ファイル:2-ITC.jpg

2012-08-26T05:57:51Z

Hkatsuki:

ファイル:1-scatch.jpg

2012-08-26T05:57:17Z

Hkatsuki: 「ファイル:1-scatch.jpg」の新しい版をアップロードしました

ファイル:1-scatch.jpg

2012-08-26T05:53:49Z

Hkatsuki:

結合定数

2012-08-26T05:28:11Z

Hkatsuki:

英：Binding constant

　結合定数とは、ある分子Aと別の分子Bが非共有結合（水素結合、疎水結合、イオン結合など）により結合／解離の平衡反応を生じる場合に、当該分子間の結合力を数値で表す指標である。低分子量化合物（生理活性物質や薬物など）の受容体タンパク質や血漿タンパク質等への結合の解析、およびタンパク質-タンパク質間相互作用の解析などで用いられる。

==定義==
　A + B ← → AB　・・・・・(1)

　分子Aと分子Bとの結合／解離について上記(1)の平衡反応が成立する場合、平衡状態における遊離型の分子A、遊離型の分子Bおよび結合型ABのモル濃度をそれぞれ[A]、[B]、[AB]とすると、結合定数KB（単位：M−1）は以下の式で表される。

　KB = [AB]／([A][B])　・・・・・(2)

==解離定数 Dissociation constant ==
　平衡反応(1)を、結合型ABから遊離型のAとBへの解離反応（AB ← → A + B）として捉えた場合の平衡定数が、解離定数KD（単位：M）である。すなわち、結合定数の逆数が解離定数となる。

　 KD = 1／KB = [A][B]／[AB]

　受容体等のタンパク質に対するリガンドの結合の解析においては、一般に結合定数よりも解離定数のほうがよく用いられる。また解離定数は、酸／塩基の解離反応（イオン化反応：例えばCH3COOH ← → H+ + CH3COO−）を記述する際にも用いられる。

==結合定数／解離定数の求め方 ==
・Scatchardプロット [1]

　受容体等のタンパク質へのリガンドの結合を解析する際に用いられてきた古典的手法である。受容体Bに対するリガンドAの結合を考えるとき、受容体総濃度Bmax = (非結合型のBの濃度) + (Aの結合したBの濃度) = [B] + [AB]であり、これを式(2)に代入すると

　KB = [AB]／{[A](Bmax−[AB])}

これを変形すると

　[AB]／[A] = KB(Bmax−[AB])　・・・・・(3)

なお、Scatchard解析では慣例的に以下の記号を用いる。

　B（Boundの意）：リガンドA-受容体Bの複合体の濃度(= [AB])

　F (Freeの意)：遊離型のリガンドAの濃度 (= [A])

これらの記号を用いると、式(3)は以下のように書き換えられる。

　B／F = KB(max−B)

Bを横軸、B／Fを縦軸にとると、その傾き(=−KB)よりKBが求められる（図1）。ただし、性質の異なる複数の結合が存在する場合は、プロットは複数の直線の合成された形の曲線となる。

　Scatchardプロットの作成に必要なBおよびFの値は、3Hや125Iなどの放射性元素で標識したリガンドを用いた結合実験により測定できる。結合型と遊離型のリガンドを分離する手法としては、低分子量化合物のみを通す透析膜を用いた平衡透析法や、一定以上の分子量のものを通さない限外ろ過膜を用いた限外ろ過法などがある。

・等温滴定熱量測定isothemal titration calorimetry (ITC) [2, 3]

　分子同士が結合する際に発生する（もしくは吸収される）微小な熱量を一定温度下で測定することにより、当該分子間相互作用の熱力学的プロファイル（結合定数を含む）を精度良く得る手法である。測定対象分子の化学修飾や固定化が不要であり、自然な状態に近い条件下での測定が可能である。実際の測定では、一方の分子の溶液に他方の分子の溶液を一定量ずつ滴下し、その際に生じた熱量変化を測定することで結合等温線（図2）が得られる。この曲線のフィッティングのパラメータより結合定数が求められる。

・表面プラズモン共鳴surface plasmon resonance (SPR)分析 [3]

　センサーチップ上で分子間相互作用をリアルタイムに測定し、分子間の結合／解離のパラメータを得る手法である。金(Au)の薄膜を蒸着させたセンサーチップ上に一方の分子B（リガンド）を固定化しておき、他方の分子A（アナライト）の溶液を一定時間灌流する。AとBの結合によって生じる微量な質量変化をSPRシグナルとして検出し（図3）、その測定値から結合反応（A + B → AB）の速度定数konを得る。その後、アナライトを含まない緩衝液を灌流すると、SPRシグナルの減衰から解離反応（AB → A + B）の速度定数koffが得られる。このとき、結合定数KB = kon／koffである。

==参考文献==
1. 田中千賀子、加藤隆一編、NEW薬理学改訂第6版（南江堂）2011, p. 12-13.

2. 織田昌幸　等温滴定熱測定、蛋白質学会アーカイブ #30 (http://www.pssj.jp/archives/Protocol/Measurement/ITC_01/ITC_01_01.html)

3. 津本浩平　タンパク質相互作用解析：等温滴定型熱量測定と表面プラズモン共鳴、生物工学Vol. 89, p. 391-394, 2011. (http://www.sbj.or.jp/sbj/sbj/sbj/sbj_vol89_no07.html)

同義語：会合定数 Association constant、親和定数 Affinity constant
重要な関連用語：解離定数 Dissociation constant

（執筆者：香月博志、担当編集委員：河西春郎）

結合定数

2012-08-26T05:16:46Z

Hkatsuki: ページの作成：「英：Binding constant 　結合定数とは、ある分子Aと別の分子Bが非共有結合（水素結合、疎水結合、イオン結合など）により結合／...」

英：Binding constant

　結合定数とは、ある分子Aと別の分子Bが非共有結合（水素結合、疎水結合、イオン結合など）により結合／解離の平衡反応を生じる場合に、当該分子間の結合力を数値で表す指標である。低分子量化合物（生理活性物質や薬物など）の受容体タンパク質や血漿タンパク質等への結合の解析、およびタンパク質-タンパク質間相互作用の解析などで用いられる。

==定義==
　A + B ← → AB　・・・・・(1)
　分子Aと分子Bとの結合／解離について上記(1)の平衡反応が成立する場合、平衡状態における遊離型の分子A、遊離型の分子Bおよび結合型ABのモル濃度をそれぞれ[A]、[B]、[AB]とすると、結合定数KB（単位：M−1）は以下の式で表される。
　KB = [AB]／([A][B])　・・・・・(2)

==解離定数 Dissociation constant ==
　平衡反応(1)を、結合型ABから遊離型のAとBへの解離反応（AB &harr A + B）として捉えた場合の平衡定数が、解離定数KD（単位：M）である。すなわち、結合定数の逆数が解離定数となる。
　 KD = 1／KB = [A][B]／[AB]
　受容体等のタンパク質に対するリガンドの結合の解析においては、一般に結合定数よりも解離定数のほうがよく用いられる。また解離定数は、酸／塩基の解離反応（イオン化反応：例えばCH3COOH ← → H+ + CH3COO−）を記述する際にも用いられる。

==結合定数／解離定数の求め方 ==
・Scatchardプロット [1]
　受容体等のタンパク質へのリガンドの結合を解析する際に用いられてきた古典的手法である。受容体Bに対するリガンドAの結合を考えるとき、受容体総濃度Bmax = (非結合型のBの濃度) + (Aの結合したBの濃度) = [B] + [AB]であり、これを式(2)に代入すると
　KB = [AB]／{[A](Bmax−[AB])}
これを変形すると
　[AB]／[A] = KB(Bmax−[AB])　・・・・・(3)
なお、Scatchard解析では慣例的に以下の記号を用いる。
　B（Boundの意）：リガンドA-受容体Bの複合体の濃度(= [AB])
　F (Freeの意)：遊離型のリガンドAの濃度 (= [A])
これらの記号を用いると、式(3)は以下のように書き換えられる。
　B／F = KB(max−B)
Bを横軸、B／Fを縦軸にとると、その傾き(=−KB)よりKBが求められる（図1）。ただし、性質の異なる複数の結合が存在する場合は、プロットは複数の直線の合成された形の曲線となる。
　Scatchardプロットの作成に必要なBおよびFの値は、3Hや125Iなどの放射性元素で標識したリガンドを用いた結合実験により測定できる。結合型と遊離型のリガンドを分離する手法としては、低分子量化合物のみを通す透析膜を用いた平衡透析法や、一定以上の分子量のものを通さない限外ろ過膜を用いた限外ろ過法などがある。

・等温滴定熱量測定isothemal titration calorimetry (ITC) [2, 3]
　分子同士が結合する際に発生する（もしくは吸収される）微小な熱量を一定温度下で測定することにより、当該分子間相互作用の熱力学的プロファイル（結合定数を含む）を精度良く得る手法である。測定対象分子の化学修飾や固定化が不要であり、自然な状態に近い条件下での測定が可能である。実際の測定では、一方の分子の溶液に他方の分子の溶液を一定量ずつ滴下し、その際に生じた熱量変化を測定することで結合等温線（図2）が得られる。この曲線のフィッティングのパラメータより結合定数が求められる。

・表面プラズモン共鳴surface plasmon resonance (SPR)分析 [3]
　センサーチップ上で分子間相互作用をリアルタイムに測定し、分子間の結合／解離のパラメータを得る手法である。金(Au)の薄膜を蒸着させたセンサーチップ上に一方の分子B（リガンド）を固定化しておき、他方の分子A（アナライト）の溶液を一定時間灌流する。AとBの結合によって生じる微量な質量変化をSPRシグナルとして検出し（図3）、その測定値から結合反応（A + B → AB）の速度定数konを得る。その後、アナライトを含まない緩衝液を灌流すると、SPRシグナルの減衰から解離反応（AB → A + B）の速度定数koffが得られる。このとき、結合定数KB = kon／koffである。

==参考文献==
1 田中千賀子、加藤隆一編、NEW薬理学改訂第6版（南江堂）2011, p. 12-13.
2 織田昌幸　等温滴定熱測定、蛋白質学会アーカイブ #30 (http://www.pssj.jp/archives/Protocol/Measurement/ITC_01/ITC_01_01.html)
3 津本浩平　タンパク質相互作用解析：等温滴定型熱量測定と表面プラズモン共鳴、生物工学Vol. 89, p. 391-394, 2011. (http://www.sbj.or.jp/sbj/sbj/sbj/sbj_vol89_no07.html)

同義語：会合定数 Association constant、親和定数 Affinity constant
重要な関連用語：解離定数 Dissociation constant

（執筆者：香月博志、担当編集委員：河西春郎）

シルドプロット

2012-01-23T00:43:16Z

Hkatsuki: 数式は単純なものばかりでしたので、通常のテキスト入力で処理しています。

英：Schild plot

　シルドプロットとは、受容体に対する拮抗薬（受容体遮断薬）の作用、特に競合的拮抗薬の作用の強さを求めるための解析手法である。薬理学者Heinz Otto Schild (1906-1984)により提唱された手法で<ref><pubmed>9142394</pubmed></ref>、現在でも広く利用されている。

　単一の受容体を介して発現する作動薬Aの作用の用量反応関係を、種々の濃度の拮抗薬Bの存在下で調べ、用量比 DR (dose ratio) を求める。ここで DR とは、拮抗薬B存在下においてある一定の大きさの反応を引き起こす作動薬Aのモル濃度 [A] を、拮抗薬非存在下において同じ大きさの反応を引き起こすAのモル濃度 [A]0 で割ったものである。横軸にBのモル濃度の常用対数、縦軸に（DR−1）の常用対数をとると、Bが競合的拮抗薬である場合は、傾きを1とする直線関係が得られる（図1）。このプロットから、競合的拮抗薬の作用強度の指標である pA2 の値が求められる。[[Image:Schildplot.jpg|thumb|right|200px|図1 シルドプロットの１例]]

== 競合的拮抗薬の場合 ==

　競合的拮抗薬は、受容体タンパク質内の同一の部位に対する可逆的な結合に関して作動薬と競合する分子である。ある組織／細胞において、作動薬Aが単一の受容体を介して反応を引き起こす場合、Aの濃度の対数 log [A] を横軸、組織／細胞の最大反応に対する反応の百分率を縦軸にとると、シグモイド型の用量反応曲線が得られる。次に、一定濃度の競合的拮抗薬Bの存在下で同様にAの用量反応関係を求めると、その曲線は拮抗薬非存在下で求めた曲線と比べて高用量側（右側）にシフトする。Bの濃度 [B] が高いほど、Aの用量反応曲線のシフトの幅（[A]／[A]0、すなわちDR）も大きくなる（図2）。 [[Image:Doseresponse.jpg|thumb|right|200px|図2 種々の濃度の拮抗薬Bの存在下での作動薬Aの用量反応曲線]]

DRと[B]との間には、以下の関係が成り立つ。

DR−1 = [B]／KB　　・・・・・(1)

式(1)は、以下の条件に基づいて立てた連立方程式より導かれる [NEW薬理学改訂第6版（田中千賀子・加藤隆一編、南江堂、2011）; p. 11]。

a) 作動薬Aは、受容体に可逆的に結合し、その解離定数は KD である。

b) 競合的拮抗薬Bは、受容体に可逆的に結合し、その解離定数は KB である。

c) 「受容体総数」＝「リガンドの結合していない受容体」＋「Aの結合した受容体」＋「Bの結合した受容体」

なお a)および b)は、酵素反応速度論におけるミカエリス・メンテンの仮定（酵素と基質とが可逆的に結合し、複合体を形成する）と同様である。

式(1)の両辺の対数をとると

log (DR−1) = log [B] − log KB　　・・・・・(2)

したがって、log [B] とlog (DR−1) は直線関係となる。

== pA2 ==

　競合的拮抗薬の作用強度を表す指標として pA2 が用いられる。pA2 は「作動薬単独時の用量反応曲線を2倍だけ高用量側にシフトさせるのに必要な競合的拮抗薬のモル濃度の負対数」と定義される。この時の競合的拮抗薬Bのモル濃度を [B2] とすると、pA2 の定義は式(3)のように表される。

pA2 = −log [B2]　　・・・・・(3)

さらにこの時 DR = 2 であるから、式(2)より log [B2] = log KB となり、式(3)と合わせて

pA2 = −log KB　　・・・・・(4)

となる。すなわち pA2 は、受容体に対する競合的拮抗薬Bの解離定数 KB を直接反映する指標である。

また、式(4)を式(2)に代入すると

log (DR−1) = log [B] + pA2

となる。したがって、シルドプロットの横軸切片からpA2が求められる（図1）。

== 理論から外れる場合 ==

　シルドプロットを作成した結果、傾きを１とする直線が得られない場合は、解析の前提となる条件が成立していないものと判断される。主な要因としては以下のことが考えられる。

・受容体タンパク質上の拮抗薬の結合部位が、作動薬の結合部位と異なる場合（＝アロステリック結合部位）

・拮抗薬の受容体への結合が不可逆的である場合

・リガンド（作動薬および拮抗薬）の受容体への結合が協同性を示す場合

・リガンド親和性の異なる複数の受容体サブタイプが発現している場合<ref><pubmed>17079019</pubmed></ref>

・測定条件下においてリガンド-受容体結合が平衡に達していなかった場合（組織／細胞がリガンドの取込み機構を有している場合など）

== 参考文献 ==

<references />

同義語：シルド回帰、シルド解析

重要な関連語：受容体、作動薬、拮抗薬、リガンド

（執筆者：香月博志、担当編集委員：林康紀）

シルドプロット

2012-01-22T10:19:39Z

Hkatsuki: ページの作成：「シルドプロットシルド回帰、シルド解析受容体に対する拮抗薬（受容体遮断薬）の作用、特に競合的拮抗薬の作用の強さを求...」

シルドプロット
シルド回帰、シルド解析

受容体に対する拮抗薬（受容体遮断薬）の作用、特に競合的拮抗薬の作用の強さを求めるための解析手法。薬理学者Heinz Otto Schild (1906-1984)により提唱され1)、現在でも広く利用される手法である。
ある単一の受容体Rに対する作動薬Aの用量反応関係を、種々の濃度の拮抗薬Bの存在下で調べ、用量比DR (dose ratio)を求める。ここで用量比DRとは、拮抗薬B存在下においてある一定の大きさの反応を引き起こす作動薬Aのモル濃度[A]を、拮抗薬非存在下において同じ大きさの反応を引き起こすAの濃度[A]0で割ったものである。横軸にBのモル濃度の対数、縦軸に（DR−1）の対数をとると、Bが競合的拮抗薬の場合には、傾きを1とする直線関係が得られ、またこのプロットから競合的拮抗薬の強さの指標であるpA2の値が求められる。

競合的拮抗薬の場合
競合的拮抗薬は、受容体タンパク質内の同一の部位に対する結合に関して作動薬と競合する分子である。ある組織／細胞において、作動薬Aに対して単一の受容体Rを介する応答が検出される場合、Aの濃度の対数log[A]を横軸、組織／細胞の最大応答に対する応答の百分率を縦軸にとると、シグモイド型の用量反応曲線が得られる。ここで、一定濃度の競合的拮抗薬Bの存在下で同様に用量反応関係を求めると、その曲線は拮抗薬非存在下で求めた曲線と比べて高用量側（右側）にシフトする。Bの濃度が高いほど、用量反応曲線のシフトの度合い（[A]/[A]0すなわちDR）も大きくなる。
DRと[B]との間には、以下の関係が成り立つ。

DR-1=[B]/KB　　・・・・・(1)

式(1)は、以下の条件に基づいて連立方程式を立てることにより導かれる2)。
a) 作動薬Aは、受容体Rに対して解離定数KDをもって結合する。
b) 競合的拮抗薬Bは、受容体Rに対して解離定数KBをもって結合する。
c) 受容体総数＝リガンドの結合していない受容体＋Aの結合した受容体＋Bの結合した受容体
a)とb)は、酵素反応速度論におけるミカエリス・メンテンの仮定（酵素と基質とが複合体を形成する）と同様である。

式(1)の両辺の対数をとると
log[DR-1] = log[B]-logKB　　・・・・・(2)
したがって、log[B]とlog[DR-1]は直線関係となる。

pA2
競合的拮抗薬の作用強度を表す指標としてpA2が用いられる。pA2は「作動薬A単独時の用量反応曲線を２倍だけ高用量側にシフトさせるのに必要な競合的拮抗薬Bのモル濃度の負対数」と定義される。この時のBのモル濃度を[B2]とすると、上記の定義は式(3)のように表される。
pA2 = -log[B2]　　・・・・・(3)
さらにこの時DR=2であるから、式(2)よりlog[B2] = logKBとなり、式(3)と合わせて
pA2 = -logKB　　・・・・・(4)
となる。すなわちpA2は、競合的拮抗薬Bの受容体Rに対する解離定数KBを直接反映する指標である。また、式(4)を式(2)に代入すると
log[DR-1] = log[B]+ pA2
となる。したがって、シルドプロットの横軸切片からpA2が求められる。

理論から外れる場合
シルドプロットを作成した結果、傾きを１とする直線関係が得られない場合は、解析の前提となる条件が成立していないことが示唆される。主な要因としては以下のものが考えられる。
・拮抗薬の受容体タンパク質への結合部位が、作動薬の結合部位と異なる場合（＝アロステリック結合部位）
・拮抗薬の受容体への結合が不可逆的である場合
・リガンド（作動薬および拮抗薬）の受容体への結合が協同性を示す場合
・リガンド親和性の異なる複数の受容体サブタイプが発現している場合3)
・測定条件下においてリガンド-受容体結合が平衡に達していなかった場合（組織／細胞がリガンドの取込み機構を有している場合など）

References
1) Schild HO. pA, a new scale for the measurement of drug antagonism. Br J Pharmacol Chemother 2, 189-206, 1947.
2) NEW薬理学改訂第6版、p. 11、田中千賀子、加藤隆一編、南江堂、2011.
3) Tallarida RJ. Interactions between drugs and occupied receptors. Pharmacol Ther 113, 197-209, 2007.