
== 蛍光特性 ==<br />
<br />
FM1-43の[[wikipedia:ja:励起状態|励起]]には1光子では波長480 nm光、2光子では波長840 nm光が頻用される。 <br />
<br />
極大蛍光波長は[[wikipedia:ja:リポソーム|リポソーム]]中にて580 nmである。 <br />
<br />
波長480nm光の高出力励起（～150 μW）にて[[wikipedia:3,3'-Diaminobenzidine|ジアミノベンチジン]]（DAB）の光変換（photoconversion） を起こす。そのため、[[wikipedia:ja:アルデヒド|アルデヒド]]で固定可能な色素であるFM1-43FX と DABを細胞に与え光変換させると、共局在部位で電子密度の高い産物が作られ、[[電子顕微鏡]]観察が可能となる。FM1-43を取り込んだ小胞が、高い電子密度で描出され、微細構造解析に活用されている。 <br />
<br />
== 応用例 ==<br />
<br />
<br />
<br />
==== シナプス前終末における小胞プールの大きさと開口放出確率の測定 ====<br />
<br />
[[Image:Takahashinoriko fig 3.jpg|thumb|250px|'''図3．（タイトル：開口放出に伴う FM 蛍光の変化''' 説明：膜融合時、細胞外色素の有無により蛍光変化の様式が異なる）]] <br />
<br />
シナプスを刺激した時にミリ秒で起きる伝達物質放出は、活性帯にドックした小胞が開口放出すると仮想されている。この仮想的な小胞群を即時性放出プール[[Readily releasable pool]]（RRP）という。[[シナプス小胞]]は開口放出後30-60秒で細胞内部に[[エンドサイトーシス]]で取り込まれる(図 3左）。更に、シナプス終末内でシナプス小胞に再生されて即時性放出プールに再び至る。これをリサイクリングと呼び、これに関係する小胞の全体をリサイクリングプール(recycling pool)、又は放出可能プール(TRP)という。<br />
<br />
細胞外を FM1-43 で還流中に、長い放出刺激（例 20 Hz、900 発）を与え[[開口放出]]([[エクソサイトーシス]]）した小胞の膜を染めた後、細胞外を色素を含まない溶液で還流し、細胞外膜に結合した色素を wash out すると、TRPの全体が染まる。一方、ちょうどRRPにある小胞を枯渇させる程度の短い放出刺激（例 20 Hz、30 発）を与えて負荷後にwash outをするとRRPが選択的に染まる。この様な解析から、RRPはTRPの10-30%でないかと推定されており<ref><pubmed> 15044806 </pubmed></ref>、TRPが40個程度の小さなシナプスではRRPの小胞数は4-12個となる。<br />
<br />
次に、TRPを染めた小胞に刺激を与えると、シナプス小胞は細胞膜と融合し、FM1-43が細胞外液へ拡散することにより神経終末の蛍光は減弱する脱染色（destaining 図3右）。このdestainingの時間経過は、小胞の開口放出確率が大きい程速い。定量的には、RRPにある小胞の数を [RRP]、その放出確率をPvとすると、一回の刺激で放出される小胞の数は平均で Pv [RRP]となる。一方、TRPにある小胞の数を[TRP]、一回の刺激によるTRPの蛍光の減弱率をkとすると、一回の刺激で放出される小胞の数は k [TRP]となる。よって、Pv [RRP] = k [TRP] となり、これからPv = k [RRP]/[TRP] という関係式が得られ、終末ごとにRRPにある小胞の放出確率を求めることができる <ref><pubmed>23049481 </pubmed></ref>。このPvと、一回の刺激である終末から開口放出が起きる確率 Pr との間には、RRP内の小胞の放出確率が等しければ<math>Pr=1-(1-Pv)^{[RRP]}</math>という関係がある。PrもFM1-43を用いて直接求めた例がある<ref><pubmed> 9136769 </pubmed></ref> 。<br />
<br />
FM1-43によって染めることができるTRPの小胞は、電子顕微鏡的に終末に存在する小胞の15-20%である<ref><pubmed> 15044806 </pubmed></ref>。 この電子顕微鏡的に同定されるリサイクリングされ難いシナプス小胞の群をreserve pool 或いは resting poolと言う。このプールの小胞もゆっくりとしたリサイクリングに関係していることが他の方法によって明らかとなっている<ref><pubmed>21835344 </pubmed></ref>。<br />
<br />
==== シナプス小胞の動態の解析 ====<br />
<br />
開口放出した顆粒は[[Active zone]]の周辺から内部に取り込まれ（[[エンドサイトーシス]]）、再び放出可能となる（[[リサイクル]]）。このリサイクルにかかる時間は、[[海馬]]培養標本では 20-30秒、神経筋接合部では 60秒と見積もられた。TRPをFM1-43で染めた後、電顕で見ると染色された小胞は、元来小胞があった領域のほぼ全域に拡散し、core(中央部）への拡散のみが軽度に少なかった。また、リサイクルした小胞は、初めて刺激を受けたプール同様の放出確率を持つことが報告された<ref><pubmed> 1553547 </pubmed></ref> 。<br />
<br />
=== 膜融合様式の解析 ===<br />
<br />
FM色素には、炭素鎖数の異なる複数種類の色素がある。これらが小胞膜を染める頻度を比較することにより、融合細孔の開放時間の長短が識別可能となる。 <br />
<br />
FM2-10やFM1-43色素を用い、小胞膜から離脱する[[完全融合]]型（full fusion）と、離脱しない[[不完全融合]]型（incomplete fusion）の識別が行われた<ref><pubmed> 9707119 </pubmed></ref> <ref><pubmed> 12354398 </pubmed></ref>。 <br />
<br />
=== 開口放出現象の可視化 ===<br />
<br />
FM1-43を[[網膜]][[双極性細胞]]のシナプス小胞に取り込ませて標識し、[[全反射顕微鏡]]で細胞膜直下（～100nm）の観察を行い、単一小胞の開口放出現象の可視化が報告された<ref><pubmed> 10972279 </pubmed></ref> 。 <br />
<br />
また、[[下垂体]][[前葉細胞]] (lactotrophs) や[[wikipedia:ja:膵島|膵島]]細胞においても、[[ホルモン]]を含む大型[[有芯小胞]]の[[膜融合]]に伴い、開口放出部位においてFM1-43蛍光強度の上昇が報告された <ref><pubmed> 10953007 </pubmed></ref><ref><pubmed>12193788 </pubmed></ref>。 <br />
<br />
=== 分泌小胞の直径測定 ===<br />
<br />
シナプス小胞から大型有芯小胞に至るまで、小胞の直径計測に有効である <ref><pubmed> 16150799 </pubmed></ref>。 <br />
<br />
水溶性色素（赤色[[wikipedia:ja:スルホローダミンB|スルホローダミンB]], SRB）とFM1-43を細胞外液に同時に与え、開口放出を誘発すると、水溶性色素は小胞内部に進入し、FM1-43は細胞外膜から小胞内膜へ拡散するため、開口放出した小胞が両色素で描出される。この際 [[２光子レーザー走査顕微鏡]]で画像を取得し、双方の色素の増加分の比を求めると小胞直径が計算される（直径＝6 ΔSRB/ΔFM1-43）。本法は色素濃度やレンズ特性（[[wikipedia:ja:点拡がり関数|点拡がり関数]]）によらず、シナプス小胞のような光学[[wikipedia:ja:解像度|解像度]]以下の器官の計測にも応用可能である。 <br />
<br />
== 関連項目 ==<br />
<br />
*[[開口放出]]（[[エクソサイトーシス]]） <br />
*[[膜融合]] <br />
*[[シナプス]] <br />
*[[wikipedia:ja:分泌|分泌]]<br />
<br />
== 参考文献 ==<br />
<br />
<references /><br />
<br />
<br>（執筆者：高橋倫子、河西春郎 担当編集委員：柚崎通介） </div>
Hkasai
https://bsd.neuroinf.jp/w/index.php?title=FM1-43&diff=19959
FM1-43
2013-04-25T15:44:39Z
<p>Hkasai: /* シナプス前機能の解析 */</p>
<hr />
<div>{{Chembox<br />
| ImageFile = FM1-43.png<br />
| ImageSize = 220px<br />
| ImageAlt = <br />
| IUPACName = 3-[4-[2-[4-(dibutylamino)phenyl]ethenyl]pyridin-1-ium-1-yl]propyl-triethylazanium dibromide<br />
| OtherNames = Frie Mao 1-43, SynaptoGreen™ Reagent, SureCN1527120, N-(3-Triethylammoniumpropyl)-4-(p-dibutylaminostyryl)pyridinium, 2Br<br />
| Section1 = {{Chembox Identifiers<br />
| CASNo = 149838-22-2<br />
| PubChem = 2733618<br />
| SMILES =CCCCN(CCCC)C1=CC=C(C=C1)C=CC2=CC=[N+](C=C2)CCC[N+](CC)(CC)CC.[Br-].[Br-] }}<br />
| Section2 = {{Chembox Properties<br />
| Formula = C30H49Br2N3<br />
| MolarMass = 611.53816<br />
| Appearance = <br />
| Density = <br />
| MeltingPt = <br />
| BoilingPt = <br />
| Solubility = }}<br />
| Section3 = {{Chembox Hazards<br />
| MainHazards = <br />
| FlashPt = <br />
| Autoignition = }}<br />
}} <br />
<br />
FM 色素は[[wikipedia:ja:脂質二重層|脂質二重膜]]を可逆的に染める蛍光色素で、[[シナプス前終末]]の機能や[[wikipedia:ja:分泌|分泌]]現象の計測に活用されている。 <br />
<br />
== FM1-43とは ==<br />
<br />
[[Image:Takahashinoriko fig 1.jpg|thumb|250px|'''図1．（タイトル：FM 色素による還流と細胞膜の蛍光標識）''' 説明：FM 色素液で細胞を還流すると細胞外膜が蛍光を発する。]] Molecular Probe 社の Fei Mao は William J Betz らとともに、細胞膜を染める一連のスチリル色素を合成した。これらを FM (Fei Mao)色素と呼び、FM1-43 はその代表格である。[[シナプス前終末]]の機能解析や、分泌小胞の動態解析に広く用いられる。 <br />
<br />
色素の特性として次の3つの性質がある。 <br />
<br />
#水溶液中に存在する場合に比べ、細胞膜に結合すると[[wikipedia:ja:量子効率|量子効率]]が著増し、強い[[wikipedia:ja:蛍光|蛍光]]を出す。 <br />
#[[wikipedia:ja:脂質二重層|脂質二重膜]]を透過しない。 <br />
#[[wikipedia:ja:両親媒性分子|両親媒性]]で可逆的に膜を染める。<br />
<br />
== 分子構造 ==<br />
<br />
[[Image:Takahashinoriko fig 2.jpg|thumb|250px|'''図2．（タイトル：FM 色素群の分子構造）''' 説明：二重結合の数は色調に、炭素鎖の数は細胞膜との親和性や蛍光強度に関連する]] 構造は、[[wikipedia:ja:親水性|親水性]]領域、[[wikipedia:ja:二重結合|二重結合]]領域、[[wikipedia:ja:疎水性|疎水性]]炭素鎖領域に分けられる。 <br />
<br />
親水性領域が正の電荷をもつため、膜を通過しない。二重結合の数は蛍光波長に関連する。 <br />
<br />
二重結合が一つの FM1-43、FM1-84、FM2-10 は黄色蛍光を呈し、二重結合が二つの FM4-64、FM5-95 は赤色蛍光を呈する。 <br />
<br />
疎水性炭素鎖の長さは細胞膜の染め方に関連し、長いものほど明るく、一旦膜に組み込まれると離脱しがたい<ref><pubmed> 10202529 </pubmed></ref>。 FM1-43 の炭素鎖数は4であり、解離時定数τ<sub>diss</sub>は8 msを示す。より短いFM2-10(炭素鎖数 2)は、比較的離脱しやすい(τ<sub>diss</sub>=6.4 ms)。逆に、より長い FM1-84（炭素鎖数 5）は離脱に時間がかかる(τ<sub>diss</sub>=36 ms)<ref><pubmed> 19580748 </pubmed></ref>。 <br />
<br />
== 蛍光特性 ==<br />
<br />
FM1-43の[[wikipedia:ja:励起状態|励起]]には1光子では波長480 nm光、2光子では波長840 nm光が頻用される。 <br />
<br />
極大蛍光波長は[[wikipedia:ja:リポソーム|リポソーム]]中にて580 nmである。 <br />
<br />
波長480nm光の高出力励起（～150 μW）にて[[wikipedia:3,3'-Diaminobenzidine|ジアミノベンチジン]]（DAB）の光変換（photoconversion） を起こす。そのため、[[wikipedia:ja:アルデヒド|アルデヒド]]で固定可能な色素であるFM1-43FX と DABを細胞に与え光変換させると、共局在部位で電子密度の高い産物が作られ、[[電子顕微鏡]]観察が可能となる。FM1-43を取り込んだ小胞が、高い電子密度で描出され、微細構造解析に活用されている。 <br />
<br />
== 応用例 ==<br />
<br />
<br />
<br />
==== シナプス前終末における小胞プールの大きさと開口放出確率の測定 ====<br />
<br />
[[Image:Takahashinoriko fig 3.jpg|thumb|250px|'''図3．（タイトル：開口放出に伴う FM 蛍光の変化''' 説明：膜融合時、細胞外色素の有無により蛍光変化の様式が異なる）]] <br />
<br />
シナプスを刺激した時にミリ秒で起きる伝達物質放出は、活性帯にドックした小胞が開口放出すると仮想されている。この仮想的な小胞群を即時性放出プール[[Readily releasable pool]]（RRP）という。[[シナプス小胞]]は開口放出後30-60秒で細胞内部に[[エンドサイトーシス]]で取り込まれる(図 3左）。更に、シナプス終末内でシナプス小胞に再生されて即時性放出プールに再び至る。これをリサイクリングと呼び、これに関係する小胞の全体をリサイクリングプール(recycling pool)、又は放出可能プール(TRP)という。<br />
<br />
細胞外を FM1-43 で還流中に、長い放出刺激（例 20 Hz、900 発）を与え[[開口放出]]([[エクソサイトーシス]]）した小胞の膜を染めた後、細胞外を色素を含まない溶液で還流し、細胞外膜に結合した色素を wash out すると、TRPの全体が染まる。一方、ちょうどRRPにある小胞を枯渇させる程度の短い放出刺激（例 20 Hz、30 発）を与えて負荷後にwash outをするとRRPが選択的に染まる。この様な解析から、RRPはTRPの10-30%でないかと推定されており<ref><pubmed> 15044806 </pubmed></ref>、TRPが40個程度の小さなシナプスではRRPの小胞数は4-12個となる。<br />
<br />
次に、TRPを染めた小胞に刺激を与えると、シナプス小胞は細胞膜と融合し、FM1-43が細胞外液へ拡散することにより神経終末の蛍光は減弱する脱染色（destaining 図3右）。このdestainingの時間経過は、小胞の開口放出確率が大きい程速い。定量的には、RRPにある小胞の数を [RRP]、その放出確率をPvとすると、一回の刺激で放出される小胞の数は平均で Pv [RRP]となる。一方、TRPにある小胞の数を[TRP]、一回の刺激によるTRPの蛍光の減弱率をkとすると、一回の刺激で放出される小胞の数は k [TRP]となる。よって、Pv [RRP] = k [TRP] となり、これからPv = k [RRP]/[TRP] という関係式が得られ、終末ごとにRRPにある小胞の放出確率を求めることができる <ref><pubmed>23049481 </pubmed></ref>。このPvと、一回の刺激である終末から開口放出が起きる確率 Pr の間には小胞間で放出確率が等しければ<math>Pr=1-(1-Pv)^{[RRP]}</math>という関係がある。PrもFM1-43を用いて直接求めた例がある<ref><pubmed> 9136769 </pubmed></ref> 。<br />
<br />
FM1-43によって染めることができるTRPの小胞は、電子顕微鏡的に終末に存在する小胞の15-20%である<ref><pubmed> 15044806 </pubmed></ref>。 この電子顕微鏡的に同定されるリサイクリングされ難いシナプス小胞の群をreserve pool 或いは resting poolと言う。このプールの小胞もゆっくりとしたリサイクリングに関係していることが他の方法によって明らかとなっている<ref><pubmed>21835344 </pubmed></ref>。<br />
<br />
==== シナプス小胞の動態の解析 ====<br />
<br />
開口放出した顆粒は[[Active zone]]の周辺から内部に取り込まれ（[[エンドサイトーシス]]）、再び放出可能となる（[[リサイクル]]）。このリサイクルにかかる時間は、[[海馬]]培養標本では 20-30秒、神経筋接合部では 60秒と見積もられた。TRPをFM1-43で染めた後、電顕で見ると染色された小胞は、元来小胞があった領域のほぼ全域に拡散し、core(中央部）への拡散のみが軽度に少なかった。また、リサイクルした小胞は、初めて刺激を受けたプール同様の放出確率を持つことが報告された<ref><pubmed> 1553547 </pubmed></ref> 。<br />
<br />
=== 膜融合様式の解析 ===<br />
<br />
FM色素には、炭素鎖数の異なる複数種類の色素がある。これらが小胞膜を染める頻度を比較することにより、融合細孔の開放時間の長短が識別可能となる。 <br />
<br />
FM2-10やFM1-43色素を用い、小胞膜から離脱する[[完全融合]]型（full fusion）と、離脱しない[[不完全融合]]型（incomplete fusion）の識別が行われた<ref><pubmed> 9707119 </pubmed></ref> <ref><pubmed> 12354398 </pubmed></ref>。 <br />
<br />
=== 開口放出現象の可視化 ===<br />
<br />
FM1-43を[[網膜]][[双極性細胞]]のシナプス小胞に取り込ませて標識し、[[全反射顕微鏡]]で細胞膜直下（～100nm）の観察を行い、単一小胞の開口放出現象の可視化が報告された<ref><pubmed> 10972279 </pubmed></ref> 。 <br />
<br />
また、[[下垂体]][[前葉細胞]] (lactotrophs) や[[wikipedia:ja:膵島|膵島]]細胞においても、[[ホルモン]]を含む大型[[有芯小胞]]の[[膜融合]]に伴い、開口放出部位においてFM1-43蛍光強度の上昇が報告された <ref><pubmed> 10953007 </pubmed></ref><ref><pubmed>12193788 </pubmed></ref>。 <br />
<br />
=== 分泌小胞の直径測定 ===<br />
<br />
シナプス小胞から大型有芯小胞に至るまで、小胞の直径計測に有効である <ref><pubmed> 16150799 </pubmed></ref>。 <br />
<br />
水溶性色素（赤色[[wikipedia:ja:スルホローダミンB|スルホローダミンB]], SRB）とFM1-43を細胞外液に同時に与え、開口放出を誘発すると、水溶性色素は小胞内部に進入し、FM1-43は細胞外膜から小胞内膜へ拡散するため、開口放出した小胞が両色素で描出される。この際 [[２光子レーザー走査顕微鏡]]で画像を取得し、双方の色素の増加分の比を求めると小胞直径が計算される（直径＝6 ΔSRB/ΔFM1-43）。本法は色素濃度やレンズ特性（[[wikipedia:ja:点拡がり関数|点拡がり関数]]）によらず、シナプス小胞のような光学[[wikipedia:ja:解像度|解像度]]以下の器官の計測にも応用可能である。 <br />
<br />
== 関連項目 ==<br />
<br />
*[[開口放出]]（[[エクソサイトーシス]]） <br />
*[[膜融合]] <br />
*[[シナプス]] <br />
*[[wikipedia:ja:分泌|分泌]]<br />
<br />
== 参考文献 ==<br />
<br />
<references /><br />
<br />
<br>（執筆者：高橋倫子、河西春郎 担当編集委員：柚崎通介） </div>
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FM1-43
2013-04-25T15:43:28Z
<p>Hkasai: /* シナプス前機能の解析 */</p>
<hr />
<div>{{Chembox<br />
| ImageFile = FM1-43.png<br />
| ImageSize = 220px<br />
| ImageAlt = <br />
| IUPACName = 3-[4-[2-[4-(dibutylamino)phenyl]ethenyl]pyridin-1-ium-1-yl]propyl-triethylazanium dibromide<br />
| OtherNames = Frie Mao 1-43, SynaptoGreen™ Reagent, SureCN1527120, N-(3-Triethylammoniumpropyl)-4-(p-dibutylaminostyryl)pyridinium, 2Br<br />
| Section1 = {{Chembox Identifiers<br />
| CASNo = 149838-22-2<br />
| PubChem = 2733618<br />
| SMILES =CCCCN(CCCC)C1=CC=C(C=C1)C=CC2=CC=[N+](C=C2)CCC[N+](CC)(CC)CC.[Br-].[Br-] }}<br />
| Section2 = {{Chembox Properties<br />
| Formula = C30H49Br2N3<br />
| MolarMass = 611.53816<br />
| Appearance = <br />
| Density = <br />
| MeltingPt = <br />
| BoilingPt = <br />
| Solubility = }}<br />
| Section3 = {{Chembox Hazards<br />
| MainHazards = <br />
| FlashPt = <br />
| Autoignition = }}<br />
}} <br />
<br />
FM 色素は[[wikipedia:ja:脂質二重層|脂質二重膜]]を可逆的に染める蛍光色素で、[[シナプス前終末]]の機能や[[wikipedia:ja:分泌|分泌]]現象の計測に活用されている。 <br />
<br />
== FM1-43とは ==<br />
<br />
[[Image:Takahashinoriko fig 1.jpg|thumb|250px|'''図1．（タイトル：FM 色素による還流と細胞膜の蛍光標識）''' 説明：FM 色素液で細胞を還流すると細胞外膜が蛍光を発する。]] Molecular Probe 社の Fei Mao は William J Betz らとともに、細胞膜を染める一連のスチリル色素を合成した。これらを FM (Fei Mao)色素と呼び、FM1-43 はその代表格である。[[シナプス前終末]]の機能解析や、分泌小胞の動態解析に広く用いられる。 <br />
<br />
色素の特性として次の3つの性質がある。 <br />
<br />
#水溶液中に存在する場合に比べ、細胞膜に結合すると[[wikipedia:ja:量子効率|量子効率]]が著増し、強い[[wikipedia:ja:蛍光|蛍光]]を出す。 <br />
#[[wikipedia:ja:脂質二重層|脂質二重膜]]を透過しない。 <br />
#[[wikipedia:ja:両親媒性分子|両親媒性]]で可逆的に膜を染める。<br />
<br />
== 分子構造 ==<br />
<br />
[[Image:Takahashinoriko fig 2.jpg|thumb|250px|'''図2．（タイトル：FM 色素群の分子構造）''' 説明：二重結合の数は色調に、炭素鎖の数は細胞膜との親和性や蛍光強度に関連する]] 構造は、[[wikipedia:ja:親水性|親水性]]領域、[[wikipedia:ja:二重結合|二重結合]]領域、[[wikipedia:ja:疎水性|疎水性]]炭素鎖領域に分けられる。 <br />
<br />
親水性領域が正の電荷をもつため、膜を通過しない。二重結合の数は蛍光波長に関連する。 <br />
<br />
二重結合が一つの FM1-43、FM1-84、FM2-10 は黄色蛍光を呈し、二重結合が二つの FM4-64、FM5-95 は赤色蛍光を呈する。 <br />
<br />
疎水性炭素鎖の長さは細胞膜の染め方に関連し、長いものほど明るく、一旦膜に組み込まれると離脱しがたい<ref><pubmed> 10202529 </pubmed></ref>。 FM1-43 の炭素鎖数は4であり、解離時定数τ<sub>diss</sub>は8 msを示す。より短いFM2-10(炭素鎖数 2)は、比較的離脱しやすい(τ<sub>diss</sub>=6.4 ms)。逆に、より長い FM1-84（炭素鎖数 5）は離脱に時間がかかる(τ<sub>diss</sub>=36 ms)<ref><pubmed> 19580748 </pubmed></ref>。 <br />
<br />
== 蛍光特性 ==<br />
<br />
FM1-43の[[wikipedia:ja:励起状態|励起]]には1光子では波長480 nm光、2光子では波長840 nm光が頻用される。 <br />
<br />
極大蛍光波長は[[wikipedia:ja:リポソーム|リポソーム]]中にて580 nmである。 <br />
<br />
波長480nm光の高出力励起（～150 μW）にて[[wikipedia:3,3'-Diaminobenzidine|ジアミノベンチジン]]（DAB）の光変換（photoconversion） を起こす。そのため、[[wikipedia:ja:アルデヒド|アルデヒド]]で固定可能な色素であるFM1-43FX と DABを細胞に与え光変換させると、共局在部位で電子密度の高い産物が作られ、[[電子顕微鏡]]観察が可能となる。FM1-43を取り込んだ小胞が、高い電子密度で描出され、微細構造解析に活用されている。 <br />
<br />
== 応用例 ==<br />
<br />
=== シナプス前機能の解析 ===<br />
<br />
<math><math>ここに数式を挿入</math></math>==== シナプス前終末における小胞プールの大きさと開口放出確率の測定 ====<br />
<br />
[[Image:Takahashinoriko fig 3.jpg|thumb|250px|'''図3．（タイトル：開口放出に伴う FM 蛍光の変化''' 説明：膜融合時、細胞外色素の有無により蛍光変化の様式が異なる）]] <br />
<br />
シナプスを刺激した時にミリ秒で起きる伝達物質放出は、活性帯にドックした小胞が開口放出すると仮想されている。この仮想的な小胞群を即時性放出プール[[Readily releasable pool]]（RRP）という。[[シナプス小胞]]は開口放出後30-60秒で細胞内部に[[エンドサイトーシス]]で取り込まれる(図 3左）。更に、シナプス終末内でシナプス小胞に再生されて即時性放出プールに再び至る。これをリサイクリングと呼び、これに関係する小胞の全体をリサイクリングプール(recycling pool)、又は放出可能プール(TRP)という。<br />
<br />
細胞外を FM1-43 で還流中に、長い放出刺激（例 20 Hz、900 発）を与え[[開口放出]]([[エクソサイトーシス]]）した小胞の膜を染めた後、細胞外を色素を含まない溶液で還流し、細胞外膜に結合した色素を wash out すると、TRPの全体が染まる。一方、ちょうどRRPにある小胞を枯渇させる程度の短い放出刺激（例 20 Hz、30 発）を与えて負荷後にwash outをするとRRPが選択的に染まる。この様な解析から、RRPはTRPの10-30%でないかと推定されており<ref><pubmed> 15044806 </pubmed></ref>、TRPが40個程度の小さなシナプスではRRPの小胞数は4-12個となる。<br />
<br />
次に、TRPを染めた小胞に刺激を与えると、シナプス小胞は細胞膜と融合し、FM1-43が細胞外液へ拡散することにより神経終末の蛍光は減弱する脱染色（destaining 図3右）。このdestainingの時間経過は、小胞の開口放出確率が大きい程速い。定量的には、RRPにある小胞の数を [RRP]、その放出確率をPvとすると、一回の刺激で放出される小胞の数は平均で Pv [RRP]となる。一方、TRPにある小胞の数を[TRP]、一回の刺激によるTRPの蛍光の減弱率をkとすると、一回の刺激で放出される小胞の数は k [TRP]となる。よって、Pv [RRP] = k [TRP] となり、これからPv = k [RRP]/[TRP] という関係式が得られ、終末ごとにRRPにある小胞の放出確率を求めることができる <ref><pubmed>23049481 </pubmed></ref>。このPvと、一回の刺激である終末から開口放出が起きる確率 Pr の間には小胞間で放出確率が等しければ<math>Pr=1-(1-Pv)^{[RRP]}</math>という関係がある。PrもFM1-43を用いて直接求めた例がある<ref><pubmed> 9136769 </pubmed></ref> 。<br />
<br />
FM1-43によって染めることができるTRPの小胞は、電子顕微鏡的に終末に存在する小胞の15-20%である<ref><pubmed> 15044806 </pubmed></ref>。 この電子顕微鏡的に同定されるリサイクリングされ難いシナプス小胞の群をreserve pool 或いは resting poolと言う。このプールの小胞もゆっくりとしたリサイクリングに関係していることが他の方法によって明らかとなっている<ref><pubmed>21835344 </pubmed></ref>。<br />
<br />
==== シナプス小胞の動態の解析 ====<br />
<br />
開口放出した顆粒は[[Active zone]]の周辺から内部に取り込まれ（[[エンドサイトーシス]]）、再び放出可能となる（[[リサイクル]]）。このリサイクルにかかる時間は、[[海馬]]培養標本では 20-30秒、神経筋接合部では 60秒と見積もられた。TRPをFM1-43で染めた後、電顕で見ると染色された小胞は、元来小胞があった領域のほぼ全域に拡散し、core(中央部）への拡散のみが軽度に少なかった。また、リサイクルした小胞は、初めて刺激を受けたプール同様の放出確率を持つことが報告された<ref><pubmed> 1553547 </pubmed></ref> 。<br />
<br />
=== 膜融合様式の解析 ===<br />
<br />
FM色素には、炭素鎖数の異なる複数種類の色素がある。これらが小胞膜を染める頻度を比較することにより、融合細孔の開放時間の長短が識別可能となる。 <br />
<br />
FM2-10やFM1-43色素を用い、小胞膜から離脱する[[完全融合]]型（full fusion）と、離脱しない[[不完全融合]]型（incomplete fusion）の識別が行われた<ref><pubmed> 9707119 </pubmed></ref> <ref><pubmed> 12354398 </pubmed></ref>。 <br />
<br />
=== 開口放出現象の可視化 ===<br />
<br />
FM1-43を[[網膜]][[双極性細胞]]のシナプス小胞に取り込ませて標識し、[[全反射顕微鏡]]で細胞膜直下（～100nm）の観察を行い、単一小胞の開口放出現象の可視化が報告された<ref><pubmed> 10972279 </pubmed></ref> 。 <br />
<br />
また、[[下垂体]][[前葉細胞]] (lactotrophs) や[[wikipedia:ja:膵島|膵島]]細胞においても、[[ホルモン]]を含む大型[[有芯小胞]]の[[膜融合]]に伴い、開口放出部位においてFM1-43蛍光強度の上昇が報告された <ref><pubmed> 10953007 </pubmed></ref><ref><pubmed>12193788 </pubmed></ref>。 <br />
<br />
=== 分泌小胞の直径測定 ===<br />
<br />
シナプス小胞から大型有芯小胞に至るまで、小胞の直径計測に有効である <ref><pubmed> 16150799 </pubmed></ref>。 <br />
<br />
水溶性色素（赤色[[wikipedia:ja:スルホローダミンB|スルホローダミンB]], SRB）とFM1-43を細胞外液に同時に与え、開口放出を誘発すると、水溶性色素は小胞内部に進入し、FM1-43は細胞外膜から小胞内膜へ拡散するため、開口放出した小胞が両色素で描出される。この際 [[２光子レーザー走査顕微鏡]]で画像を取得し、双方の色素の増加分の比を求めると小胞直径が計算される（直径＝6 ΔSRB/ΔFM1-43）。本法は色素濃度やレンズ特性（[[wikipedia:ja:点拡がり関数|点拡がり関数]]）によらず、シナプス小胞のような光学[[wikipedia:ja:解像度|解像度]]以下の器官の計測にも応用可能である。 <br />
<br />
== 関連項目 ==<br />
<br />
*[[開口放出]]（[[エクソサイトーシス]]） <br />
*[[膜融合]] <br />
*[[シナプス]] <br />
*[[wikipedia:ja:分泌|分泌]]<br />
<br />
== 参考文献 ==<br />
<br />
<references /><br />
<br />
<br>（執筆者：高橋倫子、河西春郎 担当編集委員：柚崎通介） </div>
Hkasai
https://bsd.neuroinf.jp/w/index.php?title=FM1-43&diff=19957
FM1-43
2013-04-25T15:42:31Z
<p>Hkasai: /* シナプス前機能の解析 */</p>
<hr />
<div>{{Chembox<br />
| ImageFile = FM1-43.png<br />
| ImageSize = 220px<br />
| ImageAlt = <br />
| IUPACName = 3-[4-[2-[4-(dibutylamino)phenyl]ethenyl]pyridin-1-ium-1-yl]propyl-triethylazanium dibromide<br />
| OtherNames = Frie Mao 1-43, SynaptoGreen™ Reagent, SureCN1527120, N-(3-Triethylammoniumpropyl)-4-(p-dibutylaminostyryl)pyridinium, 2Br<br />
| Section1 = {{Chembox Identifiers<br />
| CASNo = 149838-22-2<br />
| PubChem = 2733618<br />
| SMILES =CCCCN(CCCC)C1=CC=C(C=C1)C=CC2=CC=[N+](C=C2)CCC[N+](CC)(CC)CC.[Br-].[Br-] }}<br />
| Section2 = {{Chembox Properties<br />
| Formula = C30H49Br2N3<br />
| MolarMass = 611.53816<br />
| Appearance = <br />
| Density = <br />
| MeltingPt = <br />
| BoilingPt = <br />
| Solubility = }}<br />
| Section3 = {{Chembox Hazards<br />
| MainHazards = <br />
| FlashPt = <br />
| Autoignition = }}<br />
}} <br />
<br />
FM 色素は[[wikipedia:ja:脂質二重層|脂質二重膜]]を可逆的に染める蛍光色素で、[[シナプス前終末]]の機能や[[wikipedia:ja:分泌|分泌]]現象の計測に活用されている。 <br />
<br />
== FM1-43とは ==<br />
<br />
[[Image:Takahashinoriko fig 1.jpg|thumb|250px|'''図1．（タイトル：FM 色素による還流と細胞膜の蛍光標識）''' 説明：FM 色素液で細胞を還流すると細胞外膜が蛍光を発する。]] Molecular Probe 社の Fei Mao は William J Betz らとともに、細胞膜を染める一連のスチリル色素を合成した。これらを FM (Fei Mao)色素と呼び、FM1-43 はその代表格である。[[シナプス前終末]]の機能解析や、分泌小胞の動態解析に広く用いられる。 <br />
<br />
色素の特性として次の3つの性質がある。 <br />
<br />
#水溶液中に存在する場合に比べ、細胞膜に結合すると[[wikipedia:ja:量子効率|量子効率]]が著増し、強い[[wikipedia:ja:蛍光|蛍光]]を出す。 <br />
#[[wikipedia:ja:脂質二重層|脂質二重膜]]を透過しない。 <br />
#[[wikipedia:ja:両親媒性分子|両親媒性]]で可逆的に膜を染める。<br />
<br />
== 分子構造 ==<br />
<br />
[[Image:Takahashinoriko fig 2.jpg|thumb|250px|'''図2．（タイトル：FM 色素群の分子構造）''' 説明：二重結合の数は色調に、炭素鎖の数は細胞膜との親和性や蛍光強度に関連する]] 構造は、[[wikipedia:ja:親水性|親水性]]領域、[[wikipedia:ja:二重結合|二重結合]]領域、[[wikipedia:ja:疎水性|疎水性]]炭素鎖領域に分けられる。 <br />
<br />
親水性領域が正の電荷をもつため、膜を通過しない。二重結合の数は蛍光波長に関連する。 <br />
<br />
二重結合が一つの FM1-43、FM1-84、FM2-10 は黄色蛍光を呈し、二重結合が二つの FM4-64、FM5-95 は赤色蛍光を呈する。 <br />
<br />
疎水性炭素鎖の長さは細胞膜の染め方に関連し、長いものほど明るく、一旦膜に組み込まれると離脱しがたい<ref><pubmed> 10202529 </pubmed></ref>。 FM1-43 の炭素鎖数は4であり、解離時定数τ<sub>diss</sub>は8 msを示す。より短いFM2-10(炭素鎖数 2)は、比較的離脱しやすい(τ<sub>diss</sub>=6.4 ms)。逆に、より長い FM1-84（炭素鎖数 5）は離脱に時間がかかる(τ<sub>diss</sub>=36 ms)<ref><pubmed> 19580748 </pubmed></ref>。 <br />
<br />
== 蛍光特性 ==<br />
<br />
FM1-43の[[wikipedia:ja:励起状態|励起]]には1光子では波長480 nm光、2光子では波長840 nm光が頻用される。 <br />
<br />
極大蛍光波長は[[wikipedia:ja:リポソーム|リポソーム]]中にて580 nmである。 <br />
<br />
波長480nm光の高出力励起（～150 μW）にて[[wikipedia:3,3'-Diaminobenzidine|ジアミノベンチジン]]（DAB）の光変換（photoconversion） を起こす。そのため、[[wikipedia:ja:アルデヒド|アルデヒド]]で固定可能な色素であるFM1-43FX と DABを細胞に与え光変換させると、共局在部位で電子密度の高い産物が作られ、[[電子顕微鏡]]観察が可能となる。FM1-43を取り込んだ小胞が、高い電子密度で描出され、微細構造解析に活用されている。 <br />
<br />
== 応用例 ==<br />
<br />
=== シナプス前機能の解析 ===<br />
<br />
<math><math>ここに数式を挿入</math></math>==== シナプス前終末における小胞プールの大きさと開口放出確率の測定 ====<br />
<br />
[[Image:Takahashinoriko fig 3.jpg|thumb|250px|'''図3．（タイトル：開口放出に伴う FM 蛍光の変化''' 説明：膜融合時、細胞外色素の有無により蛍光変化の様式が異なる）]] <br />
<br />
シナプスを刺激した時にミリ秒で起きる伝達物質放出は、活性帯にドックした小胞が開口放出すると仮想されている。この仮想的な小胞群を即時性放出プール[[Readily releasable pool]]（RRP）という。[[シナプス小胞]]は開口放出後30-60秒で細胞内部に[[エンドサイトーシス]]で取り込まれる(図 3左）。更に、シナプス終末内でシナプス小胞に再生されて即時性放出プールに再び至る。これをリサイクリングと呼び、これに関係する小胞の全体をリサイクリングプール(recycling pool)、又は放出可能プール(TRP)という。<br />
<br />
細胞外を FM1-43 で還流中に、長い放出刺激（例 20 Hz、900 発）を与え[[開口放出]]([[エクソサイトーシス]]）した小胞の膜を染めた後、細胞外を色素を含まない溶液で還流し、細胞外膜に結合した色素を wash out すると、TRPの全体が染まる。一方、ちょうどRRPにある小胞を枯渇させる程度の短い放出刺激（例 20 Hz、30 発）を与えて負荷後にwash outをするとRRPが選択的に染まる。この様な解析から、RRPはTRPの10-30%でないかと推定されており<ref><pubmed> 15044806 </pubmed></ref>、TRPが40個程度の小さなシナプスではRRPの小胞数は4-12個となる。<br />
<br />
次に、TRPを染めた小胞に刺激を与えると、シナプス小胞は細胞膜と融合し、FM1-43が細胞外液へ拡散することにより神経終末の蛍光は減弱する脱染色（destaining 図3右）。このdestainingの時間経過は、小胞の開口放出確率が大きい程速い。定量的には、RRPにある小胞の数を [RRP]、その放出確率をPvとすると、一回の刺激で放出される小胞の数は平均で Pv [RRP]となる。一方、TRPにある小胞の数を[TRP]、一回の刺激によるTRPの蛍光の減弱率をkとすると、一回の刺激で放出される小胞の数は k [TRP]となる。よって、Pv [RRP] = k [TRP] となり、これからPv = k [RRP]/[TRP] という関係式が得られ、終末ごとにRRPにある小胞の放出確率を求めることができる <ref><pubmed>23049481 </pubmed></ref>。このPvと、一回の刺激である終末から開口放出が起きる確率 Pr の間には小胞間で放出確率が等しければ<math>Pr=1-(1-Pv)^{[RRP]}/math>という関係がある。PrもFM1-43を用いて直接求めた例がある<ref><pubmed> 9136769 </pubmed></ref> 。<br />
<br />
FM1-43によって染めることができるTRPの小胞は、電子顕微鏡的に終末に存在する小胞の15-20%である<ref><pubmed> 15044806 </pubmed></ref>。 この電子顕微鏡的に同定されるリサイクリングされ難いシナプス小胞の群をreserve pool 或いは resting poolと言う。このプールの小胞もゆっくりとしたリサイクリングに関係していることが他の方法によって明らかとなっている<ref><pubmed>21835344 </pubmed></ref>。<br />
<br />
==== シナプス小胞の動態の解析 ====<br />
<br />
開口放出した顆粒は[[Active zone]]の周辺から内部に取り込まれ（[[エンドサイトーシス]]）、再び放出可能となる（[[リサイクル]]）。このリサイクルにかかる時間は、[[海馬]]培養標本では 20-30秒、神経筋接合部では 60秒と見積もられた。TRPをFM1-43で染めた後、電顕で見ると染色された小胞は、元来小胞があった領域のほぼ全域に拡散し、core(中央部）への拡散のみが軽度に少なかった。また、リサイクルした小胞は、初めて刺激を受けたプール同様の放出確率を持つことが報告された<ref><pubmed> 1553547 </pubmed></ref> 。<br />
<br />
=== 膜融合様式の解析 ===<br />
<br />
FM色素には、炭素鎖数の異なる複数種類の色素がある。これらが小胞膜を染める頻度を比較することにより、融合細孔の開放時間の長短が識別可能となる。 <br />
<br />
FM2-10やFM1-43色素を用い、小胞膜から離脱する[[完全融合]]型（full fusion）と、離脱しない[[不完全融合]]型（incomplete fusion）の識別が行われた<ref><pubmed> 9707119 </pubmed></ref> <ref><pubmed> 12354398 </pubmed></ref>。 <br />
<br />
=== 開口放出現象の可視化 ===<br />
<br />
FM1-43を[[網膜]][[双極性細胞]]のシナプス小胞に取り込ませて標識し、[[全反射顕微鏡]]で細胞膜直下（～100nm）の観察を行い、単一小胞の開口放出現象の可視化が報告された<ref><pubmed> 10972279 </pubmed></ref> 。 <br />
<br />
また、[[下垂体]][[前葉細胞]] (lactotrophs) や[[wikipedia:ja:膵島|膵島]]細胞においても、[[ホルモン]]を含む大型[[有芯小胞]]の[[膜融合]]に伴い、開口放出部位においてFM1-43蛍光強度の上昇が報告された <ref><pubmed> 10953007 </pubmed></ref><ref><pubmed>12193788 </pubmed></ref>。 <br />
<br />
=== 分泌小胞の直径測定 ===<br />
<br />
シナプス小胞から大型有芯小胞に至るまで、小胞の直径計測に有効である <ref><pubmed> 16150799 </pubmed></ref>。 <br />
<br />
水溶性色素（赤色[[wikipedia:ja:スルホローダミンB|スルホローダミンB]], SRB）とFM1-43を細胞外液に同時に与え、開口放出を誘発すると、水溶性色素は小胞内部に進入し、FM1-43は細胞外膜から小胞内膜へ拡散するため、開口放出した小胞が両色素で描出される。この際 [[２光子レーザー走査顕微鏡]]で画像を取得し、双方の色素の増加分の比を求めると小胞直径が計算される（直径＝6 ΔSRB/ΔFM1-43）。本法は色素濃度やレンズ特性（[[wikipedia:ja:点拡がり関数|点拡がり関数]]）によらず、シナプス小胞のような光学[[wikipedia:ja:解像度|解像度]]以下の器官の計測にも応用可能である。 <br />
<br />
== 関連項目 ==<br />
<br />
*[[開口放出]]（[[エクソサイトーシス]]） <br />
*[[膜融合]] <br />
*[[シナプス]] <br />
*[[wikipedia:ja:分泌|分泌]]<br />
<br />
== 参考文献 ==<br />
<br />
<references /><br />
<br />
<br>（執筆者：高橋倫子、河西春郎 担当編集委員：柚崎通介） </div>
Hkasai
https://bsd.neuroinf.jp/w/index.php?title=FM1-43&diff=19956
FM1-43
2013-04-25T15:28:25Z
<p>Hkasai: /* シナプス前機能の解析 */</p>
<hr />
<div>{{Chembox<br />
| ImageFile = FM1-43.png<br />
| ImageSize = 220px<br />
| ImageAlt = <br />
| IUPACName = 3-[4-[2-[4-(dibutylamino)phenyl]ethenyl]pyridin-1-ium-1-yl]propyl-triethylazanium dibromide<br />
| OtherNames = Frie Mao 1-43, SynaptoGreen™ Reagent, SureCN1527120, N-(3-Triethylammoniumpropyl)-4-(p-dibutylaminostyryl)pyridinium, 2Br<br />
| Section1 = {{Chembox Identifiers<br />
| CASNo = 149838-22-2<br />
| PubChem = 2733618<br />
| SMILES =CCCCN(CCCC)C1=CC=C(C=C1)C=CC2=CC=[N+](C=C2)CCC[N+](CC)(CC)CC.[Br-].[Br-] }}<br />
| Section2 = {{Chembox Properties<br />
| Formula = C30H49Br2N3<br />
| MolarMass = 611.53816<br />
| Appearance = <br />
| Density = <br />
| MeltingPt = <br />
| BoilingPt = <br />
| Solubility = }}<br />
| Section3 = {{Chembox Hazards<br />
| MainHazards = <br />
| FlashPt = <br />
| Autoignition = }}<br />
}} <br />
<br />
FM 色素は[[wikipedia:ja:脂質二重層|脂質二重膜]]を可逆的に染める蛍光色素で、[[シナプス前終末]]の機能や[[wikipedia:ja:分泌|分泌]]現象の計測に活用されている。 <br />
<br />
== FM1-43とは ==<br />
<br />
[[Image:Takahashinoriko fig 1.jpg|thumb|250px|'''図1．（タイトル：FM 色素による還流と細胞膜の蛍光標識）''' 説明：FM 色素液で細胞を還流すると細胞外膜が蛍光を発する。]] Molecular Probe 社の Fei Mao は William J Betz らとともに、細胞膜を染める一連のスチリル色素を合成した。これらを FM (Fei Mao)色素と呼び、FM1-43 はその代表格である。[[シナプス前終末]]の機能解析や、分泌小胞の動態解析に広く用いられる。 <br />
<br />
色素の特性として次の3つの性質がある。 <br />
<br />
#水溶液中に存在する場合に比べ、細胞膜に結合すると[[wikipedia:ja:量子効率|量子効率]]が著増し、強い[[wikipedia:ja:蛍光|蛍光]]を出す。 <br />
#[[wikipedia:ja:脂質二重層|脂質二重膜]]を透過しない。 <br />
#[[wikipedia:ja:両親媒性分子|両親媒性]]で可逆的に膜を染める。<br />
<br />
== 分子構造 ==<br />
<br />
[[Image:Takahashinoriko fig 2.jpg|thumb|250px|'''図2．（タイトル：FM 色素群の分子構造）''' 説明：二重結合の数は色調に、炭素鎖の数は細胞膜との親和性や蛍光強度に関連する]] 構造は、[[wikipedia:ja:親水性|親水性]]領域、[[wikipedia:ja:二重結合|二重結合]]領域、[[wikipedia:ja:疎水性|疎水性]]炭素鎖領域に分けられる。 <br />
<br />
親水性領域が正の電荷をもつため、膜を通過しない。二重結合の数は蛍光波長に関連する。 <br />
<br />
二重結合が一つの FM1-43、FM1-84、FM2-10 は黄色蛍光を呈し、二重結合が二つの FM4-64、FM5-95 は赤色蛍光を呈する。 <br />
<br />
疎水性炭素鎖の長さは細胞膜の染め方に関連し、長いものほど明るく、一旦膜に組み込まれると離脱しがたい<ref><pubmed> 10202529 </pubmed></ref>。 FM1-43 の炭素鎖数は4であり、解離時定数τ<sub>diss</sub>は8 msを示す。より短いFM2-10(炭素鎖数 2)は、比較的離脱しやすい(τ<sub>diss</sub>=6.4 ms)。逆に、より長い FM1-84（炭素鎖数 5）は離脱に時間がかかる(τ<sub>diss</sub>=36 ms)<ref><pubmed> 19580748 </pubmed></ref>。 <br />
<br />
== 蛍光特性 ==<br />
<br />
FM1-43の[[wikipedia:ja:励起状態|励起]]には1光子では波長480 nm光、2光子では波長840 nm光が頻用される。 <br />
<br />
極大蛍光波長は[[wikipedia:ja:リポソーム|リポソーム]]中にて580 nmである。 <br />
<br />
波長480nm光の高出力励起（～150 μW）にて[[wikipedia:3,3'-Diaminobenzidine|ジアミノベンチジン]]（DAB）の光変換（photoconversion） を起こす。そのため、[[wikipedia:ja:アルデヒド|アルデヒド]]で固定可能な色素であるFM1-43FX と DABを細胞に与え光変換させると、共局在部位で電子密度の高い産物が作られ、[[電子顕微鏡]]観察が可能となる。FM1-43を取り込んだ小胞が、高い電子密度で描出され、微細構造解析に活用されている。 <br />
<br />
== 応用例 ==<br />
<br />
=== シナプス前機能の解析 ===<br />
<br />
<math><math>ここに数式を挿入</math></math>==== シナプス前終末における小胞プールの大きさと開口放出確率の測定 ====<br />
<br />
[[Image:Takahashinoriko fig 3.jpg|thumb|250px|'''図3．（タイトル：開口放出に伴う FM 蛍光の変化''' 説明：膜融合時、細胞外色素の有無により蛍光変化の様式が異なる）]] <br />
<br />
シナプスを刺激した時にミリ秒で起きる伝達物質放出は、活性帯にドックした小胞が開口放出すると仮想されている。この仮想的な小胞群を即時性放出プール[[Readily releasable pool]]（RRP）という。[[シナプス小胞]]は開口放出後30-60秒で細胞内部に[[エンドサイトーシス]]で取り込まれる(図 3左）。更に、シナプス終末内でシナプス小胞に再生されて即時性放出プールに再び至る。これをリサイクリングと呼び、これに関係する小胞の全体をリサイクリングプール(recycling pool)、又は放出可能プール(TRP)という。<br />
<br />
細胞外を FM1-43 で還流中に、長い放出刺激（例 20 Hz、900 発）を与え[[開口放出]]([[エクソサイトーシス]]）した小胞の膜を染めた後、細胞外を色素を含まない溶液で還流し、細胞外膜に結合した色素を wash out すると、TRPの全体が染まる。一方、ちょうどRRPにある小胞を枯渇させる程度の短い放出刺激（例 20 Hz、30 発）を与えて負荷後にwash outをするとRRPが選択的に染まる。この様な解析から、RRPはTRPの10-30%でないかと推定されており<ref><pubmed> 15044806 </pubmed></ref>、TRPが40程度の小さなシナプスではRRPの小胞数は4-12個となる。<br />
<br />
次に、TRPを染めた小胞に刺激を与えると、シナプス小胞は細胞膜と融合し、FM1-43が細胞外液へ拡散することにより神経終末の蛍光は減弱する脱染色（destaining 図3右）。このdestainingの時間経過は、小胞の開口放出確率が大きい程速い。定量的には、RRPにある小胞の数を [RRP]、その放出確率をPvとすると、一回の刺激で放出される小胞の数は平均<math>[RRP] ¥time Pv</math>となる。一方、TRPにある小胞の数を[TRP]、一回の刺激によるTRPの蛍光の減弱率をkとすると、一回の刺激で放出される小胞の数は[TRP]*kとなる。よって、[RRP]*Pv = [TRP]*k となり、これからPv=k*[RRP]/[TRP] という関係式が得られ、終末ごとにRRPにある小胞の放出確率を求めることができる <ref><pubmed>23049481 </pubmed></ref>。<math>Pr=1-(1-Pv)^{[RRP]}ここに数式を挿入</math><br />
<br />
FM1-43によって染めることができるリサイクリングプールの小胞は、電子顕微鏡的に終末に存在する小胞の15-20%である<ref><pubmed> 15044806 </pubmed></ref>。 この電子顕微鏡的に同定されるリサイクリングされ難いシナプス小胞の群をreserve pool 或いは resting poolと言う。このプールの小胞もゆっくりとしたリサイクリングに関係していることが他の方法によって明らかとなっている<ref><pubmed>21835344 </pubmed></ref>。<br />
<br />
==== シナプス小胞の動態の解析 ====<br />
<br />
開口放出した顆粒は[[Active zone]]の周辺から内部に取り込まれ（[[エンドサイトーシス]]）、再び放出可能となる（[[リサイクル]]）。このリサイクルにかかる時間は、[[海馬]]培養標本では 20-30秒、神経筋接合部では 60秒と見積もられた。そこで[[Recycling pool]]（= RRP + Reserve pool）の測定は、RRP 測定時よりも長い時間電気刺激を与え、色素をロードする事により達成できる（例 10Hz 900 発）。リサイクルされた小胞は、元来小胞があった領域のほぼ全域に拡散し、core(中央部）への拡散のみが軽度に少なかった。また、リサイクルした小胞は、初めて刺激を受けたプール同様の放出確率を持つことが報告された<ref><pubmed> 1553547 </pubmed></ref> 。<br />
<br />
=== 膜融合様式の解析 ===<br />
<br />
FM色素には、炭素鎖数の異なる複数種類の色素がある。これらが小胞膜を染める頻度を比較することにより、融合細孔の開放時間の長短が識別可能となる。 <br />
<br />
FM2-10やFM1-43色素を用い、小胞膜から離脱する[[完全融合]]型（full fusion）と、離脱しない[[不完全融合]]型（incomplete fusion）の識別が行われた<ref><pubmed> 9707119 </pubmed></ref> <ref><pubmed> 12354398 </pubmed></ref>。 <br />
<br />
=== 開口放出現象の可視化 ===<br />
<br />
FM1-43を[[網膜]][[双極性細胞]]のシナプス小胞に取り込ませて標識し、[[全反射顕微鏡]]で細胞膜直下（～100nm）の観察を行い、単一小胞の開口放出現象の可視化が報告された<ref><pubmed> 10972279 </pubmed></ref> 。 <br />
<br />
また、[[下垂体]][[前葉細胞]] (lactotrophs) や[[wikipedia:ja:膵島|膵島]]細胞においても、[[ホルモン]]を含む大型[[有芯小胞]]の[[膜融合]]に伴い、開口放出部位においてFM1-43蛍光強度の上昇が報告された <ref><pubmed> 10953007 </pubmed></ref><ref><pubmed>12193788 </pubmed></ref>。 <br />
<br />
=== 分泌小胞の直径測定 ===<br />
<br />
シナプス小胞から大型有芯小胞に至るまで、小胞の直径計測に有効である <ref><pubmed> 16150799 </pubmed></ref>。 <br />
<br />
水溶性色素（赤色[[wikipedia:ja:スルホローダミンB|スルホローダミンB]], SRB）とFM1-43を細胞外液に同時に与え、開口放出を誘発すると、水溶性色素は小胞内部に進入し、FM1-43は細胞外膜から小胞内膜へ拡散するため、開口放出した小胞が両色素で描出される。この際 [[２光子レーザー走査顕微鏡]]で画像を取得し、双方の色素の増加分の比を求めると小胞直径が計算される（直径＝6 ΔSRB/ΔFM1-43）。本法は色素濃度やレンズ特性（[[wikipedia:ja:点拡がり関数|点拡がり関数]]）によらず、シナプス小胞のような光学[[wikipedia:ja:解像度|解像度]]以下の器官の計測にも応用可能である。 <br />
<br />
== 関連項目 ==<br />
<br />
*[[開口放出]]（[[エクソサイトーシス]]） <br />
*[[膜融合]] <br />
*[[シナプス]] <br />
*[[wikipedia:ja:分泌|分泌]]<br />
<br />
== 参考文献 ==<br />
<br />
<references /><br />
<br />
<br>（執筆者：高橋倫子、河西春郎 担当編集委員：柚崎通介） </div>
Hkasai
https://bsd.neuroinf.jp/w/index.php?title=FM1-43&diff=19955
FM1-43
2013-04-25T15:20:56Z
<p>Hkasai: /* シナプス前機能の解析 */</p>
<hr />
<div>{{Chembox<br />
| ImageFile = FM1-43.png<br />
| ImageSize = 220px<br />
| ImageAlt = <br />
| IUPACName = 3-[4-[2-[4-(dibutylamino)phenyl]ethenyl]pyridin-1-ium-1-yl]propyl-triethylazanium dibromide<br />
| OtherNames = Frie Mao 1-43, SynaptoGreen™ Reagent, SureCN1527120, N-(3-Triethylammoniumpropyl)-4-(p-dibutylaminostyryl)pyridinium, 2Br<br />
| Section1 = {{Chembox Identifiers<br />
| CASNo = 149838-22-2<br />
| PubChem = 2733618<br />
| SMILES =CCCCN(CCCC)C1=CC=C(C=C1)C=CC2=CC=[N+](C=C2)CCC[N+](CC)(CC)CC.[Br-].[Br-] }}<br />
| Section2 = {{Chembox Properties<br />
| Formula = C30H49Br2N3<br />
| MolarMass = 611.53816<br />
| Appearance = <br />
| Density = <br />
| MeltingPt = <br />
| BoilingPt = <br />
| Solubility = }}<br />
| Section3 = {{Chembox Hazards<br />
| MainHazards = <br />
| FlashPt = <br />
| Autoignition = }}<br />
}} <br />
<br />
FM 色素は[[wikipedia:ja:脂質二重層|脂質二重膜]]を可逆的に染める蛍光色素で、[[シナプス前終末]]の機能や[[wikipedia:ja:分泌|分泌]]現象の計測に活用されている。 <br />
<br />
== FM1-43とは ==<br />
<br />
[[Image:Takahashinoriko fig 1.jpg|thumb|250px|'''図1．（タイトル：FM 色素による還流と細胞膜の蛍光標識）''' 説明：FM 色素液で細胞を還流すると細胞外膜が蛍光を発する。]] Molecular Probe 社の Fei Mao は William J Betz らとともに、細胞膜を染める一連のスチリル色素を合成した。これらを FM (Fei Mao)色素と呼び、FM1-43 はその代表格である。[[シナプス前終末]]の機能解析や、分泌小胞の動態解析に広く用いられる。 <br />
<br />
色素の特性として次の3つの性質がある。 <br />
<br />
#水溶液中に存在する場合に比べ、細胞膜に結合すると[[wikipedia:ja:量子効率|量子効率]]が著増し、強い[[wikipedia:ja:蛍光|蛍光]]を出す。 <br />
#[[wikipedia:ja:脂質二重層|脂質二重膜]]を透過しない。 <br />
#[[wikipedia:ja:両親媒性分子|両親媒性]]で可逆的に膜を染める。<br />
<br />
== 分子構造 ==<br />
<br />
[[Image:Takahashinoriko fig 2.jpg|thumb|250px|'''図2．（タイトル：FM 色素群の分子構造）''' 説明：二重結合の数は色調に、炭素鎖の数は細胞膜との親和性や蛍光強度に関連する]] 構造は、[[wikipedia:ja:親水性|親水性]]領域、[[wikipedia:ja:二重結合|二重結合]]領域、[[wikipedia:ja:疎水性|疎水性]]炭素鎖領域に分けられる。 <br />
<br />
親水性領域が正の電荷をもつため、膜を通過しない。二重結合の数は蛍光波長に関連する。 <br />
<br />
二重結合が一つの FM1-43、FM1-84、FM2-10 は黄色蛍光を呈し、二重結合が二つの FM4-64、FM5-95 は赤色蛍光を呈する。 <br />
<br />
疎水性炭素鎖の長さは細胞膜の染め方に関連し、長いものほど明るく、一旦膜に組み込まれると離脱しがたい<ref><pubmed> 10202529 </pubmed></ref>。 FM1-43 の炭素鎖数は4であり、解離時定数τ<sub>diss</sub>は8 msを示す。より短いFM2-10(炭素鎖数 2)は、比較的離脱しやすい(τ<sub>diss</sub>=6.4 ms)。逆に、より長い FM1-84（炭素鎖数 5）は離脱に時間がかかる(τ<sub>diss</sub>=36 ms)<ref><pubmed> 19580748 </pubmed></ref>。 <br />
<br />
== 蛍光特性 ==<br />
<br />
FM1-43の[[wikipedia:ja:励起状態|励起]]には1光子では波長480 nm光、2光子では波長840 nm光が頻用される。 <br />
<br />
極大蛍光波長は[[wikipedia:ja:リポソーム|リポソーム]]中にて580 nmである。 <br />
<br />
波長480nm光の高出力励起（～150 μW）にて[[wikipedia:3,3'-Diaminobenzidine|ジアミノベンチジン]]（DAB）の光変換（photoconversion） を起こす。そのため、[[wikipedia:ja:アルデヒド|アルデヒド]]で固定可能な色素であるFM1-43FX と DABを細胞に与え光変換させると、共局在部位で電子密度の高い産物が作られ、[[電子顕微鏡]]観察が可能となる。FM1-43を取り込んだ小胞が、高い電子密度で描出され、微細構造解析に活用されている。 <br />
<br />
== 応用例 ==<br />
<br />
=== シナプス前機能の解析 ===<br />
<br />
<math><math>ここに数式を挿入</math></math>==== シナプス前終末における小胞プールの大きさと開口放出確率の測定 ====<br />
<br />
[[Image:Takahashinoriko fig 3.jpg|thumb|250px|'''図3．（タイトル：開口放出に伴う FM 蛍光の変化''' 説明：膜融合時、細胞外色素の有無により蛍光変化の様式が異なる）]] <br />
<br />
シナプスを刺激した時にミリ秒で起きる伝達物質放出は、活性帯にドックした小胞が開口放出すると仮想されている。この仮想的な小胞群を即時性放出プール[[Readily releasable pool]]（RRP）という。[[シナプス小胞]]は開口放出後30-60秒で細胞内部に[[エンドサイトーシス]]で取り込まれる(図 3左）。更に、シナプス終末内でシナプス小胞に再生されて即時性放出プールに再び至る。これをリサイクリングと呼び、これに関係する小胞の全体をリサイクリングプール(recycling pool)という。<br />
<br />
細胞外を FM1-43 で還流中に、長い放出刺激（例 20 Hz、900 発）を与え[[開口放出]]([[エクソサイトーシス]]）した小胞の膜を染めた後、細胞外を色素を含まない溶液で還流し、細胞外膜に結合した色素を wash out すると、リサイクリングプール(放出可能プール、TRP)の全体が染まる。一方、ちょうどRRPにある小胞を枯渇させる程度の短い放出刺激（例 20 Hz、30 発）を与えて負荷後にwash outをするとRRPが選択的に染まる。この様な解析から、RRPはリサイクリングプールの10-30%でないかと推定されており<ref><pubmed> 15044806 </pubmed></ref>、TRPが40程度の小さなシナプスではRRPの小胞数は4-12個となる。<br />
<br />
次に、リサイクリングプールを染めた小胞に刺激を与えると、シナプス小胞は細胞膜と融合し、<br />
== FM1-43が細胞外液へ拡散することにより神経終末の蛍光は減弱する脱染色（destaining 図3右）。このdestainingの時間経過は、小胞の開口放出確率が大きい程速い。定量的には、RRPにある小胞の数を <br />
[RRP]、その放出確率をPvとすると、一回の刺激で放出される小胞の数は平均<math>[RRP] ¥times Pv</math>となる。一方、TRPにある小胞の数を[TRP]、一回の刺激によるTRPの蛍光の減弱率をkとすると、一回の刺激で放出される小胞の数は[TRP]*kとなる。よって、[RRP]*Pv = [TRP]*k となり、これからPv=k*[RRP]/[TRP] という関係式が得られ、終末ごとにRRPにある小胞の放出確率を求めることができる <ref><pubmed>23049481 </pubmed></ref>。<math>Pr=1-(1-Pv)^{[RRP]}ここに数式を挿入</math><br />
<br />
FM1-43によって染めることができるリサイクリングプールの小胞は、電子顕微鏡的に終末に存在する小胞の15-20%である<ref><pubmed> 15044806 </pubmed></ref>。 この電子顕微鏡的に同定されるリサイクリングされ難いシナプス小胞の群をreserve pool 或いは resting poolと言う。このプールの小胞もゆっくりとしたリサイクリングに関係していることが他の方法によって明らかとなっている<ref><pubmed>21835344 </pubmed></ref>。<br />
<br />
==== シナプス小胞の動態の解析 ====<br />
<br />
開口放出した顆粒は[[Active zone]]の周辺から内部に取り込まれ（[[エンドサイトーシス]]）、再び放出可能となる（[[リサイクル]]）。このリサイクルにかかる時間は、[[海馬]]培養標本では 20-30秒、神経筋接合部では 60秒と見積もられた。そこで[[Recycling pool]]（= RRP + Reserve pool）の測定は、RRP 測定時よりも長い時間電気刺激を与え、色素をロードする事により達成できる（例 10Hz 900 発）。リサイクルされた小胞は、元来小胞があった領域のほぼ全域に拡散し、core(中央部）への拡散のみが軽度に少なかった。また、リサイクルした小胞は、初めて刺激を受けたプール同様の放出確率を持つことが報告された<ref><pubmed> 1553547 </pubmed></ref> 。<br />
<br />
=== 膜融合様式の解析 ===<br />
<br />
FM色素には、炭素鎖数の異なる複数種類の色素がある。これらが小胞膜を染める頻度を比較することにより、融合細孔の開放時間の長短が識別可能となる。 <br />
<br />
FM2-10やFM1-43色素を用い、小胞膜から離脱する[[完全融合]]型（full fusion）と、離脱しない[[不完全融合]]型（incomplete fusion）の識別が行われた<ref><pubmed> 9707119 </pubmed></ref> <ref><pubmed> 12354398 </pubmed></ref>。 <br />
<br />
=== 開口放出現象の可視化 ===<br />
<br />
FM1-43を[[網膜]][[双極性細胞]]のシナプス小胞に取り込ませて標識し、[[全反射顕微鏡]]で細胞膜直下（～100nm）の観察を行い、単一小胞の開口放出現象の可視化が報告された<ref><pubmed> 10972279 </pubmed></ref> 。 <br />
<br />
また、[[下垂体]][[前葉細胞]] (lactotrophs) や[[wikipedia:ja:膵島|膵島]]細胞においても、[[ホルモン]]を含む大型[[有芯小胞]]の[[膜融合]]に伴い、開口放出部位においてFM1-43蛍光強度の上昇が報告された <ref><pubmed> 10953007 </pubmed></ref><ref><pubmed>12193788 </pubmed></ref>。 <br />
<br />
=== 分泌小胞の直径測定 ===<br />
<br />
シナプス小胞から大型有芯小胞に至るまで、小胞の直径計測に有効である <ref><pubmed> 16150799 </pubmed></ref>。 <br />
<br />
水溶性色素（赤色[[wikipedia:ja:スルホローダミンB|スルホローダミンB]], SRB）とFM1-43を細胞外液に同時に与え、開口放出を誘発すると、水溶性色素は小胞内部に進入し、FM1-43は細胞外膜から小胞内膜へ拡散するため、開口放出した小胞が両色素で描出される。この際 [[２光子レーザー走査顕微鏡]]で画像を取得し、双方の色素の増加分の比を求めると小胞直径が計算される（直径＝6 ΔSRB/ΔFM1-43）。本法は色素濃度やレンズ特性（[[wikipedia:ja:点拡がり関数|点拡がり関数]]）によらず、シナプス小胞のような光学[[wikipedia:ja:解像度|解像度]]以下の器官の計測にも応用可能である。 <br />
<br />
== 関連項目 ==<br />
<br />
*[[開口放出]]（[[エクソサイトーシス]]） <br />
*[[膜融合]] <br />
*[[シナプス]] <br />
*[[wikipedia:ja:分泌|分泌]]<br />
<br />
== 参考文献 ==<br />
<br />
<references /><br />
<br />
<br>（執筆者：高橋倫子、河西春郎 担当編集委員：柚崎通介） </div>
Hkasai
https://bsd.neuroinf.jp/w/index.php?title=FM1-43&diff=19954
FM1-43
2013-04-25T15:18:52Z
<p>Hkasai: /* シナプス前終末における小胞プールの大きさと開口放出確率の測定 */</p>
<hr />
<div>{{Chembox<br />
| ImageFile = FM1-43.png<br />
| ImageSize = 220px<br />
| ImageAlt = <br />
| IUPACName = 3-[4-[2-[4-(dibutylamino)phenyl]ethenyl]pyridin-1-ium-1-yl]propyl-triethylazanium dibromide<br />
| OtherNames = Frie Mao 1-43, SynaptoGreen™ Reagent, SureCN1527120, N-(3-Triethylammoniumpropyl)-4-(p-dibutylaminostyryl)pyridinium, 2Br<br />
| Section1 = {{Chembox Identifiers<br />
| CASNo = 149838-22-2<br />
| PubChem = 2733618<br />
| SMILES =CCCCN(CCCC)C1=CC=C(C=C1)C=CC2=CC=[N+](C=C2)CCC[N+](CC)(CC)CC.[Br-].[Br-] }}<br />
| Section2 = {{Chembox Properties<br />
| Formula = C30H49Br2N3<br />
| MolarMass = 611.53816<br />
| Appearance = <br />
| Density = <br />
| MeltingPt = <br />
| BoilingPt = <br />
| Solubility = }}<br />
| Section3 = {{Chembox Hazards<br />
| MainHazards = <br />
| FlashPt = <br />
| Autoignition = }}<br />
}} <br />
<br />
FM 色素は[[wikipedia:ja:脂質二重層|脂質二重膜]]を可逆的に染める蛍光色素で、[[シナプス前終末]]の機能や[[wikipedia:ja:分泌|分泌]]現象の計測に活用されている。 <br />
<br />
== FM1-43とは ==<br />
<br />
[[Image:Takahashinoriko fig 1.jpg|thumb|250px|'''図1．（タイトル：FM 色素による還流と細胞膜の蛍光標識）''' 説明：FM 色素液で細胞を還流すると細胞外膜が蛍光を発する。]] Molecular Probe 社の Fei Mao は William J Betz らとともに、細胞膜を染める一連のスチリル色素を合成した。これらを FM (Fei Mao)色素と呼び、FM1-43 はその代表格である。[[シナプス前終末]]の機能解析や、分泌小胞の動態解析に広く用いられる。 <br />
<br />
色素の特性として次の3つの性質がある。 <br />
<br />
#水溶液中に存在する場合に比べ、細胞膜に結合すると[[wikipedia:ja:量子効率|量子効率]]が著増し、強い[[wikipedia:ja:蛍光|蛍光]]を出す。 <br />
#[[wikipedia:ja:脂質二重層|脂質二重膜]]を透過しない。 <br />
#[[wikipedia:ja:両親媒性分子|両親媒性]]で可逆的に膜を染める。<br />
<br />
== 分子構造 ==<br />
<br />
[[Image:Takahashinoriko fig 2.jpg|thumb|250px|'''図2．（タイトル：FM 色素群の分子構造）''' 説明：二重結合の数は色調に、炭素鎖の数は細胞膜との親和性や蛍光強度に関連する]] 構造は、[[wikipedia:ja:親水性|親水性]]領域、[[wikipedia:ja:二重結合|二重結合]]領域、[[wikipedia:ja:疎水性|疎水性]]炭素鎖領域に分けられる。 <br />
<br />
親水性領域が正の電荷をもつため、膜を通過しない。二重結合の数は蛍光波長に関連する。 <br />
<br />
二重結合が一つの FM1-43、FM1-84、FM2-10 は黄色蛍光を呈し、二重結合が二つの FM4-64、FM5-95 は赤色蛍光を呈する。 <br />
<br />
疎水性炭素鎖の長さは細胞膜の染め方に関連し、長いものほど明るく、一旦膜に組み込まれると離脱しがたい<ref><pubmed> 10202529 </pubmed></ref>。 FM1-43 の炭素鎖数は4であり、解離時定数τ<sub>diss</sub>は8 msを示す。より短いFM2-10(炭素鎖数 2)は、比較的離脱しやすい(τ<sub>diss</sub>=6.4 ms)。逆に、より長い FM1-84（炭素鎖数 5）は離脱に時間がかかる(τ<sub>diss</sub>=36 ms)<ref><pubmed> 19580748 </pubmed></ref>。 <br />
<br />
== 蛍光特性 ==<br />
<br />
FM1-43の[[wikipedia:ja:励起状態|励起]]には1光子では波長480 nm光、2光子では波長840 nm光が頻用される。 <br />
<br />
極大蛍光波長は[[wikipedia:ja:リポソーム|リポソーム]]中にて580 nmである。 <br />
<br />
波長480nm光の高出力励起（～150 μW）にて[[wikipedia:3,3'-Diaminobenzidine|ジアミノベンチジン]]（DAB）の光変換（photoconversion） を起こす。そのため、[[wikipedia:ja:アルデヒド|アルデヒド]]で固定可能な色素であるFM1-43FX と DABを細胞に与え光変換させると、共局在部位で電子密度の高い産物が作られ、[[電子顕微鏡]]観察が可能となる。FM1-43を取り込んだ小胞が、高い電子密度で描出され、微細構造解析に活用されている。 <br />
<br />
== 応用例 ==<br />
<br />
=== シナプス前機能の解析 ===<br />
<br />
<math><math>ここに数式を挿入</math></math>==== シナプス前終末における小胞プールの大きさと開口放出確率の測定 ====<br />
<br />
[[Image:Takahashinoriko fig 3.jpg|thumb|250px|'''図3．（タイトル：開口放出に伴う FM 蛍光の変化''' 説明：膜融合時、細胞外色素の有無により蛍光変化の様式が異なる）]] <br />
<br />
シナプスを刺激した時にミリ秒で起きる伝達物質放出は、活性帯にドックした小胞が開口放出すると仮想されている。この仮想的な小胞群を即時性放出プール[[Readily releasable pool]]（RRP）という。[[シナプス小胞]]は開口放出後30-60秒で細胞内部に[[エンドサイトーシス]]で取り込まれる(図 3左）。更に、シナプス終末内でシナプス小胞に再生されて即時性放出プールに再び至る。これをリサイクリングと呼び、これに関係する小胞の全体をリサイクリングプール(recycling pool)という。<br />
<br />
細胞外を FM1-43 で還流中に、長い放出刺激（例 20 Hz、900 発）を与え[[開口放出]]([[エクソサイトーシス]]）した小胞の膜を染めた後、細胞外を色素を含まない溶液で還流し、細胞外膜に結合した色素を wash out すると、リサイクリングプール(放出可能プール、TRP)の全体が染まる。一方、ちょうどRRPにある小胞を枯渇させる程度の短い放出刺激（例 20 Hz、30 発）を与えて負荷後にwash outをするとRRPが選択的に染まる。この様な解析から、RRPはリサイクリングプールの10-30%でないかと推定されており<ref><pubmed> 15044806 </pubmed></ref>、TRPが40程度の小さなシナプスではRRPの小胞数は4-12個となる。<br />
<br />
次に、リサイクリングプールを染めた小胞に刺激を与えると、シナプス小胞は細胞膜と融合し、<br />
== FM1-43が細胞外液へ拡散することにより神経終末の蛍光は減弱する脱染色（destaining 図3右）。このdestainingの時間経過は、小胞の開口放出確率が大きい程速い。定量的には、RRPにある小胞の数を <br />
[RRP]、その放出確率をPvとすると、一回の刺激で放出される小胞の数は平均<math>¥[RRP] ¥times ¥Pv</math>となる。一方、TRPにある小胞の数を[TRP]、一回の刺激によるTRPの蛍光の減弱率をkとすると、一回の刺激で放出される小胞の数は[TRP]*kとなる。よって、[RRP]*Pv = [TRP]*k となり、これからPv=k*[RRP]/[TRP] という関係式が得られ、終末ごとにRRPにある小胞の放出確率を求めることができる <ref><pubmed>23049481 </pubmed></ref>。<math>Pr=1-(1-Pv)^[RRP]ここに数式を挿入</math><br />
<br />
FM1-43によって染めることができるリサイクリングプールの小胞は、電子顕微鏡的に終末に存在する小胞の15-20%である<ref><pubmed> 15044806 </pubmed></ref>。 この電子顕微鏡的に同定されるリサイクリングされ難いシナプス小胞の群をreserve pool 或いは resting poolと言う。このプールの小胞もゆっくりとしたリサイクリングに関係していることが他の方法によって明らかとなっている<ref><pubmed>21835344 </pubmed></ref>。<br />
<br />
==== シナプス小胞の動態の解析 ====<br />
<br />
開口放出した顆粒は[[Active zone]]の周辺から内部に取り込まれ（[[エンドサイトーシス]]）、再び放出可能となる（[[リサイクル]]）。このリサイクルにかかる時間は、[[海馬]]培養標本では 20-30秒、神経筋接合部では 60秒と見積もられた。そこで[[Recycling pool]]（= RRP + Reserve pool）の測定は、RRP 測定時よりも長い時間電気刺激を与え、色素をロードする事により達成できる（例 10Hz 900 発）。リサイクルされた小胞は、元来小胞があった領域のほぼ全域に拡散し、core(中央部）への拡散のみが軽度に少なかった。また、リサイクルした小胞は、初めて刺激を受けたプール同様の放出確率を持つことが報告された<ref><pubmed> 1553547 </pubmed></ref> 。 <br />
<br />
=== 膜融合様式の解析 ===<br />
<br />
FM色素には、炭素鎖数の異なる複数種類の色素がある。これらが小胞膜を染める頻度を比較することにより、融合細孔の開放時間の長短が識別可能となる。 <br />
<br />
FM2-10やFM1-43色素を用い、小胞膜から離脱する[[完全融合]]型（full fusion）と、離脱しない[[不完全融合]]型（incomplete fusion）の識別が行われた<ref><pubmed> 9707119 </pubmed></ref> <ref><pubmed> 12354398 </pubmed></ref>。 <br />
<br />
=== 開口放出現象の可視化 ===<br />
<br />
FM1-43を[[網膜]][[双極性細胞]]のシナプス小胞に取り込ませて標識し、[[全反射顕微鏡]]で細胞膜直下（～100nm）の観察を行い、単一小胞の開口放出現象の可視化が報告された<ref><pubmed> 10972279 </pubmed></ref> 。 <br />
<br />
また、[[下垂体]][[前葉細胞]] (lactotrophs) や[[wikipedia:ja:膵島|膵島]]細胞においても、[[ホルモン]]を含む大型[[有芯小胞]]の[[膜融合]]に伴い、開口放出部位においてFM1-43蛍光強度の上昇が報告された <ref><pubmed> 10953007 </pubmed></ref><ref><pubmed>12193788 </pubmed></ref>。 <br />
<br />
=== 分泌小胞の直径測定 ===<br />
<br />
シナプス小胞から大型有芯小胞に至るまで、小胞の直径計測に有効である <ref><pubmed> 16150799 </pubmed></ref>。 <br />
<br />
水溶性色素（赤色[[wikipedia:ja:スルホローダミンB|スルホローダミンB]], SRB）とFM1-43を細胞外液に同時に与え、開口放出を誘発すると、水溶性色素は小胞内部に進入し、FM1-43は細胞外膜から小胞内膜へ拡散するため、開口放出した小胞が両色素で描出される。この際 [[２光子レーザー走査顕微鏡]]で画像を取得し、双方の色素の増加分の比を求めると小胞直径が計算される（直径＝6 ΔSRB/ΔFM1-43）。本法は色素濃度やレンズ特性（[[wikipedia:ja:点拡がり関数|点拡がり関数]]）によらず、シナプス小胞のような光学[[wikipedia:ja:解像度|解像度]]以下の器官の計測にも応用可能である。 <br />
<br />
== 関連項目 ==<br />
<br />
*[[開口放出]]（[[エクソサイトーシス]]） <br />
*[[膜融合]] <br />
*[[シナプス]] <br />
*[[wikipedia:ja:分泌|分泌]]<br />
<br />
== 参考文献 ==<br />
<br />
<references /><br />
<br />
<br>（執筆者：高橋倫子、河西春郎 担当編集委員：柚崎通介） </div>
Hkasai
https://bsd.neuroinf.jp/w/index.php?title=FM1-43&diff=19953
FM1-43
2013-04-25T15:14:24Z
<p>Hkasai: /* シナプス前終末における小胞プールの大きさと開口放出確率の測定 */</p>
<hr />
<div>{{Chembox<br />
| ImageFile = FM1-43.png<br />
| ImageSize = 220px<br />
| ImageAlt = <br />
| IUPACName = 3-[4-[2-[4-(dibutylamino)phenyl]ethenyl]pyridin-1-ium-1-yl]propyl-triethylazanium dibromide<br />
| OtherNames = Frie Mao 1-43, SynaptoGreen™ Reagent, SureCN1527120, N-(3-Triethylammoniumpropyl)-4-(p-dibutylaminostyryl)pyridinium, 2Br<br />
| Section1 = {{Chembox Identifiers<br />
| CASNo = 149838-22-2<br />
| PubChem = 2733618<br />
| SMILES =CCCCN(CCCC)C1=CC=C(C=C1)C=CC2=CC=[N+](C=C2)CCC[N+](CC)(CC)CC.[Br-].[Br-] }}<br />
| Section2 = {{Chembox Properties<br />
| Formula = C30H49Br2N3<br />
| MolarMass = 611.53816<br />
| Appearance = <br />
| Density = <br />
| MeltingPt = <br />
| BoilingPt = <br />
| Solubility = }}<br />
| Section3 = {{Chembox Hazards<br />
| MainHazards = <br />
| FlashPt = <br />
| Autoignition = }}<br />
}} <br />
<br />
FM 色素は[[wikipedia:ja:脂質二重層|脂質二重膜]]を可逆的に染める蛍光色素で、[[シナプス前終末]]の機能や[[wikipedia:ja:分泌|分泌]]現象の計測に活用されている。 <br />
<br />
== FM1-43とは ==<br />
<br />
[[Image:Takahashinoriko fig 1.jpg|thumb|250px|'''図1．（タイトル：FM 色素による還流と細胞膜の蛍光標識）''' 説明：FM 色素液で細胞を還流すると細胞外膜が蛍光を発する。]] Molecular Probe 社の Fei Mao は William J Betz らとともに、細胞膜を染める一連のスチリル色素を合成した。これらを FM (Fei Mao)色素と呼び、FM1-43 はその代表格である。[[シナプス前終末]]の機能解析や、分泌小胞の動態解析に広く用いられる。 <br />
<br />
色素の特性として次の3つの性質がある。 <br />
<br />
#水溶液中に存在する場合に比べ、細胞膜に結合すると[[wikipedia:ja:量子効率|量子効率]]が著増し、強い[[wikipedia:ja:蛍光|蛍光]]を出す。 <br />
#[[wikipedia:ja:脂質二重層|脂質二重膜]]を透過しない。 <br />
#[[wikipedia:ja:両親媒性分子|両親媒性]]で可逆的に膜を染める。<br />
<br />
== 分子構造 ==<br />
<br />
[[Image:Takahashinoriko fig 2.jpg|thumb|250px|'''図2．（タイトル：FM 色素群の分子構造）''' 説明：二重結合の数は色調に、炭素鎖の数は細胞膜との親和性や蛍光強度に関連する]] 構造は、[[wikipedia:ja:親水性|親水性]]領域、[[wikipedia:ja:二重結合|二重結合]]領域、[[wikipedia:ja:疎水性|疎水性]]炭素鎖領域に分けられる。 <br />
<br />
親水性領域が正の電荷をもつため、膜を通過しない。二重結合の数は蛍光波長に関連する。 <br />
<br />
二重結合が一つの FM1-43、FM1-84、FM2-10 は黄色蛍光を呈し、二重結合が二つの FM4-64、FM5-95 は赤色蛍光を呈する。 <br />
<br />
疎水性炭素鎖の長さは細胞膜の染め方に関連し、長いものほど明るく、一旦膜に組み込まれると離脱しがたい<ref><pubmed> 10202529 </pubmed></ref>。 FM1-43 の炭素鎖数は4であり、解離時定数τ<sub>diss</sub>は8 msを示す。より短いFM2-10(炭素鎖数 2)は、比較的離脱しやすい(τ<sub>diss</sub>=6.4 ms)。逆に、より長い FM1-84（炭素鎖数 5）は離脱に時間がかかる(τ<sub>diss</sub>=36 ms)<ref><pubmed> 19580748 </pubmed></ref>。 <br />
<br />
== 蛍光特性 ==<br />
<br />
FM1-43の[[wikipedia:ja:励起状態|励起]]には1光子では波長480 nm光、2光子では波長840 nm光が頻用される。 <br />
<br />
極大蛍光波長は[[wikipedia:ja:リポソーム|リポソーム]]中にて580 nmである。 <br />
<br />
波長480nm光の高出力励起（～150 μW）にて[[wikipedia:3,3'-Diaminobenzidine|ジアミノベンチジン]]（DAB）の光変換（photoconversion） を起こす。そのため、[[wikipedia:ja:アルデヒド|アルデヒド]]で固定可能な色素であるFM1-43FX と DABを細胞に与え光変換させると、共局在部位で電子密度の高い産物が作られ、[[電子顕微鏡]]観察が可能となる。FM1-43を取り込んだ小胞が、高い電子密度で描出され、微細構造解析に活用されている。 <br />
<br />
== 応用例 ==<br />
<br />
=== シナプス前機能の解析 ===<br />
<br />
==== シナプス前終末における小胞プールの大きさと開口放出確率の測定 ====<br />
<br />
[[Image:Takahashinoriko fig 3.jpg|thumb|250px|'''図3．（タイトル：開口放出に伴う FM 蛍光の変化''' 説明：膜融合時、細胞外色素の有無により蛍光変化の様式が異なる）]] <br />
<br />
シナプスを刺激した時にミリ秒で起きる伝達物質放出は、活性帯にドックした小胞が開口放出すると仮想されている。この仮想的な小胞群を即時性放出プール[[Readily releasable pool]]（RRP）という。[[シナプス小胞]]は開口放出後30-60秒で細胞内部に[[エンドサイトーシス]]で取り込まれる(図 3左）。更に、シナプス終末内でシナプス小胞に再生されて即時性放出プールに再び至る。これをリサイクリングと呼び、これに関係する小胞の全体をリサイクリングプール(recycling pool)という。<br />
<br />
細胞外を FM1-43 で還流中に、長い放出刺激（例 20 Hz、900 発）を与え[[開口放出]]([[エクソサイトーシス]]）した小胞の膜を染めた後、細胞外を色素を含まない溶液で還流し、細胞外膜に結合した色素を wash out すると、リサイクリングプール(放出可能プール、TRP)の全体が染まる。一方、ちょうどRRPにある小胞を枯渇させる程度の短い放出刺激（例 20 Hz、30 発）を与えて負荷後にwash outをするとRRPが選択的に染まる。この様な解析から、RRPはリサイクリングプールの10-30%でないかと推定されており<ref><pubmed> 15044806 </pubmed></ref>、TRPが40程度の小さなシナプスではRRPの小胞数は4-12個となる。<br />
<br />
次に、リサイクリングプールを染めた小胞に刺激を与えると、シナプス小胞は細胞膜と融合し、FM1-43が細胞外液へ拡散することにより神経終末の蛍光は減弱する脱染色（destaining 図3右）。このdestainingの時間経過は、小胞の開口放出確率が大きい程速い。定量的には、RRPにある小胞の数を[RRP]、その放出確率をPvとすると、一回の刺激で放出される小胞の数は平均<math>[RRP] x Pv</math>となる。一方、TRPにある小胞の数を[TRP]、一回の刺激によるTRPの蛍光の減弱率をkとすると、一回の刺激で放出される小胞の数は[TRP]*kとなる。よって、[RRP]*Pv = [TRP]*k となり、これからPv=k*[RRP]/[TRP] という関係式が得られ、終末ごとにRRPにある小胞の放出確率を求めることができる <ref><pubmed>23049481 </pubmed></ref>。<math>Pr=1-(1-Pv)^[RRP]ここに数式を挿入</math><br />
<br />
FM1-43によって染めることができるリサイクリングプールの小胞は、電子顕微鏡的に終末に存在する小胞の15-20%である<ref><pubmed> 15044806 </pubmed></ref>。 この電子顕微鏡的に同定されるリサイクリングされ難いシナプス小胞の群をreserve pool 或いは resting poolと言う。このプールの小胞もゆっくりとしたリサイクリングに関係していることが他の方法によって明らかとなっている<ref><pubmed>21835344 </pubmed></ref>。<br />
<br />
==== シナプス小胞の動態の解析 ====<br />
<br />
開口放出した顆粒は[[Active zone]]の周辺から内部に取り込まれ（[[エンドサイトーシス]]）、再び放出可能となる（[[リサイクル]]）。このリサイクルにかかる時間は、[[海馬]]培養標本では 20-30秒、神経筋接合部では 60秒と見積もられた。そこで[[Recycling pool]]（= RRP + Reserve pool）の測定は、RRP 測定時よりも長い時間電気刺激を与え、色素をロードする事により達成できる（例 10Hz 900 発）。リサイクルされた小胞は、元来小胞があった領域のほぼ全域に拡散し、core(中央部）への拡散のみが軽度に少なかった。また、リサイクルした小胞は、初めて刺激を受けたプール同様の放出確率を持つことが報告された<ref><pubmed> 1553547 </pubmed></ref> 。 <br />
<br />
=== 膜融合様式の解析 ===<br />
<br />
FM色素には、炭素鎖数の異なる複数種類の色素がある。これらが小胞膜を染める頻度を比較することにより、融合細孔の開放時間の長短が識別可能となる。 <br />
<br />
FM2-10やFM1-43色素を用い、小胞膜から離脱する[[完全融合]]型（full fusion）と、離脱しない[[不完全融合]]型（incomplete fusion）の識別が行われた<ref><pubmed> 9707119 </pubmed></ref> <ref><pubmed> 12354398 </pubmed></ref>。 <br />
<br />
=== 開口放出現象の可視化 ===<br />
<br />
FM1-43を[[網膜]][[双極性細胞]]のシナプス小胞に取り込ませて標識し、[[全反射顕微鏡]]で細胞膜直下（～100nm）の観察を行い、単一小胞の開口放出現象の可視化が報告された<ref><pubmed> 10972279 </pubmed></ref> 。 <br />
<br />
また、[[下垂体]][[前葉細胞]] (lactotrophs) や[[wikipedia:ja:膵島|膵島]]細胞においても、[[ホルモン]]を含む大型[[有芯小胞]]の[[膜融合]]に伴い、開口放出部位においてFM1-43蛍光強度の上昇が報告された <ref><pubmed> 10953007 </pubmed></ref><ref><pubmed>12193788 </pubmed></ref>。 <br />
<br />
=== 分泌小胞の直径測定 ===<br />
<br />
シナプス小胞から大型有芯小胞に至るまで、小胞の直径計測に有効である <ref><pubmed> 16150799 </pubmed></ref>。 <br />
<br />
水溶性色素（赤色[[wikipedia:ja:スルホローダミンB|スルホローダミンB]], SRB）とFM1-43を細胞外液に同時に与え、開口放出を誘発すると、水溶性色素は小胞内部に進入し、FM1-43は細胞外膜から小胞内膜へ拡散するため、開口放出した小胞が両色素で描出される。この際 [[２光子レーザー走査顕微鏡]]で画像を取得し、双方の色素の増加分の比を求めると小胞直径が計算される（直径＝6 ΔSRB/ΔFM1-43）。本法は色素濃度やレンズ特性（[[wikipedia:ja:点拡がり関数|点拡がり関数]]）によらず、シナプス小胞のような光学[[wikipedia:ja:解像度|解像度]]以下の器官の計測にも応用可能である。 <br />
<br />
== 関連項目 ==<br />
<br />
*[[開口放出]]（[[エクソサイトーシス]]） <br />
*[[膜融合]] <br />
*[[シナプス]] <br />
*[[wikipedia:ja:分泌|分泌]]<br />
<br />
== 参考文献 ==<br />
<br />
<references /><br />
<br />
<br>（執筆者：高橋倫子、河西春郎 担当編集委員：柚崎通介） </div>
Hkasai
https://bsd.neuroinf.jp/w/index.php?title=FM1-43&diff=19952
FM1-43
2013-04-25T15:12:31Z
<p>Hkasai: /* シナプス前終末における小胞プールの大きさと開口放出確率の測定 */</p>
<hr />
<div>{{Chembox<br />
| ImageFile = FM1-43.png<br />
| ImageSize = 220px<br />
| ImageAlt = <br />
| IUPACName = 3-[4-[2-[4-(dibutylamino)phenyl]ethenyl]pyridin-1-ium-1-yl]propyl-triethylazanium dibromide<br />
| OtherNames = Frie Mao 1-43, SynaptoGreen™ Reagent, SureCN1527120, N-(3-Triethylammoniumpropyl)-4-(p-dibutylaminostyryl)pyridinium, 2Br<br />
| Section1 = {{Chembox Identifiers<br />
| CASNo = 149838-22-2<br />
| PubChem = 2733618<br />
| SMILES =CCCCN(CCCC)C1=CC=C(C=C1)C=CC2=CC=[N+](C=C2)CCC[N+](CC)(CC)CC.[Br-].[Br-] }}<br />
| Section2 = {{Chembox Properties<br />
| Formula = C30H49Br2N3<br />
| MolarMass = 611.53816<br />
| Appearance = <br />
| Density = <br />
| MeltingPt = <br />
| BoilingPt = <br />
| Solubility = }}<br />
| Section3 = {{Chembox Hazards<br />
| MainHazards = <br />
| FlashPt = <br />
| Autoignition = }}<br />
}} <br />
<br />
FM 色素は[[wikipedia:ja:脂質二重層|脂質二重膜]]を可逆的に染める蛍光色素で、[[シナプス前終末]]の機能や[[wikipedia:ja:分泌|分泌]]現象の計測に活用されている。 <br />
<br />
== FM1-43とは ==<br />
<br />
[[Image:Takahashinoriko fig 1.jpg|thumb|250px|'''図1．（タイトル：FM 色素による還流と細胞膜の蛍光標識）''' 説明：FM 色素液で細胞を還流すると細胞外膜が蛍光を発する。]] Molecular Probe 社の Fei Mao は William J Betz らとともに、細胞膜を染める一連のスチリル色素を合成した。これらを FM (Fei Mao)色素と呼び、FM1-43 はその代表格である。[[シナプス前終末]]の機能解析や、分泌小胞の動態解析に広く用いられる。 <br />
<br />
色素の特性として次の3つの性質がある。 <br />
<br />
#水溶液中に存在する場合に比べ、細胞膜に結合すると[[wikipedia:ja:量子効率|量子効率]]が著増し、強い[[wikipedia:ja:蛍光|蛍光]]を出す。 <br />
#[[wikipedia:ja:脂質二重層|脂質二重膜]]を透過しない。 <br />
#[[wikipedia:ja:両親媒性分子|両親媒性]]で可逆的に膜を染める。<br />
<br />
== 分子構造 ==<br />
<br />
[[Image:Takahashinoriko fig 2.jpg|thumb|250px|'''図2．（タイトル：FM 色素群の分子構造）''' 説明：二重結合の数は色調に、炭素鎖の数は細胞膜との親和性や蛍光強度に関連する]] 構造は、[[wikipedia:ja:親水性|親水性]]領域、[[wikipedia:ja:二重結合|二重結合]]領域、[[wikipedia:ja:疎水性|疎水性]]炭素鎖領域に分けられる。 <br />
<br />
親水性領域が正の電荷をもつため、膜を通過しない。二重結合の数は蛍光波長に関連する。 <br />
<br />
二重結合が一つの FM1-43、FM1-84、FM2-10 は黄色蛍光を呈し、二重結合が二つの FM4-64、FM5-95 は赤色蛍光を呈する。 <br />
<br />
疎水性炭素鎖の長さは細胞膜の染め方に関連し、長いものほど明るく、一旦膜に組み込まれると離脱しがたい<ref><pubmed> 10202529 </pubmed></ref>。 FM1-43 の炭素鎖数は4であり、解離時定数τ<sub>diss</sub>は8 msを示す。より短いFM2-10(炭素鎖数 2)は、比較的離脱しやすい(τ<sub>diss</sub>=6.4 ms)。逆に、より長い FM1-84（炭素鎖数 5）は離脱に時間がかかる(τ<sub>diss</sub>=36 ms)<ref><pubmed> 19580748 </pubmed></ref>。 <br />
<br />
== 蛍光特性 ==<br />
<br />
FM1-43の[[wikipedia:ja:励起状態|励起]]には1光子では波長480 nm光、2光子では波長840 nm光が頻用される。 <br />
<br />
極大蛍光波長は[[wikipedia:ja:リポソーム|リポソーム]]中にて580 nmである。 <br />
<br />
波長480nm光の高出力励起（～150 μW）にて[[wikipedia:3,3'-Diaminobenzidine|ジアミノベンチジン]]（DAB）の光変換（photoconversion） を起こす。そのため、[[wikipedia:ja:アルデヒド|アルデヒド]]で固定可能な色素であるFM1-43FX と DABを細胞に与え光変換させると、共局在部位で電子密度の高い産物が作られ、[[電子顕微鏡]]観察が可能となる。FM1-43を取り込んだ小胞が、高い電子密度で描出され、微細構造解析に活用されている。 <br />
<br />
== 応用例 ==<br />
<br />
=== シナプス前機能の解析 ===<br />
<br />
==== シナプス前終末における小胞プールの大きさと開口放出確率の測定 ====<br />
<br />
[[Image:Takahashinoriko fig 3.jpg|thumb|250px|'''図3．（タイトル：開口放出に伴う FM 蛍光の変化''' 説明：膜融合時、細胞外色素の有無により蛍光変化の様式が異なる）]] <br />
<br />
シナプスを刺激した時にミリ秒で起きる伝達物質放出は、活性帯にドックした小胞が開口放出すると仮想されている。この仮想的な小胞群を即時性放出プール[[Readily releasable pool]]（RRP）という。[[シナプス小胞]]は開口放出後30-60秒で細胞内部に[[エンドサイトーシス]]で取り込まれる(図 3左）。更に、シナプス終末内でシナプス小胞に再生されて即時性放出プールに再び至る。これをリサイクリングと呼び、これに関係する小胞の全体をリサイクリングプール(recycling pool)という。<br />
<br />
細胞外を FM1-43 で還流中に、長い放出刺激（例 20 Hz、900 発）を与え[[開口放出]]([[エクソサイトーシス]]）した小胞の膜を染めた後、細胞外を色素を含まない溶液で還流し、細胞外膜に結合した色素を wash out すると、リサイクリングプール(放出可能プール、TRP)の全体が染まる。一方、ちょうどRRPにある小胞を枯渇させる程度の短い放出刺激（例 20 Hz、30 発）を与えて負荷後にwash outをするとRRPが選択的に染まる。この様な解析から、RRPはリサイクリングプールの10-30%でないかと推定されており<ref><pubmed> 15044806 </pubmed></ref>、TRPが40程度の小さなシナプスではRRPの小胞数は4-12個となる。<br />
<br />
次に、リサイクリングプールを染めた小胞に刺激を与えると、シナプス小胞は細胞膜と融合し、FM1-43が細胞外液へ拡散することにより神経終末の蛍光は減弱する脱染色（destaining 図3右）。このdestainingの時間経過は、小胞の開口放出確率が大きい程速い。定量的には、RRPにある小胞の数を[RRP]、その放出確率をPvとすると、一回の刺激で放出される小胞の数は平均<math>[RRP]*Pv</math>となる。一方、TRPにある小胞の数を[TRP]、一回の刺激によるTRPの蛍光の減弱率をkとすると、一回の刺激で放出される小胞の数は[TRP]*kとなる。よって、[RRP]*Pv = [TRP]*k となり、これからPv=k*[RRP]/[TRP] という関係式が得られ、終末ごとにRRPにある小胞の放出確率を求めることができる <ref><pubmed>23049481 </pubmed></ref>。<math>Pr=1-(1-Pv)^[RRP]ここに数式を挿入</math><br />
<br />
FM1-43によって染めることができるリサイクリングプールの小胞は、電子顕微鏡的に終末に存在する小胞の15-20%である<ref><pubmed> 15044806 </pubmed></ref>。 この電子顕微鏡的に同定されるリサイクリングされ難いシナプス小胞の群をreserve pool 或いは resting poolと言う。このプールの小胞もゆっくりとしたリサイクリングに関係していることが他の方法によって明らかとなっている<ref><pubmed>21835344 </pubmed></ref>。<br />
<br />
==== シナプス小胞の動態の解析 ====<br />
<br />
開口放出した顆粒は[[Active zone]]の周辺から内部に取り込まれ（[[エンドサイトーシス]]）、再び放出可能となる（[[リサイクル]]）。このリサイクルにかかる時間は、[[海馬]]培養標本では 20-30秒、神経筋接合部では 60秒と見積もられた。そこで[[Recycling pool]]（= RRP + Reserve pool）の測定は、RRP 測定時よりも長い時間電気刺激を与え、色素をロードする事により達成できる（例 10Hz 900 発）。リサイクルされた小胞は、元来小胞があった領域のほぼ全域に拡散し、core(中央部）への拡散のみが軽度に少なかった。また、リサイクルした小胞は、初めて刺激を受けたプール同様の放出確率を持つことが報告された<ref><pubmed> 1553547 </pubmed></ref> 。 <br />
<br />
=== 膜融合様式の解析 ===<br />
<br />
FM色素には、炭素鎖数の異なる複数種類の色素がある。これらが小胞膜を染める頻度を比較することにより、融合細孔の開放時間の長短が識別可能となる。 <br />
<br />
FM2-10やFM1-43色素を用い、小胞膜から離脱する[[完全融合]]型（full fusion）と、離脱しない[[不完全融合]]型（incomplete fusion）の識別が行われた<ref><pubmed> 9707119 </pubmed></ref> <ref><pubmed> 12354398 </pubmed></ref>。 <br />
<br />
=== 開口放出現象の可視化 ===<br />
<br />
FM1-43を[[網膜]][[双極性細胞]]のシナプス小胞に取り込ませて標識し、[[全反射顕微鏡]]で細胞膜直下（～100nm）の観察を行い、単一小胞の開口放出現象の可視化が報告された<ref><pubmed> 10972279 </pubmed></ref> 。 <br />
<br />
また、[[下垂体]][[前葉細胞]] (lactotrophs) や[[wikipedia:ja:膵島|膵島]]細胞においても、[[ホルモン]]を含む大型[[有芯小胞]]の[[膜融合]]に伴い、開口放出部位においてFM1-43蛍光強度の上昇が報告された <ref><pubmed> 10953007 </pubmed></ref><ref><pubmed>12193788 </pubmed></ref>。 <br />
<br />
=== 分泌小胞の直径測定 ===<br />
<br />
シナプス小胞から大型有芯小胞に至るまで、小胞の直径計測に有効である <ref><pubmed> 16150799 </pubmed></ref>。 <br />
<br />
水溶性色素（赤色[[wikipedia:ja:スルホローダミンB|スルホローダミンB]], SRB）とFM1-43を細胞外液に同時に与え、開口放出を誘発すると、水溶性色素は小胞内部に進入し、FM1-43は細胞外膜から小胞内膜へ拡散するため、開口放出した小胞が両色素で描出される。この際 [[２光子レーザー走査顕微鏡]]で画像を取得し、双方の色素の増加分の比を求めると小胞直径が計算される（直径＝6 ΔSRB/ΔFM1-43）。本法は色素濃度やレンズ特性（[[wikipedia:ja:点拡がり関数|点拡がり関数]]）によらず、シナプス小胞のような光学[[wikipedia:ja:解像度|解像度]]以下の器官の計測にも応用可能である。 <br />
<br />
== 関連項目 ==<br />
<br />
*[[開口放出]]（[[エクソサイトーシス]]） <br />
*[[膜融合]] <br />
*[[シナプス]] <br />
*[[wikipedia:ja:分泌|分泌]]<br />
<br />
== 参考文献 ==<br />
<br />
<references /><br />
<br />
<br>（執筆者：高橋倫子、河西春郎 担当編集委員：柚崎通介） </div>
Hkasai
https://bsd.neuroinf.jp/w/index.php?title=FM1-43&diff=19951
FM1-43
2013-04-25T15:10:51Z
<p>Hkasai: </p>
<hr />
<div>{{Chembox<br />
| ImageFile = FM1-43.png<br />
| ImageSize = 220px<br />
| ImageAlt = <br />
| IUPACName = 3-[4-[2-[4-(dibutylamino)phenyl]ethenyl]pyridin-1-ium-1-yl]propyl-triethylazanium dibromide<br />
| OtherNames = Frie Mao 1-43, SynaptoGreen™ Reagent, SureCN1527120, N-(3-Triethylammoniumpropyl)-4-(p-dibutylaminostyryl)pyridinium, 2Br<br />
| Section1 = {{Chembox Identifiers<br />
| CASNo = 149838-22-2<br />
| PubChem = 2733618<br />
| SMILES =CCCCN(CCCC)C1=CC=C(C=C1)C=CC2=CC=[N+](C=C2)CCC[N+](CC)(CC)CC.[Br-].[Br-] }}<br />
| Section2 = {{Chembox Properties<br />
| Formula = C30H49Br2N3<br />
| MolarMass = 611.53816<br />
| Appearance = <br />
| Density = <br />
| MeltingPt = <br />
| BoilingPt = <br />
| Solubility = }}<br />
| Section3 = {{Chembox Hazards<br />
| MainHazards = <br />
| FlashPt = <br />
| Autoignition = }}<br />
}} <br />
<br />
FM 色素は[[wikipedia:ja:脂質二重層|脂質二重膜]]を可逆的に染める蛍光色素で、[[シナプス前終末]]の機能や[[wikipedia:ja:分泌|分泌]]現象の計測に活用されている。 <br />
<br />
== FM1-43とは ==<br />
<br />
[[Image:Takahashinoriko fig 1.jpg|thumb|250px|'''図1．（タイトル：FM 色素による還流と細胞膜の蛍光標識）''' 説明：FM 色素液で細胞を還流すると細胞外膜が蛍光を発する。]] Molecular Probe 社の Fei Mao は William J Betz らとともに、細胞膜を染める一連のスチリル色素を合成した。これらを FM (Fei Mao)色素と呼び、FM1-43 はその代表格である。[[シナプス前終末]]の機能解析や、分泌小胞の動態解析に広く用いられる。 <br />
<br />
色素の特性として次の3つの性質がある。 <br />
<br />
#水溶液中に存在する場合に比べ、細胞膜に結合すると[[wikipedia:ja:量子効率|量子効率]]が著増し、強い[[wikipedia:ja:蛍光|蛍光]]を出す。 <br />
#[[wikipedia:ja:脂質二重層|脂質二重膜]]を透過しない。 <br />
#[[wikipedia:ja:両親媒性分子|両親媒性]]で可逆的に膜を染める。<br />
<br />
== 分子構造 ==<br />
<br />
[[Image:Takahashinoriko fig 2.jpg|thumb|250px|'''図2．（タイトル：FM 色素群の分子構造）''' 説明：二重結合の数は色調に、炭素鎖の数は細胞膜との親和性や蛍光強度に関連する]] 構造は、[[wikipedia:ja:親水性|親水性]]領域、[[wikipedia:ja:二重結合|二重結合]]領域、[[wikipedia:ja:疎水性|疎水性]]炭素鎖領域に分けられる。 <br />
<br />
親水性領域が正の電荷をもつため、膜を通過しない。二重結合の数は蛍光波長に関連する。 <br />
<br />
二重結合が一つの FM1-43、FM1-84、FM2-10 は黄色蛍光を呈し、二重結合が二つの FM4-64、FM5-95 は赤色蛍光を呈する。 <br />
<br />
疎水性炭素鎖の長さは細胞膜の染め方に関連し、長いものほど明るく、一旦膜に組み込まれると離脱しがたい<ref><pubmed> 10202529 </pubmed></ref>。 FM1-43 の炭素鎖数は4であり、解離時定数τ<sub>diss</sub>は8 msを示す。より短いFM2-10(炭素鎖数 2)は、比較的離脱しやすい(τ<sub>diss</sub>=6.4 ms)。逆に、より長い FM1-84（炭素鎖数 5）は離脱に時間がかかる(τ<sub>diss</sub>=36 ms)<ref><pubmed> 19580748 </pubmed></ref>。 <br />
<br />
== 蛍光特性 ==<br />
<br />
FM1-43の[[wikipedia:ja:励起状態|励起]]には1光子では波長480 nm光、2光子では波長840 nm光が頻用される。 <br />
<br />
極大蛍光波長は[[wikipedia:ja:リポソーム|リポソーム]]中にて580 nmである。 <br />
<br />
波長480nm光の高出力励起（～150 μW）にて[[wikipedia:3,3'-Diaminobenzidine|ジアミノベンチジン]]（DAB）の光変換（photoconversion） を起こす。そのため、[[wikipedia:ja:アルデヒド|アルデヒド]]で固定可能な色素であるFM1-43FX と DABを細胞に与え光変換させると、共局在部位で電子密度の高い産物が作られ、[[電子顕微鏡]]観察が可能となる。FM1-43を取り込んだ小胞が、高い電子密度で描出され、微細構造解析に活用されている。 <br />
<br />
== 応用例 ==<br />
<br />
=== シナプス前機能の解析 ===<br />
<br />
==== シナプス前終末における小胞プールの大きさと開口放出確率の測定 ====<br />
<br />
[[Image:Takahashinoriko fig 3.jpg|thumb|250px|'''図3．（タイトル：開口放出に伴う FM 蛍光の変化''' 説明：膜融合時、細胞外色素の有無により蛍光変化の様式が異なる）]] <br />
<br />
シナプスを刺激した時にミリ秒で起きる伝達物質放出は、活性帯にドックした小胞が開口放出すると仮想されている。この仮想的な小胞群を即時性放出プール[[Readily releasable pool]]（RRP）という。[[シナプス小胞]]は開口放出後30-60秒で細胞内部に[[エンドサイトーシス]]で取り込まれる(図 3左）。更に、シナプス終末内でシナプス小胞に再生されて即時性放出プールに再び至る。これをリサイクリングと呼び、これに関係する小胞の全体をリサイクリングプール(recycling pool)という。<br />
<br />
細胞外を FM1-43 で還流中に、長い放出刺激（例 20 Hz、900 発）を与え[[開口放出]]([[エクソサイトーシス]]）した小胞の膜を染めた後、細胞外を色素を含まない溶液で還流し、細胞外膜に結合した色素を wash out すると、リサイクリングプール(放出可能プール、TRP)の全体が染まる。一方、ちょうどRRPにある小胞を枯渇させる程度の短い放出刺激（例 20 Hz、30 発）を与えて負荷後にwash outをするとRRPが選択的に染まる。この様な解析から、RRPはリサイクリングプールの10-30%でないかと推定されており<ref><pubmed> 15044806 </pubmed></ref>、TRPが40程度の小さなシナプスではRRPの小胞数は4-12個となる。<br />
<br />
次に、リサイクリングプールを染めた小胞に刺激を与えると、シナプス小胞は細胞膜と融合し、FM1-43が細胞外液へ拡散することにより神経終末の蛍光は減弱する脱染色（destaining 図3右）。このdestainingの時間経過は、小胞の開口放出確率が大きい程速い。定量的には、RRPにある小胞の数を[RRP]、その放出確率をPvとすると、一回の刺激で放出される小胞の数は平均[RRP]*Pvとなる。一方、TRPにある小胞の数を[TRP]、一回の刺激によるTRPの蛍光の減弱率をkとすると、一回の刺激で放出される小胞の数は[TRP]*kとなる。よって、[RRP]*Pv = [TRP]*k となり、これからPv=k*[RRP]/[TRP] という関係式が得られ、終末ごとにRRPにある小胞の放出確率を求めることができる <ref><pubmed>23049481 </pubmed></ref>。<math>Pr=1-(1-Pv)**[RRP]ここに数式を挿入</math><br />
<br />
FM1-43によって染めることができるリサイクリングプールの小胞は、電子顕微鏡的に終末に存在する小胞の15-20%である<ref><pubmed> 15044806 </pubmed></ref>。 この電子顕微鏡的に同定されるリサイクリングされ難いシナプス小胞の群をreserve pool 或いは resting poolと言う。このプールの小胞もゆっくりとしたリサイクリングに関係していることが他の方法によって明らかとなっている<ref><pubmed>21835344 </pubmed></ref>。<br />
<br />
==== シナプス小胞の動態の解析 ====<br />
<br />
開口放出した顆粒は[[Active zone]]の周辺から内部に取り込まれ（[[エンドサイトーシス]]）、再び放出可能となる（[[リサイクル]]）。このリサイクルにかかる時間は、[[海馬]]培養標本では 20-30秒、神経筋接合部では 60秒と見積もられた。そこで[[Recycling pool]]（= RRP + Reserve pool）の測定は、RRP 測定時よりも長い時間電気刺激を与え、色素をロードする事により達成できる（例 10Hz 900 発）。リサイクルされた小胞は、元来小胞があった領域のほぼ全域に拡散し、core(中央部）への拡散のみが軽度に少なかった。また、リサイクルした小胞は、初めて刺激を受けたプール同様の放出確率を持つことが報告された<ref><pubmed> 1553547 </pubmed></ref> 。 <br />
<br />
=== 膜融合様式の解析 ===<br />
<br />
FM色素には、炭素鎖数の異なる複数種類の色素がある。これらが小胞膜を染める頻度を比較することにより、融合細孔の開放時間の長短が識別可能となる。 <br />
<br />
FM2-10やFM1-43色素を用い、小胞膜から離脱する[[完全融合]]型（full fusion）と、離脱しない[[不完全融合]]型（incomplete fusion）の識別が行われた<ref><pubmed> 9707119 </pubmed></ref> <ref><pubmed> 12354398 </pubmed></ref>。 <br />
<br />
=== 開口放出現象の可視化 ===<br />
<br />
FM1-43を[[網膜]][[双極性細胞]]のシナプス小胞に取り込ませて標識し、[[全反射顕微鏡]]で細胞膜直下（～100nm）の観察を行い、単一小胞の開口放出現象の可視化が報告された<ref><pubmed> 10972279 </pubmed></ref> 。 <br />
<br />
また、[[下垂体]][[前葉細胞]] (lactotrophs) や[[wikipedia:ja:膵島|膵島]]細胞においても、[[ホルモン]]を含む大型[[有芯小胞]]の[[膜融合]]に伴い、開口放出部位においてFM1-43蛍光強度の上昇が報告された <ref><pubmed> 10953007 </pubmed></ref><ref><pubmed>12193788 </pubmed></ref>。 <br />
<br />
=== 分泌小胞の直径測定 ===<br />
<br />
シナプス小胞から大型有芯小胞に至るまで、小胞の直径計測に有効である <ref><pubmed> 16150799 </pubmed></ref>。 <br />
<br />
水溶性色素（赤色[[wikipedia:ja:スルホローダミンB|スルホローダミンB]], SRB）とFM1-43を細胞外液に同時に与え、開口放出を誘発すると、水溶性色素は小胞内部に進入し、FM1-43は細胞外膜から小胞内膜へ拡散するため、開口放出した小胞が両色素で描出される。この際 [[２光子レーザー走査顕微鏡]]で画像を取得し、双方の色素の増加分の比を求めると小胞直径が計算される（直径＝6 ΔSRB/ΔFM1-43）。本法は色素濃度やレンズ特性（[[wikipedia:ja:点拡がり関数|点拡がり関数]]）によらず、シナプス小胞のような光学[[wikipedia:ja:解像度|解像度]]以下の器官の計測にも応用可能である。 <br />
<br />
== 関連項目 ==<br />
<br />
*[[開口放出]]（[[エクソサイトーシス]]） <br />
*[[膜融合]] <br />
*[[シナプス]] <br />
*[[wikipedia:ja:分泌|分泌]]<br />
<br />
== 参考文献 ==<br />
<br />
<references /><br />
<br />
<br>（執筆者：高橋倫子、河西春郎 担当編集委員：柚崎通介） </div>
Hkasai
https://bsd.neuroinf.jp/w/index.php?title=FM1-43&diff=19947
FM1-43
2013-04-25T12:22:57Z
<p>Hkasai: /* シナプス前終末における小胞プールの大きさと開口放出確率の測定 */</p>
<hr />
<div>{{Chembox<br />
| ImageFile = FM1-43.png<br />
| ImageSize = 220px<br />
| ImageAlt = <br />
| IUPACName = 3-[4-[2-[4-(dibutylamino)phenyl]ethenyl]pyridin-1-ium-1-yl]propyl-triethylazanium dibromide<br />
| OtherNames = Frie Mao 1-43, SynaptoGreen™ Reagent, SureCN1527120, N-(3-Triethylammoniumpropyl)-4-(p-dibutylaminostyryl)pyridinium, 2Br<br />
| Section1 = {{Chembox Identifiers<br />
| CASNo = 149838-22-2<br />
| PubChem = 2733618<br />
| SMILES =CCCCN(CCCC)C1=CC=C(C=C1)C=CC2=CC=[N+](C=C2)CCC[N+](CC)(CC)CC.[Br-].[Br-] }}<br />
| Section2 = {{Chembox Properties<br />
| Formula = C30H49Br2N3<br />
| MolarMass = 611.53816<br />
| Appearance = <br />
| Density = <br />
| MeltingPt = <br />
| BoilingPt = <br />
| Solubility = }}<br />
| Section3 = {{Chembox Hazards<br />
| MainHazards = <br />
| FlashPt = <br />
| Autoignition = }}<br />
}} <br />
<br />
FM 色素は[[wikipedia:ja:脂質二重層|脂質二重膜]]を可逆的に染める蛍光色素で、[[シナプス前終末]]の機能や[[wikipedia:ja:分泌|分泌]]現象の計測に活用されている。 <br />
<br />
== FM1-43とは ==<br />
<br />
[[Image:Takahashinoriko fig 1.jpg|thumb|250px|'''図1．（タイトル：FM 色素による還流と細胞膜の蛍光標識）''' 説明：FM 色素液で細胞を還流すると細胞外膜が蛍光を発する。]] Molecular Probe 社の Fei Mao は William J Betz らとともに、細胞膜を染める一連のスチリル色素を合成した。これらを FM (Fei Mao)色素と呼び、FM1-43 はその代表格である。[[シナプス前終末]]の機能解析や、分泌小胞の動態解析に広く用いられる。 <br />
<br />
色素の特性として次の3つの性質がある。 <br />
<br />
#水溶液中に存在する場合に比べ、細胞膜に結合すると[[wikipedia:ja:量子効率|量子効率]]が著増し、強い[[wikipedia:ja:蛍光|蛍光]]を出す。 <br />
#[[wikipedia:ja:脂質二重層|脂質二重膜]]を透過しない。 <br />
#[[wikipedia:ja:両親媒性分子|両親媒性]]で可逆的に膜を染める。<br />
<br />
== 分子構造 ==<br />
<br />
[[Image:Takahashinoriko fig 2.jpg|thumb|250px|'''図2．（タイトル：FM 色素群の分子構造）''' 説明：二重結合の数は色調に、炭素鎖の数は細胞膜との親和性や蛍光強度に関連する]] 構造は、[[wikipedia:ja:親水性|親水性]]領域、[[wikipedia:ja:二重結合|二重結合]]領域、[[wikipedia:ja:疎水性|疎水性]]炭素鎖領域に分けられる。 <br />
<br />
親水性領域が正の電荷をもつため、膜を通過しない。二重結合の数は蛍光波長に関連する。 <br />
<br />
二重結合が一つの FM1-43、FM1-84、FM2-10 は黄色蛍光を呈し、二重結合が二つの FM4-64、FM5-95 は赤色蛍光を呈する。 <br />
<br />
疎水性炭素鎖の長さは細胞膜の染め方に関連し、長いものほど明るく、一旦膜に組み込まれると離脱しがたい<ref><pubmed> 10202529 </pubmed></ref>。 FM1-43 の炭素鎖数は4であり、解離時定数τ<sub>diss</sub>は8 msを示す。より短いFM2-10(炭素鎖数 2)は、比較的離脱しやすい(τ<sub>diss</sub>=6.4 ms)。逆に、より長い FM1-84（炭素鎖数 5）は離脱に時間がかかる(τ<sub>diss</sub>=36 ms)<ref><pubmed> 19580748 </pubmed></ref>。 <br />
<br />
== 蛍光特性 ==<br />
<br />
FM1-43の[[wikipedia:ja:励起状態|励起]]には1光子では波長480 nm光、2光子では波長840 nm光が頻用される。 <br />
<br />
極大蛍光波長は[[wikipedia:ja:リポソーム|リポソーム]]中にて580 nmである。 <br />
<br />
波長480nm光の高出力励起（～150 μW）にて[[wikipedia:3,3'-Diaminobenzidine|ジアミノベンチジン]]（DAB）の光変換（photoconversion） を起こす。そのため、[[wikipedia:ja:アルデヒド|アルデヒド]]で固定可能な色素であるFM1-43FX と DABを細胞に与え光変換させると、共局在部位で電子密度の高い産物が作られ、[[電子顕微鏡]]観察が可能となる。FM1-43を取り込んだ小胞が、高い電子密度で描出され、微細構造解析に活用されている。 <br />
<br />
== 応用例 ==<br />
<br />
=== シナプス前機能の解析 ===<br />
<br />
==== シナプス前終末における小胞プールの大きさと開口放出確率の測定 ====<br />
<br />
[[Image:Takahashinoriko fig 3.jpg|thumb|250px|'''図3．（タイトル：開口放出に伴う FM 蛍光の変化''' 説明：膜融合時、細胞外色素の有無により蛍光変化の様式が異なる）]] <br />
<br />
シナプスを刺激した時にミリ秒で起きる伝達物質放出は、活性帯にドックした小胞が開口放出すると仮想されている。この仮想的な小胞群を即時性放出プール[[Readily releasable pool]]（RRP）という。[[シナプス小胞]]は開口放出後30-60秒で細胞内部に[[エンドサイトーシス]]で取り込まれる(図 3左）。更に、シナプス終末内でシナプス小胞に再生されて即時性放出プールに再び至る。これをリサイクリングと呼び、これに関係する小胞の全体をリサイクリングプール(recycling pool)という。<br />
<br />
細胞外を FM1-43 で還流中に、長い放出刺激（例 10 Hz、900 発）を与え[[開口放出]]([[エクソサイトーシス]]）した小胞の膜を染めた後、細胞外を色素を含まない溶液で還流し、細胞外膜に結合した色素を wash out すると、リサイクリングプール(放出可能プール、TRP)の全体が染まる。一方、ちょうどRRPにある小胞を枯渇させる程度の短い放出刺激（例 20 Hz、30 発）を与えて負荷後にwash outをするとRRPが選択的に染まる。この様な解析から、RRPはリサイクリングプールの10-30%でないかと推定されており<ref><pubmed> 15044806 </pubmed></ref>、TRPが40程度の小さなシナプスではRRPの小胞数は4-12個となる。<br />
<br />
次に、リサイクリングプールを染めた小胞に刺激を与えると、シナプス小胞は細胞膜と融合し、FM1-43が細胞外液へ拡散することにより神経終末の蛍光は減弱する脱染色（destaining 図3右）。このdestainingの時間経過は、小胞の開口放出確率が大きい程速い。定量的には、RRPにある小胞の数を[RRP]、その放出確率をPvとすると、一回の刺激で放出される小胞の数は平均[RRP]*Pvとなる。一方、TRPにある小胞の数を[TRP]、一回の刺激によるTRPの蛍光の減弱率をkとすると、一回の刺激で放出される小胞の数は[TRP]*kとなる。よって、[RRP]*Pv = [TRP]*k となり、これからPv=k*[RRP]/[TRP] という関係式が得られ、終末ごとにRRPにある小胞の放出確率を求めることができる <ref><pubmed>23049481 </pubmed></ref>。<br />
<br />
FM1-43によって染めることができるリサイクリングプールの小胞は、電子顕微鏡的に終末に存在する小胞の15-20%である<ref><pubmed> 15044806 </pubmed></ref>。 この電子顕微鏡的に同定されるリサイクリングされ難いシナプス小胞の群をreserve pool 或いは resting poolと言う。このプールの小胞もゆっくりとしたリサイクリングに関係していることが他の方法によって明らかとなっている<ref><pubmed>21835344 </pubmed></ref>。<br />
<br />
==== シナプス小胞の動態の解析 ====<br />
<br />
開口放出した顆粒は[[Active zone]]の周辺から内部に取り込まれ（[[エンドサイトーシス]]）、再び放出可能となる（[[リサイクル]]）。このリサイクルにかかる時間は、[[海馬]]培養標本では 20-30秒、神経筋接合部では 60秒と見積もられた。そこで[[Recycling pool]]（= RRP + Reserve pool）の測定は、RRP 測定時よりも長い時間電気刺激を与え、色素をロードする事により達成できる（例 10Hz 900 発）。リサイクルされた小胞は、元来小胞があった領域のほぼ全域に拡散し、core(中央部）への拡散のみが軽度に少なかった。また、リサイクルした小胞は、初めて刺激を受けたプール同様の放出確率を持つことが報告された<ref><pubmed> 1553547 </pubmed></ref> 。 <br />
<br />
=== 膜融合様式の解析 ===<br />
<br />
FM色素には、炭素鎖数の異なる複数種類の色素がある。これらが小胞膜を染める頻度を比較することにより、融合細孔の開放時間の長短が識別可能となる。 <br />
<br />
FM2-10やFM1-43色素を用い、小胞膜から離脱する[[完全融合]]型（full fusion）と、離脱しない[[不完全融合]]型（incomplete fusion）の識別が行われた<ref><pubmed> 9707119 </pubmed></ref> <ref><pubmed> 12354398 </pubmed></ref>。 <br />
<br />
=== 開口放出現象の可視化 ===<br />
<br />
FM1-43を[[網膜]][[双極性細胞]]のシナプス小胞に取り込ませて標識し、[[全反射顕微鏡]]で細胞膜直下（～100nm）の観察を行い、単一小胞の開口放出現象の可視化が報告された<ref><pubmed> 10972279 </pubmed></ref> 。 <br />
<br />
また、[[下垂体]][[前葉細胞]] (lactotrophs) や[[wikipedia:ja:膵島|膵島]]細胞においても、[[ホルモン]]を含む大型[[有芯小胞]]の[[膜融合]]に伴い、開口放出部位においてFM1-43蛍光強度の上昇が報告された <ref><pubmed> 10953007 </pubmed></ref><ref><pubmed>12193788 </pubmed></ref>。 <br />
<br />
=== 分泌小胞の直径測定 ===<br />
<br />
シナプス小胞から大型有芯小胞に至るまで、小胞の直径計測に有効である <ref><pubmed> 16150799 </pubmed></ref>。 <br />
<br />
水溶性色素（赤色[[wikipedia:ja:スルホローダミンB|スルホローダミンB]], SRB）とFM1-43を細胞外液に同時に与え、開口放出を誘発すると、水溶性色素は小胞内部に進入し、FM1-43は細胞外膜から小胞内膜へ拡散するため、開口放出した小胞が両色素で描出される。この際 [[２光子レーザー走査顕微鏡]]で画像を取得し、双方の色素の増加分の比を求めると小胞直径が計算される（直径＝6 ΔSRB/ΔFM1-43）。本法は色素濃度やレンズ特性（[[wikipedia:ja:点拡がり関数|点拡がり関数]]）によらず、シナプス小胞のような光学[[wikipedia:ja:解像度|解像度]]以下の器官の計測にも応用可能である。 <br />
<br />
== 関連項目 ==<br />
<br />
*[[開口放出]]（[[エクソサイトーシス]]） <br />
*[[膜融合]] <br />
*[[シナプス]] <br />
*[[wikipedia:ja:分泌|分泌]]<br />
<br />
== 参考文献 ==<br />
<br />
<references /><br />
<br />
<br>（執筆者：高橋倫子、河西春郎 担当編集委員：柚崎通介） </div>
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https://bsd.neuroinf.jp/w/index.php?title=FM1-43&diff=19946
FM1-43
2013-04-25T12:12:48Z
<p>Hkasai: </p>
<hr />
<div>{{Chembox<br />
| ImageFile = FM1-43.png<br />
| ImageSize = 220px<br />
| ImageAlt = <br />
| IUPACName = 3-[4-[2-[4-(dibutylamino)phenyl]ethenyl]pyridin-1-ium-1-yl]propyl-triethylazanium dibromide<br />
| OtherNames = Frie Mao 1-43, SynaptoGreen™ Reagent, SureCN1527120, N-(3-Triethylammoniumpropyl)-4-(p-dibutylaminostyryl)pyridinium, 2Br<br />
| Section1 = {{Chembox Identifiers<br />
| CASNo = 149838-22-2<br />
| PubChem = 2733618<br />
| SMILES =CCCCN(CCCC)C1=CC=C(C=C1)C=CC2=CC=[N+](C=C2)CCC[N+](CC)(CC)CC.[Br-].[Br-] }}<br />
| Section2 = {{Chembox Properties<br />
| Formula = C30H49Br2N3<br />
| MolarMass = 611.53816<br />
| Appearance = <br />
| Density = <br />
| MeltingPt = <br />
| BoilingPt = <br />
| Solubility = }}<br />
| Section3 = {{Chembox Hazards<br />
| MainHazards = <br />
| FlashPt = <br />
| Autoignition = }}<br />
}} <br />
<br />
FM 色素は[[wikipedia:ja:脂質二重層|脂質二重膜]]を可逆的に染める蛍光色素で、[[シナプス前終末]]の機能や[[wikipedia:ja:分泌|分泌]]現象の計測に活用されている。 <br />
<br />
== FM1-43とは ==<br />
<br />
[[Image:Takahashinoriko fig 1.jpg|thumb|250px|'''図1．（タイトル：FM 色素による還流と細胞膜の蛍光標識）''' 説明：FM 色素液で細胞を還流すると細胞外膜が蛍光を発する。]] Molecular Probe 社の Fei Mao は William J Betz らとともに、細胞膜を染める一連のスチリル色素を合成した。これらを FM (Fei Mao)色素と呼び、FM1-43 はその代表格である。[[シナプス前終末]]の機能解析や、分泌小胞の動態解析に広く用いられる。 <br />
<br />
色素の特性として次の3つの性質がある。 <br />
<br />
#水溶液中に存在する場合に比べ、細胞膜に結合すると[[wikipedia:ja:量子効率|量子効率]]が著増し、強い[[wikipedia:ja:蛍光|蛍光]]を出す。 <br />
#[[wikipedia:ja:脂質二重層|脂質二重膜]]を透過しない。 <br />
#[[wikipedia:ja:両親媒性分子|両親媒性]]で可逆的に膜を染める。<br />
<br />
== 分子構造 ==<br />
<br />
[[Image:Takahashinoriko fig 2.jpg|thumb|250px|'''図2．（タイトル：FM 色素群の分子構造）''' 説明：二重結合の数は色調に、炭素鎖の数は細胞膜との親和性や蛍光強度に関連する]] 構造は、[[wikipedia:ja:親水性|親水性]]領域、[[wikipedia:ja:二重結合|二重結合]]領域、[[wikipedia:ja:疎水性|疎水性]]炭素鎖領域に分けられる。 <br />
<br />
親水性領域が正の電荷をもつため、膜を通過しない。二重結合の数は蛍光波長に関連する。 <br />
<br />
二重結合が一つの FM1-43、FM1-84、FM2-10 は黄色蛍光を呈し、二重結合が二つの FM4-64、FM5-95 は赤色蛍光を呈する。 <br />
<br />
疎水性炭素鎖の長さは細胞膜の染め方に関連し、長いものほど明るく、一旦膜に組み込まれると離脱しがたい<ref><pubmed> 10202529 </pubmed></ref>。 FM1-43 の炭素鎖数は4であり、解離時定数τ<sub>diss</sub>は8 msを示す。より短いFM2-10(炭素鎖数 2)は、比較的離脱しやすい(τ<sub>diss</sub>=6.4 ms)。逆に、より長い FM1-84（炭素鎖数 5）は離脱に時間がかかる(τ<sub>diss</sub>=36 ms)<ref><pubmed> 19580748 </pubmed></ref>。 <br />
<br />
== 蛍光特性 ==<br />
<br />
FM1-43の[[wikipedia:ja:励起状態|励起]]には1光子では波長480 nm光、2光子では波長840 nm光が頻用される。 <br />
<br />
極大蛍光波長は[[wikipedia:ja:リポソーム|リポソーム]]中にて580 nmである。 <br />
<br />
波長480nm光の高出力励起（～150 μW）にて[[wikipedia:3,3'-Diaminobenzidine|ジアミノベンチジン]]（DAB）の光変換（photoconversion） を起こす。そのため、[[wikipedia:ja:アルデヒド|アルデヒド]]で固定可能な色素であるFM1-43FX と DABを細胞に与え光変換させると、共局在部位で電子密度の高い産物が作られ、[[電子顕微鏡]]観察が可能となる。FM1-43を取り込んだ小胞が、高い電子密度で描出され、微細構造解析に活用されている。 <br />
<br />
== 応用例 ==<br />
<br />
=== シナプス前機能の解析 ===<br />
<br />
==== シナプス前終末における小胞プールの大きさと開口放出確率の測定 ====<br />
<br />
[[Image:Takahashinoriko fig 3.jpg|thumb|250px|'''図3．（タイトル：開口放出に伴う FM 蛍光の変化''' 説明：膜融合時、細胞外色素の有無により蛍光変化の様式が異なる）]] <br />
<br />
シナプスを刺激した時ミリ秒で放出は、ドックした小胞によると仮想されている即時性放出プール[[Readily releasable pool]]（RRP）にある小胞が開口放出すると考えることができる。 開口放出の後に[[シナプス小胞]]は30-60秒で細胞内部に[[エンドサイトーシス]]で取り込まれた後(図 3左）、シナプス終末内でシナプス小胞に再生されて即時性放出プールに再び至る。この様に、リサイクリングしている小胞の全体をリサイクリングプール(recycling pool)という。<br />
<br />
細胞外を FM1-43 で還流中に、長い放出刺激（例 10 Hz、900 発）を与え[[開口放出]]([[エクソサイトーシス]]）した小胞の膜を染めた後、細胞外を色素を含まない溶液で還流し、細胞外膜に結合した色素を wash out すると、リサイクリングプール(放出可能プール、TRP)の全体が染まる。一方、ちょうどRRPにある小胞を枯渇させる程度の短い放出刺激（例 20 Hz、30 発）を与えて負荷後にwash outをするとRRPが選択的に染まる。この様な解析から、RRPはリサイクリングプールの10-30%でないかと推定されている<ref><pubmed> 15044806 </pubmed></ref>。<br />
<br />
次に、リサイクリングプールを染めた小胞に刺激を与えると、シナプス小胞は細胞膜と融合し、FM1-43が細胞外液へ拡散することにより神経終末の蛍光は減弱する（destaining 図3右）。このdestainingの時間経過は、小胞の開口放出確率が大きい程速い。定量的には、RRPにある小胞の数を[RRP]、その放出確率をPvとすると、一回の刺激で放出される小胞の数は平均[RRP]*Pvとなる。一方、TRPにある小胞の数を[TRP]、一回の刺激によるTRPの蛍光の減弱率をkとすると、一回の刺激で放出される小胞の数は[TRP]*kとなる。よって、[RRP]*Pv = [TRP]*k となり、これからPv=k*[RRP]/[TRP] という関係式が得られ、終末ごとにRRPにある小胞の放出確率を求めることができる <ref><pubmed>23049481 </pubmed></ref>。<br />
<br />
FM1-43によって染めることができるリサイクリングプールの小胞は、電子顕微鏡的に終末に存在する小胞の15-20%である<ref><pubmed> 15044806 </pubmed></ref>。 この電子顕微鏡的に同定されるリサイクリングされ難いシナプス小胞の群をreserve pool 或いは resting poolと言う。このプールの小胞もゆっくりとしたリサイクリングに関係していることが他の方法によって指摘されている <ref><pubmed>21835344 </pubmed></ref>。<br />
<br />
<br />
==== シナプス小胞の動態の解析 ====<br />
<br />
開口放出した顆粒は[[Active zone]]の周辺から内部に取り込まれ（[[エンドサイトーシス]]）、再び放出可能となる（[[リサイクル]]）。このリサイクルにかかる時間は、[[海馬]]培養標本では 20-30秒、神経筋接合部では 60秒と見積もられた。そこで[[Recycling pool]]（= RRP + Reserve pool）の測定は、RRP 測定時よりも長い時間電気刺激を与え、色素をロードする事により達成できる（例 10Hz 900 発）。リサイクルされた小胞は、元来小胞があった領域のほぼ全域に拡散し、core(中央部）への拡散のみが軽度に少なかった。また、リサイクルした小胞は、初めて刺激を受けたプール同様の放出確率を持つことが報告された<ref><pubmed> 1553547 </pubmed></ref> 。 <br />
<br />
=== 膜融合様式の解析 ===<br />
<br />
FM色素には、炭素鎖数の異なる複数種類の色素がある。これらが小胞膜を染める頻度を比較することにより、融合細孔の開放時間の長短が識別可能となる。 <br />
<br />
FM2-10やFM1-43色素を用い、小胞膜から離脱する[[完全融合]]型（full fusion）と、離脱しない[[不完全融合]]型（incomplete fusion）の識別が行われた<ref><pubmed> 9707119 </pubmed></ref> <ref><pubmed> 12354398 </pubmed></ref>。 <br />
<br />
=== 開口放出現象の可視化 ===<br />
<br />
FM1-43を[[網膜]][[双極性細胞]]のシナプス小胞に取り込ませて標識し、[[全反射顕微鏡]]で細胞膜直下（～100nm）の観察を行い、単一小胞の開口放出現象の可視化が報告された<ref><pubmed> 10972279 </pubmed></ref> 。 <br />
<br />
また、[[下垂体]][[前葉細胞]] (lactotrophs) や[[wikipedia:ja:膵島|膵島]]細胞においても、[[ホルモン]]を含む大型[[有芯小胞]]の[[膜融合]]に伴い、開口放出部位においてFM1-43蛍光強度の上昇が報告された <ref><pubmed> 10953007 </pubmed></ref><ref><pubmed>12193788 </pubmed></ref>。 <br />
<br />
=== 分泌小胞の直径測定 ===<br />
<br />
シナプス小胞から大型有芯小胞に至るまで、小胞の直径計測に有効である <ref><pubmed> 16150799 </pubmed></ref>。 <br />
<br />
水溶性色素（赤色[[wikipedia:ja:スルホローダミンB|スルホローダミンB]], SRB）とFM1-43を細胞外液に同時に与え、開口放出を誘発すると、水溶性色素は小胞内部に進入し、FM1-43は細胞外膜から小胞内膜へ拡散するため、開口放出した小胞が両色素で描出される。この際 [[２光子レーザー走査顕微鏡]]で画像を取得し、双方の色素の増加分の比を求めると小胞直径が計算される（直径＝6 ΔSRB/ΔFM1-43）。本法は色素濃度やレンズ特性（[[wikipedia:ja:点拡がり関数|点拡がり関数]]）によらず、シナプス小胞のような光学[[wikipedia:ja:解像度|解像度]]以下の器官の計測にも応用可能である。 <br />
<br />
== 関連項目 ==<br />
<br />
*[[開口放出]]（[[エクソサイトーシス]]） <br />
*[[膜融合]] <br />
*[[シナプス]] <br />
*[[wikipedia:ja:分泌|分泌]]<br />
<br />
== 参考文献 ==<br />
<br />
<references /><br />
<br />
<br>（執筆者：高橋倫子、河西春郎 担当編集委員：柚崎通介） </div>
Hkasai
https://bsd.neuroinf.jp/w/index.php?title=FM1-43&diff=19945
FM1-43
2013-04-25T12:06:43Z
<p>Hkasai: </p>
<hr />
<div>{{Chembox<br />
| ImageFile = FM1-43.png<br />
| ImageSize = 220px<br />
| ImageAlt = <br />
| IUPACName = 3-[4-[2-[4-(dibutylamino)phenyl]ethenyl]pyridin-1-ium-1-yl]propyl-triethylazanium dibromide<br />
| OtherNames = Frie Mao 1-43, SynaptoGreen™ Reagent, SureCN1527120, N-(3-Triethylammoniumpropyl)-4-(p-dibutylaminostyryl)pyridinium, 2Br<br />
| Section1 = {{Chembox Identifiers<br />
| CASNo = 149838-22-2<br />
| PubChem = 2733618<br />
| SMILES =CCCCN(CCCC)C1=CC=C(C=C1)C=CC2=CC=[N+](C=C2)CCC[N+](CC)(CC)CC.[Br-].[Br-] }}<br />
| Section2 = {{Chembox Properties<br />
| Formula = C30H49Br2N3<br />
| MolarMass = 611.53816<br />
| Appearance = <br />
| Density = <br />
| MeltingPt = <br />
| BoilingPt = <br />
| Solubility = }}<br />
| Section3 = {{Chembox Hazards<br />
| MainHazards = <br />
| FlashPt = <br />
| Autoignition = }}<br />
}} <br />
<br />
FM 色素は[[wikipedia:ja:脂質二重層|脂質二重膜]]を可逆的に染める蛍光色素で、[[シナプス前終末]]の機能や[[wikipedia:ja:分泌|分泌]]現象の計測に活用されている。 <br />
<br />
== FM1-43とは ==<br />
<br />
[[Image:Takahashinoriko fig 1.jpg|thumb|250px|'''図1．（タイトル：FM 色素による還流と細胞膜の蛍光標識）''' 説明：FM 色素液で細胞を還流すると細胞外膜が蛍光を発する。]] Molecular Probe 社の Fei Mao は William J Betz らとともに、細胞膜を染める一連のスチリル色素を合成した。これらを FM (Fei Mao)色素と呼び、FM1-43 はその代表格である。[[シナプス前終末]]の機能解析や、分泌小胞の動態解析に広く用いられる。 <br />
<br />
色素の特性として次の3つの性質がある。 <br />
<br />
#水溶液中に存在する場合に比べ、細胞膜に結合すると[[wikipedia:ja:量子効率|量子効率]]が著増し、強い[[wikipedia:ja:蛍光|蛍光]]を出す。 <br />
#[[wikipedia:ja:脂質二重層|脂質二重膜]]を透過しない。 <br />
#[[wikipedia:ja:両親媒性分子|両親媒性]]で可逆的に膜を染める。<br />
<br />
== 分子構造 ==<br />
<br />
[[Image:Takahashinoriko fig 2.jpg|thumb|250px|'''図2．（タイトル：FM 色素群の分子構造）''' 説明：二重結合の数は色調に、炭素鎖の数は細胞膜との親和性や蛍光強度に関連する]] 構造は、[[wikipedia:ja:親水性|親水性]]領域、[[wikipedia:ja:二重結合|二重結合]]領域、[[wikipedia:ja:疎水性|疎水性]]炭素鎖領域に分けられる。 <br />
<br />
親水性領域が正の電荷をもつため、膜を通過しない。二重結合の数は蛍光波長に関連する。 <br />
<br />
二重結合が一つの FM1-43、FM1-84、FM2-10 は黄色蛍光を呈し、二重結合が二つの FM4-64、FM5-95 は赤色蛍光を呈する。 <br />
<br />
疎水性炭素鎖の長さは細胞膜の染め方に関連し、長いものほど明るく、一旦膜に組み込まれると離脱しがたい<ref><pubmed> 10202529 </pubmed></ref>。 FM1-43 の炭素鎖数は4であり、解離時定数τ<sub>diss</sub>は8 msを示す。より短いFM2-10(炭素鎖数 2)は、比較的離脱しやすい(τ<sub>diss</sub>=6.4 ms)。逆に、より長い FM1-84（炭素鎖数 5）は離脱に時間がかかる(τ<sub>diss</sub>=36 ms)<ref><pubmed> 19580748 </pubmed></ref>。 <br />
<br />
== 蛍光特性 ==<br />
<br />
FM1-43の[[wikipedia:ja:励起状態|励起]]には1光子では波長480 nm光、2光子では波長840 nm光が頻用される。 <br />
<br />
極大蛍光波長は[[wikipedia:ja:リポソーム|リポソーム]]中にて580 nmである。 <br />
<br />
波長480nm光の高出力励起（～150 μW）にて[[wikipedia:3,3'-Diaminobenzidine|ジアミノベンチジン]]（DAB）の光変換（photoconversion） を起こす。そのため、[[wikipedia:ja:アルデヒド|アルデヒド]]で固定可能な色素であるFM1-43FX と DABを細胞に与え光変換させると、共局在部位で電子密度の高い産物が作られ、[[電子顕微鏡]]観察が可能となる。FM1-43を取り込んだ小胞が、高い電子密度で描出され、微細構造解析に活用されている。 <br />
<br />
== 応用例 ==<br />
<br />
=== シナプス前機能の解析 ===<br />
<br />
==== シナプス前終末における小胞プールの大きさと開口放出確率の測定 ====<br />
<br />
[[Image:Takahashinoriko fig 3.jpg|thumb|250px|'''図3．（タイトル：開口放出に伴う FM 蛍光の変化''' 説明：膜融合時、細胞外色素の有無により蛍光変化の様式が異なる）]] <br />
<br />
シナプスを刺激した時ミリ秒で放出は、ドックした小胞によると仮想されている即時性放出プール[[Readily releasable pool]]（RRP）にある小胞が開口放出すると考えることができる。 開口放出の後に[[シナプス小胞]]は30-60秒で細胞内部に[[エンドサイトーシス]]で取り込まれた後(図 3左）、シナプス終末内でシナプス小胞に再生されて即時性放出プールに再び至る。この様に、リサイクリングしている小胞の全体をリサイクリングプール(recycling pool)という。<br />
<br />
細胞外を FM1-43 で還流中に、長い放出刺激（例 10 Hz、900 発）を与え[[開口放出]]([[エクソサイトーシス]]）した小胞の膜を染めた後、細胞外を色素を含まない溶液で還流し、細胞外膜に結合した色素を wash out すると、リサイクリングプール(放出可能プール、TRP)の全体が染まる。一方、ちょうどRRPにある小胞を枯渇させる程度の短い放出刺激（例 20 Hz、30 発）を与えて負荷後にwash outをするとRRPが選択的に染まる。この様な解析から、RRPはリサイクリングプールの10-30%でないかと推定されている<ref><pubmed> 15044806 </pubmed></ref>。<br />
<br />
次に、リサイクリングプールを染めた小胞に刺激を与えると、シナプス小胞は細胞膜と融合し、FM1-43が細胞外液へ拡散することにより神経終末の蛍光は減弱する（destaining 図3右）。このdestainingの時間経過は、小胞の開口放出確率が大きい程速い。定量的には、RRPにある小胞の数を[RRP]、その放出確率をPrとすると、一回の刺激で放出される小胞の数は平均[RRP]*Prとなる。一方、TRPにある小胞の数を[TRP]、一回の刺激によるTRPの蛍光の減弱率をkとすると、一回の刺激で放出される小胞の数は[TRP]*kとなる。よって、[RRP]*Pr = [TRP]*k となり、これからPr=k*[RRP]/[TRP] という関係式から終末ごとにRRPにある小胞の放出確率を求めることができる。<br />
<br />
FM1-43によって染めることができるリサイクリングプールの小胞は、電子顕微鏡的に終末に存在する小胞の15-20%である<ref><pubmed> 15044806 </pubmed></ref>。 この電子顕微鏡的に同定されるリサイクリングされ難いシナプス小胞の群をreserve pool 或いは resting poolと言う。このプールの小胞もゆっくりとしたリサイクリングに関係していることが他の方法によって指摘されている <ref><pubmed>21835344 </pubmed></ref>。<br />
<br />
<br />
<br />
==== シナプス小胞の動態の解析 ====<br />
<br />
開口放出した顆粒は[[Active zone]]の周辺から内部に取り込まれ（[[エンドサイトーシス]]）、再び放出可能となる（[[リサイクル]]）。このリサイクルにかかる時間は、[[海馬]]培養標本では 20-30秒、神経筋接合部では 60秒と見積もられた。そこで[[Recycling pool]]（= RRP + Reserve pool）の測定は、RRP 測定時よりも長い時間電気刺激を与え、色素をロードする事により達成できる（例 10Hz 900 発）。リサイクルされた小胞は、元来小胞があった領域のほぼ全域に拡散し、core(中央部）への拡散のみが軽度に少なかった。また、リサイクルした小胞は、初めて刺激を受けたプール同様の放出確率を持つことが報告された<ref><pubmed> 1553547 </pubmed></ref> 。 <br />
<br />
=== 膜融合様式の解析 ===<br />
<br />
FM色素には、炭素鎖数の異なる複数種類の色素がある。これらが小胞膜を染める頻度を比較することにより、融合細孔の開放時間の長短が識別可能となる。 <br />
<br />
FM2-10やFM1-43色素を用い、小胞膜から離脱する[[完全融合]]型（full fusion）と、離脱しない[[不完全融合]]型（incomplete fusion）の識別が行われた<ref><pubmed> 9707119 </pubmed></ref> <ref><pubmed> 12354398 </pubmed></ref>。 <br />
<br />
=== 開口放出現象の可視化 ===<br />
<br />
FM1-43を[[網膜]][[双極性細胞]]のシナプス小胞に取り込ませて標識し、[[全反射顕微鏡]]で細胞膜直下（～100nm）の観察を行い、単一小胞の開口放出現象の可視化が報告された<ref><pubmed> 10972279 </pubmed></ref> 。 <br />
<br />
また、[[下垂体]][[前葉細胞]] (lactotrophs) や[[wikipedia:ja:膵島|膵島]]細胞においても、[[ホルモン]]を含む大型[[有芯小胞]]の[[膜融合]]に伴い、開口放出部位においてFM1-43蛍光強度の上昇が報告された <ref><pubmed> 10953007 </pubmed></ref><ref><pubmed>12193788 </pubmed></ref>。 <br />
<br />
=== 分泌小胞の直径測定 ===<br />
<br />
シナプス小胞から大型有芯小胞に至るまで、小胞の直径計測に有効である <ref><pubmed> 16150799 </pubmed></ref>。 <br />
<br />
水溶性色素（赤色[[wikipedia:ja:スルホローダミンB|スルホローダミンB]], SRB）とFM1-43を細胞外液に同時に与え、開口放出を誘発すると、水溶性色素は小胞内部に進入し、FM1-43は細胞外膜から小胞内膜へ拡散するため、開口放出した小胞が両色素で描出される。この際 [[２光子レーザー走査顕微鏡]]で画像を取得し、双方の色素の増加分の比を求めると小胞直径が計算される（直径＝6 ΔSRB/ΔFM1-43）。本法は色素濃度やレンズ特性（[[wikipedia:ja:点拡がり関数|点拡がり関数]]）によらず、シナプス小胞のような光学[[wikipedia:ja:解像度|解像度]]以下の器官の計測にも応用可能である。 <br />
<br />
== 関連項目 ==<br />
<br />
*[[開口放出]]（[[エクソサイトーシス]]） <br />
*[[膜融合]] <br />
*[[シナプス]] <br />
*[[wikipedia:ja:分泌|分泌]]<br />
<br />
== 参考文献 ==<br />
<br />
<references /><br />
<br />
<br>（執筆者：高橋倫子、河西春郎 担当編集委員：柚崎通介） </div>
Hkasai
https://bsd.neuroinf.jp/w/index.php?title=%E3%83%88%E3%83%BC%E3%82%AF:%E8%86%9C%E5%AE%B9%E9%87%8F%E6%B8%AC%E5%AE%9A%E6%B3%95&diff=19943
トーク:膜容量測定法
2013-04-25T07:07:08Z
<p>Hkasai: </p>
<hr />
<div>==編集 林 作業記録==<br />
*内部リンク、外部リンク作成<br />
<br />
--[[利用者:WikiSysop|Yasunori Hayashi]] 2013年2月1日 (金) 08:09 (JST)<br />
<br />
==編集 柚崎 作業記録==<br />
*遅くなり済みません。勉強させていただきました。以下、私が良く理解できなかった点を書きます。<br />
<br />
*図１右図でのセルアタッチドでの膜容量測定の図ですが、これは、たまたまピペット直下で小胞が融合している図でしょうか？マストセルなどmassiveに分泌する細胞ならこのようなことも起きるかもしれませんが、神経細胞で分泌場所の真上にパッチすることは可能なのでしょうか？逆にマストセルでは、他の部位で小胞放出が起きてしまったりして困らないでしょうか？ここでの参考文献［3］Breckenridge & Almers.Nature 328;814-7, 1987は、セルアタッチではなく、ホールセルでの実験のように思いましたが、私の勘違いでしょうか？<br />
<br />
*関連する質問ですが、「軸索終末への応用も試みられている。この場合、高周波正弦波が軸索に沿って著しく減衰するので、単一終末の開口放出やエンドサイトーシスを記録することが可能と考えられている。」とありますが、この意味するところがよく分かりませんでした。正弦波が減衰してしまうならば、終末部の開口放出による膜容量変化はdetectできないように直感的には感じます。多分、私の固定概念と思いますが、膜容量測定法は強力な方法であるものの、あくまで小胞放出部位の近くにspace clampできるサンプル（例えば神経系ではCalyx of Heldなど）に限られるように思っていました。神経系への応用可能性とその限界といった観点から、もう少し説明していただけると私としては有り難いです。<br />
<br />
--[[利用者:Michisuke Yuzaki]] 2013年4月3日 (水)<br />
<br />
<br />
柚崎先生、注意深いご査読ありがとうございました。<br />
全体的にわかりやすくなるように直しました。<br />
<br />
*図１右図でのセルアタッチドでの膜容量測定の図ですが、これは、たまたまピペット直下で小胞が融合している図でしょうか？<br />
<br />
そうです。<br />
<br />
マストセルなどmassiveに分泌する細胞ならこのようなことも起きるかもしれませんが、神経細胞で分泌場所の真上にパッチすることは可能なのでしょうか？<br />
<br />
可能です。文献[4]<br />
<br />
逆にマストセルでは、他の部位で小胞放出が起きてしまったりして困らないでしょうか？<br />
<br />
これで困らないことを下記のように追加しました。<br />
「パッチ膜以外の細胞膜のインピーダンスはパッチ膜に比して低すぎるので無視されると考えられ、パッチ膜のインピーダンス変化だけが捉えられる。」<br />
<br />
Breckenridge & Almers.Nature 328;814-7, 1987は、セルアタッチではなく、ホールセルでの実験のように思いましたが、私の勘違いでしょうか？<br />
<br />
この論文では両方やってあります。<br />
<br />
関連する質問ですが、「軸索終末への応用も試みられている。この場合、高周波正弦波が軸索に沿って著しく減衰するので、単一終末の開口放出やエンドサイトーシスを記録することが可能と考えられている。」とありますが、この意味するところがよく分かりませんでした。正弦波が減衰してしまうならば、終末部の開口放出による膜容量変化はdetectできないように直感的には感じます。<br />
<br />
誤解されるような表現でしたので、直しました。これはCalyx of Heldで膜容量測定ができてしまう原理です。<br />
<br />
多分、私の固定概念と思いますが、膜容量測定法は強力な方法であるものの、あくまで小胞放出部位の近くにspace clampできるサンプル（例えば神経系ではCalyx of Heldなど）に限られるように思っていました。神経系への応用可能性とその限界といった観点から、もう少し説明していただけると私としては有り難いです。<br />
<br />
本当に、限界が多くあまりいい方法とは思いません。この限界について、最終段の解説をより明瞭にしました。<br />
<br />
ご校閲よろしくお願いいたします。<br />
<br />
河西春郎<br />
<br />
</div>
Hkasai
https://bsd.neuroinf.jp/w/index.php?title=%E3%83%88%E3%83%BC%E3%82%AF:%E8%86%9C%E5%AE%B9%E9%87%8F%E6%B8%AC%E5%AE%9A%E6%B3%95&diff=19942
トーク:膜容量測定法
2013-04-25T07:03:44Z
<p>Hkasai: </p>
<hr />
<div>==編集 林 作業記録==<br />
*内部リンク、外部リンク作成<br />
<br />
--[[利用者:WikiSysop|Yasunori Hayashi]] 2013年2月1日 (金) 08:09 (JST)<br />
<br />
==編集 柚崎 作業記録==<br />
*遅くなり済みません。勉強させていただきました。以下、私が良く理解できなかった点を書きます。<br />
<br />
*図１右図でのセルアタッチドでの膜容量測定の図ですが、これは、たまたまピペット直下で小胞が融合している図でしょうか？マストセルなどmassiveに分泌する細胞ならこのようなことも起きるかもしれませんが、神経細胞で分泌場所の真上にパッチすることは可能なのでしょうか？逆にマストセルでは、他の部位で小胞放出が起きてしまったりして困らないでしょうか？ここでの参考文献［3］Breckenridge & Almers.Nature 328;814-7, 1987は、セルアタッチではなく、ホールセルでの実験のように思いましたが、私の勘違いでしょうか？<br />
<br />
*関連する質問ですが、「軸索終末への応用も試みられている。この場合、高周波正弦波が軸索に沿って著しく減衰するので、単一終末の開口放出やエンドサイトーシスを記録することが可能と考えられている。」とありますが、この意味するところがよく分かりませんでした。正弦波が減衰してしまうならば、終末部の開口放出による膜容量変化はdetectできないように直感的には感じます。多分、私の固定概念と思いますが、膜容量測定法は強力な方法であるものの、あくまで小胞放出部位の近くにspace clampできるサンプル（例えば神経系ではCalyx of Heldなど）に限られるように思っていました。神経系への応用可能性とその限界といった観点から、もう少し説明していただけると私としては有り難いです。<br />
<br />
--[[利用者:Michisuke Yuzaki]] 2013年4月3日 (水)<br />
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<br />
柚崎先生、注意深いご査読ありがとうございました。<br />
全体的にわかりやすくなるように直しました。<br />
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*図１右図でのセルアタッチドでの膜容量測定の図ですが、これは、たまたまピペット直下で小胞が融合している図でしょうか？<br />
<br />
そうです。<br />
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マストセルなどmassiveに分泌する細胞ならこのようなことも起きるかもしれませんが、神経細胞で分泌場所の真上にパッチすることは可能なのでしょうか？<br />
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可能です。文献[4]<br />
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逆にマストセルでは、他の部位で小胞放出が起きてしまったりして困らないでしょうか？<br />
<br />
これで困らないことを下記のように追加しました。<br />
「パッチ膜以外の細胞膜のインピーダンスはパッチ膜に比して低すぎるので無視されると考えられ、パッチ膜のインピーダンス変化だけが捉えられる。」<br />
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Breckenridge & Almers.Nature 328;814-7, 1987は、セルアタッチではなく、ホールセルでの実験のように思いましたが、私の勘違いでしょうか？<br />
<br />
この論文では両方やってあります。<br />
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関連する質問ですが、「軸索終末への応用も試みられている。この場合、高周波正弦波が軸索に沿って著しく減衰するので、単一終末の開口放出やエンドサイトーシスを記録することが可能と考えられている。」とありますが、この意味するところがよく分かりませんでした。正弦波が減衰してしまうならば、終末部の開口放出による膜容量変化はdetectできないように直感的には感じます。<br />
<br />
誤解されるような表現でしたので、直しました。これはCalyx of Heldで膜容量測定ができてしまう原理です。<br />
<br />
多分、私の固定概念と思いますが、膜容量測定法は強力な方法であるものの、あくまで小胞放出部位の近くにspace clampできるサンプル（例えば神経系ではCalyx of Heldなど）に限られるように思っていました。神経系への応用可能性とその限界といった観点から、もう少し説明していただけると私としては有り難いです。<br />
<br />
本当に、限界が多くいい方法とは思いません。この限界について、最終段の解説をより明瞭にしました。<br />
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ご校閲よろしくお願いいたします。<br />
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河西春郎<br />
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</div>
Hkasai
https://bsd.neuroinf.jp/w/index.php?title=%E3%83%88%E3%83%BC%E3%82%AF:%E8%86%9C%E5%AE%B9%E9%87%8F%E6%B8%AC%E5%AE%9A%E6%B3%95&diff=19941
トーク:膜容量測定法
2013-04-25T06:53:55Z
<p>Hkasai: 修正コメント</p>
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<div>==編集 林 作業記録==<br />
*内部リンク、外部リンク作成<br />
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--[[利用者:WikiSysop|Yasunori Hayashi]] 2013年2月1日 (金) 08:09 (JST)<br />
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==編集 柚崎 作業記録==<br />
*遅くなり済みません。勉強させていただきました。以下、私が良く理解できなかった点を書きます。<br />
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*図１右図でのセルアタッチドでの膜容量測定の図ですが、これは、たまたまピペット直下で小胞が融合している図でしょうか？マストセルなどmassiveに分泌する細胞ならこのようなことも起きるかもしれませんが、神経細胞で分泌場所の真上にパッチすることは可能なのでしょうか？逆にマストセルでは、他の部位で小胞放出が起きてしまったりして困らないでしょうか？ここでの参考文献［3］Breckenridge & Almers.Nature 328;814-7, 1987は、セルアタッチではなく、ホールセルでの実験のように思いましたが、私の勘違いでしょうか？<br />
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*関連する質問ですが、「軸索終末への応用も試みられている。この場合、高周波正弦波が軸索に沿って著しく減衰するので、単一終末の開口放出やエンドサイトーシスを記録することが可能と考えられている。」とありますが、この意味するところがよく分かりませんでした。正弦波が減衰してしまうならば、終末部の開口放出による膜容量変化はdetectできないように直感的には感じます。多分、私の固定概念と思いますが、膜容量測定法は強力な方法であるものの、あくまで小胞放出部位の近くにspace clampできるサンプル（例えば神経系ではCalyx of Heldなど）に限られるように思っていました。神経系への応用可能性とその限界といった観点から、もう少し説明していただけると私としては有り難いです。<br />
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--[[利用者:Michisuke Yuzaki]] 2013年4月3日 (水)<br />
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柚崎先生、注意深いご査読ありがとうございました。<br />
全体的にわかりやすくなるように直しました。<br />
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*図１右図でのセルアタッチドでの膜容量測定の図ですが、これは、たまたまピペット直下で小胞が融合している図でしょうか？<br />
<br />
そうです。<br />
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マストセルなどmassiveに分泌する細胞ならこのようなことも起きるかもしれませんが、神経細胞で分泌場所の真上にパッチすることは可能なのでしょうか？<br />
<br />
可能です。<br />
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逆にマストセルでは、他の部位で小胞放出が起きてしまったりして困らないでしょうか？<br />
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これで困らないことを</div>
Hkasai