https://bsd.neuroinf.jp/w/api.php?action=feedcontributions&feedformat=atom&user=Masahitoyamagata
脳科学辞典 - 利用者の投稿記録 [ja]
2026-04-15T08:00:54Z
利用者の投稿記録
MediaWiki 1.43.8
https://bsd.neuroinf.jp/w/index.php?title=%E5%88%A9%E7%94%A8%E8%80%85%E3%83%BB%E3%83%88%E3%83%BC%E3%82%AF:Masahitoyamagata&diff=46476
利用者・トーク:Masahitoyamagata
2021-07-14T08:45:43Z
<p>Masahitoyamagata: ページの作成:「申し訳ありません。手元がくるって、つい、承認のところをクリックしてしまいました。」</p>
<hr />
<div>申し訳ありません。手元がくるって、つい、承認のところをクリックしてしまいました。</div>
Masahitoyamagata
https://bsd.neuroinf.jp/w/index.php?title=%E3%82%B7%E3%83%B3%E3%82%B0%E3%83%AB%E3%82%BB%E3%83%ABRNA%E3%82%B7%E3%83%BC%E3%82%B1%E3%83%B3%E3%82%B7%E3%83%B3%E3%82%B0&diff=45638
シングルセルRNAシーケンシング
2021-01-06T01:18:52Z
<p>Masahitoyamagata: PMID:33393903をつかって、<ref name=Yamagata2021></ref>に変更</p>
<hr />
<div><div align="right"> <br />
<font size="+1">[http://researchmap.jp/yamagatm 山形方人]</font><br><br />
''Harvard University''<br><br />
DOI：<selfdoi /> 原稿受付日：2020年10月22日 原稿完成日：2020年12月23日<br><br />
外部査読委員：京都大学メディカルイノベーションセンター [https://researchmap.jp/read0140206 渡辺 亮]<br>理化学研究所 生命機能科学研究センターバイオインフォマティクス研究開発チーム/東京医科歯科大学 難治疾患研究所 ゲノム応用医学部門 ゲノム機能情報分野 [https://researchmap.jp/dritoshi 二階堂 愛]<br><br />
</div><br />
英：single-cell RNA sequencing, scRNA-seq<br />
{{box|text= シングルセルRNAシーケンシング(single-cell RNA sequencing, 以下scRNA-seq)は、[[次世代シーケンサー]]（next generation sequencer、以下NGS）を用いることで、個々の細胞が保持しているmRNA全体を質的、量的に網羅的に調べる方法である。次元圧縮などの数理的な解析と組み合わせることで、遺伝子発現の状態に基づいた細胞の分類を行うことが可能であり、従来の組織学的、あるいは細胞生物学的手法では知られなかった新規の細胞種の同定や細胞状態の推定を行うことが可能になった。また、遺伝子発現プロファイルの変化に基づく擬時系列解析(pseudotime analysis)によって、刺激や発生に伴う細胞状態の遷移の描写ができる。神経系では、この方法により、神経細胞や非神経細胞の分類や状態についての知見が深まり、新しい神経細胞タイプ、細胞マーカー、病態の理解、更に機能的な遺伝子の同定などが系統的かつ網羅的に行われるようになった。scRNA-seqに、空間的情報、エピゲノム情報、タンパク質情報などの複数モダリティを取り入れた統合解析（multimodal single-cell omics）も行われている。}}<br />
<br />
==背景==<br />
===トランスクリプトーム===<br />
[[トランスクリプトーム]]（transcriptome）は、細胞中に存在する全ての[[転写]]産物（タンパク質をコードする[[mRNA]]、タンパク質をコードしない[[ノンコーディングRNA]]、[[マイクロRNA]]など）の総体である<ref><pubmed>19015660</pubmed></ref><ref><pubmed>31341269</pubmed></ref>。トランスクリプトームは、[[ゲノム]]とは異なり、同一の個体でも、組織ごとに、更には発生段階や細胞外環境や刺激によって変化する。トランスクリプトームは、同質あるいは異質の多数の細胞集団（組織、[[培養細胞]]）から[[RNA]]抽出後、[[cDNA]]に変換し、それを1990年代に出現した[[DNAマイクロアレイ]]のように数多くの既知mRNAを識別する技術によって解析されるようになった。その後、[[次世代シーケンサー]]の利用により、希少mRNAやノンコーディングRNAを含めた未知の転写産物の高感度検出が可能になるとともに、[[スプライシング]]で成熟していく過程のmRNAなど、転写産物の種類だけでなく、転写産物の構造的差異（スプライシングバリアント、[[SNPs]]、変異など）の解析もできるようになった。加えて、[[ヒト]]やモデル[[実験動物]]（[[マウス]]、[[ゼブラフィッシュ]]、[[ショウジョウバエ]]、[[線虫]]など）だけでなく、多種多様な生物のトランスクリプトームの把握も可能になった。従来から行われてきた組織全体などの多数の細胞を対象としたRNA-seq（バルクRNA-seq）では、複数の細胞における転写産物の平均を観察しているが、本項目では個々の細胞における転写産物を解析するscRNA-seqの原理とその応用について概説する。<br />
<br />
===開発史===<br />
1つの細胞の持つ生体物質を解明し、定量しようとする試みは古くからあった。1960年代になると、[[フローサイトメトリー]]を利用した[[蛍光活性化セルソーティング]]（Fluorescence-activated cell sorting, FACS）が発明され、標識抗体などのプローブと組み合わせることで、多数の細胞集団の中で１つの細胞が保持している生体分子の種類や量についての断片的な研究が可能になり、この方法は現在でも汎用されている<ref><pubmed>22271369</pubmed></ref>。その後、[[免疫組織化学]]や[[in situ hybridization]]nなどにより、タンパク質やmRNAの種類や量が観察できるようになり、組織中に存在するそれぞれの細胞の同定などに活用されてきている。最近では、それぞれの細胞が持つ抗原分子を、異なった金属イオンで標識した抗体とフローサイトメトリーを組み合わせた方法で検出する[[マスサイトメトリー]]（CyTOFなど）も開発されてきている<ref><pubmed>27153492</pubmed></ref>。<br />
<br />
細胞種にもよるが、1つの細胞内にある全RNA（ribosomal RNAを含む）は細胞種にもよるが1-50pgである。そのうち、mRNAの占める割合は1-5%程度である<ref><pubmed>15239941</pubmed></ref>。この微量のmRNAをcDNAに変換してから大幅に増幅できる方法が発明されたことで、1つの細胞が発現するmRNAを高感度で検出できるようになった<ref><pubmed>1557406</pubmed></ref><ref><pubmed>7541630</pubmed></ref> 。例えば、1991年、[[wj:リンダ・バック|Linda Buck]]と[[wj:リチャード・アクセル|Richard Axel]]は、[[嗅覚受容体]]が[[Gタンパク質]]であると仮定し、個々の嗅覚細胞で特異的に観察されるGタンパク質mRNAを比較することで、嗅覚受容体の同定に成功した<ref><pubmed>1840504</pubmed></ref>。1995年になると、[[wj:キャサリン・ドュラック|Catherine Dulac]]とRichard Axelは、異なる[[鋤鼻神経細胞]]で特異的に発現する遺伝子を１つの細胞から作製したcDNAライブラリーを比較する[[ディファレンシャル・スクリーニング]]を行うことで、[[フェロモン受容体]]を同定した<ref><pubmed>7585937</pubmed></ref>。同じ手法で異なる種類の神経細胞で発現している遺伝子も同定され<ref><pubmed>9778248</pubmed></ref><ref><pubmed>12230981</pubmed></ref>、1つの細胞の持つトランスクリプトームを比較するアプローチが神経細胞で特徴的に発現している遺伝子の同定に効果的なことが示された。<br />
<br />
一方で多くの種類のmRNAを1細胞レベルで一挙に観察するための技術には感度やスループット、そしてコストの観点からブレークスルーが待たれた。1つの問題は多種類のcDNAを簡便に識別することを可能にする方法の開発であった。これを可能にしたのが、[[PCR]]などのcDNA増幅法の改良とマイクロアレイの利用であった<ref><pubmed>12736331</pubmed></ref><ref><pubmed>16547197</pubmed></ref>。しかしながら、細胞ごとに高価な[[マイクロアレイ]]を使用することは、多数の細胞のトランスクリプトームの観察には限界があった。2009年になると、これらの問題を解決できる可能性として、次世代シーケンサーを利用するscRNA-seqプロトコールがAzim Suraniのグループによって報告された<ref><pubmed>19349980</pubmed></ref>。しかしながら、多数のマイクロアレイでなく1回の次世代シーケンサー使用で済ませることができるものの、この報告でもわずか8個の細胞の解析に留まっており、1つの細胞ごとに処理を行うという操作が必要で、多数の細胞についてのトランスクリプームを一挙に理解することはできなかった。また、塩基配列の違うcDNAごとにPCR効率に差がある結果生じる増幅バイアス、また3’末端側が選択的に補足されることなどの課題があった。<br />
<br />
==現状==<br />
===分子生物学的反応=== <br />
その後、5’末端側の領域まで効率よく増幅するscRNA-seqのプロトコールが考案された<ref name=Mereu2020><pubmed>32518403</pubmed></ref>。特に、SMART-seq（Switching mechanism at the 5' End of RNA Templates）<ref><pubmed>22820318</pubmed></ref>およびその改良されたプロトコールであるSMART-seq2<ref><pubmed>24056875</pubmed></ref> <ref><pubmed>24385147</pubmed></ref>の使用例が多い（既に、SMART-seq3という改良プロトコールもある<ref><pubmed>32518404</pubmed></ref>が、以下SMART-seqと呼ぶ）。また、類似法としてSTRT（single-cell tagged reverse transcription）<ref name=Islam2011><pubmed>21543516</pubmed></ref>などがある。<br />
<br />
一方、CEL-seq（Cell Expression by Linear amplification and Sequencing）<ref><pubmed>22939981</pubmed></ref>、CEL-seq2<ref><pubmed> 27121950 </pubmed></ref> 、MARS-seq（Massively parallel single-cell RNA-seq）<ref><pubmed>24531970 </pubmed></ref>では、[[T7 RNAポリメラーゼ]]による[[in vitro転写]]を用いることにより、[[PCR]]による増幅で見られるバイアスを低減させようとしている。<br />
<br />
また、Quartz-SeqやQuartz-Seq2ではPCR用のアダプターを付加する反応にポリAテーリングを利用することで、他の手法と比較して1.5-5倍程度の遺伝子を検出できる<ref name=Mereu2020><pubmed>32518403</pubmed></ref>。<br />
===バーコード技術 ===<br />
増幅バイアス除去のアプローチとして特に重要なのは、2011年に発表された核酸配列バーコードを利用した方法で、分子識別子（unique molecular identifiers: UMI）を持つcDNAを増幅させ、次世代シーケンサー後の情報処理を用いるものであると考えられる<ref><pubmed>22101854</pubmed></ref>。この方法では[[逆転写]]反応の際、ランダム塩基配列から構成されるUMIをcDNA末端に付加した後、増幅反応、次世代シーケンサーを行い、cDNA配列とUMI配列の両方を読む。cDNAにはRNA1分子に1つのUMIが付加されるので、同一のUMIを持っていれば、逆転写時に同一のcDNA由来とカウントする。UMIをカウントすることで、増幅前のmRNAのコピー数を知ることができる<ref name=Islam2011><pubmed>21543516</pubmed></ref><ref><pubmed>24363023</pubmed></ref><ref name=Gierahn2017><pubmed>28192419</pubmed></ref> <ref><pubmed>29474909</pubmed></ref><ref name=Cao2017><pubmed>28818938</pubmed></ref><ref name=Rosenberg2018><pubmed>29545511</pubmed></ref>。<br />
===多様なプラットフォーム===<br />
細胞を分別するプラットフォームには、マイクロピペットによる捕獲、[[セルソーター]]、[[レーザー捕獲]]などを用いるマルチウェル法、あるいは半導体集積回路様の製作技術で作った流体回路を利用するFluidigm C1の装置（[https://jp.fluidigm.com C1 Single- Cell Auto Prep]）、更にドロップレット使用（下記）などがある<ref><pubmed>30405621</pubmed></ref><ref><pubmed>33247933</pubmed></ref>。これらは、SMART-seqと組み合わせて利用されることが多い。SMART-seqプロトコールの特徴は、全長mRNAのトランスクリプトーム情報を得ることができることであり、mRNAのスプライシングバリアントなどのアイソフォーム、SNPsの情報を利用したアリル特異的発現、変異の検出にも利用できる。また、それぞれ細胞ごとの反応を独立した場所で行うため、反応中に別の細胞の反応と混じる可能性が低い。小型のナノウェルを用いるSeq-Wellも同様に反応自体が混じる可能性が低い<ref name=Gierahn2017><pubmed>28192419</pubmed></ref>。これらの点が、次に説明するドロップレットを使用して3’末端のみを標的にしたscRNA-seqと比べた場合の長所であるが、その高コスト（1細胞あたり数十ドル）と処理可能な細胞数の少なさが短所である。<br />
<br />
これらとは別に、ハイスループットで安価な方法として、それぞれの細胞を独立に標識するのではなく、プールされた細胞を異なるウェルにランダムに振り分け、ウェル固有のバーコードで転写物を標識していく操作を複数回繰り返していくことで細胞を区別するSplit-seqやsci-RNA-seq3などの方法も用いられている<ref name=Rosenberg2018><pubmed>29545511</pubmed></ref><ref><pubmed>30787437</pubmed></ref>。<br />
<br />
===ドロップレット使用の3’エンドリード法===<br />
scRNA-seqのプラットフォームと方法について重要と考えられる進歩は、2015年、Harvard Medical Schoolの独立した２つのグループが、inDrops<ref><pubmed>26000487</pubmed></ref>そしてDrop-seq<ref><pubmed>26000488 </pubmed></ref>という類似した2つのハイスループットな方法を開発したことであろう（inDropsは[[T7 RNAポリメラーゼ]]、Drop-seqはPCRで増幅）。これらの方法では、[[マイクロ流体力学]] (microfluidics) 、 UMI（上述）と細胞ごとのバーコード（Cell Barcode）という2種類のDNAバーコーディング、そしてNGSと情報解析法を利用している。そして、多く細胞のサンプル調製の自動化と容易さから、1つの細胞あたりに要するコストを大幅に低下させることに成功した（Drop-seqは発表時で、１細胞あたり約5セント）。つまり、細胞1つずつをマイクロ流体力学によるエマルジョン作製技術を利用した装置に流入させ、その1細胞を1つのドロップレットに自動的に閉じ込める。そのドロップレット中には、ドロップレットごとにCell barcode/UMIとしてユニークなDNAバーコードを持つゲルビーズ(Gel Beads in Emulsion, GEMs)が入っており、それを足場に3’末端のみを標的にしたcDNA合成反応を実施することで、同じ細胞に含まれていた1分子のmRNAが同じCell barcodeを持つcDNAとして合成され、そのmRNA/cDNAが由来した細胞を識別できるということを利用している（'''図1'''）。<br />
[[ファイル:scFig1.jpg|サムネイル|300px|'''図1. ドロップレット使用の3’エンドリード法 '''<br>組織から解離させた細胞それぞれを、マイクロ流体力学を利用した装置で、バーコードプライマーが結合したゲルビーズとともにドロップレットに封じ込める。ドロップレット中には、ドロップレットごとにCell barcode/UMIとしてユニークなDNA配列を持つゲルビーズ(GEMs)が入っており、それを足場にcDNA合成反応を実施することで、同じ細胞に含まれていたmRNAが同じCell barcodeを持つDNAとして合成され、それを増幅する。]]<br />
<br />
DropSeqはコストが低いが、細胞の取得率と検出感度が低い弱点がある。inDropsはDropSeqより細胞取得率が高く、パラメータを調整することにより、低レベルで発現される遺伝子の検出にも有利であるとされる<ref name=Zhang2019><pubmed>30472192</pubmed></ref>。DropSeqのセットアップは[https://www.dolomite-bio.com Dolomite Bio]、inDropは[https://1cell-bio.com 1 Cellbio社]から販売されている。しかし、その後、[https://www.10xgenomics.com/jp/ 10x Genomics社]が同様の原理を用いたシングルセル遺伝子発現解析システムを市販することで、多くの研究者が利用できるようになっている<ref><pubmed>28091601</pubmed></ref>。Svenssonらによる最近の[http://www.nxn.se/single-cell-studies/gui データベース]<ref><pubmed>33247933</pubmed></ref>では、scRNA-seqを用いた論文で用いられた方法について調査しており、この数年、10x Genomics社のプラットフォームを用いた論文が飛躍的に増加していることがわかる。10x Genomics社のプラットフォームは市販であるので導入が容易であり、DropSeqやinDropsに比べ多くの転写産物の検出が可能であるが、それらよりランニングコストは高価である<ref name=Zhang2019><pubmed>30472192</pubmed></ref>。<br />
<br />
なお、3’エンドリード法だけでなく、抗体やT細胞レセプターのN末端側に位置する可変領域の配列決定が可能である5'末端のシーケンシングには5’エンドリード法が利用されることがある。<br />
<br />
==実際==<br />
ここでは主流になっている10x Genomics社のChromium controllerなどのドロップレットを用いた方法とSMART-seqなどを用いた他のプラットフォームに共通する方法の実際について概説する。scRNA-seqの利用には、4つのステップがある（'''図2'''）<ref name=Luecken2019><pubmed>31217225</pubmed></ref><ref><pubmed>30089861</pubmed></ref>。これらのうち、'''2.'''の段階については、上に記述したように市販の機器や試薬を利用する機会が多くなっているので、詳細は説明しない。<br />
[[ファイル:ScFig2d.jpg|サムネイル|500px|'''図２．scRNA-seqの実際のステップ '''<br>細胞の単離、ライブラリ作製とNGS、データの前処理から次元圧縮、データ解析。図の一部は2016 DBCLS TogoTV、あるいはSeuratを用いて10x Genomics社の[https://support.10xgenomics.com/single-cell-gene-expression/datasets PBMCデータ]から執筆者が作製。]]<br />
# 個体や組織を採集し、そこから細胞あるいは細胞核を個別に解離された状態にすること。<br />
# ドロップレット法やSMART-seq対応のプラットフォームなどによる個々の細胞からのライブラリーの作製とNGS。<br />
# 得られた配列情報の前処理（preprocessing）。<br />
# データ解析。<br />
<br />
===組織からの細胞、細胞核の分離===<br />
浮遊細胞（[[血液]]細胞など）ではない場合、物理的あるいは酵素処理などによって解離することで、生組織から状態の良い個々に分散した細胞を調製する必要がある。神経系組織の酵素処理には、パパインを用いる方法が広く用いられている<ref><pubmed>29970990</pubmed></ref>。ここで、しばしば問題となるのが、酵素処理による短時間加温や機械的刺激で、発現量が変化する遺伝子が存在することである<ref><pubmed>27090946</pubmed></ref>。特に、脳の[[ミクログリア]]の解析には、低温下で組織をホモゲナイズするなどの工夫が必要であった<ref name=Hammond2019><pubmed>30471926</pubmed></ref>。また、このような現象を抑制するために、酵素処理時に転写阻害剤である[[アクチノマイシン]]で処理したり<ref><pubmed>29024657</pubmed></ref>、ヒマラヤ氷河から得られた細菌''Bacillus licheniformis''から得られた低温プロテアーゼを用いる方法も報告されている<ref><pubmed>28851704</pubmed></ref><ref><pubmed>31623682</pubmed></ref>。また、細胞解離後に、[[メタノール]]で固定しscRNA-seqに使用したり<ref><pubmed>28526029</pubmed></ref>、クロスリンカーを用いる方法もある<ref><pubmed>29391536</pubmed></ref>。<br />
<br />
単離した細胞は、そのまま10x Genomicsのシングルセル遺伝子発現解析のプラットフォームに導入することができるが、細胞表面分子マーカーに対する[[抗体]]や[[蛍光タンパク質]]レポーターなどを用いたFACS、[[パニング]]、MACS([[磁気ビーズカラム]])などによって、細胞の選択的濃縮や除去を行う場合もある。更に、抗体に抗体表示バーコードDNAをカップリングさせるCITE-seq(Cellular Indexing of Transcriptomes and Epitopes by Sequencing) については、下記の「統合解析」でも述べる。<br />
<br />
なお、ヒト組織や希少生物などから生細胞を得ることは困難なことが多い。この場合、scRNA-seqの変法として、凍結した組織から、各細胞由来の核を調製し、核内のmRNAを分析するsnRNA-seq (single-nucleus RNA-seq)が利用されている。ただ、snRNA-seqでは、FACSなどによる特定細胞集団の分離が困難であることが多い。また、細胞質を持つ生細胞を利用したscRNA-seqとは違って、スプライシングの途上にある未成熟な核内転写産物を検出すること、更に検出できる遺伝子数も少なく、同等な結果が必ずしも得られない<ref><pubmed>24248345</pubmed></ref><ref><pubmed>26890679</pubmed></ref> <ref><pubmed>27471252</pubmed></ref><ref name=Habib2017><pubmed>28846088</pubmed></ref><ref><pubmed>29220646</pubmed></ref><ref name=Habib2017><pubmed>28846088</pubmed></ref><ref><pubmed>30586455</pubmed></ref><ref><pubmed>28729663</pubmed></ref><ref><pubmed>31728515</pubmed></ref><ref><pubmed>32341560</pubmed></ref> <ref name=Mereu2020><pubmed>32518403</pubmed></ref>。一方で、snRNA-seqでは、組織をそのまま凍結することから開始することが可能であるので、上述したscRNA-seqの問題である細胞解離酵素による処理などを避けることができる。更に、核を用いることで、大きな細胞体はマイクロ流体力学の流路で詰まりやすいなど、特に神経細胞で顕著である細胞の形状の多様性に伴うバイアスを減らすことができるといったメリットもある。こうしたプロトコールの一部は、protocols.ioのHuman Cell Atlasの[https://www.protocols.io/groups/hca グループ]で公開されている。<br />
<br />
通常のscRNA-seqは、ポリアデニル化されたmRNAを検出しているが、MATQ-seq（multiple annealing and dC-tailing-based quantitative single-cell RNA-seq）、RamDA-seqなどを用いると、ポリアデニル化されていないRNAの検出も可能である<ref><pubmed> 28092691</pubmed></ref> <ref><pubmed>29434199 </pubmed></ref>[https://doi.org/10.1101/2020.06.02.131060]。<br />
<br />
更に、RNAを分析するscRNA-seqではないが、遺伝子発現状態との関係が想定される[[オープンクロマチン]]領域を[[トランスポゾン]]を用いることで個々の細胞レベルで選択的に検出するsingle cell ATAC-seq (Assay for Transposase-Accessible Chromatin) <ref><pubmed>26083756</pubmed></ref><ref><pubmed>29434377</pubmed></ref><ref><pubmed>25953818</pubmed></ref>, single cell THS-seq (transposome hypersensitive-site) <ref><pubmed>29227469</pubmed></ref>や [[DNAメチル化]]領域を観察するsnmC-seq、RRBSのような方法も利用されている<ref name=Lake2018><pubmed>28798132</pubmed></ref><ref><pubmed>30237449</pubmed></ref><ref><pubmed> 20852635</pubmed></ref>。<br />
<br />
===データ処理の流れ===<br />
====総論====<br />
Illumina社に代表される次世代シーケンサーを用いて得られた結果は、ベースコールや細胞バーコードを用いたdemultiplexingなどの基礎解析を行うことで、各細胞における遺伝子の発現量のマトリックスを出力する。例えば、10XGenomics社のChromiumプラットフォームを用いた場合、10XGenomics社が提供するCell Rangerの[https://support.10xgenomics.com/single-cell-gene-expression/software/pipelines/latest/using/tutorial_mr mkrefコマンド](Linux上で作動)などにより、各生物種ごとの[https://www.ncbi.nlm.nih.gov/grc レファレンス配列リスト]（マウスやヒトでは既製のものを利用できる）などを参考にしながら、細胞と転写産物量の対応マトリックスを作製する。その後のデータの処理についても、10x Genomics社がソフトウェアLoupeを提供している。しかしながら、その後のデータ解析を考慮して、[[R]], [[Python]], [[MATLAB]]などのデータ解析のための汎用プログラミング言語やコードで扱えるオブジェクトに変換するのが通常である。<br />
<br />
scRNA-seq解析のためには、数多くのツールが公開されている。これらのツールは、バージョンが更新されたり、新しいものに置き換えられることがあるので、実際に利用する場合は最新の動向に注意を払う必要がある。scRNA-seqの解析に必要なツールは、[https://www.scrna-tools.org scRNA-tools], [https://github.com/seandavi/awesome-single-cell Awesome single cell], [https://www.bioconductor.org Bioconductor]などで紹介されており、ほとんどがダウンロード可能である。また、[[bioRxiv]]などの査読前のプレプリントサーバで公開されて、随時試用、評価されていくものが多く、scRNA-seqのデータ（下記参考）とともに、オープンサイエンス実践の好例となっている。<br />
<br />
====Seurat====<br />
ここでは、scRNA-seqデータ解析のために最もよく利用されているRを用いたパッケージ「Seurat」<ref name=Butler2018><pubmed>29608179</pubmed></ref> <ref><pubmed> 31178118 </pubmed></ref>を中心に紹介しておきたい。なお、一部の解析操作は、University of WashingtonのCole Trapnell研究室で開発されてきた軌道推定（下記参考）によく使用される[https://cole-trapnell-lab.github.io/monocle3/ Monocle3]でも可能である。Pythonを利用したものでは、ドイツ・ミュンヘンInstitute of Computational Biologyの Fabian Theisらが開発しているScanpyが有名である<ref><pubmed> 29409532</pubmed></ref>。<br />
<br />
New York UniversityのRahul Satija研究室が開発しているSeurat（画家スーラに由来）は、scRNA-seqデータ解析のために広く利用されているRパッケージであり、2020年秋現在、Seurat4のβバージョンが公開されている。論文の正式発表前から、サポート情報提供やコード修正なども頻繁に行っており、Satija研究室の[https://satijalab.org/seurat/ ウェッブサイト]、[https://github.com/satijalab/Seurat Github]、更に[https://twitter.com/satijalab Twitterアカウント]などで最新情報を得ることできる。<br />
<br />
====品質の検討事項====<br />
最初に行うのは、scRNA-seqデータの品質管理である。ここでは、質の低い細胞のデータ（例えば、壊れた細胞では、転写産物の種類が少なくミトコンドリア由来の転写産物が多い）を取り除く。また、複数の試料を組み合わせる場合には、バッチごとの違いについて検討する<ref><pubmed>29608177</pubmed></ref><ref><pubmed> 28045081</pubmed></ref><ref><pubmed>31948481</pubmed></ref> <ref><pubmed>32854757</pubmed></ref>。現実には、実験ごとのバッチの違いによる影響（Batch effect）がscRNA-seqの最大の問題であると示されてきており、試料の処理を同時に行うなど実験デザインを工夫する必要がある<ref><pubmed>29121214</pubmed></ref>。<br />
<br />
また、ドロップレットを使用するscRNA-seqでしばしば問題になるのが、ドロップレットに２つ以上の細胞が封じ込められ、それらが同一のCell barcodeを持ってしまうアーティファクトである。通常「Doublet」「Multilet」と呼ばれるこの問題はデータ解析を混乱させるので、細胞単離の段階から注意する必要があるが、scRNA-seqデータ取得後にもデータ処理で解決できる可能性もある<ref><pubmed>30954476</pubmed></ref><ref><pubmed>30954475</pubmed></ref> <ref><pubmed>31693907</pubmed></ref><ref><pubmed>32592658</pubmed></ref> <ref><pubmed>29227470</pubmed></ref><ref><pubmed>31836005</pubmed></ref><ref><pubmed>31856883</pubmed></ref><ref><pubmed>30567574</pubmed></ref> <ref><pubmed>31266958</pubmed></ref><ref><pubmed>32366989</pubmed></ref><ref><pubmed>33338399</pubmed></ref>[https://doi.org/10.1101/2019.12.17.879304]。なお、この手法を利用することで、バッチ効果を抑えるために、異なるバーコードを持つ複数の試料を混ぜて一つの試料として扱い、計算機的に再び分離、解析する手法が注目されている<ref><pubmed>32483174</pubmed></ref>。<br />
<br />
scRNA-seqデータの次のノイズは、ある遺伝子の発現が低いために、本来同じタイプの細胞であっても、その遺伝子の発現が全く見られない「Dropout」と呼ばれる現象であり解析に影響を与えるので、これについても検討が必要である<ref><pubmed>24056876<br />
</pubmed></ref><ref><pubmed>32127540</pubmed></ref>。<br />
<br />
====次元圧縮====<br />
このような品質管理、ノーマライゼーションの過程を経て<ref><pubmed>28504683</pubmed></ref>、scRNA-seqのデータ解析において、最初に行うのが、[[次元圧縮]] (dimensionality reduction)である<ref><pubmed>30617341</pubmed></ref><ref><pubmed>31780648</pubmed></ref><ref><pubmed>31955711</pubmed></ref><ref><pubmed>31823809</pubmed></ref>。主成分分析 (Principal component analysis, PCA)、更に発展させた均一マニフォールド近似と投影(Uniform Manifold Approximation and Projection, UMAP)、Diffusion maps<ref><pubmed> 26002886<br />
</pubmed></ref>, t分布型確率的近傍埋込み (t-distributed Stochastic Neighbor Embedding, tSNE)などの手法が用いられる。 特に、[http://www.jmlr.org/papers/v9/vandermaaten08a.html tSNE]と[https://arxiv.org/abs/1802.03426 UMAP]は、高次元データを低次元の点の集合として可視化することで、それぞれの細胞の持つ遺伝子発現状態の類似度についての直観的な表示が可能でありしばしば用いられる（'''図3'''）。tSNEよりUMAPの方が迅速に類似集団間の関係が明確になるので、最近はUMAPを利用することが多くなってきている。次に、[[Louvainアルゴリズム]]などでクラスタリング（[[コミュニティ分割]]）を行いグラフ上に表示できる（'''図3'''の色分け）。こうして、異なる転写状態を示す細胞の集合が別のクラスターとして表示され、同定可能になる<ref><pubmed>31500660</pubmed></ref>。<br />
[[ファイル:scFig3.jpg|サムネイル|250px|'''図３． tSNEとUMAPによる同じデータの可視化'''<br>網膜（ニワトリ）の視細胞のデータを用いて執筆者が作製<ref name=Yamagata2021><pubmed>33393903</pubmed></ref>。]]<br />
<br />
==データ解析==<br />
===細胞クラスターの解釈とマーカー遺伝子候補の発見===<br />
scRNA-seqデータから得られる生物学的知見には、内在的に存在する細胞の種類、外部刺激や環境で変化した細胞の状態、そして種類や変化により特徴的に発現するマーカー遺伝子候補の発見がある<ref><pubmed>27824854</pubmed></ref><ref><pubmed>32033589</pubmed></ref>。クラスタリングにより、異なった細胞集団の存在が認識されると、それぞれのクラスター（群）に特徴的に発現している具体的な遺伝子を探索し、細胞集団の持つバイオマーカーによって、そのクラスター（群）の同定が可能になる。例えば、既に神経細胞とグリア細胞に特異的に発現する典型的マーカーはよく知られており、それぞれのクラスターの識別は容易である。更に、神経細胞のタイプ（下記参考）を区別できるマーカーや、外部刺激によって遺伝子発現状態が変化した神経細胞の状態は、In situ hybridizationや免疫組織化学などにより確認できる。このようなクラスターごとに発現が異なる遺伝子（差次的発現遺伝子）を見つけるためには（Differential expression analysis, DE analysis）、SeuratのFindMarkersコマンド中でも利用可能であるコード（MAST、DESeq2など<ref><pubmed>26653891</pubmed></ref><ref><pubmed>25516281</pubmed></ref><ref><pubmed>30658573</pubmed></ref>）を用いることができる。細胞ごとの差次的発現遺伝子のVisualization（表示可視化）には、[[ドットプロット]]（dot plot）、[[ヴァイオリンプロット]]（violin plot）、[[リッジプロット]]（Ridge plot, joy plot）、UMAPなどの次元圧縮図上に転写物量をプロットするFeatureプロット（feature plot）などが、目的に応じて頻繁に用いられる（'''図4'''）。<br />
[[ファイル:scFig4.jpg|サムネイル|300px|'''図４．scRNA-seqデータの可視化の例 '''<br>A. ドットプロット。B.ヴァイオリンプロット。C. リッジプロット。D. UMAP（灰色）に転写物量（青）をプロットした Featureプロット。網膜の視細胞のデータを用いて執筆者が作製<ref name=Yamagata2021></ref>。]]<br />
===擬時系列解析===<br />
実験的なノイズとは別に生物学的に意味のある遺伝子発現の変動には、位置情報、[[細胞周期]]、[[概日リズム]]、発現変動が大きい破裂型[[プロモーター]]の作動などの理由で 変動が見られるものもある<ref name=Luecken2019><pubmed>31217225</pubmed></ref><ref><pubmed> 26000846</pubmed></ref>。特に、刺激・薬剤処理やさまざまな病態の進行や治療に伴う細胞の変化、発生途上にある[[細胞系譜]]や[[細胞分化]]といった細胞の遷移状態の解析（[[軌道推定]]（Trajectory inference）；[[擬時系列解析]]（擬似時系列解析）、Pseudo-time analysis）には、scRNA-seqデータを用いることが効果的である<ref><pubmed>29576429</pubmed></ref><ref><pubmed>28813177</pubmed></ref><ref><pubmed>29565398</pubmed></ref>。しばしば用いられるMonocle3 <ref><pubmed>30787437</pubmed></ref>[https://cole-trapnell-lab.github.io/monocle3/]など、多くのコードを収集、比較しているサイトがある [https://dynverse.org][https://github.com/agitter/single-cell-pseudotime]。RNA velocityといったスプライシングされていく転写産物の量から細胞の分化状態を推定する方法もある<ref><pubmed>30089906</pubmed></ref><ref><pubmed> 32747759</pubmed></ref>。しかし、これらの方法は、あくまで細胞系譜や細胞分化の推定に過ぎない。細胞系譜を更に確実に観察しつつ、scRNA-seqを行うことで、細胞タイプの系統関係を調べる方法として、[[CRISPR-Cas9]]を用いた[[ゲノム編集]]による痕跡追跡記録法を導入したscGESTALT<ref><pubmed>29608178</pubmed></ref>、ScarTrace<ref><pubmed>29590089</pubmed></ref> 、LINNAEUS<ref><pubmed>29644996</pubmed></ref>、あるいはアデノシンデアミナーゼでRNA編集を行いタイムスタンプを入れる方法<ref><pubmed>33077959</pubmed></ref>がある。[[1塩基バリアント]]（Single-nucleotide variants: SNV）の系統的解析は、細胞の不均一性や系統的な関係を明らかにするための最も有望なアプローチの一つである<ref><pubmed>31744515</pubmed></ref>。<br />
===遺伝子制御ネットワーク、パスウェイ解析など===<br />
また細胞分化や刺激などによる変動に伴う特徴的な遺伝子発現状態をscRNA-seqで観察することは、[[遺伝子制御ネットワーク]]（例、[https://github.com/aertslab/SCENIC SCENIC]<ref><pubmed>28991892</pubmed></ref>）、[[代謝経路]]や[[シグナル伝達系]]のための[[パスウェイ解析]](例、Metascape<ref><pubmed>30944313</pubmed></ref>, [http://metascape.org]、Gene Ontolgoy[http://geneontology.org])を理解するシステム生物学的な研究として有用である<ref><pubmed>32051003</pubmed></ref>。更に、scRNA-seqで得られた結果をもとに、細胞間相互作用の理解を深めるのを目的とするCellPhoneDB<ref><pubmed>32103204</pubmed></ref>[https://github.com/Teichlab/cellphonedb]、NicheNet<ref><pubmed>3181926</pubmed></ref>、SVCA<ref><pubmed>31577949</pubmed></ref>などがある。特に、Perturb-seq<ref><pubmed>27984732</pubmed></ref> やその変法<ref><pubmed> 32231336</pubmed></ref>は、CRISPRライブラリーによるゲノム編集を施した細胞をscRNA-seqで解析することで、ゲノム編集で破壊された遺伝子の機能や遺伝子間の相互作用の理解を可能にしている後述する複数モダリティ情報を取り込んだscRNA-seqの１つであり、注目されている。<br />
<br />
==神経科学研究への適用==<br />
===神経系細胞ビッグデータとしてのscRNA-seq===<br />
様々な神経・精神疾患について理解しその診断や治療に役立てるためには、神経細胞、[[グリア細胞]]を中心にした神経系にある細胞の種類や状態を識別し、それぞれの細胞における分子的な変化を観察することが重要である <ref><pubmed>28775344</pubmed></ref><ref><pubmed>29738987</pubmed></ref>。本項目で解説してきたscRNA-seq技術は、神経系に見られるそれぞれの細胞のトランスクリプトームについて[[ビッグデータ]]を提供することで、この細胞の種類や状態の識別に新たな判断材料を与えつつある。近年、中枢神経系の[[アストロサイト]]、[[オリゴデンドロサイト]]、[[ミクログリア]]といった[[グリア細胞]]も均一ではなく、内在的な多様性や外部因子による状態の変動が報告されてきている。神経細胞は、著しく多様であり、この多様性が神経系の多彩で複雑な機能発現の基盤となっている。従来の神経科学では、神経細胞の多様性は、それぞれの神経細胞の解剖学的な位置、発現している分子、電気生理学、結合性、形態、神経伝達物質、神経伝達物質受容体とシグナル伝達によって識別されてきている。こうした神経細胞の多様性を便宜的に記述するのに、タイプ（type）、クラス（class）、サブクラス（subclass）、サブタイプ（subtype） というような用語が用いられてきた。しかし、ここでは混乱を防ぐため、Masland（2004）<ref><pubmed>15242626</pubmed></ref>が提唱し、広く受けいれられている「クラス」と「タイプ」という単語を用いることとする<ref name=Yuste2020><pubmed>32839617</pubmed></ref>。タイプは、これ以上分類することができないとされる階層であり、共通性を持つタイプの集団がクラスである。例えば、[[大脳皮質]]の[[錐体細胞]]、[[網膜神経節細胞]]といった大雑把な区分はクラスである。大脳皮質の錐体細胞というクラスは、層や領野によって異なるタイプ、網膜神経節細胞には視覚情報に対して応答が異なるタイプが存在する。scRNA-seqは、「タイプ」の理解に新たな視点を提供している。<br />
===神経系へのscRNA-seqの適用===<br />
scRNA-seqの神経系での利用については、次々と新しい論文やプレプリントが発表されており、ここではscRNA-seqで得られてきた情報の典型例を紹介することにとどめる。<br />
<br />
大脳皮質には、錐体細胞や[[非錐体細胞]]などの神経細胞や様々なグリア細胞などが見られ、古くから神経細胞タイプの識別が行われてきた。初期のFluidigm C1を用いたscRNA-seq技術でも、マウス皮質の小規模な細胞数を分類した研究で、これまで知られていた主要な神経細胞タイプとは違うタイプが見つかりscRNA-seqの有効性が示された<ref><pubmed>25700174</pubmed></ref>。その後のドロップレット使用の3’エンドリード法を利用した多数の細胞数の解析で、更に多数の神経細胞のタイプが見つかっている<ref name=Yuste2020><pubmed>32839617</pubmed></ref><ref name=Habib2017><pubmed>28846088</pubmed></ref><ref><pubmed>30096299</pubmed></ref><ref><pubmed>30096314</pubmed></ref><ref><pubmed>30382198</pubmed></ref><ref><pubmed>29320739</pubmed></ref><ref><pubmed>33338423</pubmed></ref>[https://doi.org/10.1101/2020.06.04.105700] [https://doi.org/10.1101/2020.07.02.184051]。特に、[[GABA]]作動性[[介在神経細胞]]タイプの多様性とその発生<ref><pubmed>28942923</pubmed></ref><ref><pubmed>28134272</pubmed></ref><ref><pubmed>29472441</pubmed></ref><ref><pubmed>29513653</pubmed></ref>についての、これまでの組織化学的な研究からは得られていなかった多くの情報は重要であろう。また、初期の発生過程<ref><pubmed>26940868</pubmed></ref><ref><pubmed>30485812</pubmed></ref><ref><pubmed>31073041</pubmed></ref><ref><pubmed>30635555</pubmed></ref><ref><pubmed>30625322</pubmed></ref>、老化<ref><pubmed>31551601</pubmed></ref>の理解が、scRNA-seq技術を利用することで進んでいる。更に、[[神経活動]]や[[臨界期]]に伴い変化するmRNAも細胞ごとに調査され興味深い<ref><pubmed>29230054</pubmed></ref> <ref><pubmed>32404418</pubmed></ref>。<br />
<br />
ヒトを含めた[[霊長類]]の大脳についても発達段階を含めてscRNA-seqが適用されてきている<ref><pubmed>26060301</pubmed></ref><ref><pubmed>27339989</pubmed></ref><ref name=Zhong2018><pubmed>29539641</pubmed></ref><ref name=Nowakowski2017><pubmed>29217575</pubmed></ref><ref name=Habib2017><pubmed>28846088</pubmed></ref><ref><pubmed>29227469</pubmed></ref><ref><pubmed>31303374</pubmed></ref><ref><pubmed>29867213</pubmed></ref><ref><pubmed>31435019</pubmed></ref><ref><pubmed>32424074</pubmed></ref> <ref><pubmed>32999462</pubmed></ref>[https://doi.org/10.1101/2020.03.31.016972][https://doi.org/10.1101/2020.04.23.056390]。ヒトや霊長類に特徴的とされる[[島]]の[[von Economo神経細胞]]（[[紡錘細胞]]）のような希少な神経細胞のscRNA-seqにも成功している<ref><pubmed>32127543</pubmed></ref>。<br />
<br />
[[海馬]]<ref><pubmed>29241552</pubmed></ref><ref><pubmed>29912866</pubmed></ref><ref><pubmed>29335606</pubmed></ref><ref><pubmed>31942070</pubmed></ref>では、これまでの研究で記載されてきた神経細胞のタイプの存在が確認され、更に新規のタイプが見つかった。中枢神経系では、その他、[[外側膝状体]]<ref><pubmed>29343640</pubmed></ref>、[[大脳基底核]]<ref><pubmed>28384468</pubmed></ref>、[[視床下部]]<ref><pubmed>28166221</pubmed></ref><ref><pubmed>28355573</pubmed></ref> <ref><pubmed>27991900</pubmed></ref><ref name=Moffitt2018><pubmed>30385464</pubmed></ref> <ref><pubmed>31249056</pubmed></ref><ref><pubmed>30858605</pubmed></ref>、[[線条体]]<ref><pubmed>27425622</pubmed></ref><ref><pubmed>30134177</pubmed></ref><ref><pubmed>31875543</pubmed></ref>、[[中脳]]<ref><pubmed>27716510</pubmed></ref><ref><pubmed>29499164</pubmed></ref><ref><pubmed>30718509</pubmed></ref>、[[手綱核]]<ref><pubmed>29576475</pubmed></ref>、発生中の[[間脳]]<ref><pubmed>30872278</pubmed></ref> 、さらに[[小脳]]<ref><pubmed>30220501</pubmed></ref><ref><pubmed>30735127</pubmed></ref><ref><pubmed>30690467</pubmed></ref>などの結果が報告されてきている。例えば、構成する細胞についての情報が詳細に研究されてきたと思われていたマウスの小脳においても、分子層にこれまでの[[星状細胞]]、[[バスケット細胞]]というカテゴリーとは違った[[ギャップジャンクション]]に特徴を持つ２種類の神経細胞があることが示唆されている<ref><pubmed>24259518</pubmed></ref>。<br />
<br />
脳の外部では、[[運動神経]][https://doi.org/10.1101/2020.03.16.992958]、[[感覚神経]]<ref><pubmed>25420068</pubmed></ref><ref><pubmed>26691752</pubmed></ref>、[[らせん神経節]]<ref><pubmed>30078709</pubmed></ref><ref><pubmed>30209249</pubmed></ref> 、[[嗅覚神経]]<ref><pubmed>26541607</pubmed></ref><ref><pubmed>32059767</pubmed></ref>、[[腸神経系]] <ref><pubmed>29483303</pubmed></ref><ref><pubmed>33288908</pubmed></ref>、[[網膜]]<ref><pubmed>27565351</pubmed></ref><ref name=Konstantinides2018><pubmed>29909983</pubmed></ref><ref><pubmed>30018341</pubmed></ref><ref><pubmed>31260032</pubmed></ref><ref><pubmed>31128945</pubmed></ref><ref name=Peng2019><pubmed>30712875</pubmed></ref><ref><pubmed>30548510</pubmed></ref><ref><pubmed>31075224</pubmed></ref><ref><pubmed>31399471</pubmed></ref><ref><pubmed>31848347</pubmed></ref><ref><pubmed>31673015</pubmed></ref><ref><pubmed>31653841</pubmed></ref><ref><pubmed>31784286</pubmed></ref>[https://doi.org/10.1101/2020.02.26.966093]<ref><pubmed>32386599</pubmed></ref>[https://www.biorxiv.org/content/10.1101/617555v2]<ref name=Yamagata2021></ref><ref>'''Shekhar K, Sanes JR (2021)'''.<br>Generating and using transcriptomically based retinal cell atlases. Annu Rev Vis Sci 7: (in press)</ref>でのscRNA-seqデータがある。<br />
<br />
また[[iPS細胞]]や[[ES細胞]]由来の神経組織[[オルガノイド]]に含まれる神経細胞タイプを知る上でも利用されている<ref><pubmed>28094016</pubmed></ref><ref><pubmed>28279351</pubmed></ref><ref><pubmed>31168097</pubmed></ref><ref><pubmed>31996853</pubmed></ref><ref><pubmed>31968264</pubmed></ref><ref><pubmed>32221280</pubmed></ref>。このようなアプローチは、[[ネアンデルタール人]]型の遺伝子を持つ脳オルガノイドの解析<ref><pubmed> 32559457</pubmed></ref>やSARS-CoV-2に感染する脳オルガノイド中の細胞の同定<ref><pubmed> 33113348</pubmed></ref>など、新たな応用例が発表されてきており興味深い。<br />
<br />
===神経細胞以外の細胞===<br />
[[上衣細胞]]<ref><pubmed>29727663</pubmed></ref>は、[[神経幹細胞]]としての役割が示唆されてきたが、scRNA-seqによる解析ではその可能性が支持されなかった。グリア細胞では、[[ラジアルグリア]]<ref><pubmed>26406371</pubmed></ref><ref><pubmed>25734491</pubmed></ref><ref><pubmed>29281841</pubmed></ref><ref name=Nowakowski2017><pubmed>29217575</pubmed></ref><ref name=Zhong2018><pubmed>29539641</pubmed></ref>、アストロサイト<ref><pubmed>32139688</pubmed></ref><ref><pubmed>32203496</pubmed></ref>[https://doi.org/10.1101/2020.04.27.064881]に多様性があることが示唆されてきている。また、オリゴデンドロサイト<ref><pubmed>27284195</pubmed></ref><ref><pubmed>30078729</pubmed></ref><ref name=Avey2018><pubmed>30257220</pubmed></ref><ref name=Jäkel2019><pubmed>30747918</pubmed></ref><ref><pubmed>31958186</pubmed></ref>[https://doi.org/10.1101/2020.03.06.981373]については、これまで細胞生物学的に研究されてきた分化の過程がscRNA-seqにより詳細に解析されている。ミクログリアは、神経系の発達、老化、損傷などに伴う重要な遺伝子発現状態の変化がscRNA-seqにより詳細に明らかになった<ref><pubmed>27338705</pubmed></ref><ref name=Mathys2017><pubmed>29020624</pubmed></ref><ref><pubmed>30206190</pubmed></ref><ref name=Hammond2019><pubmed>30471926</pubmed></ref><ref><pubmed>31209379</pubmed></ref><ref><pubmed>31835035</pubmed></ref>。また、[[CNS境界関連マクロファージ]](BAM) <ref><pubmed>31061494</pubmed></ref>や[[脳血管系]]<ref><pubmed>29443965</pubmed></ref>のscRNA-seqも実施されている。<br />
===疾患===<br />
scRNA-seqは、疾患の理解にも有用である。scRNA-seqでは、疾患に伴う遺伝子発現状態の変化を細胞タイプごとに観察することができるので、バルクRNA-seqでは埋もれていた遺伝子発現状態の変化や細胞ごとの変化を検出できるという長所がある。<br />
例えば、[[筋萎縮性側索硬化症]]<ref name=Maniatis2019><pubmed>30948552</pubmed></ref>、[[多発性硬化症]]<ref name=Jäkel2019><pubmed>30747918</pubmed></ref><ref><pubmed>30420755</pubmed></ref><ref><pubmed>32313246</pubmed></ref>、[[アルツハイマー病]]やそのモデル動物<ref><pubmed>31042697</pubmed></ref><ref><pubmed>31399126</pubmed></ref><ref name=Mathys2017><pubmed>29020624</pubmed></ref><br />
[https://doi.org/10.1101/628347]<ref><pubmed>28602351</pubmed></ref><ref><pubmed>32341542</pubmed></ref>、[[統合失調症]]<ref><pubmed>29785013</pubmed></ref><ref><pubmed>32203495</pubmed></ref>、[[てんかん]]<ref><pubmed> 33028830</pubmed></ref>、[[自閉症]]や[[レット症候群]]<ref><pubmed>31097668</pubmed></ref><ref><pubmed>30455458</pubmed></ref>、[[シャルコー・マリー・トゥース病]]<ref><pubmed>29888333</pubmed></ref>、[[ダウン症]][https://www.biorxiv.org/content/10.1101/2020.01.01.892398v1]、[[パーキンソン病]]<ref><pubmed>30503143</pubmed></ref><ref><pubmed>32826893</pubmed></ref>、[[ハンチントン病]]<ref><pubmed>32070434</pubmed></ref>、[[がん]]<ref><pubmed>31327527</pubmed></ref><ref><pubmed>28360267</pubmed></ref>などに適用されている。最近、Perturb-seqにより、[[自閉症]]に関わる遺伝子の欠損に伴う細胞状態の変化などもscRNA-seqで報告されており<ref><pubmed>33243861</pubmed></ref>、疾患の理解のための新たな実験系の開発も始まりつつある。<br />
==scRNA-seqの展望==<br />
===神経系の多様性と進化===<br />
NGSを用いることで、どんな生物種にも適用可能なscRNA-seqは、既に多様な生物の神経系の細胞の理解、更には種間の相同性や差異の研究に利用されており、神経系の進化を細胞レベルで考察するのに有用であろう（例、[[線虫]]<ref name=Cao2017><pubmed>28818938</pubmed></ref>、[[ショウジョウバエ]]<ref><pubmed>29909982</pubmed></ref><ref><pubmed>29149607</pubmed></ref><ref><pubmed>30703584</pubmed></ref><ref name=Konstantinides2018><pubmed>29909983</pubmed></ref><ref><pubmed>33125872</pubmed></ref>、[[カタユウレイボヤ]]''Ciona intestinalis''<ref><pubmed>30069052</pubmed></ref><ref><pubmed>30228204</pubmed></ref>、[[ゼブラフィッシュ]]<ref><pubmed>31018142</pubmed></ref><ref><pubmed>30929901</pubmed></ref>、[[アカミミガメ]]''Trachemys scripta elegans''、[[トカゲ]]''Pogona vitticeps'', PV<ref><pubmed>29724907</pubmed></ref>、[[ニワトリ]]<ref name=Yamagata2021></ref>、[[霊長類]]<ref><pubmed>30730291</pubmed></ref><ref><pubmed>31619793</pubmed></ref>[https://doi.org/10.1101/2020.03.31.016972]）。ただ、遺伝子やトランスクリプトームの研究が進んでいる生物種では比較的容易であるが、遺伝子のアノテーションが十分でない生物種を用いる場合、scRNA-seqのデータ解析は困難を伴う。また種を超えた細胞タイプの相同性の理解には様々な工夫が必要である<ref><pubmed>31552245</pubmed></ref><ref name=Peng2019><pubmed>30712875</pubmed></ref>[https://doi.org/10.1101/2020.03.31.016972]。<br />
===データベースと統合===<br />
獲得されたscRNA-seqのデータは様々な目的で利用できるので、データベース化し利用できるようにする必要がある。神経系のトランスクリプトーム一般のデータベースが多数公開されており<ref><pubmed>29437890</pubmed></ref>、scRNA-seqのデータも基本的にNCBIの[https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/ Gene Expression Omnibus]に登録されている。また、オープンサイエンス推進のためにcommon coordinate framework (CCF) やcentral annotation platform (CAP)という概念のもと、特にscRNA-seqを意識したものとして、米国のBRAIN Initiative Cell Census Consortium<ref><pubmed>29096072</pubmed></ref>、Human Cell Atlas Projectの[https://data.humancellatlas.org Human Cell Atlas Data Portal]、そのマウス版である[https://genome.ucsc.edu/cgi-bin/hgTrackUi?db=mm10&g=tabulaMuris Tabula Muris]<ref><pubmed>30283141</pubmed></ref>やSten Linnarssonラボの[http://mousebrain.org マウス脳発生データベース]、アレン脳研究所の[https://portal.brain-map.org Allen Brain Atlas]、ブロード研究所の[https://singlecell.broadinstitute.org/ Single Cell Portal]などのデータベースが稼働している。また、異なった方法や実験で得られたscRNA-seqのデータや後述の複数モダリティのシングルセルオミクスのデータを体系的に比較することも重要であり、CCA (Canonical correlation analysis)<ref name=Butler2018><pubmed>29608179</pubmed></ref>, Seurat 3.0以降に組み込まれたMMN (Mutual Nearest Neighbors)、LIGER<ref><pubmed>31178122</pubmed></ref> 、Harmony<ref><pubmed>31740819</pubmed></ref> 、MetaNeighber<ref><pubmed>29491377</pubmed></ref>、Conos<ref><pubmed>31308548</pubmed></ref>[https://doi.org/10.1101/2020.05.22.111161]のようなアルゴリズムが開発され、後述の複数モダリティのシングルセルオミクスを組み込んだ[https://biccn.org 統合サイト]もでき始めている。またデータベースを利用して発現類似性検索も研究されている<ref><pubmed>29608555</pubmed></ref><ref><pubmed>30744683</pubmed></ref>。<br />
===空間トランスクリプトミクス===<br />
多数の細胞を扱うscRNA-seqの弱点は、組織から細胞や細胞核を解離する必要があるので、その細胞が存在していた解剖学的あるいは空間的な位置の情報を消去してしまうということである。組織切片におけるタンパク質などの分布は[[免疫組織化学]]、mRNAの分布はin situ hybridizationで検出することができるが、数多くのmRNAの分布を情報処理技術と組み合わせ一気に同定する方法がscRNA-seqと同様に開発されてきている（Slide-seq<ref><pubmed>30923225</pubmed></ref><ref><pubmed> 33288904</pubmed></ref>、HDST<ref><pubmed>31501547</pubmed></ref>、Expansion sequencing[http://doi.org/10.1101/2020.05.13.094268]など<ref><pubmed>27365449</pubmed></ref>, <ref><pubmed>31932730</pubmed></ref><ref name=Maniatis2019><pubmed>30948552</pubmed></ref>）、更に10x Genomics社が市販するVisium（現時点ではシングルセルレベルではない）などがある。現状では、大きな組織の空間トランスクリプトミクスは、空間解像度は限定されており、技術普及の観点からも課題が多い。しかし、そのデータを解析するためのアルゴリズム<ref><pubmed>29553578</pubmed></ref><ref><pubmed>29553579</pubmed></ref><ref><pubmed>32350282</pubmed></ref>[https://doi.org/10.1101/757096][https://doi.org/10.1101/701680][https://doi.org/10.1101/431957]、更にMerFish <ref><pubmed>25858977</pubmed></ref>、corrFISH<ref><pubmed>27271198</pubmed></ref>のように、subcellularレベルで多数のmRNAを検出する方法が多数開発されてきており（<ref><pubmed>25549890</pubmed></ref> osmFISH<ref><pubmed>30377364</pubmed></ref>、STARmap (spatially-resolved transcript amplicon readout mapping) <ref><pubmed>29930089</pubmed></ref>、seqFISH+<ref><pubmed>27764670</pubmed></ref>、pciSeq(probabilistic cell typing by in situ sequencing)[https://doi.org/10.1101/431957]、DSP(Digital Spatial Profiling) <ref><pubmed>32393914</pubmed></ref>、scRNA-seqと組み合わせることで、その弱点を補う空間トランスクリプトミクスにも利用され始め<ref name=Moffitt2018><pubmed>30385464</pubmed></ref>[https://doi.org/10.1101/2020.06.04.105700]、今後の発展が期待される分野である<ref><pubmed>32702314</pubmed></ref>。<br />
===統合解析 ===<br />
同一の細胞からscRNA-seqの情報だけでなく、ゲノム配列、ATAC-seqなどによる[[エピゲノム]]解析、少数のタンパク質、あるいは[[プロテオーム]]など複数のモダリティを同時に観察するオミクス（Single-cell multimodal omics）が注目されている<ref><pubmed>31907462</pubmed></ref><ref><pubmed>30696980</pubmed></ref>。2019年には、Nature Methodsの「Methods of the Year」に選ばれており、現状については、その特集号などを参考にされたい。例えば、細胞表面に提示されているマーカー分子に対する抗体にDNAを付加することで、そのマーカーを発現する細胞のトランスクリプトームを解析するCITE-seq<ref><pubmed>28759029</pubmed></ref>、 REAP-seq<ref><pubmed>28854175</pubmed></ref>も、既知の細胞表面マーカーの発現とscRNA-seqが同時に観察できる方法である。<br />
<br />
複数モダリティのシングルセルオミクスとして、神経科学分野で注目されるのは、scRNA-seqを[[パッチクランプ]]による電気生理学的情報と組み合わせたPatch-seq<ref><pubmed>26689544</pubmed></ref> <ref><pubmed>26689543</pubmed></ref>である。また、ゲノムDNAとscRNA-seqを同時に観察することによって、近年、精神疾患の観点から注目されている発生途中で生じる遺伝子変異を研究するPRDD-seqは今後の展開が注目される<ref><pubmed> 32522880</pubmed></ref>。最後に、BARseq (barcoded anatomy resolved by sequencing) <ref><pubmed>31626774</pubmed></ref>、CONNECTID[https://doi.org/10.1101/378760]、Epi-Retro-seq<ref><pubmed>30276807</pubmed></ref>のような方法は、[[コネクトーム]]（神経細胞の結合性）と遺伝子発現状態を記録できるオミクスの新たな方向として興味深い。<br />
== 関連項目 ==<br />
*[[ゲノムワイド関連解析 ]]<br />
*[[ディファレンシャルディスプレイ ]]<br />
*[[In situハイブリダイゼーション法 ]]<br />
*[[免疫組織化学法]]<br />
*[[エピジェネティクス]]<br />
*[[コネクトーム]]<br />
== 参考文献 ==<br />
<references /></div>
Masahitoyamagata
https://bsd.neuroinf.jp/w/index.php?title=%E3%82%B7%E3%83%B3%E3%82%B0%E3%83%AB%E3%82%BB%E3%83%ABRNA%E3%82%B7%E3%83%BC%E3%82%B1%E3%83%B3%E3%82%B7%E3%83%B3%E3%82%B0&diff=45631
シングルセルRNAシーケンシング
2021-01-04T14:15:13Z
<p>Masahitoyamagata: bioRxivのhttps://doi.org/10.1101/2020.10.09.333633 のリンクを、査読済みの正式論文 https://doi.org/10.7554/eLife.63907 のリンクに変更しました。</p>
<hr />
<div><div align="right"> <br />
<font size="+1">[http://researchmap.jp/yamagatm 山形方人]</font><br><br />
''Harvard University''<br><br />
DOI：<selfdoi /> 原稿受付日：2020年10月22日 原稿完成日：2020年12月23日<br><br />
外部査読委員：京都大学メディカルイノベーションセンター [https://researchmap.jp/read0140206 渡辺 亮]<br>理化学研究所 生命機能科学研究センターバイオインフォマティクス研究開発チーム/東京医科歯科大学 難治疾患研究所 ゲノム応用医学部門 ゲノム機能情報分野 [https://researchmap.jp/dritoshi 二階堂 愛]<br><br />
</div><br />
英：single-cell RNA sequencing, scRNA-seq<br />
{{box|text= シングルセルRNAシーケンシング(single-cell RNA sequencing, 以下scRNA-seq)は、[[次世代シーケンサー]]（next generation sequencer、以下NGS）を用いることで、個々の細胞が保持しているmRNA全体を質的、量的に網羅的に調べる方法である。次元圧縮などの数理的な解析と組み合わせることで、遺伝子発現の状態に基づいた細胞の分類を行うことが可能であり、従来の組織学的、あるいは細胞生物学的手法では知られなかった新規の細胞種の同定や細胞状態の推定を行うことが可能になった。また、遺伝子発現プロファイルの変化に基づく擬時系列解析(pseudotime analysis)によって、刺激や発生に伴う細胞状態の遷移の描写ができる。神経系では、この方法により、神経細胞や非神経細胞の分類や状態についての知見が深まり、新しい神経細胞タイプ、細胞マーカー、病態の理解、更に機能的な遺伝子の同定などが系統的かつ網羅的に行われるようになった。scRNA-seqに、空間的情報、エピゲノム情報、タンパク質情報などの複数モダリティを取り入れた統合解析（multimodal single-cell omics）も行われている。}}<br />
<br />
==背景==<br />
===トランスクリプトーム===<br />
[[トランスクリプトーム]]（transcriptome）は、細胞中に存在する全ての[[転写]]産物（タンパク質をコードする[[mRNA]]、タンパク質をコードしない[[ノンコーディングRNA]]、[[マイクロRNA]]など）の総体である<ref><pubmed>19015660</pubmed></ref><ref><pubmed>31341269</pubmed></ref>。トランスクリプトームは、[[ゲノム]]とは異なり、同一の個体でも、組織ごとに、更には発生段階や細胞外環境や刺激によって変化する。トランスクリプトームは、同質あるいは異質の多数の細胞集団（組織、[[培養細胞]]）から[[RNA]]抽出後、[[cDNA]]に変換し、それを1990年代に出現した[[DNAマイクロアレイ]]のように数多くの既知mRNAを識別する技術によって解析されるようになった。その後、[[次世代シーケンサー]]の利用により、希少mRNAやノンコーディングRNAを含めた未知の転写産物の高感度検出が可能になるとともに、[[スプライシング]]で成熟していく過程のmRNAなど、転写産物の種類だけでなく、転写産物の構造的差異（スプライシングバリアント、[[SNPs]]、変異など）の解析もできるようになった。加えて、[[ヒト]]やモデル[[実験動物]]（[[マウス]]、[[ゼブラフィッシュ]]、[[ショウジョウバエ]]、[[線虫]]など）だけでなく、多種多様な生物のトランスクリプトームの把握も可能になった。従来から行われてきた組織全体などの多数の細胞を対象としたRNA-seq（バルクRNA-seq）では、複数の細胞における転写産物の平均を観察しているが、本項目では個々の細胞における転写産物を解析するscRNA-seqの原理とその応用について概説する。<br />
<br />
===開発史===<br />
1つの細胞の持つ生体物質を解明し、定量しようとする試みは古くからあった。1960年代になると、[[フローサイトメトリー]]を利用した[[蛍光活性化セルソーティング]]（Fluorescence-activated cell sorting, FACS）が発明され、標識抗体などのプローブと組み合わせることで、多数の細胞集団の中で１つの細胞が保持している生体分子の種類や量についての断片的な研究が可能になり、この方法は現在でも汎用されている<ref><pubmed>22271369</pubmed></ref>。その後、[[免疫組織化学]]や[[in situ hybridization]]nなどにより、タンパク質やmRNAの種類や量が観察できるようになり、組織中に存在するそれぞれの細胞の同定などに活用されてきている。最近では、それぞれの細胞が持つ抗原分子を、異なった金属イオンで標識した抗体とフローサイトメトリーを組み合わせた方法で検出する[[マスサイトメトリー]]（CyTOFなど）も開発されてきている<ref><pubmed>27153492</pubmed></ref>。<br />
<br />
細胞種にもよるが、1つの細胞内にある全RNA（ribosomal RNAを含む）は細胞種にもよるが1-50pgである。そのうち、mRNAの占める割合は1-5%程度である<ref><pubmed>15239941</pubmed></ref>。この微量のmRNAをcDNAに変換してから大幅に増幅できる方法が発明されたことで、1つの細胞が発現するmRNAを高感度で検出できるようになった<ref><pubmed>1557406</pubmed></ref><ref><pubmed>7541630</pubmed></ref> 。例えば、1991年、[[wj:リンダ・バック|Linda Buck]]と[[wj:リチャード・アクセル|Richard Axel]]は、[[嗅覚受容体]]が[[Gタンパク質]]であると仮定し、個々の嗅覚細胞で特異的に観察されるGタンパク質mRNAを比較することで、嗅覚受容体の同定に成功した<ref><pubmed>1840504</pubmed></ref>。1995年になると、[[wj:キャサリン・ドュラック|Catherine Dulac]]とRichard Axelは、異なる[[鋤鼻神経細胞]]で特異的に発現する遺伝子を１つの細胞から作製したcDNAライブラリーを比較する[[ディファレンシャル・スクリーニング]]を行うことで、[[フェロモン受容体]]を同定した<ref><pubmed>7585937</pubmed></ref>。同じ手法で異なる種類の神経細胞で発現している遺伝子も同定され<ref><pubmed>9778248</pubmed></ref><ref><pubmed>12230981</pubmed></ref>、1つの細胞の持つトランスクリプトームを比較するアプローチが神経細胞で特徴的に発現している遺伝子の同定に効果的なことが示された。<br />
<br />
一方で多くの種類のmRNAを1細胞レベルで一挙に観察するための技術には感度やスループット、そしてコストの観点からブレークスルーが待たれた。1つの問題は多種類のcDNAを簡便に識別することを可能にする方法の開発であった。これを可能にしたのが、[[PCR]]などのcDNA増幅法の改良とマイクロアレイの利用であった<ref><pubmed>12736331</pubmed></ref><ref><pubmed>16547197</pubmed></ref>。しかしながら、細胞ごとに高価な[[マイクロアレイ]]を使用することは、多数の細胞のトランスクリプトームの観察には限界があった。2009年になると、これらの問題を解決できる可能性として、次世代シーケンサーを利用するscRNA-seqプロトコールがAzim Suraniのグループによって報告された<ref><pubmed>19349980</pubmed></ref>。しかしながら、多数のマイクロアレイでなく1回の次世代シーケンサー使用で済ませることができるものの、この報告でもわずか8個の細胞の解析に留まっており、1つの細胞ごとに処理を行うという操作が必要で、多数の細胞についてのトランスクリプームを一挙に理解することはできなかった。また、塩基配列の違うcDNAごとにPCR効率に差がある結果生じる増幅バイアス、また3’末端側が選択的に補足されることなどの課題があった。<br />
<br />
==現状==<br />
===分子生物学的反応=== <br />
その後、5’末端側の領域まで効率よく増幅するscRNA-seqのプロトコールが考案された<ref name=Mereu2020><pubmed>32518403</pubmed></ref>。特に、SMART-seq（Switching mechanism at the 5' End of RNA Templates）<ref><pubmed>22820318</pubmed></ref>およびその改良されたプロトコールであるSMART-seq2<ref><pubmed>24056875</pubmed></ref> <ref><pubmed>24385147</pubmed></ref>の使用例が多い（既に、SMART-seq3という改良プロトコールもある<ref><pubmed>32518404</pubmed></ref>が、以下SMART-seqと呼ぶ）。また、類似法としてSTRT（single-cell tagged reverse transcription）<ref name=Islam2011><pubmed>21543516</pubmed></ref>などがある。<br />
<br />
一方、CEL-seq（Cell Expression by Linear amplification and Sequencing）<ref><pubmed>22939981</pubmed></ref>、CEL-seq2<ref><pubmed> 27121950 </pubmed></ref> 、MARS-seq（Massively parallel single-cell RNA-seq）<ref><pubmed>24531970 </pubmed></ref>では、[[T7 RNAポリメラーゼ]]による[[in vitro転写]]を用いることにより、[[PCR]]による増幅で見られるバイアスを低減させようとしている。<br />
<br />
また、Quartz-SeqやQuartz-Seq2ではPCR用のアダプターを付加する反応にポリAテーリングを利用することで、他の手法と比較して1.5-5倍程度の遺伝子を検出できる<ref name=Mereu2020><pubmed>32518403</pubmed></ref>。<br />
===バーコード技術 ===<br />
増幅バイアス除去のアプローチとして特に重要なのは、2011年に発表された核酸配列バーコードを利用した方法で、分子識別子（unique molecular identifiers: UMI）を持つcDNAを増幅させ、次世代シーケンサー後の情報処理を用いるものであると考えられる<ref><pubmed>22101854</pubmed></ref>。この方法では[[逆転写]]反応の際、ランダム塩基配列から構成されるUMIをcDNA末端に付加した後、増幅反応、次世代シーケンサーを行い、cDNA配列とUMI配列の両方を読む。cDNAにはRNA1分子に1つのUMIが付加されるので、同一のUMIを持っていれば、逆転写時に同一のcDNA由来とカウントする。UMIをカウントすることで、増幅前のmRNAのコピー数を知ることができる<ref name=Islam2011><pubmed>21543516</pubmed></ref><ref><pubmed>24363023</pubmed></ref><ref name=Gierahn2017><pubmed>28192419</pubmed></ref> <ref><pubmed>29474909</pubmed></ref><ref name=Cao2017><pubmed>28818938</pubmed></ref><ref name=Rosenberg2018><pubmed>29545511</pubmed></ref>。<br />
===多様なプラットフォーム===<br />
細胞を分別するプラットフォームには、マイクロピペットによる捕獲、[[セルソーター]]、[[レーザー捕獲]]などを用いるマルチウェル法、あるいは半導体集積回路様の製作技術で作った流体回路を利用するFluidigm C1の装置（[https://jp.fluidigm.com C1 Single- Cell Auto Prep]）、更にドロップレット使用（下記）などがある<ref><pubmed>30405621</pubmed></ref><ref><pubmed>33247933</pubmed></ref>。これらは、SMART-seqと組み合わせて利用されることが多い。SMART-seqプロトコールの特徴は、全長mRNAのトランスクリプトーム情報を得ることができることであり、mRNAのスプライシングバリアントなどのアイソフォーム、SNPsの情報を利用したアリル特異的発現、変異の検出にも利用できる。また、それぞれ細胞ごとの反応を独立した場所で行うため、反応中に別の細胞の反応と混じる可能性が低い。小型のナノウェルを用いるSeq-Wellも同様に反応自体が混じる可能性が低い<ref name=Gierahn2017><pubmed>28192419</pubmed></ref>。これらの点が、次に説明するドロップレットを使用して3’末端のみを標的にしたscRNA-seqと比べた場合の長所であるが、その高コスト（1細胞あたり数十ドル）と処理可能な細胞数の少なさが短所である。<br />
<br />
これらとは別に、ハイスループットで安価な方法として、それぞれの細胞を独立に標識するのではなく、プールされた細胞を異なるウェルにランダムに振り分け、ウェル固有のバーコードで転写物を標識していく操作を複数回繰り返していくことで細胞を区別するSplit-seqやsci-RNA-seq3などの方法も用いられている<ref name=Rosenberg2018><pubmed>29545511</pubmed></ref><ref><pubmed>30787437</pubmed></ref>。<br />
<br />
===ドロップレット使用の3’エンドリード法===<br />
scRNA-seqのプラットフォームと方法について重要と考えられる進歩は、2015年、Harvard Medical Schoolの独立した２つのグループが、inDrops<ref><pubmed>26000487</pubmed></ref>そしてDrop-seq<ref><pubmed>26000488 </pubmed></ref>という類似した2つのハイスループットな方法を開発したことであろう（inDropsは[[T7 RNAポリメラーゼ]]、Drop-seqはPCRで増幅）。これらの方法では、[[マイクロ流体力学]] (microfluidics) 、 UMI（上述）と細胞ごとのバーコード（Cell Barcode）という2種類のDNAバーコーディング、そしてNGSと情報解析法を利用している。そして、多く細胞のサンプル調製の自動化と容易さから、1つの細胞あたりに要するコストを大幅に低下させることに成功した（Drop-seqは発表時で、１細胞あたり約5セント）。つまり、細胞1つずつをマイクロ流体力学によるエマルジョン作製技術を利用した装置に流入させ、その1細胞を1つのドロップレットに自動的に閉じ込める。そのドロップレット中には、ドロップレットごとにCell barcode/UMIとしてユニークなDNAバーコードを持つゲルビーズ(Gel Beads in Emulsion, GEMs)が入っており、それを足場に3’末端のみを標的にしたcDNA合成反応を実施することで、同じ細胞に含まれていた1分子のmRNAが同じCell barcodeを持つcDNAとして合成され、そのmRNA/cDNAが由来した細胞を識別できるということを利用している（'''図1'''）。<br />
[[ファイル:scFig1.jpg|サムネイル|300px|'''図1. ドロップレット使用の3’エンドリード法 '''<br>組織から解離させた細胞それぞれを、マイクロ流体力学を利用した装置で、バーコードプライマーが結合したゲルビーズとともにドロップレットに封じ込める。ドロップレット中には、ドロップレットごとにCell barcode/UMIとしてユニークなDNA配列を持つゲルビーズ(GEMs)が入っており、それを足場にcDNA合成反応を実施することで、同じ細胞に含まれていたmRNAが同じCell barcodeを持つDNAとして合成され、それを増幅する。]]<br />
<br />
DropSeqはコストが低いが、細胞の取得率と検出感度が低い弱点がある。inDropsはDropSeqより細胞取得率が高く、パラメータを調整することにより、低レベルで発現される遺伝子の検出にも有利であるとされる<ref name=Zhang2019><pubmed>30472192</pubmed></ref>。DropSeqのセットアップは[https://www.dolomite-bio.com Dolomite Bio]、inDropは[https://1cell-bio.com 1 Cellbio社]から販売されている。しかし、その後、[https://www.10xgenomics.com/jp/ 10x Genomics社]が同様の原理を用いたシングルセル遺伝子発現解析システムを市販することで、多くの研究者が利用できるようになっている<ref><pubmed>28091601</pubmed></ref>。Svenssonらによる最近の[http://www.nxn.se/single-cell-studies/gui データベース]<ref><pubmed>33247933</pubmed></ref>では、scRNA-seqを用いた論文で用いられた方法について調査しており、この数年、10x Genomics社のプラットフォームを用いた論文が飛躍的に増加していることがわかる。10x Genomics社のプラットフォームは市販であるので導入が容易であり、DropSeqやinDropsに比べ多くの転写産物の検出が可能であるが、それらよりランニングコストは高価である<ref name=Zhang2019><pubmed>30472192</pubmed></ref>。<br />
<br />
なお、3’エンドリード法だけでなく、抗体やT細胞レセプターのN末端側に位置する可変領域の配列決定が可能である5'末端のシーケンシングには5’エンドリード法が利用されることがある。<br />
<br />
==実際==<br />
ここでは主流になっている10x Genomics社のChromium controllerなどのドロップレットを用いた方法とSMART-seqなどを用いた他のプラットフォームに共通する方法の実際について概説する。scRNA-seqの利用には、4つのステップがある（'''図2'''）<ref name=Luecken2019><pubmed>31217225</pubmed></ref><ref><pubmed>30089861</pubmed></ref>。これらのうち、'''2.'''の段階については、上に記述したように市販の機器や試薬を利用する機会が多くなっているので、詳細は説明しない。<br />
[[ファイル:ScFig2d.jpg|サムネイル|500px|'''図２．scRNA-seqの実際のステップ '''<br>細胞の単離、ライブラリ作製とNGS、データの前処理から次元圧縮、データ解析。図の一部は2016 DBCLS TogoTV、あるいはSeuratを用いて10x Genomics社の[https://support.10xgenomics.com/single-cell-gene-expression/datasets PBMCデータ]から執筆者が作製。]]<br />
# 個体や組織を採集し、そこから細胞あるいは細胞核を個別に解離された状態にすること。<br />
# ドロップレット法やSMART-seq対応のプラットフォームなどによる個々の細胞からのライブラリーの作製とNGS。<br />
# 得られた配列情報の前処理（preprocessing）。<br />
# データ解析。<br />
<br />
===組織からの細胞、細胞核の分離===<br />
浮遊細胞（[[血液]]細胞など）ではない場合、物理的あるいは酵素処理などによって解離することで、生組織から状態の良い個々に分散した細胞を調製する必要がある。神経系組織の酵素処理には、パパインを用いる方法が広く用いられている<ref><pubmed>29970990</pubmed></ref>。ここで、しばしば問題となるのが、酵素処理による短時間加温や機械的刺激で、発現量が変化する遺伝子が存在することである<ref><pubmed>27090946</pubmed></ref>。特に、脳の[[ミクログリア]]の解析には、低温下で組織をホモゲナイズするなどの工夫が必要であった<ref name=Hammond2019><pubmed>30471926</pubmed></ref>。また、このような現象を抑制するために、酵素処理時に転写阻害剤である[[アクチノマイシン]]で処理したり<ref><pubmed>29024657</pubmed></ref>、ヒマラヤ氷河から得られた細菌''Bacillus licheniformis''から得られた低温プロテアーゼを用いる方法も報告されている<ref><pubmed>28851704</pubmed></ref><ref><pubmed>31623682</pubmed></ref>。また、細胞解離後に、[[メタノール]]で固定しscRNA-seqに使用したり<ref><pubmed>28526029</pubmed></ref>、クロスリンカーを用いる方法もある<ref><pubmed>29391536</pubmed></ref>。<br />
<br />
単離した細胞は、そのまま10x Genomicsのシングルセル遺伝子発現解析のプラットフォームに導入することができるが、細胞表面分子マーカーに対する[[抗体]]や[[蛍光タンパク質]]レポーターなどを用いたFACS、[[パニング]]、MACS([[磁気ビーズカラム]])などによって、細胞の選択的濃縮や除去を行う場合もある。更に、抗体に抗体表示バーコードDNAをカップリングさせるCITE-seq(Cellular Indexing of Transcriptomes and Epitopes by Sequencing) については、下記の「統合解析」でも述べる。<br />
<br />
なお、ヒト組織や希少生物などから生細胞を得ることは困難なことが多い。この場合、scRNA-seqの変法として、凍結した組織から、各細胞由来の核を調製し、核内のmRNAを分析するsnRNA-seq (single-nucleus RNA-seq)が利用されている。ただ、snRNA-seqでは、FACSなどによる特定細胞集団の分離が困難であることが多い。また、細胞質を持つ生細胞を利用したscRNA-seqとは違って、スプライシングの途上にある未成熟な核内転写産物を検出すること、更に検出できる遺伝子数も少なく、同等な結果が必ずしも得られない<ref><pubmed>24248345</pubmed></ref><ref><pubmed>26890679</pubmed></ref> <ref><pubmed>27471252</pubmed></ref><ref name=Habib2017><pubmed>28846088</pubmed></ref><ref><pubmed>29220646</pubmed></ref><ref name=Habib2017><pubmed>28846088</pubmed></ref><ref><pubmed>30586455</pubmed></ref><ref><pubmed>28729663</pubmed></ref><ref><pubmed>31728515</pubmed></ref><ref><pubmed>32341560</pubmed></ref> <ref name=Mereu2020><pubmed>32518403</pubmed></ref>。一方で、snRNA-seqでは、組織をそのまま凍結することから開始することが可能であるので、上述したscRNA-seqの問題である細胞解離酵素による処理などを避けることができる。更に、核を用いることで、大きな細胞体はマイクロ流体力学の流路で詰まりやすいなど、特に神経細胞で顕著である細胞の形状の多様性に伴うバイアスを減らすことができるといったメリットもある。こうしたプロトコールの一部は、protocols.ioのHuman Cell Atlasの[https://www.protocols.io/groups/hca グループ]で公開されている。<br />
<br />
通常のscRNA-seqは、ポリアデニル化されたmRNAを検出しているが、MATQ-seq（multiple annealing and dC-tailing-based quantitative single-cell RNA-seq）、RamDA-seqなどを用いると、ポリアデニル化されていないRNAの検出も可能である<ref><pubmed> 28092691</pubmed></ref> <ref><pubmed>29434199 </pubmed></ref>[https://doi.org/10.1101/2020.06.02.131060]。<br />
<br />
更に、RNAを分析するscRNA-seqではないが、遺伝子発現状態との関係が想定される[[オープンクロマチン]]領域を[[トランスポゾン]]を用いることで個々の細胞レベルで選択的に検出するsingle cell ATAC-seq (Assay for Transposase-Accessible Chromatin) <ref><pubmed>26083756</pubmed></ref><ref><pubmed>29434377</pubmed></ref><ref><pubmed>25953818</pubmed></ref>, single cell THS-seq (transposome hypersensitive-site) <ref><pubmed>29227469</pubmed></ref>や [[DNAメチル化]]領域を観察するsnmC-seq、RRBSのような方法も利用されている<ref name=Lake2018><pubmed>28798132</pubmed></ref><ref><pubmed>30237449</pubmed></ref><ref><pubmed> 20852635</pubmed></ref>。<br />
<br />
===データ処理の流れ===<br />
====総論====<br />
Illumina社に代表される次世代シーケンサーを用いて得られた結果は、ベースコールや細胞バーコードを用いたdemultiplexingなどの基礎解析を行うことで、各細胞における遺伝子の発現量のマトリックスを出力する。例えば、10XGenomics社のChromiumプラットフォームを用いた場合、10XGenomics社が提供するCell Rangerの[https://support.10xgenomics.com/single-cell-gene-expression/software/pipelines/latest/using/tutorial_mr mkrefコマンド](Linux上で作動)などにより、各生物種ごとの[https://www.ncbi.nlm.nih.gov/grc レファレンス配列リスト]（マウスやヒトでは既製のものを利用できる）などを参考にしながら、細胞と転写産物量の対応マトリックスを作製する。その後のデータの処理についても、10x Genomics社がソフトウェアLoupeを提供している。しかしながら、その後のデータ解析を考慮して、[[R]], [[Python]], [[MATLAB]]などのデータ解析のための汎用プログラミング言語やコードで扱えるオブジェクトに変換するのが通常である。<br />
<br />
scRNA-seq解析のためには、数多くのツールが公開されている。これらのツールは、バージョンが更新されたり、新しいものに置き換えられることがあるので、実際に利用する場合は最新の動向に注意を払う必要がある。scRNA-seqの解析に必要なツールは、[https://www.scrna-tools.org scRNA-tools], [https://github.com/seandavi/awesome-single-cell Awesome single cell], [https://www.bioconductor.org Bioconductor]などで紹介されており、ほとんどがダウンロード可能である。また、[[bioRxiv]]などの査読前のプレプリントサーバで公開されて、随時試用、評価されていくものが多く、scRNA-seqのデータ（下記参考）とともに、オープンサイエンス実践の好例となっている。<br />
<br />
====Seurat====<br />
ここでは、scRNA-seqデータ解析のために最もよく利用されているRを用いたパッケージ「Seurat」<ref name=Butler2018><pubmed>29608179</pubmed></ref> <ref><pubmed> 31178118 </pubmed></ref>を中心に紹介しておきたい。なお、一部の解析操作は、University of WashingtonのCole Trapnell研究室で開発されてきた軌道推定（下記参考）によく使用される[https://cole-trapnell-lab.github.io/monocle3/ Monocle3]でも可能である。Pythonを利用したものでは、ドイツ・ミュンヘンInstitute of Computational Biologyの Fabian Theisらが開発しているScanpyが有名である<ref><pubmed> 29409532</pubmed></ref>。<br />
<br />
New York UniversityのRahul Satija研究室が開発しているSeurat（画家スーラに由来）は、scRNA-seqデータ解析のために広く利用されているRパッケージであり、2020年秋現在、Seurat4のβバージョンが公開されている。論文の正式発表前から、サポート情報提供やコード修正なども頻繁に行っており、Satija研究室の[https://satijalab.org/seurat/ ウェッブサイト]、[https://github.com/satijalab/Seurat Github]、更に[https://twitter.com/satijalab Twitterアカウント]などで最新情報を得ることできる。<br />
<br />
====品質の検討事項====<br />
最初に行うのは、scRNA-seqデータの品質管理である。ここでは、質の低い細胞のデータ（例えば、壊れた細胞では、転写産物の種類が少なくミトコンドリア由来の転写産物が多い）を取り除く。また、複数の試料を組み合わせる場合には、バッチごとの違いについて検討する<ref><pubmed>29608177</pubmed></ref><ref><pubmed> 28045081</pubmed></ref><ref><pubmed>31948481</pubmed></ref> <ref><pubmed>32854757</pubmed></ref>。現実には、実験ごとのバッチの違いによる影響（Batch effect）がscRNA-seqの最大の問題であると示されてきており、試料の処理を同時に行うなど実験デザインを工夫する必要がある<ref><pubmed>29121214</pubmed></ref>。<br />
<br />
また、ドロップレットを使用するscRNA-seqでしばしば問題になるのが、ドロップレットに２つ以上の細胞が封じ込められ、それらが同一のCell barcodeを持ってしまうアーティファクトである。通常「Doublet」「Multilet」と呼ばれるこの問題はデータ解析を混乱させるので、細胞単離の段階から注意する必要があるが、scRNA-seqデータ取得後にもデータ処理で解決できる可能性もある<ref><pubmed>30954476</pubmed></ref><ref><pubmed>30954475</pubmed></ref> <ref><pubmed>31693907</pubmed></ref><ref><pubmed>32592658</pubmed></ref> <ref><pubmed>29227470</pubmed></ref><ref><pubmed>31836005</pubmed></ref><ref><pubmed>31856883</pubmed></ref><ref><pubmed>30567574</pubmed></ref> <ref><pubmed>31266958</pubmed></ref><ref><pubmed>32366989</pubmed></ref><ref><pubmed>33338399</pubmed></ref>[https://doi.org/10.1101/2019.12.17.879304]。なお、この手法を利用することで、バッチ効果を抑えるために、異なるバーコードを持つ複数の試料を混ぜて一つの試料として扱い、計算機的に再び分離、解析する手法が注目されている<ref><pubmed>32483174</pubmed></ref>。<br />
<br />
scRNA-seqデータの次のノイズは、ある遺伝子の発現が低いために、本来同じタイプの細胞であっても、その遺伝子の発現が全く見られない「Dropout」と呼ばれる現象であり解析に影響を与えるので、これについても検討が必要である<ref><pubmed>24056876<br />
</pubmed></ref><ref><pubmed>32127540</pubmed></ref>。<br />
<br />
====次元圧縮====<br />
このような品質管理、ノーマライゼーションの過程を経て<ref><pubmed>28504683</pubmed></ref>、scRNA-seqのデータ解析において、最初に行うのが、[[次元圧縮]] (dimensionality reduction)である<ref><pubmed>30617341</pubmed></ref><ref><pubmed>31780648</pubmed></ref><ref><pubmed>31955711</pubmed></ref><ref><pubmed>31823809</pubmed></ref>。主成分分析 (Principal component analysis, PCA)、更に発展させた均一マニフォールド近似と投影(Uniform Manifold Approximation and Projection, UMAP)、Diffusion maps<ref><pubmed> 26002886<br />
</pubmed></ref>, t分布型確率的近傍埋込み (t-distributed Stochastic Neighbor Embedding, tSNE)などの手法が用いられる。 特に、[http://www.jmlr.org/papers/v9/vandermaaten08a.html tSNE]と[https://arxiv.org/abs/1802.03426 UMAP]は、高次元データを低次元の点の集合として可視化することで、それぞれの細胞の持つ遺伝子発現状態の類似度についての直観的な表示が可能でありしばしば用いられる（'''図3'''）。tSNEよりUMAPの方が迅速に類似集団間の関係が明確になるので、最近はUMAPを利用することが多くなってきている。次に、[[Louvainアルゴリズム]]などでクラスタリング（[[コミュニティ分割]]）を行いグラフ上に表示できる（'''図3'''の色分け）。こうして、異なる転写状態を示す細胞の集合が別のクラスターとして表示され、同定可能になる<ref><pubmed>31500660</pubmed></ref>。<br />
[[ファイル:scFig3.jpg|サムネイル|250px|'''図３． tSNEとUMAPによる同じデータの可視化'''<br>網膜（ニワトリ）の視細胞のデータを用いて執筆者が作製[https://doi.org/10.7554/eLife.63907]。]]<br />
<br />
==データ解析==<br />
===細胞クラスターの解釈とマーカー遺伝子候補の発見===<br />
scRNA-seqデータから得られる生物学的知見には、内在的に存在する細胞の種類、外部刺激や環境で変化した細胞の状態、そして種類や変化により特徴的に発現するマーカー遺伝子候補の発見がある<ref><pubmed>27824854</pubmed></ref><ref><pubmed>32033589</pubmed></ref>。クラスタリングにより、異なった細胞集団の存在が認識されると、それぞれのクラスター（群）に特徴的に発現している具体的な遺伝子を探索し、細胞集団の持つバイオマーカーによって、そのクラスター（群）の同定が可能になる。例えば、既に神経細胞とグリア細胞に特異的に発現する典型的マーカーはよく知られており、それぞれのクラスターの識別は容易である。更に、神経細胞のタイプ（下記参考）を区別できるマーカーや、外部刺激によって遺伝子発現状態が変化した神経細胞の状態は、In situ hybridizationや免疫組織化学などにより確認できる。このようなクラスターごとに発現が異なる遺伝子（差次的発現遺伝子）を見つけるためには（Differential expression analysis, DE analysis）、SeuratのFindMarkersコマンド中でも利用可能であるコード（MAST、DESeq2など<ref><pubmed>26653891</pubmed></ref><ref><pubmed>25516281</pubmed></ref><ref><pubmed>30658573</pubmed></ref>）を用いることができる。細胞ごとの差次的発現遺伝子のVisualization（表示可視化）には、[[ドットプロット]]（dot plot）、[[ヴァイオリンプロット]]（violin plot）、[[リッジプロット]]（Ridge plot, joy plot）、UMAPなどの次元圧縮図上に転写物量をプロットするFeatureプロット（feature plot）などが、目的に応じて頻繁に用いられる（'''図4'''）。<br />
[[ファイル:scFig4.jpg|サムネイル|300px|'''図４．scRNA-seqデータの可視化の例 '''<br>A. ドットプロット。B.ヴァイオリンプロット。C. リッジプロット。D. UMAP（灰色）に転写物量（青）をプロットした Featureプロット。網膜の視細胞のデータを用いて執筆者が作製[https://doi.org/10.7554/eLife.63907]。]]<br />
===擬時系列解析===<br />
実験的なノイズとは別に生物学的に意味のある遺伝子発現の変動には、位置情報、[[細胞周期]]、[[概日リズム]]、発現変動が大きい破裂型[[プロモーター]]の作動などの理由で 変動が見られるものもある<ref name=Luecken2019><pubmed>31217225</pubmed></ref><ref><pubmed> 26000846</pubmed></ref>。特に、刺激・薬剤処理やさまざまな病態の進行や治療に伴う細胞の変化、発生途上にある[[細胞系譜]]や[[細胞分化]]といった細胞の遷移状態の解析（[[軌道推定]]（Trajectory inference）；[[擬時系列解析]]（擬似時系列解析）、Pseudo-time analysis）には、scRNA-seqデータを用いることが効果的である<ref><pubmed>29576429</pubmed></ref><ref><pubmed>28813177</pubmed></ref><ref><pubmed>29565398</pubmed></ref>。しばしば用いられるMonocle3 <ref><pubmed>30787437</pubmed></ref>[https://cole-trapnell-lab.github.io/monocle3/]など、多くのコードを収集、比較しているサイトがある [https://dynverse.org][https://github.com/agitter/single-cell-pseudotime]。RNA velocityといったスプライシングされていく転写産物の量から細胞の分化状態を推定する方法もある<ref><pubmed>30089906</pubmed></ref><ref><pubmed> 32747759</pubmed></ref>。しかし、これらの方法は、あくまで細胞系譜や細胞分化の推定に過ぎない。細胞系譜を更に確実に観察しつつ、scRNA-seqを行うことで、細胞タイプの系統関係を調べる方法として、[[CRISPR-Cas9]]を用いた[[ゲノム編集]]による痕跡追跡記録法を導入したscGESTALT<ref><pubmed>29608178</pubmed></ref>、ScarTrace<ref><pubmed>29590089</pubmed></ref> 、LINNAEUS<ref><pubmed>29644996</pubmed></ref>、あるいはアデノシンデアミナーゼでRNA編集を行いタイムスタンプを入れる方法<ref><pubmed>33077959</pubmed></ref>がある。[[1塩基バリアント]]（Single-nucleotide variants: SNV）の系統的解析は、細胞の不均一性や系統的な関係を明らかにするための最も有望なアプローチの一つである<ref><pubmed>31744515</pubmed></ref>。<br />
===遺伝子制御ネットワーク、パスウェイ解析など===<br />
また細胞分化や刺激などによる変動に伴う特徴的な遺伝子発現状態をscRNA-seqで観察することは、[[遺伝子制御ネットワーク]]（例、[https://github.com/aertslab/SCENIC SCENIC]<ref><pubmed>28991892</pubmed></ref>）、[[代謝経路]]や[[シグナル伝達系]]のための[[パスウェイ解析]](例、Metascape<ref><pubmed>30944313</pubmed></ref>, [http://metascape.org]、Gene Ontolgoy[http://geneontology.org])を理解するシステム生物学的な研究として有用である<ref><pubmed>32051003</pubmed></ref>。更に、scRNA-seqで得られた結果をもとに、細胞間相互作用の理解を深めるのを目的とするCellPhoneDB<ref><pubmed>32103204</pubmed></ref>[https://github.com/Teichlab/cellphonedb]、NicheNet<ref><pubmed>3181926</pubmed></ref>、SVCA<ref><pubmed>31577949</pubmed></ref>などがある。特に、Perturb-seq<ref><pubmed>27984732</pubmed></ref> やその変法<ref><pubmed> 32231336</pubmed></ref>は、CRISPRライブラリーによるゲノム編集を施した細胞をscRNA-seqで解析することで、ゲノム編集で破壊された遺伝子の機能や遺伝子間の相互作用の理解を可能にしている後述する複数モダリティ情報を取り込んだscRNA-seqの１つであり、注目されている。<br />
<br />
==神経科学研究への適用==<br />
===神経系細胞ビッグデータとしてのscRNA-seq===<br />
様々な神経・精神疾患について理解しその診断や治療に役立てるためには、神経細胞、[[グリア細胞]]を中心にした神経系にある細胞の種類や状態を識別し、それぞれの細胞における分子的な変化を観察することが重要である <ref><pubmed>28775344</pubmed></ref><ref><pubmed>29738987</pubmed></ref>。本項目で解説してきたscRNA-seq技術は、神経系に見られるそれぞれの細胞のトランスクリプトームについて[[ビッグデータ]]を提供することで、この細胞の種類や状態の識別に新たな判断材料を与えつつある。近年、中枢神経系の[[アストロサイト]]、[[オリゴデンドロサイト]]、[[ミクログリア]]といった[[グリア細胞]]も均一ではなく、内在的な多様性や外部因子による状態の変動が報告されてきている。神経細胞は、著しく多様であり、この多様性が神経系の多彩で複雑な機能発現の基盤となっている。従来の神経科学では、神経細胞の多様性は、それぞれの神経細胞の解剖学的な位置、発現している分子、電気生理学、結合性、形態、神経伝達物質、神経伝達物質受容体とシグナル伝達によって識別されてきている。こうした神経細胞の多様性を便宜的に記述するのに、タイプ（type）、クラス（class）、サブクラス（subclass）、サブタイプ（subtype） というような用語が用いられてきた。しかし、ここでは混乱を防ぐため、Masland（2004）<ref><pubmed>15242626</pubmed></ref>が提唱し、広く受けいれられている「クラス」と「タイプ」という単語を用いることとする<ref name=Yuste2020><pubmed>32839617</pubmed></ref>。タイプは、これ以上分類することができないとされる階層であり、共通性を持つタイプの集団がクラスである。例えば、[[大脳皮質]]の[[錐体細胞]]、[[網膜神経節細胞]]といった大雑把な区分はクラスである。大脳皮質の錐体細胞というクラスは、層や領野によって異なるタイプ、網膜神経節細胞には視覚情報に対して応答が異なるタイプが存在する。scRNA-seqは、「タイプ」の理解に新たな視点を提供している。<br />
===神経系へのscRNA-seqの適用===<br />
scRNA-seqの神経系での利用については、次々と新しい論文やプレプリントが発表されており、ここではscRNA-seqで得られてきた情報の典型例を紹介することにとどめる。<br />
<br />
大脳皮質には、錐体細胞や[[非錐体細胞]]などの神経細胞や様々なグリア細胞などが見られ、古くから神経細胞タイプの識別が行われてきた。初期のFluidigm C1を用いたscRNA-seq技術でも、マウス皮質の小規模な細胞数を分類した研究で、これまで知られていた主要な神経細胞タイプとは違うタイプが見つかりscRNA-seqの有効性が示された<ref><pubmed>25700174</pubmed></ref>。その後のドロップレット使用の3’エンドリード法を利用した多数の細胞数の解析で、更に多数の神経細胞のタイプが見つかっている<ref name=Yuste2020><pubmed>32839617</pubmed></ref><ref name=Habib2017><pubmed>28846088</pubmed></ref><ref><pubmed>30096299</pubmed></ref><ref><pubmed>30096314</pubmed></ref><ref><pubmed>30382198</pubmed></ref><ref><pubmed>29320739</pubmed></ref><ref><pubmed>33338423</pubmed></ref>[https://doi.org/10.1101/2020.06.04.105700] [https://doi.org/10.1101/2020.07.02.184051]。特に、[[GABA]]作動性[[介在神経細胞]]タイプの多様性とその発生<ref><pubmed>28942923</pubmed></ref><ref><pubmed>28134272</pubmed></ref><ref><pubmed>29472441</pubmed></ref><ref><pubmed>29513653</pubmed></ref>についての、これまでの組織化学的な研究からは得られていなかった多くの情報は重要であろう。また、初期の発生過程<ref><pubmed>26940868</pubmed></ref><ref><pubmed>30485812</pubmed></ref><ref><pubmed>31073041</pubmed></ref><ref><pubmed>30635555</pubmed></ref><ref><pubmed>30625322</pubmed></ref>、老化<ref><pubmed>31551601</pubmed></ref>の理解が、scRNA-seq技術を利用することで進んでいる。更に、[[神経活動]]や[[臨界期]]に伴い変化するmRNAも細胞ごとに調査され興味深い<ref><pubmed>29230054</pubmed></ref> <ref><pubmed>32404418</pubmed></ref>。<br />
<br />
ヒトを含めた[[霊長類]]の大脳についても発達段階を含めてscRNA-seqが適用されてきている<ref><pubmed>26060301</pubmed></ref><ref><pubmed>27339989</pubmed></ref><ref name=Zhong2018><pubmed>29539641</pubmed></ref><ref name=Nowakowski2017><pubmed>29217575</pubmed></ref><ref name=Habib2017><pubmed>28846088</pubmed></ref><ref><pubmed>29227469</pubmed></ref><ref><pubmed>31303374</pubmed></ref><ref><pubmed>29867213</pubmed></ref><ref><pubmed>31435019</pubmed></ref><ref><pubmed>32424074</pubmed></ref> <ref><pubmed>32999462</pubmed></ref>[https://doi.org/10.1101/2020.03.31.016972][https://doi.org/10.1101/2020.04.23.056390]。ヒトや霊長類に特徴的とされる[[島]]の[[von Economo神経細胞]]（[[紡錘細胞]]）のような希少な神経細胞のscRNA-seqにも成功している<ref><pubmed>32127543</pubmed></ref>。<br />
<br />
[[海馬]]<ref><pubmed>29241552</pubmed></ref><ref><pubmed>29912866</pubmed></ref><ref><pubmed>29335606</pubmed></ref><ref><pubmed>31942070</pubmed></ref>では、これまでの研究で記載されてきた神経細胞のタイプの存在が確認され、更に新規のタイプが見つかった。中枢神経系では、その他、[[外側膝状体]]<ref><pubmed>29343640</pubmed></ref>、[[大脳基底核]]<ref><pubmed>28384468</pubmed></ref>、[[視床下部]]<ref><pubmed>28166221</pubmed></ref><ref><pubmed>28355573</pubmed></ref> <ref><pubmed>27991900</pubmed></ref><ref name=Moffitt2018><pubmed>30385464</pubmed></ref> <ref><pubmed>31249056</pubmed></ref><ref><pubmed>30858605</pubmed></ref>、[[線条体]]<ref><pubmed>27425622</pubmed></ref><ref><pubmed>30134177</pubmed></ref><ref><pubmed>31875543</pubmed></ref>、[[中脳]]<ref><pubmed>27716510</pubmed></ref><ref><pubmed>29499164</pubmed></ref><ref><pubmed>30718509</pubmed></ref>、[[手綱核]]<ref><pubmed>29576475</pubmed></ref>、発生中の[[間脳]]<ref><pubmed>30872278</pubmed></ref> 、さらに[[小脳]]<ref><pubmed>30220501</pubmed></ref><ref><pubmed>30735127</pubmed></ref><ref><pubmed>30690467</pubmed></ref>などの結果が報告されてきている。例えば、構成する細胞についての情報が詳細に研究されてきたと思われていたマウスの小脳においても、分子層にこれまでの[[星状細胞]]、[[バスケット細胞]]というカテゴリーとは違った[[ギャップジャンクション]]に特徴を持つ２種類の神経細胞があることが示唆されている<ref><pubmed>24259518</pubmed></ref>。<br />
<br />
脳の外部では、[[運動神経]][https://doi.org/10.1101/2020.03.16.992958]、[[感覚神経]]<ref><pubmed>25420068</pubmed></ref><ref><pubmed>26691752</pubmed></ref>、[[らせん神経節]]<ref><pubmed>30078709</pubmed></ref><ref><pubmed>30209249</pubmed></ref> 、[[嗅覚神経]]<ref><pubmed>26541607</pubmed></ref><ref><pubmed>32059767</pubmed></ref>、[[腸神経系]] <ref><pubmed>29483303</pubmed></ref><ref><pubmed>33288908</pubmed></ref>、[[網膜]]<ref><pubmed>27565351</pubmed></ref><ref name=Konstantinides2018><pubmed>29909983</pubmed></ref><ref><pubmed>30018341</pubmed></ref><ref><pubmed>31260032</pubmed></ref><ref><pubmed>31128945</pubmed></ref><ref name=Peng2019><pubmed>30712875</pubmed></ref><ref><pubmed>30548510</pubmed></ref><ref><pubmed>31075224</pubmed></ref><ref><pubmed>31399471</pubmed></ref><ref><pubmed>31848347</pubmed></ref><ref><pubmed>31673015</pubmed></ref><ref><pubmed>31653841</pubmed></ref><ref><pubmed>31784286</pubmed></ref>[https://doi.org/10.1101/2020.02.26.966093]<ref><pubmed>32386599</pubmed></ref>[https://www.biorxiv.org/content/10.1101/617555v2][https://doi.org/10.7554/eLife.63907]<ref>'''Shekhar K, Sanes JR (2021)'''.<br>Generating and using transcriptomically based retinal cell atlases. Annu Rev Vis Sci 7: (in press)</ref>でのscRNA-seqデータがある。<br />
<br />
また[[iPS細胞]]や[[ES細胞]]由来の神経組織[[オルガノイド]]に含まれる神経細胞タイプを知る上でも利用されている<ref><pubmed>28094016</pubmed></ref><ref><pubmed>28279351</pubmed></ref><ref><pubmed>31168097</pubmed></ref><ref><pubmed>31996853</pubmed></ref><ref><pubmed>31968264</pubmed></ref><ref><pubmed>32221280</pubmed></ref>。このようなアプローチは、[[ネアンデルタール人]]型の遺伝子を持つ脳オルガノイドの解析<ref><pubmed> 32559457</pubmed></ref>やSARS-CoV-2に感染する脳オルガノイド中の細胞の同定<ref><pubmed> 33113348</pubmed></ref>など、新たな応用例が発表されてきており興味深い。<br />
<br />
===神経細胞以外の細胞===<br />
[[上衣細胞]]<ref><pubmed>29727663</pubmed></ref>は、[[神経幹細胞]]としての役割が示唆されてきたが、scRNA-seqによる解析ではその可能性が支持されなかった。グリア細胞では、[[ラジアルグリア]]<ref><pubmed>26406371</pubmed></ref><ref><pubmed>25734491</pubmed></ref><ref><pubmed>29281841</pubmed></ref><ref name=Nowakowski2017><pubmed>29217575</pubmed></ref><ref name=Zhong2018><pubmed>29539641</pubmed></ref>、アストロサイト<ref><pubmed>32139688</pubmed></ref><ref><pubmed>32203496</pubmed></ref>[https://doi.org/10.1101/2020.04.27.064881]に多様性があることが示唆されてきている。また、オリゴデンドロサイト<ref><pubmed>27284195</pubmed></ref><ref><pubmed>30078729</pubmed></ref><ref name=Avey2018><pubmed>30257220</pubmed></ref><ref name=Jäkel2019><pubmed>30747918</pubmed></ref><ref><pubmed>31958186</pubmed></ref>[https://doi.org/10.1101/2020.03.06.981373]については、これまで細胞生物学的に研究されてきた分化の過程がscRNA-seqにより詳細に解析されている。ミクログリアは、神経系の発達、老化、損傷などに伴う重要な遺伝子発現状態の変化がscRNA-seqにより詳細に明らかになった<ref><pubmed>27338705</pubmed></ref><ref name=Mathys2017><pubmed>29020624</pubmed></ref><ref><pubmed>30206190</pubmed></ref><ref name=Hammond2019><pubmed>30471926</pubmed></ref><ref><pubmed>31209379</pubmed></ref><ref><pubmed>31835035</pubmed></ref>。また、[[CNS境界関連マクロファージ]](BAM) <ref><pubmed>31061494</pubmed></ref>や[[脳血管系]]<ref><pubmed>29443965</pubmed></ref>のscRNA-seqも実施されている。<br />
===疾患===<br />
scRNA-seqは、疾患の理解にも有用である。scRNA-seqでは、疾患に伴う遺伝子発現状態の変化を細胞タイプごとに観察することができるので、バルクRNA-seqでは埋もれていた遺伝子発現状態の変化や細胞ごとの変化を検出できるという長所がある。<br />
例えば、[[筋萎縮性側索硬化症]]<ref name=Maniatis2019><pubmed>30948552</pubmed></ref>、[[多発性硬化症]]<ref name=Jäkel2019><pubmed>30747918</pubmed></ref><ref><pubmed>30420755</pubmed></ref><ref><pubmed>32313246</pubmed></ref>、[[アルツハイマー病]]やそのモデル動物<ref><pubmed>31042697</pubmed></ref><ref><pubmed>31399126</pubmed></ref><ref name=Mathys2017><pubmed>29020624</pubmed></ref><br />
[https://doi.org/10.1101/628347]<ref><pubmed>28602351</pubmed></ref><ref><pubmed>32341542</pubmed></ref>、[[統合失調症]]<ref><pubmed>29785013</pubmed></ref><ref><pubmed>32203495</pubmed></ref>、[[てんかん]]<ref><pubmed> 33028830</pubmed></ref>、[[自閉症]]や[[レット症候群]]<ref><pubmed>31097668</pubmed></ref><ref><pubmed>30455458</pubmed></ref>、[[シャルコー・マリー・トゥース病]]<ref><pubmed>29888333</pubmed></ref>、[[ダウン症]][https://www.biorxiv.org/content/10.1101/2020.01.01.892398v1]、[[パーキンソン病]]<ref><pubmed>30503143</pubmed></ref><ref><pubmed>32826893</pubmed></ref>、[[ハンチントン病]]<ref><pubmed>32070434</pubmed></ref>、[[がん]]<ref><pubmed>31327527</pubmed></ref><ref><pubmed>28360267</pubmed></ref>などに適用されている。最近、Perturb-seqにより、[[自閉症]]に関わる遺伝子の欠損に伴う細胞状態の変化などもscRNA-seqで報告されており<ref><pubmed>33243861</pubmed></ref>、疾患の理解のための新たな実験系の開発も始まりつつある。<br />
==scRNA-seqの展望==<br />
===神経系の多様性と進化===<br />
NGSを用いることで、どんな生物種にも適用可能なscRNA-seqは、既に多様な生物の神経系の細胞の理解、更には種間の相同性や差異の研究に利用されており、神経系の進化を細胞レベルで考察するのに有用であろう（例、[[線虫]]<ref name=Cao2017><pubmed>28818938</pubmed></ref>、[[ショウジョウバエ]]<ref><pubmed>29909982</pubmed></ref><ref><pubmed>29149607</pubmed></ref><ref><pubmed>30703584</pubmed></ref><ref name=Konstantinides2018><pubmed>29909983</pubmed></ref><ref><pubmed>33125872</pubmed></ref>、[[カタユウレイボヤ]]''Ciona intestinalis''<ref><pubmed>30069052</pubmed></ref><ref><pubmed>30228204</pubmed></ref>、[[ゼブラフィッシュ]]<ref><pubmed>31018142</pubmed></ref><ref><pubmed>30929901</pubmed></ref>、[[アカミミガメ]]''Trachemys scripta elegans''、[[トカゲ]]''Pogona vitticeps'', PV<ref><pubmed>29724907</pubmed></ref>、[[ニワトリ]][https://doi.org/10.1101/2020.10.09.333633]、[[霊長類]]<ref><pubmed>30730291</pubmed></ref><ref><pubmed>31619793</pubmed></ref>[https://doi.org/10.1101/2020.03.31.016972]）。ただ、遺伝子やトランスクリプトームの研究が進んでいる生物種では比較的容易であるが、遺伝子のアノテーションが十分でない生物種を用いる場合、scRNA-seqのデータ解析は困難を伴う。また種を超えた細胞タイプの相同性の理解には様々な工夫が必要である<ref><pubmed>31552245</pubmed></ref><ref name=Peng2019><pubmed>30712875</pubmed></ref>[https://doi.org/10.1101/2020.03.31.016972]。<br />
===データベースと統合===<br />
獲得されたscRNA-seqのデータは様々な目的で利用できるので、データベース化し利用できるようにする必要がある。神経系のトランスクリプトーム一般のデータベースが多数公開されており<ref><pubmed>29437890</pubmed></ref>、scRNA-seqのデータも基本的にNCBIの[https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/ Gene Expression Omnibus]に登録されている。また、オープンサイエンス推進のためにcommon coordinate framework (CCF) やcentral annotation platform (CAP)という概念のもと、特にscRNA-seqを意識したものとして、米国のBRAIN Initiative Cell Census Consortium<ref><pubmed>29096072</pubmed></ref>、Human Cell Atlas Projectの[https://data.humancellatlas.org Human Cell Atlas Data Portal]、そのマウス版である[https://genome.ucsc.edu/cgi-bin/hgTrackUi?db=mm10&g=tabulaMuris Tabula Muris]<ref><pubmed>30283141</pubmed></ref>やSten Linnarssonラボの[http://mousebrain.org マウス脳発生データベース]、アレン脳研究所の[https://portal.brain-map.org Allen Brain Atlas]、ブロード研究所の[https://singlecell.broadinstitute.org/ Single Cell Portal]などのデータベースが稼働している。また、異なった方法や実験で得られたscRNA-seqのデータや後述の複数モダリティのシングルセルオミクスのデータを体系的に比較することも重要であり、CCA (Canonical correlation analysis)<ref name=Butler2018><pubmed>29608179</pubmed></ref>, Seurat 3.0以降に組み込まれたMMN (Mutual Nearest Neighbors)、LIGER<ref><pubmed>31178122</pubmed></ref> 、Harmony<ref><pubmed>31740819</pubmed></ref> 、MetaNeighber<ref><pubmed>29491377</pubmed></ref>、Conos<ref><pubmed>31308548</pubmed></ref>[https://doi.org/10.1101/2020.05.22.111161]のようなアルゴリズムが開発され、後述の複数モダリティのシングルセルオミクスを組み込んだ[https://biccn.org 統合サイト]もでき始めている。またデータベースを利用して発現類似性検索も研究されている<ref><pubmed>29608555</pubmed></ref><ref><pubmed>30744683</pubmed></ref>。<br />
===空間トランスクリプトミクス===<br />
多数の細胞を扱うscRNA-seqの弱点は、組織から細胞や細胞核を解離する必要があるので、その細胞が存在していた解剖学的あるいは空間的な位置の情報を消去してしまうということである。組織切片におけるタンパク質などの分布は[[免疫組織化学]]、mRNAの分布はin situ hybridizationで検出することができるが、数多くのmRNAの分布を情報処理技術と組み合わせ一気に同定する方法がscRNA-seqと同様に開発されてきている（Slide-seq<ref><pubmed>30923225</pubmed></ref><ref><pubmed> 33288904</pubmed></ref>、HDST<ref><pubmed>31501547</pubmed></ref>、Expansion sequencing[http://doi.org/10.1101/2020.05.13.094268]など<ref><pubmed>27365449</pubmed></ref>, <ref><pubmed>31932730</pubmed></ref><ref name=Maniatis2019><pubmed>30948552</pubmed></ref>）、更に10x Genomics社が市販するVisium（現時点ではシングルセルレベルではない）などがある。現状では、大きな組織の空間トランスクリプトミクスは、空間解像度は限定されており、技術普及の観点からも課題が多い。しかし、そのデータを解析するためのアルゴリズム<ref><pubmed>29553578</pubmed></ref><ref><pubmed>29553579</pubmed></ref><ref><pubmed>32350282</pubmed></ref>[https://doi.org/10.1101/757096][https://doi.org/10.1101/701680][https://doi.org/10.1101/431957]、更にMerFish <ref><pubmed>25858977</pubmed></ref>、corrFISH<ref><pubmed>27271198</pubmed></ref>のように、subcellularレベルで多数のmRNAを検出する方法が多数開発されてきており（<ref><pubmed>25549890</pubmed></ref> osmFISH<ref><pubmed>30377364</pubmed></ref>、STARmap (spatially-resolved transcript amplicon readout mapping) <ref><pubmed>29930089</pubmed></ref>、seqFISH+<ref><pubmed>27764670</pubmed></ref>、pciSeq(probabilistic cell typing by in situ sequencing)[https://doi.org/10.1101/431957]、DSP(Digital Spatial Profiling) <ref><pubmed>32393914</pubmed></ref>、scRNA-seqと組み合わせることで、その弱点を補う空間トランスクリプトミクスにも利用され始め<ref name=Moffitt2018><pubmed>30385464</pubmed></ref>[https://doi.org/10.1101/2020.06.04.105700]、今後の発展が期待される分野である<ref><pubmed>32702314</pubmed></ref>。<br />
===統合解析 ===<br />
同一の細胞からscRNA-seqの情報だけでなく、ゲノム配列、ATAC-seqなどによる[[エピゲノム]]解析、少数のタンパク質、あるいは[[プロテオーム]]など複数のモダリティを同時に観察するオミクス（Single-cell multimodal omics）が注目されている<ref><pubmed>31907462</pubmed></ref><ref><pubmed>30696980</pubmed></ref>。2019年には、Nature Methodsの「Methods of the Year」に選ばれており、現状については、その特集号などを参考にされたい。例えば、細胞表面に提示されているマーカー分子に対する抗体にDNAを付加することで、そのマーカーを発現する細胞のトランスクリプトームを解析するCITE-seq<ref><pubmed>28759029</pubmed></ref>、 REAP-seq<ref><pubmed>28854175</pubmed></ref>も、既知の細胞表面マーカーの発現とscRNA-seqが同時に観察できる方法である。<br />
<br />
複数モダリティのシングルセルオミクスとして、神経科学分野で注目されるのは、scRNA-seqを[[パッチクランプ]]による電気生理学的情報と組み合わせたPatch-seq<ref><pubmed>26689544</pubmed></ref> <ref><pubmed>26689543</pubmed></ref>である。また、ゲノムDNAとscRNA-seqを同時に観察することによって、近年、精神疾患の観点から注目されている発生途中で生じる遺伝子変異を研究するPRDD-seqは今後の展開が注目される<ref><pubmed> 32522880</pubmed></ref>。最後に、BARseq (barcoded anatomy resolved by sequencing) <ref><pubmed>31626774</pubmed></ref>、CONNECTID[https://doi.org/10.1101/378760]、Epi-Retro-seq<ref><pubmed>30276807</pubmed></ref>のような方法は、[[コネクトーム]]（神経細胞の結合性）と遺伝子発現状態を記録できるオミクスの新たな方向として興味深い。<br />
== 関連項目 ==<br />
*[[ゲノムワイド関連解析 ]]<br />
*[[ディファレンシャルディスプレイ ]]<br />
*[[In situハイブリダイゼーション法 ]]<br />
*[[免疫組織化学法]]<br />
*[[エピジェネティクス]]<br />
*[[コネクトーム]]<br />
== 参考文献 ==<br />
<references /></div>
Masahitoyamagata
https://bsd.neuroinf.jp/w/index.php?title=%E3%82%B7%E3%83%B3%E3%82%B0%E3%83%AB%E3%82%BB%E3%83%ABRNA%E3%82%B7%E3%83%BC%E3%82%B1%E3%83%B3%E3%82%B7%E3%83%B3%E3%82%B0&diff=45395
シングルセルRNAシーケンシング
2020-12-19T20:24:28Z
<p>Masahitoyamagata: </p>
<hr />
<div><div align="right"> <br />
<font size="+1">[http://researchmap.jp/yamagatm 山形方人]</font><br><br />
''Harvard University''<br><br />
DOI：<selfdoi /> 原稿受付日：年月日 原稿完成日：年月日<br><br />
担当編集委員：<br><br />
</div><br />
英：single-cell RNA sequencing, scRNA-seq<br />
{{box|text=<br />
シングルセルRNAシーケンシング(single-cell RNA sequencing, 以下scRNA-seq)は、[[次世代シーケンサー]]（next generation sequencer、以下NGS）を用いることで、個々の細胞が保持しているmRNA全体を質的、量的に網羅的に調べる方法である。次元圧縮などの数理的な解析と組み合わせることで、遺伝子発現の状態に基づいた細胞の分類を行うことが可能であり、従来の組織学的、あるいは細胞生物学的手法では知られなかった新規の細胞種の同定や細胞状態の推定を行うことが可能になった。また、遺伝子発現プロファイルの変化に基づく擬時系列解析(pseudotime analysis)によって、刺激や発生に伴う細胞状態の遷移の描写ができる。神経系では、この方法により、神経細胞や非神経細胞の分類や状態についての知見が深まり、新しい神経細胞タイプ、細胞マーカー、病態の理解、更に機能的な遺伝子の同定などが系統的かつ網羅的に行われるようになった。scRNA-seqに、空間的情報、エピゲノム情報、タンパク質情報などの複数モダリティを取り入れた統合解析（multimodal single-cell omics）も行われている。<br />
}}<br />
<br />
==scRNA-seqの背景==<br />
===トランスクリプトーム===<br />
トランスクリプトーム（transcriptome）は、細胞中に存在する全ての転写産物（タンパク質をコードするmRNA、タンパク質をコードしない[[ノンコーディングRNA]]、[[マイクロRNA]]など）の総体である<ref><pubmed>19015660</pubmed></ref><ref><pubmed>31341269 </pubmed></ref>。トランスクリプトームは、[[ゲノム]]とは異なり、同一の個体でも、組織ごとに、更には発生段階や細胞外環境や刺激によって変化する。トランスクリプトームは、同質あるいは異質の多数の細胞集団（組織、培養細胞）からRNA抽出後、cDNAに変換し、それを1990年代に出現した[[DNAマイクロアレイ]]のように数多くの既知mRNAを識別する技術によって解析されるようになった。その後、NGSの利用により、希少mRNAやノンコーディングRNAを含めた未知の転写産物の高感度検出が可能になるとともに、[[スプライシング]]で成熟していく過程のmRNAなど、転写産物の種類だけでなく、転写産物の構造的差異（スプライシングバリアント、SNPs、変異など）の解析もできるようになった。加えて、ヒトやモデル実験生物（[[マウス]]、[[ゼブラフィッシュ]]、[[ショウジョウバエ]]、[[線虫]]など）だけでなく、多種多様な生物のトランスクリプトームの把握も可能になった。従来から行われてきた組織全体などの多数の細胞を対象としたRNA-seq（バルクRNA-seq）では、複数の細胞における転写産物の平均を観察しているが、本項目では個々の細胞における転写産物を解析するscRNA-seqの原理とその応用について概説する。<br />
<br />
===scRNA-seqとその開発史===<br />
1つの細胞の持つ生体物質を解明し、定量しようとする試みは古くからあった。1960年代になると、フローサイトメトリーを利用した[[蛍光活性化セルソーティング]]（Fluorescence-activated cell sorting, FACS）が発明され、標識抗体などのプローブと組み合わせることで、多数の細胞集団の中で１つの細胞が保持している生体分子の種類や量についての断片的な研究が可能になり、この方法は現在でも汎用されている<ref><pubmed>22271369</pubmed></ref>。その後、[[免疫組織化学]]や[[in situ hybridization]]nなどにより、タンパク質やmRNAの種類や量が観察できるようになり、組織中に存在するそれぞれの細胞の同定などに活用されてきている。最近では、それぞれの細胞が持つ抗原分子を、異なった金属イオンで標識した抗体とフローサイトメトリーを組み合わせた方法で検出する[[マスサイトメトリー]]（CyTOFなど）も開発されてきている<ref><pubmed>27153492</pubmed></ref>。<br />
<br />
細胞種にもよるが、1つの細胞内にある全RNA（ribosomal RNAを含む）は細胞種にもよるが1-50pgである。そのうち、mRNAの占める割合は1-5%程度である<ref><pubmed>15239941</pubmed></ref>。この微量のmRNAをcDNAに変換してから大幅に増幅できる方法が発明されたことで、1つの細胞が発現するmRNAを高感度で検出できるようになった<ref><pubmed>1557406</pubmed></ref><ref><pubmed>7541630</pubmed></ref> 。例えば、1991年、Linda BuckとRichard Axelは、[[嗅覚受容体]]が[[Gタンパク質]]であると仮定し、個々の嗅覚細胞で特異的に観察されるGタンパク質mRNAを比較することで、嗅覚受容体の同定に成功した<ref><pubmed>1840504</pubmed></ref>。1995年になると、Catherine DulacとRichard Axelは、異なる[[鋤鼻神経細胞]]で特異的に発現する遺伝子を１つの細胞から作製したcDNAライブラリーを比較するディファレンシャル・スクリーニングを行うことで、[[フェロモン受容体]]を同定した<ref><pubmed>7585937</pubmed></ref>。同じ手法で異なる種類の神経細胞で発現している遺伝子も同定され<ref><pubmed>9778248</pubmed></ref><ref><pubmed>12230981</pubmed></ref>、１つの細胞の持つトランスクリプトームを比較するアプローチが神経細胞で特徴的に発現している遺伝子の同定に効果的なことが示された。<br />
<br />
一方で多くの種類のmRNAを１細胞レベルで一挙に観察するための技術には感度やスループット、そしてコストの観点からブレークスルーが待たれた。1つの問題は多種類のcDNAを簡便に識別することを可能にする方法の開発であった。これを可能にしたのが、[[PCR]]などのcDNA増幅法の改良とマイクロアレイの利用であった<ref><pubmed>12736331</pubmed></ref><ref><pubmed>16547197</pubmed></ref>。しかしながら、細胞ごとに高価なマイクロアレイを使用することは、多数の細胞のトランスクリプトームの観察には限界があった。2009年になると、これらの問題を解決できる可能性として、NGSを利用するscRNA-seqプロトコールがAzim Suraniのグループによって報告された<ref><pubmed>19349980</pubmed></ref>。しかしながら、多数のマイクロアレイでなく1回のNGS使用で済ませることができるものの、この報告でもわずか8個の細胞の解析に留まっており、1つの細胞ごとに処理を行うという操作が必要で、多数の細胞についてのトランスクリプームを一挙に理解することはできなかった。また、塩基配列の違うcDNAごとにPCR効率に差がある結果生じる増幅バイアス、また3’末端側が選択的に補足されることなどの課題があった。<br />
<br />
==scRNA-seqの現状==<br />
===scRNA-seqの分子生物学的反応=== <br />
その後、5’末端側の領域まで効率よく増幅するscRNA-seqのプロトコールが考案された<ref><pubmed>32518403</pubmed></ref>。特に、SMART-seq（Switching mechanism at the 5' End of RNA Templates）<ref><pubmed>22820318</pubmed></ref>およびその改良されたプロトコールであるSMART-seq2<ref><pubmed>24056875</pubmed></ref> <ref><pubmed>24385147</pubmed></ref>の使用例が多い（既に、SMART-seq3という改良プロトコールもある<ref><pubmed>32518404</pubmed></ref>が、以下SMART-seqと呼ぶ）。また、類似法としてSTRT（single-cell tagged reverse transcription）<ref><pubmed>21543516</pubmed></ref>などがある。<br />
<br />
一方、CEL-seq（Cell Expression by Linear amplification and Sequencing）<ref><pubmed>22939981</pubmed></ref>、CEL-seq2<ref><pubmed> 27121950 </pubmed></ref> 、MARS-seq（Massively parallel single-cell RNA-seq）<ref><pubmed>24531970 </pubmed></ref>では、[[T7 RNAポリメラーゼ]]による[[in vitro転写]]を用いることにより、ＰＣＲによる増幅で見られるバイアスを低減させようとしている。<br />
<br />
また、Quartz-SeqやQuartz-Seq2ではPCR用のアダプターを付加する反応にポリAテーリングを利用することで、他の手法と比較して1.5-5倍程度の遺伝子を検出できる<ref><pubmed> 32518403</pubmed></ref>。<br />
===バーコード技術 ===<br />
増幅バイアス除去のアプローチとして特に重要なのは、2011年に発表された核酸配列バーコードを利用した方法で、分子識別子（unique molecular identifiers: UMI）を持つcDNAを増幅させ、NGS後の情報処理を用いるものであると考えられる<ref><pubmed>22101854</pubmed></ref>。この方法では逆転写反応の際、ランダム塩基配列から構成されるUMIをcDNA末端に付加した後、増幅反応、NGSを行い、cDNA配列とUMI配列の両方を読む。cDNAにはRNA1分子に1つのUMIが付加されるので、同一のUMIを持っていれば、逆転写時に同一のcDNA由来とカウントする。UMIをカウントすることで、増幅前のmRNAのコピー数を知ることができる<ref><pubmed>21543516</pubmed></ref><ref><pubmed>24363023</pubmed></ref><ref><pubmed>28192419</pubmed></ref> <ref><pubmed>29474909</pubmed></ref><ref><pubmed> 28818938 </pubmed></ref><ref><pubmed>29545511</pubmed></ref>。<br />
===多様なプラットフォーム===<br />
細胞を分別するプラットフォームには、マイクロピペットによる捕獲、セルソーター、[[レーザー捕獲]]などを用いるマルチウェル法、あるいは半導体集積回路様の製作技術で作った流体回路を利用するFluidigm C1の装置（C1 Single- Cell Auto Prep<br />
）[https://jp.fluidigm.com] 、更にドロップレット使用（下記）などがある<ref><pubmed>30405621</pubmed></ref>[https://doi.org/10.1101/742304]。これらは、SMART-seqと組み合わせて利用されることが多い。SMART-seqプロトコールの特徴は、全長mRNAのトランスクリプトーム情報を得ることができることであり、mRNAのスプライシングバリアントなどのアイソフォーム、SNPsの情報を利用したアリル特異的発現、変異の検出にも利用できる。また、それぞれ細胞ごとの反応を独立した場所で行うため、反応中に別の細胞の反応と混じる可能性が低い。小型のナノウェルを用いるSeq-Wellも同様に反応自体が混じる可能性が低い<ref><pubmed>28192419</pubmed></ref>。これらの点が、次に説明するドロップレットを使用して3’末端のみを標的にしたscRNA-seqと比べた場合の長所であるが、その高コスト（1細胞あたり数十ドル）と処理可能な細胞数の少なさが短所である。<br />
<br />
これらとは別に、ハイスループットで安価な方法として、それぞれの細胞を独立に標識するのではなく、プールされた細胞を異なるウェルにランダムに振り分け、ウェル固有のバーコードで転写物を標識していく操作を複数回繰り返していくことで細胞を区別するSplit-seqやsci-RNA-seq3などの方法も用いられている<ref><pubmed>29545511</pubmed></ref><ref><pubmed>30787437</pubmed></ref>。<br />
===ドロップレット使用の3’エンドリード法===<br />
scRNA-seqのプラットフォームと方法について重要と考えられる進歩は、2015年、Harvard Medical Schoolの独立した２つのグループが、inDrops<ref><pubmed>26000487</pubmed></ref>そしてDrop-seq<ref><pubmed>26000488 </pubmed></ref>という類似した2つのハイスループットな方法を開発したことであろう（inDropsはT7RNAポリメラーゼ、Drop-seqはPCRで増幅）。これらの方法では、[[マイクロ流体力学]] (Microfluidics) 、 UMI（上述）と細胞ごとのバーコード（Cell Barcode）という2種類のDNAバーコーディング、そしてNGSと情報解析法を利用している。そして、多く細胞のサンプル調製の自動化と容易さから、1つの細胞あたりに要するコストを大幅に低下させることに成功した（Drop-seqは発表時で、１細胞あたり約5セント）。つまり、細胞1つずつをマイクロ流体力学によるエマルジョン作製技術を利用した装置に流入させ、その１細胞を1つのドロップレットに自動的に閉じ込める。そのドロップレット中には、ドロップレットごとにCell barcode/UMIとしてユニークなDNAバーコードを持つゲルビーズ(Gel Beads in Emulsion, GEMs)が入っており、それを足場に3’末端のみを標的にしたcDNA合成反応を実施することで、同じ細胞に含まれていた1分子のmRNAが同じCell barcodeを持つcDNAとして合成され、そのmRNA/cDNAが由来した細胞を識別できるということを利用している（図１）。<br />
[[ファイル:scFig1.jpg|サムネイル|300px|'''図1．ドロップレット使用の3’エンドリード法 '''<br>組織から解離させた細胞それぞれを、マイクロ流体力学を利用した装置で、バーコードプライマーが結合したゲルビーズとともにドロップレットに封じ込める。ドロップレット中には、ドロップレットごとにCell barcode/UMIとしてユニークなDNA配列を持つゲルビーズ(GEMs)が入っており、それを足場にcDNA合成反応を実施することで、同じ細胞に含まれていたmRNAが同じCell barcodeを持つDNAとして合成され、それを増幅する。]]<br />
<br />
<br />
DropSeqはコストが低いが、細胞の取得率と検出感度が低い弱点がある。inDropsはDropSeqより細胞取得率が高く、パラメータを調整することにより、低レベルで発現される遺伝子の検出にも有利であるとされる<ref><pubmed>30472192</pubmed></ref>。DropSeqのセットアップはDolomite Bio ([https://www.dolomite-bio.com])、inDropは1 Cellbio社から販売されている[https://1cell-bio.com]。しかし、その後、10x Genomics社が同様の原理を用いたシングルセル遺伝子発現解析システムを市販することで、多くの研究者が利用できるようになっている<ref><pubmed>28091601</pubmed></ref>[https://www.10xgenomics.com/jp/]。Svenssonらによる最近のデータベース<ref><pubmed>33247933</pubmed></ref> [http://www.nxn.se/single-cell-studies/gui]では、scRNA-seqを用いた論文で用いられた方法について調査しており、この数年、10x Genomics社のプラットフォームを用いた論文が飛躍的に増加していることがわかる。10x Genomics社のプラットフォームは市販であるので導入が容易であり、DropSeqやinDropsに比べ多くの転写産物の検出が可能であるが、それらよりランニングコストは高価である<ref><pubmed>30472192</pubmed></ref>。<br />
<br />
なお、3’エンドリード法だけでなく、抗体やT 細胞レセプターのN末端側に位置する可変領域の配列決定が可能である5'末端のシーケンシングには5’エンドリード法が利用されることがある。<br />
<br />
==scRNA-seqの実際==<br />
ここでは主流になっている10x Genomics社のChromium controllerなどのドロップレットを用いた方法とSMART-seqなどを用いた他のプラットフォームに共通する方法の実際について概説する。scRNA-seqの利用には、4つのステップがある（図２）<ref><pubmed> 31217225</pubmed></ref><ref><pubmed>30089861</pubmed></ref>。<br />
[[ファイル:ScFig2d.jpg|サムネイル|500px|'''図２．scRNA-seqの実際のステップ '''<br>細胞の単離、ライブラリ作製とNGS、データの前処理から次元圧縮、データ解析。図の一部は2016 DBCLS TogoTV、あるいはSeuratを用いて10x Genomics社のPBMCデータ（[https://support.10xgenomics.com/single-cell-gene-expression/datasets]から執筆者が作製。]]<br />
１）個体や組織を採集し、そこから細胞あるいは細胞核を個別に解離された状態にすること。<br />
２）ドロップレット法やSMART-seq対応のプラットフォームなどによる個々の細胞からのライブラリーの作製とNGS。<br />
３）得られた配列情報の前処理（preprocessing）。<br />
４）データ解析。これらのうち、２）の段階については、上に記述したように市販の機器や試薬を利用する機会が多くなっているので、詳細は説明しない。<br />
===組織からの細胞、細胞核の分離===<br />
浮遊細胞（血液細胞など）ではない場合、物理的あるいは酵素処理などによって解離することで、生組織から状態の良い個々に分散した細胞を調製する必要がある。神経系組織の酵素処理には、パパインを用いる方法が広く用いられている<ref><pubmed>29970990</pubmed></ref>。ここで、しばしば問題となるのが、酵素処理による短時間加温や機械的刺激で、発現量が変化する遺伝子が存在することである<ref><pubmed>27090946</pubmed></ref>。特に、脳の[[ミクログリア]]の解析には、低温下で組織をホモゲナイズするなどの工夫が必要であった<ref><pubmed>30471926</pubmed></ref>。また、このような現象を抑制するために、酵素処理時に転写阻害剤である[[アクチノマイシン]]で処理したり<ref><pubmed>29024657</pubmed></ref>、ヒマラヤ氷河から得られた細菌Bacillus licheniformisから得られた低温プロテアーゼを用いる方法も報告されている<ref><pubmed>28851704</pubmed></ref><ref><pubmed>31623682</pubmed></ref>。また、細胞解離後に、メタノールで固定しscRNA-seqに使用したり<ref><pubmed>28526029</pubmed></ref>、クロスリンカーを用いる方法もある<ref><pubmed>29391536</pubmed></ref>。<br />
<br />
単離した細胞は、そのまま10x Genomicsのシングルセル遺伝子発現解析のプラットフォームに導入することができるが、細胞表面分子マーカーに対する抗体や蛍光タンパク質レポーターなどを用いたFACS、[[パニング]]、MACS(磁気ビーズカラム)などによって、細胞の選択的濃縮や除去を行う場合もある。更に、抗体に抗体表示バーコードDNAをカップリングさせるCITE-seq(Cellular Indexing of Transcriptomes and Epitopes by Sequencing) については、下記の「統合解析」でも述べる。<br />
<br />
なお、ヒト組織や希少生物などから生細胞を得ることは困難なことが多い。この場合、scRNA-seqの変法として、凍結した組織から、各細胞由来の核を調製し、核内のmRNAを分析するsnRNA-seq (single-nucleus RNA-seq)が利用されている。ただ、snRNA-seqでは、FACSなどによる特定細胞集団の分離が困難であることが多い。また、細胞質を持つ生細胞を利用したscRNA-seqとは違って、スプライシングの途上にある未成熟な核内転写産物を検出すること、更に検出できる遺伝子数も少なく、同等な結果が必ずしも得られない<ref><pubmed>24248345</pubmed></ref><ref><pubmed>26890679</pubmed></ref> <ref><pubmed>27471252</pubmed></ref><ref><pubmed>28846088</pubmed></ref><ref><pubmed>29220646</pubmed></ref><ref><pubmed>28846088</pubmed></ref><ref><pubmed>30586455</pubmed></ref><ref><pubmed>28729663</pubmed></ref><ref><pubmed>31728515</pubmed></ref><ref><pubmed>32341560</pubmed></ref> <ref><pubmed>32518403</pubmed></ref>。一方で、snRNA-seqでは、組織をそのまま凍結することから開始することが可能であるので、上述したscRNA-seqの問題である細胞解離酵素による処理などを避けることができる。更に、核を用いることで、大きな細胞体はマイクロ流体力学の流路で詰まりやすいなど、特に神経細胞で顕著である細胞の形状の多様性に伴うバイアスを減らすことができるといったメリットもある。こうしたプロトコールの一部は、protocols.ioのHuman Cell Atlasのグループ[https://www.protocols.io/groups/hca]で公開されている。<br />
通常のscRNA-seqは、ポリアデニル化されたmRNAを検出しているが、MATQ-seq（multiple annealing and dC-tailing-based quantitative single-cell RNA-seq）、RamDA-seqなどを用いると、ポリアデニル化されていないRNAの検出も可能である<ref><pubmed> 28092691</pubmed></ref> <ref><pubmed>29434199 </pubmed></ref>[https://doi.org/10.1101/2020.06.02.131060]。<br />
<br />
更に、RNAを分析するscRNA-seqではないが、遺伝子発現状態との関係が想定される[[オープンクロマチン]]領域を[[トランスポゾン]]を用いることで個々の細胞レベルで選択的に検出するsingle cell ATAC-seq (Assay for Transposase-Accessible Chromatin) <ref><pubmed>26083756</pubmed></ref>, <ref><pubmed>29434377</pubmed></ref><ref><pubmed>25953818</pubmed></ref>, single cell THS-seq (transposome hypersensitive-site) <ref><pubmed>29227469</pubmed></ref>や [[DNAメチル化]]領域を観察するsnmC-seq、RRBSのような方法も利用されている<ref><pubmed>28798132</pubmed></ref><ref><pubmed>30237449</pubmed></ref><ref><pubmed> 20852635</pubmed></ref>。<br />
===scRNA-seqデータ処理の流れ===<br />
====総論====<br />
Illumina社に代表されるNGSを用いて得られた結果は、ベースコールや細胞バーコードを用いたdemultiplexingなどの基礎解析を行うことで、各細胞における遺伝子の発現量のマトリックスを出力する。例えば、10XGenomics社のChromiumプラットフォームを用いた場合、10XGenomics社が提供するCell Rangerのmkrefコマンド(Linux上で作動, [https://support.10xgenomics.com/single-cell-gene-expression/software/pipelines/latest/using/tutorial_mr])などにより、各生物種ごとのレファレンス配列リスト（[https://www.ncbi.nlm.nih.gov/grc]、マウスやヒトでは既製のものを利用できる）などを参考にしながら、細胞と転写産物量の対応マトリックスを作製する。その後のデータの処理についても、10x Genomics社がソフトウェアLoupeを提供している。しかしながら、その後のデータ解析を考慮して、[[R]], [[Python]], MATLABなどのデータ解析のための汎用プログラミング言語やコードで扱えるオブジェクトに変換するのが通常である。<br />
<br />
scRNA-seq解析のためには、数多くのツールが公開されている。これらのツールは、バージョンが更新されたり、新しいものに置き換えられることがあるので、実際に利用する場合は最新の動向に注意を払う必要がある。scRNA-seqの解析に必要なツールは、scRNA-tools [https://www.scrna-tools.org], Awesome single cell [https://github.com/seandavi/awesome-single-cell], Bioconductor[https://www.bioconductor.org]などで紹介されており、ほとんどがダウンロード可能である。また、bioRxivなどの査読前のプレプリントサーバで公開されて、随時試用、評価されていくものが多く、scRNA-seqのデータ（下記参考）とともに、オープンサイエンス実践の好例となっている。<br />
====Seurat====<br />
ここでは、scRNA-seqデータ解析のために最もよく利用されているRを用いたパッケージ「Seurat」<ref><pubmed> 29608179 </pubmed></ref> <ref><pubmed> 31178118 </pubmed></ref>を中心に紹介しておきたい。なお、一部の解析操作は、University of WashingtonのCole Trapnell研究室で開発されてきた軌道推定（下記参考）によく使用されるMonocle3でも可能である（[https://cole-trapnell-lab.github.io/monocle3/]）。Pythonを利用したものでは、ドイツ・ミュンヘンInstitute of Computational Biologyの Fabian Theisらが開発しているScanpyが有名である<ref><pubmed> 29409532</pubmed></ref>。<br />
<br />
New York UniversityのRahul Satija研究室が開発しているSeurat（画家スーラに由来）は、scRNA-seqデータ解析のために広く利用されているRパッケージであり、2020年秋現在、Seurat4のβバージョンが公開されている。論文の正式発表前から、サポート情報提供やコード修正なども頻繁に行っており、Satija研究室のウェッブサイト（ [http://satijalab.org/Seurat]）、Github([https://github.com/satijalab/Seurat])、更にTwitterアカウント（@satijalab）などで最新情報を得ることできる。<br />
====品質の検討事項====<br />
最初に行うのは、scRNA-seqデータの品質管理である。ここでは、質の低い細胞のデータ（例えば、壊れた細胞では、転写産物の種類が少なくミトコンドリア由来の転写産物が多い）を取り除く。また、複数の試料を組み合わせる場合には、バッチごとの違いについて検討する<ref><pubmed>29608177</pubmed></ref><ref><pubmed> 28045081<br />
</pubmed></ref><ref><pubmed>31948481</pubmed></ref> <ref><pubmed>32854757</pubmed></ref>。現実には、実験ごとのバッチの違いによる影響（Batch effect）がscRNA-seqの最大の問題であると示されてきており、試料の処理を同時に行うなど実験デザインを工夫する必要がある<ref><pubmed>29121214</pubmed></ref>。<br />
<br />
また、ドロップレットを使用するscRNA-seqでしばしば問題になるのが、ドロップレットに２つ以上の細胞が封じ込められ、それらが同一のCell barcodeを持ってしまうアーティファクトである。通常「Doublet」「Multilet」と呼ばれるこの問題はデータ解析を混乱させるので、細胞単離の段階から注意する必要があるが、scRNA-seqデータ取得後にもデータ処理で解決できる可能性もある<ref><pubmed>30954476</pubmed></ref><ref><pubmed>30954475</pubmed></ref> <ref><pubmed>31693907</pubmed></ref><ref><pubmed>32592658</pubmed></ref> <ref><pubmed>29227470</pubmed></ref><ref><pubmed>31836005</pubmed></ref><ref><pubmed>31856883</pubmed></ref><ref><pubmed>30567574</pubmed></ref> <ref><pubmed>31266958</pubmed></ref> [https://doi.org/10.1101/2019.12.17.879304][https://doi.org/10.1101/699637][http://dx.doi.org/10.2139/ssrn.3646565]。なお、この手法を利用することで、バッチ効果を抑えるために、異なるバーコードを持つ複数の試料を混ぜて一つの試料として扱い、計算機的に再び分離、解析する手法が注目されている<ref><pubmed>32483174</pubmed></ref>。<br />
<br />
scRNA-seqデータの次のノイズは、ある遺伝子の発現が低いために、本来同じタイプの細胞であっても、その遺伝子の発現が全く見られない「Dropout」と呼ばれる現象であり解析に影響を与えるので、これについても検討が必要である<ref><pubmed> 24056876<br />
</pubmed></ref><ref><pubmed>32127540</pubmed></ref>。<br />
====次元圧縮====<br />
このような品質管理、ノーマライゼーションの過程を経て<ref><pubmed>28504683</pubmed></ref>、scRNA-seqのデータ解析において、最初に行うのが、[[次元圧縮]] (dimensionality reduction)である<ref><pubmed>30617341</pubmed></ref><ref><pubmed>31780648</pubmed></ref><ref><pubmed>31955711</pubmed></ref><ref><pubmed>31823809</pubmed></ref>。PCA (Principal component analysis, 主成分分析)、更に発展させたUMAP（Uniform Manifold Approximation and Projection, 均一マニフォールド近似と投影）、Diffusion maps<ref><pubmed> 26002886<br />
</pubmed></ref>, tSNE(t-distributed Stochastic Neighbor Embedding , t分布型確率的近傍埋込み)などの手法が用いられる。 特に、tSNE[http://www.jmlr.org/papers/v9/vandermaaten08a.html]とUMAP[https://arxiv.org/abs/1802.03426]は、高次元データを低次元の点の集合として可視化することで、それぞれの細胞の持つ遺伝子発現状態の類似度についての直観的な表示が可能でありしばしば用いられる（図３）。tSNEよりUMAPの方が迅速に類似集団間の関係が明確になるので、最近はUMAPを利用することが多くなってきている。次に、[[Louvainアルゴリズム]]などでクラスタリング（コミュニティ分割）を行いグラフ上に表示できる（図３の色分け）。こうして、異なる転写状態を示す細胞の集合が別のクラスターとして表示され、同定可能になる<ref><pubmed>31500660</pubmed></ref>。<br />
[[ファイル:scFig3.jpg|サムネイル|250px|'''図３． tSNEとUMAPによる同じデータの可視化'''<br>網膜（ニワトリ）の視細胞のデータを用いて執筆者が作製[https://doi.org/10.1101/2020.10.09.333633]。]]<br />
==データ解析==<br />
===細胞クラスターの解釈とマーカー遺伝子候補の発見===<br />
scRNA-seqデータから得られる生物学的知見には、内在的に存在する細胞の種類、外部刺激や環境で変化した細胞の状態、そして種類や変化により特徴的に発現するマーカー遺伝子候補の発見がある<ref><pubmed>27824854</pubmed></ref><ref><pubmed>32033589</pubmed></ref><br />
。クラスタリングにより、異なった細胞集団の存在が認識されると、それぞれのクラスター（群）に特徴的に発現している具体的な遺伝子を探索し、細胞集団の持つバイオマーカーによって、そのクラスター（群）の同定が可能になる。例えば、既に神経細胞とグリア細胞に特異的に発現する典型的マーカーはよく知られており、それぞれのクラスターの識別は容易である。更に、神経細胞のタイプ（下記参考）を区別できるマーカーや、外部刺激によって遺伝子発現状態が変化した神経細胞の状態は、In situ hybridizationや免疫組織化学などにより確認できる。このようなクラスターごとに発現が異なる遺伝子（差次的発現遺伝子）を見つけるためには（Differential expression analysis, DE analysis）、SeuratのFindMarkersコマンド中でも利用可能であるコード（MAST、DESeq2など<ref><pubmed>26653891</pubmed></ref><ref><pubmed>25516281</pubmed></ref><ref><pubmed>30658573</pubmed></ref>）を用いることができる。細胞ごとの差次的発現遺伝子のVisualization（表示可視化）には、ドットプロット（dot plot）、ヴァイオリンプロット（violin plot）、リッジプロット（Ridge plot, joy plot）、UMAPなどの次元圧縮図上に転写物量をプロットするFeatureプロット（feature plot）などが、目的に応じて頻繁に用いられる（図４）。<br />
[[ファイル:scFig4.jpg|サムネイル|300px|'''図４．scRNA-seqデータの可視化の例 '''<br>A. ドットプロット。B.ヴァイオリンプロット。C. リッジプロット。D. UMAP（灰色）に転写物量（青）をプロットした Featureプロット。網膜の視細胞のデータを用いて執筆者が作製[https://doi.org/10.1101/2020.10.09.333633]。]]<br />
===擬時系列解析===<br />
実験的なノイズとは別に生物学的に意味のある遺伝子発現の変動には、位置情報、[[細胞周期]]、[[概日リズム]]、発現変動が大きい破裂型プロモーターの作動などの理由で 変動が見られるものもある<ref><pubmed> 31217225 </pubmed></ref><ref><pubmed> 26000846</pubmed></ref>。特に、刺激・薬剤処理やさまざまな病態の進行や治療に伴う細胞の変化、発生途上にある細胞系譜や細胞分化といった細胞の遷移状態の解析（[[軌道推定]]（Trajectory inference）；[[擬時系列解析]]（擬似時系列解析）、Pseudo-time analysis ）には、scRNA-seqデータを用いることが効果的である<ref><pubmed>29576429</pubmed></ref><ref><pubmed>28813177</pubmed></ref><ref><pubmed>29565398</pubmed></ref>。しばしば用いられるMonocle3 <ref><pubmed>30787437</pubmed></ref>[https://cole-trapnell-lab.github.io/monocle3/]など、多くのコードを収集、比較しているサイトがある [https://dynverse.org][https://github.com/agitter/single-cell-pseudotime]。RNA velocityといったスプライシングされていく転写産物の量から細胞の分化状態を推定する方法もある<ref><pubmed>30089906</pubmed></ref><ref><pubmed> 32747759</pubmed></ref>。しかし、これらの方法は、あくまで[[細胞系譜]]や細胞分化の推定に過ぎない。細胞系譜を更に確実に観察しつつ、scRNA-seqを行うことで、細胞タイプの系統関係を調べる方法として、CRISPR-Cas9を用いた[[ゲノム編集]]による痕跡追跡記録法を導入したscGESTALT<ref><pubmed>29608178</pubmed></ref>、ScarTrace<ref><pubmed>29590089</pubmed></ref> 、LINNAEUS<ref><pubmed>29644996</pubmed></ref>、あるいはアデノシンデアミナーゼでRNA編集を行いタイムスタンプを入れる方法<ref><pubmed>33077959</pubmed></ref>がある。1塩基バリアント（Single-nucleotide variants: SNV）の系統的解析は、細胞の不均一性や系統的な関係を明らかにするための最も有望なアプローチの一つである<ref><pubmed>31744515</pubmed></ref>。<br />
===遺伝子制御ネットワーク、パスウェイ解析など===<br />
また細胞分化や刺激などによる変動に伴う特徴的な遺伝子発現状態をscRNA-seqで観察することは、遺伝子制御ネットワーク（例、SCENIC<ref><pubmed>28991892</pubmed></ref>, [https://github.com/aertslab/SCENIC]）、[[代謝経路]]や[[シグナル伝達系]]のための[[パスウェイ解析]](例、Metascape<ref><pubmed>30944313</pubmed></ref>, [http://metascape.org]、Gene Ontolgoy[http://geneontology.org])を理解するシステム生物学的な研究として有用である<ref><pubmed>32051003</pubmed></ref>。更に、scRNA-seqで得られた結果をもとに、細胞間相互作用の理解を深めるのを目的とするCellPhoneDB<ref><pubmed>32103204</pubmed></ref>[https://github.com/Teichlab/cellphonedb]、NicheNet<ref><pubmed>3181926</pubmed></ref>, SVCA<ref><pubmed>31577949</pubmed></ref>などがある。特に、Perturb-seq<ref><pubmed>27984732</pubmed></ref> やその変法<ref><pubmed> 32231336</pubmed></ref>は、CRISPRライブラリーによるゲノム編集を施した細胞をscRNA-seqで解析することで、ゲノム編集で破壊された遺伝子の機能や遺伝子間の相互作用の理解を可能にしている後述する複数モダリティ情報を取り込んだscRNA-seqの１つであり、注目されている。<br />
==scRNA-seqの神経科学研究への適用==<br />
===神経系細胞ビッグデータとしてのscRNA-seq===<br />
様々な神経・精神疾患について理解しその診断や治療に役立てるためには、神経細胞、[[グリア細胞]]を中心にした神経系にある細胞の種類や状態を識別し、それぞれの細胞における分子的な変化を観察することが重要である <ref><pubmed>28775344</pubmed></ref><ref><pubmed>29738987</pubmed></ref>。本項目で解説してきたscRNA-seq技術は、神経系に見られるそれぞれの細胞のトランスクリプトームについて[[ビッグデータ]]を提供することで、この細胞の種類や状態の識別に新たな判断材料を与えつつある。近年、中枢神経系の[[アストロサイト]]、[[オリゴデンドロサイト]]、ミクログリアといったグリア細胞も均一ではなく、内在的な多様性や外部因子による状態の変動が報告されてきている。神経細胞は、著しく多様であり、この多様性が神経系の多彩で複雑な機能発現の基盤となっている。従来の神経科学では、神経細胞の多様性は、それぞれの神経細胞の解剖学的な位置、発現している分子、電気生理学、結合性、形態、神経伝達物質、神経伝達物質受容体とシグナル伝達によって識別されてきている。こうした神経細胞の多様性を便宜的に記述するのに、タイプ（type）、クラス（class）、サブクラス（subclass）、サブタイプ（subtype） というような用語が用いられてきた。しかし、ここでは混乱を防ぐため、Masland（2004）<ref><pubmed>15242626</pubmed></ref>が提唱し、広く受けいれられている「クラス」と「タイプ」という単語を用いることとする<ref><pubmed> 32839617<br />
</pubmed></ref>。タイプは、これ以上分類することができないとされる階層であり、共通性を持つタイプの集団がクラスである。例えば、大脳皮質の錐体細胞、網膜神経節細胞といった大雑把な区分はクラスである。大脳皮質の錐体細胞というクラスは、層や領野によって異なるタイプ、網膜神経節細胞には視覚情報に対して応答が異なるタイプが存在する。scRNA-seqは、「タイプ」の理解に新たな視点を提供している。<br />
===神経系へのscRNA-seqの適用===<br />
scRNA-seqの神経系での利用については、次々と新しい論文やプレプリントが発表されており、ここではscRNA-seqで得られてきた情報の典型例を紹介することにとどめる。<br />
<br />
[[大脳皮質]]には、[[錐体細胞]]や[[非錐体細胞]]などの神経細胞や様々なグリア細胞などが見られ、古くから神経細胞タイプの識別が行われてきた。初期のFluidigm C1を用いたscRNA-seq技術でも、マウス皮質の小規模な細胞数を分類した研究で、これまで知られていた主要な神経細胞タイプとは違うタイプが見つかりscRNA-seqの有効性が示された<ref><pubmed>25700174</pubmed></ref>。その後のドロップレット使用の3’エンドリード法を利用した多数の細胞数の解析で、更に多数の神経細胞のタイプが見つかっている<ref><pubmed>32839617</pubmed></ref><ref><pubmed>28846088</pubmed></ref><ref><pubmed>30096299</pubmed></ref><ref><pubmed>30096314</pubmed></ref><ref><pubmed>30382198</pubmed></ref><ref><pubmed>29320739</pubmed></ref><ref><pubmed>28846088</pubmed></ref>[https://doi.org/10.1101/2020.03.14.991018][https://doi.org/10.1101/2020.06.04.105700] [https://doi.org/10.1101/2020.07.02.184051]。特に、GABA作動性介在神経細胞タイプの多様性とその発生<ref><pubmed>28942923</pubmed></ref><ref><pubmed>28134272</pubmed></ref><ref><pubmed>29472441</pubmed></ref><ref><pubmed>29513653</pubmed></ref>についての、これまでの組織化学的な研究からは得られていなかった多くの情報は重要であろう。また、初期の発生過程<ref><pubmed>26940868</pubmed></ref><ref><pubmed>30485812</pubmed></ref><ref><pubmed>31073041</pubmed></ref><ref><pubmed>30635555</pubmed></ref><ref><pubmed>30625322</pubmed></ref>、老化<ref><pubmed>31551601</pubmed></ref>の理解が、scRNA-seq技術を利用することで進んでいる。更に、[[神経活動]]や[[臨界期]]に伴い変化するmRNAも細胞ごとに調査され興味深い<ref><pubmed>29230054</pubmed></ref> <ref><pubmed>32404418</pubmed></ref>。 ヒトを含めた霊長類の大脳についても発達段階を含めてscRNA-seqが適用されてきている<ref><pubmed>26060301</pubmed></ref><ref><pubmed>27339989</pubmed></ref><ref><pubmed>29539641</pubmed></ref><ref><pubmed>29217575</pubmed></ref><ref><pubmed>28846088</pubmed></ref><ref><pubmed>29227469</pubmed></ref><ref><pubmed>31303374</pubmed></ref><ref><pubmed>29867213</pubmed></ref><ref><pubmed>31435019</pubmed></ref><ref><pubmed>32424074</pubmed></ref> [https://doi.org/10.1101/709501][https://doi.org/10.1101/2020.03.31.016972][https://doi.org/10.1101/2020.04.23.056390]。ヒトや霊長類に特徴的とされる[[島]]のvon Economo神経細胞（紡錘細胞）のような希少な神経細胞のscRNA-seqにも成功している<ref><pubmed>32127543</pubmed></ref>。<br />
<br />
[[海馬]]<ref><pubmed>29241552</pubmed></ref><ref><pubmed>29912866</pubmed></ref><ref><pubmed>29335606</pubmed></ref><ref><pubmed>31942070</pubmed></ref>では、これまでの研究で記載されてきた神経細胞のタイプの存在が確認され、更に新規のタイプが見つかった。中枢神経系では、その他、[[外側膝状体]]<ref><pubmed>29343640</pubmed></ref>、[[大脳基底核]](足底核)<ref><pubmed>28384468</pubmed></ref> 、[[視床下部]]<ref><pubmed>28166221</pubmed></ref><ref><pubmed>28355573</pubmed></ref> <ref><pubmed>27991900</pubmed></ref><ref><pubmed>30385464</pubmed></ref> <ref><pubmed>31249056</pubmed></ref><ref><pubmed>30858605</pubmed></ref>、[[線条体]]<ref><pubmed>27425622</pubmed></ref><ref><pubmed>30134177</pubmed></ref><ref><pubmed>31875543</pubmed></ref>、[[中脳]]<ref><pubmed>27716510</pubmed></ref><ref><pubmed>29499164</pubmed></ref> <ref><pubmed>30718509</pubmed></ref> 、[[手綱]]<ref><pubmed>29576475</pubmed></ref>、発生中の[[間脳]]<ref><pubmed>30872278</pubmed></ref> 、さらに[[小脳]]<ref><pubmed>30220501</pubmed></ref><ref><pubmed>30735127</pubmed></ref><ref><pubmed>30690467</pubmed></ref>などの結果が報告されてきている。例えば、構成する細胞についての情報が詳細に研究されてきたと思われていたマウスの小脳においても、分子層にこれまでの星状細胞、バスケット細胞というカテゴリーとは違ったギャップジャンクションに特徴を持つ２種類の神経細胞があることが示唆されている[https://doi.org/10.1101/2020.03.04.976407]。<br />
<br />
脳の外部では、[[運動神経]][https://doi.org/10.1101/2020.03.16.992958]、[[感覚神経]]<ref><pubmed>25420068</pubmed></ref><ref><pubmed>26691752</pubmed></ref>、[[らせん神経節]]<ref><pubmed>30078709</pubmed></ref><ref><pubmed>30209249</pubmed></ref> 、[[臭覚神経]]<ref><pubmed>26541607</pubmed></ref> <ref><pubmed>32059767</pubmed></ref>、[[腸神経系]] <ref><pubmed>29483303</pubmed></ref>[https://doi.org/10.1101/2020.03.02.955757] 、[[網膜]]<ref><pubmed>27565351</pubmed></ref><ref><pubmed>29909983</pubmed></ref><ref><pubmed>30018341</pubmed></ref><ref><pubmed>31260032</pubmed></ref><ref><pubmed>31128945</pubmed></ref><ref><pubmed>30712875</pubmed></ref><ref><pubmed>30548510</pubmed></ref><ref><pubmed>31075224</pubmed></ref><ref><pubmed>31399471</pubmed></ref><ref><pubmed>31848347</pubmed></ref><ref><pubmed>31673015</pubmed></ref><ref><pubmed>31653841</pubmed></ref><ref><pubmed>31784286</pubmed></ref>[https://doi.org/10.1101/2020.02.26.966093][https://doi.org/10.1101/779694][https://www.biorxiv.org/content/10.1101/617555] [https://doi.org/10.1101/2020.10.09.333633][Shekhar K, Sanes JR (2021), Generating and using transcriptomically based retinal cell atlases. Annu Rev Vis Sci 7: (in press)]でのscRNA-seqデータがある。<br />
また[[iPS細胞]]や[[ES細胞]]由来の神経組織[[オルガノイド]]に含まれる神経細胞タイプを知る上でも利用されている<ref><pubmed>28094016</pubmed></ref><ref><pubmed>28279351</pubmed></ref><ref><pubmed>31168097</pubmed></ref><ref><pubmed>31996853</pubmed></ref><ref><pubmed>31968264</pubmed></ref><ref><pubmed><ref><pubmed>32221280</pubmed></ref>。このようなアプローチは、ネアンデルタール人型の遺伝子を持つ脳オルガノイドの解析<ref><pubmed> 32559457</pubmed></ref>やSARS-CoV-2に感染する脳オルガノイド中の細胞の同定<ref><pubmed> 33113348</pubmed></ref>など、新たな応用例が発表されてきており興味深い。<br />
===神経細胞以外の細胞===<br />
[[上衣細胞]]<ref><pubmed>29727663</pubmed></ref>は、[[神経幹細胞]]としての役割が示唆されてきたが、scRNA-seqによる解析ではその可能性が支持されなかった。グリア細胞では、[[ラジアルグリア]]<ref><pubmed>26406371</pubmed></ref><ref><pubmed>25734491</pubmed></ref><ref><pubmed>29281841</pubmed></ref><ref><pubmed>29217575</pubmed></ref><ref><pubmed>29539641</pubmed></ref>、アストロサイト<ref><pubmed>32139688</pubmed></ref><ref><pubmed>32203496</pubmed></ref>[https://doi.org/10.1101/2020.04.27.064881]に多様性があることが示唆されてきている。また、オリゴデンドロサイト<ref><pubmed>27284195</pubmed></ref><ref><pubmed>30078729</pubmed></ref><ref><pubmed>30257220</pubmed></ref><ref><pubmed>30747918</pubmed></ref><ref><pubmed>31958186</pubmed></ref>[https://doi.org/10.1101/2020.03.06.981373]については、これまで細胞生物学的に研究されてきた分化の過程がscRNA-seqにより詳細に解析されている。ミクログリアは、神経系の発達、老化、損傷などに伴う重要な遺伝子発現状態の変化がscRNA-seqにより詳細に明らかになった<ref><pubmed>27338705</pubmed></ref><ref><pubmed>29020624</pubmed></ref><ref><pubmed>30206190</pubmed></ref><ref><pubmed>30471926</pubmed></ref><ref><pubmed>31209379</pubmed></ref><br />
<ref><pubmed>31835035</pubmed></ref>。また、[[CNS境界関連マクロファージ]](BAM) <ref><pubmed>31061494</pubmed></ref>や[[脳血管系]]<ref><pubmed>29443965</pubmed></ref>のscRNA-seqも実施されている。<br />
===疾患===<br />
scRNA-seqは、疾患の理解にも有用である。scRNA-seqでは、疾患に伴う遺伝子発現状態の変化を細胞タイプごとに観察することができるので、バルクRNA-seqでは埋もれていた遺伝子発現状態の変化や細胞ごとの変化を検出できるという長所がある。<br />
例えば、筋萎縮性側索硬化症<ref><pubmed>30948552</pubmed></ref>、多発性硬化症<ref><pubmed>30747918</pubmed></ref><ref><pubmed>30420755</pubmed></ref><ref><pubmed>32313246</pubmed></ref> <br />
、アルツハイマー病やそのモデル動物<ref><pubmed>31042697</pubmed></ref><ref><pubmed>31399126</pubmed></ref><ref><pubmed>29020624</pubmed></ref><br />
[https://doi.org/10.1101/628347]<ref><pubmed>28602351</pubmed></ref><ref><pubmed>32341542</pubmed></ref>、統合失調症<ref><pubmed>29785013</pubmed></ref><ref><pubmed>32203495</pubmed></ref>、てんかん<ref><pubmed> 33028830</pubmed></ref>、自閉症やレット症候群<ref><pubmed>31097668</pubmed></ref><ref><pubmed>30455458</pubmed></ref>、シャルコー・マリー・トゥース病<ref><pubmed>29888333</pubmed></ref>、ダウン症[https://www.biorxiv.org/content/10.1101/2020.01.01.892398v1]、パーキンソン病<ref><pubmed>30503143</pubmed></ref> <ref><pubmed>32826893</pubmed></ref>、ハンチントン病<ref><pubmed>32070434</pubmed></ref>、がん<ref><pubmed>31327527</pubmed></ref><ref><pubmed>28360267</pubmed></ref>などに適用されている。最近、Perturb-seqにより、自閉症に関わる遺伝子の欠損に伴う細胞状態の変化などもscRNA-seqで報告されており<ref><pubmed>33243861</pubmed></ref>、疾患の理解のための新たな実験系の開発も始まりつつある。<br />
==scRNA-seqの展望==<br />
===神経系の多様性と進化===<br />
NGSを用いることで、どんな生物種にも適用可能なscRNA-seqは、既に多様な生物の神経系の細胞の理解、更には種間の相同性や差異の研究に利用されており、神経系の進化を細胞レベルで考察するのに有用であろう（例、線虫<ref><pubmed> 28818938 </pubmed></ref>、ショウジョウバエ <ref><pubmed>29909982</pubmed></ref><ref><pubmed>29149607</pubmed></ref><ref><pubmed>30703584</pubmed></ref><ref><pubmed>29909983</pubmed></ref><ref><pubmed>33125872</pubmed></ref>、カタユウレイボヤCiona intestinalis <ref><pubmed>30069052</pubmed></ref><ref><pubmed>30228204</pubmed></ref>、ゼブラフィッシュ<ref><pubmed>31018142</pubmed></ref><ref><pubmed>30929901</pubmed></ref>、アカミミガメTrachemys scripta elegans、トカゲPogona vitticeps, pv<ref><pubmed>29724907</pubmed></ref>、ニワトリ[https://doi.org/10.1101/2020.10.09.333633]、霊長類<ref><pubmed>30730291</pubmed></ref><ref><pubmed>31619793</pubmed></ref>[https://doi.org/10.1101/2020.03.31.016972]）。ただ、遺伝子やトランスクリプトームの研究が進んでいる生物種では比較的容易であるが、遺伝子のアノテーションが十分でない生物種を用いる場合、scRNA-seqのデータ解析は困難を伴う。また種を超えた細胞タイプの相同性の理解には様々な工夫が必要である<ref><pubmed>31552245</pubmed></ref><ref><pubmed>30712875</pubmed></ref>[https://doi.org/10.1101/2020.03.31.016972]。<br />
===データベースと統合===<br />
獲得されたscRNA-seqのデータは様々な目的で利用できるので、データベース化し利用できるようにする必要がある。神経系のトランスクリプトーム一般のデータベースが多数公開されており<ref><pubmed>29437890</pubmed></ref>、scRNA-seqのデータも基本的にNCBIのGene Expression Omnibus[https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/]に登録されている。また、オープンサイエンス推進のためにcommon coordinate framework (CCF) やcentral annotation platform (CAP)という概念のもと、特にscRNA-seqを意識したものとして、米国のBRAIN Initiative Cell Census Consortium<ref><pubmed>29096072</pubmed></ref> 、Human Cell Atlas ProjectのHuman Cell Atlas Data Portal [https://data.humancellatlas.org]、そのマウス版であるTabula Muris <ref><pubmed>30283141</pubmed></ref>[https://genome.ucsc.edu/cgi-bin/hgTrackUi?db=mm10&g=tabulaMuris]やSten Linnarssonラボのマウス脳発生データベース[http://mousebrain.org]、アレン脳研究所のAllen Brain Atlas [https://portal.brain-map.org]、ブロード研究所のSingle Cell Portal [https://singlecell.broadinstitute.org/]などのデータベースが稼働している。また、異なった方法や実験で得られたscRNA-seqのデータや後述の複数モダリティのシングルセルオミクスのデータを体系的に比較することも重要であり、CCA (Canonical correlation analysis)<ref><pubmed>29608179</pubmed></ref>, Seurat 3.0以降に組み込まれたMMN (Mutual Nearest Neighbors)、LIGER<ref><pubmed>31178122</pubmed></ref> 、Harmony<ref><pubmed>31740819</pubmed></ref> 、MetaNeighber<ref><pubmed>29491377</pubmed></ref>、Conos<ref><pubmed>31308548</pubmed></ref>[https://doi.org/10.1101/2020.05.22.111161]のようなアルゴリズムが開発され、後述の複数モダリティのシングルセルオミクスを組み込んだ統合サイトもでき始めている（[https://biccn.org]）。またデータベースを利用して発現類似性検索も研究されている<ref><pubmed>29608555</pubmed></ref><ref><pubmed>30744683</pubmed></ref>。<br />
===空間トランスクリプトミクス===<br />
多数の細胞を扱うscRNA-seqの弱点は、組織から細胞や細胞核を解離する必要があるので、その細胞が存在していた解剖学的あるいは空間的な位置の情報を消去してしまうということである。組織切片におけるタンパク質などの分布は免疫組織化学、mRNAの分布はin situ hybridizationで検出することができるが、数多くのmRNAの分布を情報処理技術と組み合わせ一気に同定する方法がscRNA-seqと同様に開発されてきている（Slide-seq<ref><pubmed>30923225</pubmed></ref><ref><pubmed> 33288904</pubmed></ref>、HDST<ref><pubmed>31501547</pubmed></ref>、Expansion sequencing[http://doi.org/10.1101/2020.05.13.094268]など<ref><pubmed>27365449</pubmed></ref>, <ref><pubmed>31932730</pubmed></ref> <ref><pubmed>30948552</pubmed></ref>）、更に10x Genomics社が市販するVisium（現時点ではシングルセルレベルではない）などがある。現状では、大きな組織の空間トランスクリプトミクスは、空間解像度は限定されており、技術普及の観点からも課題が多い。しかし、そのデータを解析するためのアルゴリズム<ref><pubmed>29553578</pubmed></ref><ref><pubmed>29553579</pubmed></ref><ref><pubmed>32350282</pubmed></ref> [https://doi.org/10.1101/757096][https://doi.org/10.1101/701680] [https://doi.org/10.1101/431957]、<br />
更にMerFish <ref><pubmed>25858977</pubmed></ref>、corrFISH<ref><pubmed>27271198</pubmed></ref>のように、subcellularレベルで多数のmRNAを検出する方法が多数開発されてきており（文献：<ref><pubmed>25549890</pubmed></ref> osmFISH<ref><pubmed>30377364</pubmed></ref> 30377364、STARmap (spatially-resolved transcript amplicon readout mapping) <ref><pubmed>29930089</pubmed></ref>、seqFISH+<ref><pubmed>27764670</pubmed></ref>、pciSeq(probabilistic cell typing by in situ sequencing)[https://doi.org/10.1101/431957]、DSP(Digital Spatial Profiling) <ref><pubmed>32393914</pubmed></ref>、scRNA-seqと組み合わせることで、その弱点を補う空間トランスクリプトミクスにも利用され始め<ref><pubmed>30385464</pubmed></ref>[https://doi.org/10.1101/2020.06.04.105700]、今後の発展が期待される分野である<ref><pubmed>32702314</pubmed></ref>。<br />
===統合解析 ===<br />
同一の細胞からscRNA-seqの情報だけでなく、ゲノム配列、ATAC-seqなどによるエピゲノム解析、少数のタンパク質、あるいはプロテオームなど複数のモダリティを同時に観察するオミクス（Single-cell multimodal omics）が注目されている<ref><pubmed>31907462</pubmed></ref><ref><pubmed>30696980</pubmed></ref>。2019年には、Nature Methodsの「Methods of the Year」に選ばれており、現状については、その特集号などを参考にされたい。例えば、細胞表面に提示されているマーカー分子に対する抗体にDNAを付加することで、そのマーカーを発現する細胞のトランスクリプトームを解析するCITE-seq<ref><pubmed>28759029</pubmed></ref>、 REAP-seq<ref><pubmed>28854175</pubmed></ref>も、既知の細胞表面マーカーの発現とscRNA-seqが同時に観察できる方法である。<br />
<br />
複数モダリティのシングルセルオミクスとして、神経科学分野で注目されるのは、scRNA-seqをパッチクランプによる電気生理学的情報と組み合わせたPatch-seq<ref><pubmed>26689544</pubmed></ref> <ref><pubmed>26689543</pubmed></ref>である。また、ゲノムDNAとscRNA-seqを同時に観察することによって、近年、精神疾患の観点から注目されている発生途中で生じる遺伝子変異を研究するPRDD-seqは今後の展開が注目される<ref><pubmed> 32522880</pubmed></ref>。最後に、BARseq (barcoded anatomy resolved by sequencing) <ref><pubmed>31626774</pubmed></ref>、CONNECTID[https://doi.org/10.1101/378760]、Epi-Retro-seq[https://doi.org/10.1101/2020.04.01.019612]のような方法は、[[コネクトーム]]（神経細胞の結合性）と遺伝子発現状態を記録できるオミクスの新たな方向として興味深い。<br />
== 関連項目 ==<br />
*[[ゲノムワイド関連解析 ]]<br />
*[[ディファレンシャルディスプレイ ]]<br />
*[[In situハイブリダイゼーション法 ]]<br />
*[[免疫組織化学法]]<br />
*[[エピジェネティクス]]<br />
*[[コネクトーム]]<br />
== 参考文献 ==<br />
<references /></div>
Masahitoyamagata
https://bsd.neuroinf.jp/w/index.php?title=%E3%83%95%E3%82%A1%E3%82%A4%E3%83%AB:ScFig2d.jpg&diff=45394
ファイル:ScFig2d.jpg
2020-12-19T19:13:52Z
<p>Masahitoyamagata: </p>
<hr />
<div>scRNAseq Figure2</div>
Masahitoyamagata
https://bsd.neuroinf.jp/w/index.php?title=%E3%82%B7%E3%83%B3%E3%82%B0%E3%83%AB%E3%82%BB%E3%83%ABRNA%E3%82%B7%E3%83%BC%E3%82%B1%E3%83%B3%E3%82%B7%E3%83%B3%E3%82%B0&diff=45299
シングルセルRNAシーケンシング
2020-12-12T19:26:44Z
<p>Masahitoyamagata: </p>
<hr />
<div><div align="right"> <br />
<font size="+1">[http://researchmap.jp/yamagatm 山形方人]</font><br><br />
''Harvard University''<br><br />
DOI：<selfdoi /> 原稿受付日：年月日 原稿完成日：年月日<br><br />
担当編集委員：<br><br />
</div><br />
英：single-cell RNA sequencing, scRNAseq<br />
{{box|text=<br />
シングルセルRNAシーケンシング(single-cell RNA sequencing, 以下scRNAseq)は、[[次世代シーケンサー]] （next generation sequencer、以下NGS）を用いることで、個々の細胞が保持しているmRNA全体を質的、量的に網羅的に調べる方法である。次元圧縮などの数理的な解析と組み合わせることで、遺伝子発現の状態に基づいた細胞の分類を行うことが可能であり、従来の組織学的、あるいは細胞生物学的手法では知られなかった新規の細胞種の同定や細胞状態の推定を行うことが可能になった。また、遺伝子発現プロファイルの変化に基づく擬時系列解析によって、刺激や発生に伴う細胞状態の遷移の描写ができる。神経系では、この方法により、神経細胞や非神経細胞の分類や状態についての知見が深まり、新しい神経細胞タイプ、細胞マーカー、病態の理解、更に機能的な遺伝子の同定などが系統的かつ網羅的に行われるようになった。scRNAseqに、空間的情報、エピゲノム情報、タンパク質情報などの複数モダリティを取り入れた統合解析（multimodal single-cell omics）も行われている。<br />
}}<br />
<br />
==scRNAseqの背景==<br />
===トランスクリプトーム===<br />
トランスクリプトーム（transcriptome）は、細胞中に存在する全ての転写産物（タンパク質をコードするmRNA、タンパク質をコードしない[[ノンコーディングRNA]]、[[マイクロRNA]]など）の総体である<ref><pubmed>19015660</pubmed></ref><ref><pubmed>31341269 </pubmed></ref>。トランスクリプトームは、[[ゲノム]]とは異なり、同一の個体でも、組織ごとに、更には発生段階や細胞外環境や刺激によって変化する。トランスクリプトームは、同質あるいは異質の多数の細胞集団（組織、培養細胞）からRNA抽出後、cDNAに変換し、それを1990年代に出現した[[DNAマイクロアレイ]]のように数多くの既知mRNAを識別する技術によって解析されるようになった。その後、NGSの利用により、希少mRNAやノンコーディングRNAを含めた未知の転写産物の高感度検出が可能になるとともに、[[スプライシング]]で成熟していく過程のmRNAなど、転写産物の種類だけでなく、転写産物の構造的差異（スプライシングバリアント、SNPs、変異など）の解析もできるようになった。加えて、ヒトやモデル実験生物（[[マウス]]、[[ゼブラフィッシュ]]、[[ショウジョウバエ]]、[[線虫]]など）だけでなく、多種多様な生物のトランスクリプトームの把握も可能になった。従来から行われてきた組織全体などの多数の細胞を対象としたRNA-seq（バルクRNAseq）では、複数の細胞における転写産物の平均を観察しているが、本項目では個々の細胞における転写産物を解析するscRNA-seqの原理とその応用について概説する。<br />
<br />
===scRNAseqとその開発史===<br />
1つの細胞の持つ生体物質を解明し、定量しようとする試みは古くからあった。1960年代になると、フローサイトメトリーを利用した[[蛍光活性化セルソーティング]]（Fluorescence-activated cell sorting, FACS）が発明され、標識抗体などのプローブと組み合わせることで、多数の細胞集団の中で１つの細胞が保持している生体分子の種類や量についての断片的な研究が可能になり、この方法は現在でも汎用されている<ref><pubmed>22271369</pubmed></ref>。その後、[[免疫組織化学]]や[[in situ hybridization]]nなどにより、タンパク質やmRNAの種類や量が観察できるようになり、組織中に存在するそれぞれの細胞の同定などに活用されてきている。最近では、それぞれの細胞が持つ抗原分子を、異なった金属イオンで標識した抗体とフローサイトメトリーを組み合わせた方法で検出する[[マスサイトメトリー]]（CyTOFなど）も開発されてきている<ref><pubmed>27153492</pubmed></ref>。<br />
<br />
細胞種にもよるが、1つの細胞内にある全RNA（ribosomal RNAを含む）は細胞種にもよるが1-50pgである。そのうち、mRNAの占める割合は1-5%程度である<ref><pubmed>15239941</pubmed></ref>。この微量のmRNAをcDNAに変換してから大幅に増幅できる方法が発明されたことで、1つの細胞が発現するmRNAを高感度で検出できるようになった<ref><pubmed>1557406</pubmed></ref><ref><pubmed>7541630</pubmed></ref> 。例えば、1991年、Linda BuckとRichard Axelは、[[嗅覚受容体]]が[[Gタンパク質]]であると仮定し、個々の嗅覚細胞で特異的に観察されるGタンパク質mRNAを比較することで、嗅覚受容体の同定に成功した<ref><pubmed>1840504</pubmed></ref>。1995年になると、Catherine DulacとRichard Axelは、異なる[[鋤鼻神経細胞]]で特異的に発現する遺伝子を１つの細胞から作製したcDNAライブラリーを比較するディファレンシャル・スクリーニングを行うことで、[[フェロモン受容体]]を同定した<ref><pubmed>7585937</pubmed></ref>。同じ手法で異なる種類の神経細胞で発現している遺伝子も同定され<ref><pubmed>9778248</pubmed></ref><ref><pubmed>12230981</pubmed></ref>、１つの細胞の持つトランスクリプトームを比較するアプローチが神経細胞で特徴的に発現している遺伝子の同定に効果的なことが示された。<br />
<br />
一方で多くの種類のmRNAを１細胞レベルで一挙に観察するための技術には感度やスループット、そしてコストの観点からブレークスルーが待たれた。1つの問題は多種類のcDNAを簡便に識別することを可能にする方法の開発であった。これを可能にしたのが、[[PCR]]などのcDNA増幅法の改良とマイクロアレイの利用であった<ref><pubmed>12736331</pubmed></ref><ref><pubmed>16547197</pubmed></ref>。しかしながら、細胞ごとに高価なマイクロアレイを使用することは、多数の細胞のトランスクリプトームの観察には限界があった。2009年になると、これらの問題を解決できる可能性として、NGSを利用するscRNAseqプロトコールがAzim Suraniのグループによって報告された<ref><pubmed>19349980</pubmed></ref>。しかしながら、多数のマイクロアレイでなく1回のNGS使用で済ませることができるものの、この報告でもわずか8個の細胞の解析に留まっており、1つの細胞ごとに処理を行うという操作が必要で、多数の細胞についてのトランスクリプームを一挙に理解することはできなかった。また、塩基配列の違うcDNAごとにPCR効率に差がある結果生じる増幅バイアス、また3’末端側が選択的に補足されることなどの課題があった。<br />
<br />
==scRNAseqの現状==<br />
===scRNAseqの分子生物学的反応=== <br />
その後、5’末端側の領域まで効率よく増幅するscRNAseqのプロトコールが考案された<ref><pubmed>32518403</pubmed></ref>。特に、SMART-seq（Switching mechanism at the 5' End of RNA Templates）<ref><pubmed>22820318</pubmed></ref>およびその改良されたプロトコールであるSMART-seq2<ref><pubmed>24056875</pubmed></ref> <ref><pubmed>24385147</pubmed></ref>の使用例が多い（既に、SMART-seq3という改良プロトコールもある<ref><pubmed>32518404</pubmed></ref>が、以下SMART-seqと呼ぶ）。また、類似法としてSTRT（single-cell tagged reverse transcription）<ref><pubmed>21543516</pubmed></ref>などがある。<br />
<br />
一方、CEL-seq（Cell Expression by Linear amplification and Sequencing）<ref><pubmed>22939981</pubmed></ref>、CEL-seq2<ref><pubmed> 27121950 </pubmed></ref> 、MARS-seq（Massively parallel single-cell RNA-seq）<ref><pubmed>24531970 </pubmed></ref>では、[[T7 RNAポリメラーゼ]]による[[in vitro転写]]を用いることにより、ＰＣＲによる増幅で見られるバイアスを低減させようとしている。<br />
<br />
また、Quartz-SeqやQuartz-Seq2ではPCR用のアダプターを付加する反応にポリAテーリングを利用することで、他の手法と比較して1.5-5倍程度の遺伝子を検出できる<ref><pubmed> 32518403</ref></pubmed>。<br />
===バーコード技術 ===<br />
増幅バイアス除去のアプローチとして特に重要なのは、2011年に発表された核酸配列バーコードを利用した方法で、分子識別子（unique molecular identifiers: UMI）を持つcDNAを増幅させ、NGS後の情報処理を用いるものであると考えられる<ref><pubmed>22101854</pubmed></ref>。この方法では逆転写反応の際、ランダム塩基配列から構成されるUMIをcDNA末端に付加した後、増幅反応、NGSを行い、cDNA配列とUMI配列の両方を読む。cDNAにはRNA1分子に1つのUMIが付加されるので、同一のUMIを持っていれば、逆転写時に同一のcDNA由来とカウントする。UMIをカウントすることで、増幅前のmRNAのコピー数を知ることができる<ref><pubmed>21543516</pubmed></ref><ref><pubmed>24363023</pubmed></ref><ref><pubmed>28192419</pubmed></ref> <ref><pubmed>29474909</pubmed></ref><ref><pubmed> 28818938 </pubmed></ref><ref><pubmed>29545511</pubmed></ref>。<br />
===多様なプラットフォーム===<br />
細胞を分別するプラットフォームには、マイクロピペットによる捕獲、セルソーター、[[レーザー捕獲]]などを用いるマルチウェル法、あるいは半導体集積回路様の製作技術で作った流体回路を利用するFluidigm C1の装置（C1 Single- Cell Auto Prep<br />
）[https://jp.fluidigm.com] 、更にドロップレット使用（下記）などがある<ref><pubmed>30405621</pubmed></ref>[https://doi.org/10.1101/742304]。これらは、SMART-seqと組み合わせて利用されることが多い。SMART-seqプロトコールの特徴は、全長mRNAのトランスクリプトーム情報を得ることができることであり、mRNAのスプライシングバリアントなどのアイソフォーム、SNPsの情報を利用したアリル特異的発現、変異の検出にも利用できる。また、それぞれ細胞ごとの反応を独立した場所で行うため、反応中に別の細胞の反応と混じる可能性が低い。小型のナノウェルを用いるSeq-Wellも同様に反応自体が混じる可能性が低い<ref><pubmed>28192419</pubmed></ref>。これらの点が、次に説明するドロップレットを使用して3’末端のみを標的にしたscRNAseqと比べた場合の長所であるが、その高コスト（1細胞あたり数十ドル）と処理可能な細胞数の少なさが短所である。<br />
<br />
これらとは別に、ハイスループットで安価な方法として、それぞれの細胞を独立に標識するのではなく、プールされた細胞を異なるウェルにランダムに振り分け、ウェル固有のバーコードで転写物を標識していく操作を複数回繰り返していくことで細胞を区別するSplit-seqやsci-RNA-seq3などの方法も用いられている<ref><pubmed>29545511</pubmed></ref><ref><pubmed>30787437</pubmed></ref>。<br />
===ドロップレット使用の3’エンドリード法===<br />
scRNAseqのプラットフォームと方法について重要と考えられる進歩は、2015年、Harvard Medical Schoolの独立した２つのグループが、inDrops<ref><pubmed>26000487</pubmed></ref>そしてDrop-seq<ref><pubmed>26000488 </pubmed></ref>という類似した2つのハイスループットな方法を開発したことであろう（inDropsはT7RNAポリメラーゼ、Drop-seqはPCRで増幅）。これらの方法では、[[マイクロ流体力学]] (Microfluidics) 、 UMI（上述）と細胞ごとのバーコード（Cell Barcode）という2種類のDNAバーコーディング、そしてNGSと情報解析法を利用している。そして、多く細胞のサンプル調製の自動化と容易さから、1つの細胞あたりに要するコストを大幅に低下させることに成功した（Drop-seqは発表時で、１細胞あたり約5セント）。つまり、細胞1つずつをマイクロ流体力学によるエマルジョン作製技術を利用した装置に流入させ、その１細胞を1つのドロップレットに自動的に閉じ込める。そのドロップレット中には、ドロップレットごとにCell barcode/UMIとしてユニークなDNAバーコードを持つゲルビーズ(Gel Beads in Emulsion, GEMs)が入っており、それを足場に3’末端のみを標的にしたcDNA合成反応を実施することで、同じ細胞に含まれていた1分子のmRNAが同じCell barcodeを持つcDNAとして合成され、そのmRNA/cDNAが由来した細胞を識別できるということを利用している（図１）。<br />
<br />
DropSeqはコストが低いが、細胞の取得率と検出感度が低い弱点がある。inDropsはDropSeqより細胞取得率が高く、パラメータを調整することにより、低レベルで発現される遺伝子の検出にも有利であるとされる<ref><pubmed>30472192</pubmed></ref>。DropSeqのセットアップはDolomite Bio ([https://www.dolomite-bio.com])、inDropは1 Cellbio社から販売されている[https://1cell-bio.com]。しかし、その後、10x Genomics社が同様の原理を用いた「Chromium」と命名された機器とそのための試薬を市販することで、多くの研究者が容易に利用できるようになっている<ref><pubmed>28091601</pubmed></ref>[https://www.10xgenomics.com/jp/]。Svenssonらによる最近のデータベース[https://doi.org/10.1101/742304], [http://www.nxn.se/single-cell-studies/gui]では、scRNAseqを用いた論文で用いられた方法について調査している。この数年、10x Genomics社Chromiumを用いた論文が飛躍的に増加している。10x Genomics社Chromiumのシステムは市販であるので導入が容易であり、DropSeqやinDropsに比べ多くの転写産物の検出が可能であるが、それらよりランニングコストは高価である<ref><pubmed>30472192</pubmed></ref>。なお、3’エンドリード法だけでなく、抗体やT 細胞レセプターのN末端側に位置する可変領域の配列決定が可能である5'末端のシーケンシングには5’エンドリード法が利用されることがある。<br />
<br />
[[ファイル:scFig1.jpg|サムネイル|300px|'''図1．ドロップレット使用の3’エンドリード法 '''<br>組織から解離させた細胞それぞれを、マイクロ流体力学を利用した装置で、バーコードプライマーが結合したゲルビーズとともにドロップレットに封じ込める。ドロップレット中には、ドロップレットごとにCell barcode/UMIとしてユニークなDNA配列を持つゲルビーズ(GEMs)が入っており、それを足場にcDNA合成反応を実施することで、同じ細胞に含まれていたmRNAが同じCell barcodeを持つDNAとして合成され、それを増幅する。]]<br />
==scRNAseqの実際==<br />
ここでは主流になっている10x Genomics社のChromiumなどのドロップレットを用いた方法とSMART-seqなどを用いた他のプラットフォームに共通する方法の実際について概説する。scRNAseqの利用には、4つのステップがある（図２）<ref><pubmed> 31217225</pubmed></ref><ref><pubmed>30089861</pubmed></ref>。１）個体や組織を採集し、そこから細胞あるいは細胞核を個別に解離された状態にすること。２）ドロップレット法やSMART-seq対応のプラットフォームなどによる個々の細胞からのライブラリーの作製とNGS。３）得られた配列情報の前処理（preprocessing）。４）下流解析と生物学的な情報を得るコンピューター生物学。これらのうち、２）の段階については、上に記述したように市販の機器や試薬を利用する機会が多くなっているので、詳細は説明しない<br />
[[ファイル:ScFig2c.jpg|サムネイル|500px|'''図２．scRNAseqの実際のステップ '''<br>細胞の単離、ライブラリ作製とNGS、データの前処理から次元圧縮、下流解析。図の一部は2016 DBCLS TogoTV、あるいはSeuratを用いて10x Genomics社のPBMCデータ（[https://support.10xgenomics.com/single-cell-gene-expression/datasets]から執筆者が作製。]]<br />
===組織からの細胞、細胞核の分離===<br />
浮遊細胞（血液細胞など）ではない場合、物理的あるいは酵素処理などによって解離することで、生組織から状態の良い個々に分散した細胞を調製する必要がある。神経系組織の酵素処理には、パパインを用いる方法が広く用いられている<ref><pubmed>29970990</pubmed></ref>。ここで、しばしば問題となるのが、酵素処理による短時間加温や機械的刺激で、発現量が変化する遺伝子が存在することである<ref><pubmed>27090946</pubmed></ref>。特に、脳の[[ミクログリア]]の解析には、低温下で組織をホモゲナイズするなどの工夫が必要であった<ref><pubmed>30471926</pubmed></ref>。また、このような現象を抑制するために、酵素処理時に転写阻害剤である[[アクチノマイシン]]で処理したり<ref><pubmed>29024657</pubmed></ref>、ヒマラヤ氷河から得られた細菌Bacillus licheniformisから得られた低温プロテアーゼを用いる方法も報告されている<ref><pubmed>28851704</pubmed></ref><ref><pubmed>31623682</pubmed></ref>。また、細胞解離後に、メタノールで固定しscRNAseqに使用したり<ref><pubmed>28526029</pubmed></ref>、クロスリンカーを用いる方法もある<ref><pubmed>29391536</pubmed></ref>。<br />
<br />
単離した細胞は、そのまま10x GenomicsのChromiumのプラットフォームに導入することができるが、細胞表面分子マーカーに対する抗体や蛍光タンパク質レポーターなどを用いたFACS、[[パニング]]、MACS(磁気ビーズカラム)などによって、細胞の選択的濃縮や除去を行う場合もある。更に、抗体に抗体表示バーコードDNAをカップリングさせるCITE-seq(Cellular Indexing of Transcriptomes and Epitopes by Sequencing) については、下記の「統合解析」でも述べる。<br />
<br />
なお、ヒト組織や希少生物などから生細胞を得ることは困難なことが多い。この場合、scRNAseqの変法として、凍結した組織から、各細胞由来の核を調製し、核内のmRNAを分析するsnRNAseq (single-nucleus RNA-seq)が利用されている。ただ、snRNAseqでは、FACSなどによる特定細胞集団の分離が困難であることが多い。また、細胞質を持つ生細胞を利用したscRNAseqとは違って、スプライシングの途上にある未成熟な核内転写産物を検出すること、更に検出できる遺伝子数も少なく、同等な結果が必ずしも得られない<ref><pubmed>24248345</pubmed></ref><ref><pubmed>26890679</pubmed></ref> <ref><pubmed>27471252</pubmed></ref><ref><pubmed>28846088</pubmed></ref><ref><pubmed>29220646</pubmed></ref><ref><pubmed>28846088</pubmed></ref><ref><pubmed>30586455</pubmed></ref><ref><pubmed>28729663</pubmed></ref><ref><pubmed>31728515</pubmed></ref><ref><pubmed>32341560</pubmed></ref> <ref><pubmed>32518403</pubmed></ref>。一方で、snRNA-seqでは、組織をそのまま凍結することから開始することが可能であるので、上述したscRNAseqの問題である細胞解離酵素による処理などを避けることができる。更に、核を用いることで、大きな細胞体はマイクロ流体力学の流路で詰まりやすいなど、特に神経細胞で顕著である細胞の形状の多様性に伴うバイアスを減らすことができるといったメリットもある。こうしたプロトコールの一部は、protocols.ioのHuman Cell Atlasのグループ[https://www.protocols.io/groups/hca]で公開されている。<br />
通常のscRNAseqは、ポリアデニル化されたmRNAを検出しているが、MATQ-seq（multiple annealing and dC-tailing-based quantitative single-cell RNA-seq）、RamDA-seqなどを用いると、ポリアデニル化されていないRNAの検出も可能である<ref><pubmed> 28092691</pubmed></ref> <ref><pubmed>29434199 </pubmed></ref>[https://doi.org/10.1101/2020.06.02.131060]。<br />
<br />
更に、RNAを分析するscRNAseqではないが、遺伝子発現との関係が想定される[[オープンクロマチン]]領域を[[トランスポゾン]]を用いることで個々の細胞レベルで選択的に検出するsingle cell ATAC-seq (Assay for Transposase-Accessible Chromatin) <ref><pubmed>26083756</pubmed></ref>, <ref><pubmed>29434377</pubmed></ref><ref><pubmed>25953818</pubmed></ref>, single cell THS-seq (transposome hypersensitive-site) <ref><pubmed>29227469</pubmed></ref>や [[DNAメチル化]]領域を観察するsnmC-seq、RRBSのような方法も利用されている<ref><pubmed>28798132</pubmed></ref><ref><pubmed>30237449</pubmed></ref><ref><pubmed> 20852635</pubmed></ref>。<br />
===scRNAseqデータ処理の流れ===<br />
====総論====<br />
10x Genomics社のChromium、Illumina社のNGSを利用した場合、Cell Rangerのmkrefコマンド(Linux上で作動, [https://support.10xgenomics.com/single-cell-gene-expression/software/pipelines/latest/using/tutorial_mr])などにより、各生物種ごとのレファレンス配列リスト（[https://www.ncbi.nlm.nih.gov/grc]、マウスやヒトでは既製のものを利用できる）などを参考にしながら、細胞と転写産物量の対応マトリックスを作製する。その後のデータの処理についても、10x Genomics社がソフトウェアLoupeを提供している。しかしながら、その後の下流解析を考慮して、[[R]], [[Python]], MATLABなどのデータ解析のための汎用プログラミング言語やコードで扱えるオブジェクトに変換するのが通常である。<br />
<br />
scRNAseq解析のためには、数多くのツールが公開されている。これらのツールは、バージョンが更新されたり、新しいものに置き換えられることがあるので、実際に利用する場合は最新の動向に注意を払う必要がある。scRNAseqの解析に必要なツールは、scRNA-tools [https://www.scrna-tools.org], Awesome single cell [https://github.com/seandavi/awesome-single-cell], Bioconductor[https://www.bioconductor.org]などで紹介されており、ほとんどがダウンロード可能である。また、bioRxivなどの査読前のプレプリントサーバで公開されて、随時試用、評価されていくものが多く、scRNAseqのデータ（下記参考）とともに、オープンサイエンス実践の好例となっている。<br />
====Seurat====<br />
ここでは、scRNAseqデータ解析のために最もよく利用されているRを用いたパッケージ「Seurat」<ref><pubmed> 29608179 </pubmed></ref> <ref><pubmed> 31178118 </pubmed></ref>を中心に紹介しておきたい。なお、一部の解析操作は、University of WashingtonのCole Trapnell研究室で開発されてきた軌道推定（下記参考）によく使用されるMonocle3でも可能である（[https://cole-trapnell-lab.github.io/monocle3/]）。Pythonを利用したものでは、ドイツ・ミュンヘンInstitute of Computational Biologyの Fabian Theisらが開発しているScanpyが有名である<ref><pubmed> 29409532</pubmed></ref>。<br />
<br />
New York UniversityのRahul Satija研究室が開発しているSeurat（画家スーラに由来）は、scRNAseqデータ解析のために広く利用されているRパッケージであり、2020年秋現在、Seurat4のβバージョンが公開されている。論文の正式発表前から、サポート情報提供やコード修正なども頻繁に行っており、Satija研究室のウェッブサイト（ [http://satijalab.org/Seurat]）、Github([https://github.com/satijalab/Seurat])、更にTwitterアカウント（@satijalab）などで最新情報を得ることできる。<br />
====品質の検討事項====<br />
最初に行うのは、scRNAseqデータの品質管理である。ここでは、質の低い細胞のデータ（例えば、壊れた細胞では、転写産物の種類が少なくミトコンドリア由来の転写産物が多い）を取り除く。また、複数の試料を組み合わせる場合には、バッチごとの違いについて検討する<ref><pubmed>29608177</pubmed></ref><ref><pubmed> 28045081<br />
</pubmed></ref><ref><pubmed>31948481</pubmed></ref> <ref><pubmed>32854757</pubmed></ref>。現実には、実験ごとのバッチの違いによる影響（Batch effect）がscRNAseqの最大の問題であると示されてきており、試料の処理を同時に行うなど実験デザインを工夫する必要がある<ref><pubmed>29121214</pubmed></ref>。<br />
<br />
また、ドロップレットを使用するscRNAseqでしばしば問題になるのが、ドロップレットに２つ以上の細胞が封じ込められ、それらが同一のCell barcodeを持ってしまうアーティファクトである。通常「Doublet」「Multilet」と呼ばれるこの問題は下流解析を混乱させるので、細胞単離の段階から注意する必要があるが、scRNAseqデータ取得後にもデータ処理で解決できる可能性もある<ref><pubmed>30954476</pubmed></ref><ref><pubmed>30954475</pubmed></ref> <ref><pubmed>31693907</pubmed></ref><ref><pubmed>32592658</pubmed></ref> <ref><pubmed>29227470</pubmed></ref><ref><pubmed>31836005</pubmed></ref><ref><pubmed>31856883</pubmed></ref><ref><pubmed>30567574</pubmed></ref> <ref><pubmed>31266958</pubmed></ref> [https://doi.org/10.1101/2019.12.17.879304][https://doi.org/10.1101/699637][http://dx.doi.org/10.2139/ssrn.3646565]。なお、この手法を利用することで、バッチ効果を抑えるために、異なるバーコードを持つ複数の試料を混ぜて一つの試料として扱い、計算機的に再び分離、解析するdemultiplexingという手法が注目されている<ref><pubmed>32483174</pubmed></ref>。<br />
<br />
scRNAseqデータの次のノイズは、ある遺伝子の発現が低いために、本来同じタイプの細胞であっても、その遺伝子の発現が全く見られない「Dropout」と呼ばれる現象であり解析に影響を与えるので、これについても検討が必要である<ref><pubmed> 24056876<br />
</pubmed></ref><ref><pubmed>32127540</pubmed></ref>。<br />
====次元圧縮====<br />
このような品質管理、ノーマライゼーションの過程を経て<ref><pubmed>28504683</pubmed></ref>、scRNAseqのデータ解析において、最初に行うのが、[[次元圧縮]] (dimensionality reduction)である<ref><pubmed>30617341</pubmed></ref><ref><pubmed>31780648</pubmed></ref><ref><pubmed>31955711</pubmed></ref><ref><pubmed>31823809</pubmed></ref>。PCA (Principal component analysis, 主成分分析)、更に発展させたUMAP（Uniform Manifold Approximation and Projection, 均一マニフォールド近似と投影）、Diffusion maps<ref><pubmed> 26002886<br />
</pubmed></ref>, tSNE(t-distributed Stochastic Neighbor Embedding , t分布型確率的近傍埋込み)などの手法が用いられる。 特に、tSNE[http://www.jmlr.org/papers/v9/vandermaaten08a.html]とUMAP[https://arxiv.org/abs/1802.03426]は、高次元データを低次元の点の集合として可視化することで、それぞれの細胞の持つトランスクリプトームの類似度についての直観的な表示が可能でありしばしば用いられる（図３）。tSNEよりUMAPの方が迅速に類似集団間の関係が明確になるので、最近はUMAPを利用することが多くなってきている。次に、[[Louvainアルゴリズム]]などでクラスタリング（コミュニティ分割）を行いグラフ上に表示できる（図３の色分け）。こうして、異なる転写状態を示す細胞の集合が別のクラスターとして表示され、同定可能になる<ref><pubmed>31500660</pubmed></ref>。<br />
[[ファイル:scFig3.jpg|サムネイル|250px|'''図３． tSNEとUMAPによる同じデータの可視化'''<br>網膜（ニワトリ）の視細胞のデータを用いて執筆者が作製[https://doi.org/10.1101/2020.10.09.333633<br />
}。]]<br />
==下流解析==<br />
===細胞クラスターの解釈とマーカー遺伝子候補の発見===<br />
scRNAseqデータから得られる生物学的知見には、内在的に存在する細胞の種類、外部刺激や環境で変化した細胞の状態、そして種類や変化により特徴的に発現するマーカー遺伝子候補の発見がある<ref><pubmed>27824854</pubmed></ref><ref><pubmed>32033589</pubmed></ref><br />
。クラスタリングにより、異なった細胞集団の存在が認識されると、それぞれのクラスター（群）に特徴的に発現している具体的な遺伝子を探索し、細胞集団の持つバイオマーカーによって、そのクラスター（群）の同定が可能になる。例えば、既に神経細胞とグリア細胞に特異的に発現する典型的マーカーはよく知られており、それぞれのクラスターの識別は容易である。更に、神経細胞のタイプ（下記参考）を区別できるマーカーや、外部刺激によって遺伝子発現が変化した神経細胞の状態は、In situ hybridizationや免疫組織化学などにより確認できる。このようなクラスターごとに発現が異なる遺伝子（差次的発現遺伝子）を見つけるためには（Differential expression analysis, DE analysis）、SeuratのFindMarkersコマンド中でも利用可能であるコード（MAST、DESeq2など<ref><pubmed>26653891</pubmed></ref><ref><pubmed>25516281</pubmed></ref><ref><pubmed>30658573</pubmed></ref>）を用いることができる。細胞ごとの差次的発現遺伝子のVisualization（表示可視化）には、ドットプロット（dot plot）、ヴァイオリンプロット（violin plot）、リッジプロット（Ridge plot, joy plot）、UMAPなどの次元圧縮図上に転写物量をプロットするFeatureプロット（feature plot）などが、目的に応じて頻繁に用いられる（図４）。<br />
[[ファイル:scFig4.jpg|サムネイル|300px|'''図４．scRNAseqデータの可視化の例 '''<br>A. ドットプロット。B.ヴァイオリンプロット。C. リッジプロット。D. UMAP（灰色）に転写物量（青）をプロットした Featureプロット。網膜の視細胞のデータを用いて執筆者が作製[https://doi.org/10.1101/2020.10.09.333633]。]]<br />
===擬時系列解析===<br />
実験的なノイズとは別に生物学的に意味のある遺伝子発現の変動には、位置情報、[[細胞周期]]、[[概日リズム]]、発現変動が大きい破裂型プロモーターの作動などの理由で 変動が見られるものもある<ref><pubmed> 31217225 </pubmed></ref><ref><pubmed> 26000846</pubmed></ref>。特に、刺激・薬剤処理やさまざまな病態の進行や治療に伴う細胞の変化、発生途上にある細胞系譜や細胞分化といった細胞の遷移状態の解析（[[軌道推定]]（Trajectory inference）；[[擬時系列解析]]（擬似時系列解析、偽時系列解析）、Pseudo-time analysis ）には、scRNAseqデータを用いることが効果的である<ref><pubmed>29576429</pubmed></ref><ref><pubmed>28813177</pubmed></ref><ref><pubmed>29565398</pubmed></ref>。しばしば用いられるMonocle3 <ref><pubmed>30787437</pubmed></ref>[https://cole-trapnell-lab.github.io/monocle3/]など、多くのコードを収集、比較しているサイトがある [https://dynverse.org][https://github.com/agitter/single-cell-pseudotime]。RNA velocityといったスプライシングされていく転写産物の量から細胞の分化状態を推定する方法もある<ref><pubmed>30089906</pubmed></ref><ref><pubmed> 32747759</pubmed></ref>。しかし、これらの方法は、あくまで[[細胞系譜]]や細胞分化の推定に過ぎない。細胞系譜を更に確実に観察しつつ、scRNAseqを行うことで、細胞タイプの系統関係を調べる方法として、CRISPR-Cas9を用いた[[ゲノム編集]]による痕跡追跡記録法を導入したscGESTALT<ref><pubmed>29608178</pubmed></ref>、ScarTrace<ref><pubmed>29590089</pubmed></ref> 、LINNAEUS<ref><pubmed>29644996</pubmed></ref>、あるいはアデノシンデアミナーゼでRNA編集を行いタイムスタンプを入れる方法<ref><pubmed>33077959</pubmed></ref>がある。1塩基バリアント（Single-nucleotide variants: SNV）の系統的解析は、細胞の不均一性や系統的な関係を明らかにするための最も有望なアプローチの一つである<ref><pubmed>31744515</pubmed></ref>。<br />
===遺伝子制御ネットワーク、パスウェイ解析など===<br />
また細胞分化や刺激などによる変動に伴う特徴的な遺伝子発現をscRNAseqで観察することは、遺伝子制御ネットワーク（例、SCENIC<ref><pubmed>28991892</pubmed></ref>, [https://github.com/aertslab/SCENIC]）、[[代謝経路]]や[[シグナル伝達系]]のための[[パスウェイ解析]](例、Metascape<ref><pubmed>30944313</pubmed></ref>, [http://metascape.org]、Gene Ontolgoy[http://geneontology.org])を理解するシステム生物学的な研究として有用である<ref><pubmed>32051003</pubmed></ref>。更に、scRNAseqで得られた結果をもとに、細胞間相互作用の理解を深めるのを目的とするCellPhoneDB<ref><pubmed>32103204</pubmed></ref>[https://github.com/Teichlab/cellphonedb]、NicheNet<ref><pubmed>3181926</pubmed></ref>, SVCA<ref><pubmed>31577949</pubmed></ref>などがある。特に、Perturb-seq<ref><pubmed>27984732</pubmed></ref> やその変法<ref><pubmed> 32231336</pubmed></ref>は、CRISPRライブラリーによるゲノム編集を施した細胞をscRNAseqで解析することで、ゲノム編集で破壊された遺伝子の機能や遺伝子間の相互作用の理解を可能にしている後述する複数モダリティ情報を取り込んだscRNAseqの１つであり、注目されている。<br />
==scRNAseqの神経科学研究への適用==<br />
===神経系細胞ビッグデータとしてのscRNAseq===<br />
様々な神経・精神疾患について理解しその診断や治療に役立てるためには、神経細胞、[[グリア細胞]]を中心にした神経系にある細胞の種類や状態を識別し、それぞれの細胞における分子的な変化を観察することが重要である <ref><pubmed>28775344</pubmed></ref><ref><pubmed>29738987</pubmed></ref>。本項目で解説してきたscRNAseq技術は、神経系に見られるそれぞれの細胞のトランスクリプトームについて[[ビッグデータ]]を提供することで、この細胞の種類や状態の識別に新たな判断材料を与えつつある。近年、中枢神経系の[[アストロサイト]]、[[オリゴデンドロサイト]]、ミクログリアといったグリア細胞も均一ではなく、内在的な多様性や外部因子による状態の変動が報告されてきている。神経細胞は、著しく多様であり、この多様性が神経系の多彩で複雑な機能発現の基盤となっている。従来の神経科学では、神経細胞の多様性は、それぞれの神経細胞の解剖学的な位置、発現している分子、電気生理学、結合性、形態、神経伝達物質、神経伝達物質受容体とシグナル伝達によって識別されてきている。こうした神経細胞の多様性を便宜的に記述するのに、タイプ（type）、クラス（class）、サブクラス（subclass）、サブタイプ（subtype） というような用語が用いられてきた。しかし、ここでは混乱を防ぐため、Masland（2004）<ref><pubmed>15242626</pubmed></ref>が提唱し、広く受けいれられている「クラス」と「タイプ」という単語を用いることとする。タイプは、これ以上分類することができないとされる階層であり、共通性を持つタイプの集団がクラスである。例えば、大脳皮質の錐体細胞、網膜神経節細胞といった大雑把な区分はクラスである。大脳皮質の錐体細胞というクラスは、層や領野によって異なるタイプ、網膜神経節細胞には視覚情報に対して応答が異なるタイプが存在する。scRNAseqは、「タイプ」の理解に新たな視点を提供している。<br />
===神経系へのscRNAseqの適用===<br />
scRNAseqの神経系での利用については、次々と新しい論文やプレプリントが発表されており、ここではscRNAseqで得られてきた情報の典型例を紹介することにとどめる。<br />
<br />
[[大脳皮質]]には、[[錐体細胞]]や[[非錐体細胞]]などの神経細胞や様々なグリア細胞などが見られ、古くから神経細胞タイプの識別が行われてきた。初期のFluidigm C1を用いたscRNAseq技術でも、マウス皮質の小規模な細胞数を分類した研究で、これまで知られていた主要な神経細胞タイプとは違うタイプが見つかりscRNAseqの有効性が示された<ref><pubmed>25700174</pubmed></ref>。その後のドロップレット使用の3’エンドリード法を利用した多数の細胞数の解析で、更に多数の神経細胞のタイプが見つかっている<ref><pubmed>32839617</pubmed></ref><ref><pubmed>28846088</pubmed></ref><ref><pubmed>30096299</pubmed></ref><ref><pubmed>30096314</pubmed></ref><ref><pubmed>30382198</pubmed></ref><ref><pubmed>29320739</pubmed></ref><ref><pubmed>28846088</pubmed></ref>[https://doi.org/10.1101/2020.03.14.991018][https://doi.org/10.1101/2020.06.04.105700] [https://doi.org/10.1101/2020.07.02.184051]。特に、GABA作動性介在神経細胞タイプの多様性とその発生<ref><pubmed>28942923</pubmed></ref><ref><pubmed>28134272</pubmed></ref><ref><pubmed>29472441</pubmed></ref><ref><pubmed>29513653</pubmed></ref>についての、これまでの組織化学的な研究からは得られていなかった多くの情報は重要であろう。また、初期の発生過程<ref><pubmed>26940868</pubmed></ref><ref><pubmed>30485812</pubmed></ref><ref><pubmed>31073041</pubmed></ref><ref><pubmed>30635555</pubmed></ref><ref><pubmed>30625322</pubmed></ref>、老化<ref><pubmed>31551601</pubmed></ref>の理解が、scRNASeq技術を利用することで進んでいる。更に、[[神経活動]]や[[臨界期]]に伴い変化するmRNAも細胞ごとに調査され興味深い<ref><pubmed>29230054</pubmed></ref> <ref><pubmed>32404418</pubmed></ref>。 ヒトを含めた霊長類の大脳についても発達段階を含めてscRNAseqが適用されてきている<ref><pubmed>26060301</pubmed></ref><ref><pubmed>27339989</pubmed></ref><ref><pubmed>29539641</pubmed></ref><ref><pubmed>29217575</pubmed></ref><ref><pubmed>28846088</pubmed></ref><ref><pubmed>29227469</pubmed></ref><ref><pubmed>31303374</pubmed></ref><ref><pubmed>29867213</pubmed></ref><ref><pubmed>31435019</pubmed></ref><ref><pubmed>32424074</pubmed></ref> [https://doi.org/10.1101/709501][https://doi.org/10.1101/2020.03.31.016972][https://doi.org/10.1101/2020.04.23.056390]。ヒトや霊長類に特徴的とされる[[島]]のvon Economo神経細胞（紡錘細胞）のような希少な神経細胞のscRNAseqにも成功している<ref><pubmed>32127543</pubmed></ref>。<br />
<br />
[[海馬]]<ref><pubmed>29241552</pubmed></ref><ref><pubmed>29912866</pubmed></ref><ref><pubmed>29335606</pubmed></ref><ref><pubmed>31942070</pubmed></ref>では、これまでの研究で記載されてきた神経細胞のタイプの存在が確認され、更に新規のタイプが見つかった。中枢神経系では、その他、[[外側膝状体]]<ref><pubmed>29343640</pubmed></ref>、[[大脳基底核]](足底核)<ref><pubmed>28384468</pubmed></ref> 、[[視床下部]]<ref><pubmed>28166221</pubmed></ref><ref><pubmed>28355573</pubmed></ref> <ref><pubmed>27991900</pubmed></ref><ref><pubmed>30385464</pubmed></ref> <ref><pubmed>31249056</pubmed></ref><ref><pubmed>30858605</pubmed></ref>、[[線条体]]<ref><pubmed>27425622</pubmed></ref><ref><pubmed>30134177</pubmed></ref><ref><pubmed>31875543</pubmed></ref>、[[中脳]]<ref><pubmed>27716510</pubmed></ref><ref><pubmed>29499164</pubmed></ref> <ref><pubmed>30718509</pubmed></ref> 、[[手綱]]<ref><pubmed>29576475</pubmed></ref>、発生中の[[間脳]]<ref><pubmed>30872278</pubmed></ref> 、さらに[[小脳]]<ref><pubmed>30220501</pubmed></ref><ref><pubmed>30735127</pubmed></ref><ref><pubmed>30690467</pubmed></ref>などの結果が報告されてきている。例えば、構成する細胞についての情報が詳細に研究されてきたと思われていたマウスの小脳においても、分子層にこれまでの星状細胞、バスケット細胞というカテゴリーとは違ったギャップジャンクションに特徴を持つ２種類の神経細胞があることが示唆されている[https://doi.org/10.1101/2020.03.04.976407]。<br />
<br />
脳の外部では、[[運動神経]][https://doi.org/10.1101/2020.03.16.992958]、[[感覚神経]]<ref><pubmed>25420068</pubmed></ref><ref><pubmed>26691752</pubmed></ref>、[[らせん神経節]]<ref><pubmed>30078709</pubmed></ref><ref><pubmed>30209249</pubmed></ref> 、[[臭覚神経]]<ref><pubmed>26541607</pubmed></ref> <ref><pubmed>32059767</pubmed></ref>、[[腸神経系]] <ref><pubmed>29483303</pubmed></ref>[https://doi.org/10.1101/2020.03.02.955757] 、[[網膜]]<ref><pubmed>27565351</pubmed></ref><ref><pubmed>29909983</pubmed></ref><ref><pubmed>30018341</pubmed></ref><ref><pubmed>31260032</pubmed></ref><ref><pubmed>31128945</pubmed></ref><ref><pubmed>30712875</pubmed></ref><ref><pubmed>30548510</pubmed></ref><ref><pubmed>31075224</pubmed></ref><ref><pubmed>31399471</pubmed></ref><ref><pubmed>31848347</pubmed></ref><ref><pubmed>31673015</pubmed></ref><ref><pubmed>31653841</pubmed></ref><ref><pubmed>31784286</pubmed></ref>[https://doi.org/10.1101/2020.02.26.966093][https://doi.org/10.1101/779694][https://www.biorxiv.org/content/10.1101/617555] [https://doi.org/10.1101/2020.10.09.333633]でのscRNAseqデータがある。<br />
<br />
また[[iPS細胞]]や[[ES細胞]]由来の神経組織[[オルガノイド]]に含まれる神経細胞タイプを知る上でも利用されている<ref><pubmed>28094016</pubmed></ref><ref><pubmed>28279351</pubmed></ref><ref><pubmed>31168097</pubmed></ref><ref><pubmed>31996853</pubmed></ref><ref><pubmed>31968264</pubmed></ref><ref><pubmed><ref><pubmed>32221280</pubmed></ref>。このようなアプローチは、ネアンデルタール人型の遺伝子を持つ脳オルガノイドの解析<ref><pubmed> 32559457</pubmed></ref>やSARS-CoV-2に感染する脳オルガノイド中の細胞の同定<ref><pubmed> 33113348</pubmed></ref>など、新たな応用例が発表されてきており興味深い。<br />
<br />
===神経細胞以外の細胞===<br />
[[上衣細胞]]<ref><pubmed>29727663</pubmed></ref>は、[[神経幹細胞]]としての役割が示唆されてきたが、scRNAseqによる解析ではその可能性が支持されなかった。グリア細胞では、[[ラジアルグリア]]<ref><pubmed>26406371</pubmed></ref><ref><pubmed>25734491</pubmed></ref><ref><pubmed>29281841</pubmed></ref><ref><pubmed>29217575</pubmed></ref><ref><pubmed>29539641</pubmed></ref>、アストロサイト<ref><pubmed>32139688</pubmed></ref><ref><pubmed>32203496</pubmed></ref>[https://doi.org/10.1101/2020.04.27.064881]に多様性があることが示唆されてきている。また、オリゴデンドロサイト<ref><pubmed>27284195</pubmed></ref><ref><pubmed>30078729</pubmed></ref><ref><pubmed>30257220</pubmed></ref><ref><pubmed>30747918</pubmed></ref><ref><pubmed>31958186</pubmed></ref>[https://doi.org/10.1101/2020.03.06.981373]については、これまで細胞生物学的に研究されてきた分化の過程がscRNAseqにより詳細に解析されている。ミクログリアは、神経系の発達、老化、損傷などに伴う重要なトランスクリプトームの変化がscRNAseqにより詳細に明らかになった<ref><pubmed>27338705</pubmed></ref><ref><pubmed>29020624</pubmed></ref><ref><pubmed>30206190</pubmed></ref><ref><pubmed>30471926</pubmed></ref><ref><pubmed>31209379</pubmed></ref><br />
<ref><pubmed>31835035</pubmed></ref>。また、[[CNS境界関連マクロファージ]](BAM) <ref><pubmed>31061494</pubmed></ref>や[[脳血管系]]<ref><pubmed>29443965</pubmed></ref>のscRNAseqも実施されている。<br />
===疾患===<br />
scRNAseqは、疾患の理解にも有用である。scRNAseqでは、疾患に伴う遺伝子発現の変化を細胞タイプごとに観察することができるので、バルクRNAseqでは埋もれていた遺伝子発現の変化や細胞ごとの変化を検出できるという長所がある。<br />
例えば、筋萎縮性側索硬化症<ref><pubmed>30948552</pubmed></ref>、多発性硬化症<ref><pubmed>30747918</pubmed></ref><ref><pubmed>30420755</pubmed></ref><ref><pubmed>32313246</pubmed></ref> <br />
、アルツハイマー病やそのモデル動物<ref><pubmed>31042697</pubmed></ref><ref><pubmed>31399126</pubmed></ref><ref><pubmed>29020624</pubmed></ref><br />
[https://doi.org/10.1101/628347]<ref><pubmed>28602351</pubmed></ref><ref><pubmed>32341542</pubmed></ref>、統合失調症<ref><pubmed>29785013</pubmed></ref><ref><pubmed>32203495</pubmed></ref>、自閉症やレット症候群<ref><pubmed>31097668</pubmed></ref><ref><pubmed>30455458</pubmed></ref>、シャルコー・マリー・トゥース病<ref><pubmed>29888333</pubmed></ref>、ダウン症[https://www.biorxiv.org/content/10.1101/2020.01.01.892398v1]、パーキンソン病<ref><pubmed>30503143</pubmed></ref> <ref><pubmed>32826893</pubmed></ref>、がん<ref><pubmed>31327527</pubmed></ref><ref><pubmed>28360267</pubmed></ref>などに適用されている。最近、Perturb-seqにより、自閉症に関わる遺伝子の欠損に伴う細胞状態の変化などもscRNAseqで報告されており<ref><pubmed>33243861</ref></pubmed>、疾患の理解のための新たな実験系の開発も始まりつつある。<br />
==scRNAseqの展望==<br />
===神経系の多様性と進化===<br />
NGSを用いることで、どんな生物種にも適用可能なscRNAseqは、既に多様な生物の神経系の細胞の理解、更には種間の相同性や差異の研究に利用されており、神経系の進化を細胞レベルで考察するのに有用であろう（例、線虫<ref><pubmed> 28818938 </pubmed></ref>、ショウジョウバエ <ref><pubmed>29909982</pubmed></ref><ref><pubmed>29149607</pubmed></ref><ref><pubmed>30703584</pubmed></ref><ref><pubmed>29909983</pubmed></ref><ref><pubmed>33125872</pubmed></ref>、カタユウレイボヤCiona intestinalis <ref><pubmed>30069052</pubmed></ref><ref><pubmed>30228204</pubmed></ref>、ゼブラフィッシュ<ref><pubmed>31018142</pubmed></ref><ref><pubmed>30929901</pubmed></ref>、アカミミガメTrachemys scripta elegans、トカゲPogona vitticeps, pv<ref><pubmed>29724907</pubmed></ref>、ニワトリ[https://doi.org/10.1101/2020.10.09.333633]、霊長類<ref><pubmed>30730291</pubmed></ref><ref><pubmed>31619793</pubmed></ref>[https://doi.org/10.1101/2020.03.31.016972]）。ただ、遺伝子やトランスクリプトームの研究が進んでいる生物種では比較的容易であるが、遺伝子のアノテーションが十分でない生物種を用いる場合、scRNAseqのデータ解析は困難を伴う。また種を超えた細胞タイプの相同性の理解には様々な工夫が必要である<ref><pubmed>31552245</pubmed></ref><ref><pubmed>30712875</pubmed></ref>[https://doi.org/10.1101/2020.03.31.016972]。<br />
===データベースと統合===<br />
獲得されたscRNAseqのデータは様々な目的で利用できるので、データベース化し利用できるようにする必要がある。神経系のトランスクリプトーム一般のデータベースが多数公開されており<ref><pubmed>29437890</pubmed></ref>、scRNAseqのデータも基本的にNCBIのGene Expression Omnibus[https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/]に登録されている。また、オープンサイエンス推進のためにcommon coordinate framework (CCF) やcentral annotation platform (CAP)という概念のもと、特にscRNAseqを意識したものとして、米国のBRAIN Initiative Cell Census Consortium<ref><pubmed>29096072</pubmed></ref> 、Human Cell Atlas ProjectのHuman Cell Atlas Data Portal [https://data.humancellatlas.org]、そのマウス版であるTabula Muris <ref><pubmed>30283141</pubmed></ref>[https://genome.ucsc.edu/cgi-bin/hgTrackUi?db=mm10&g=tabulaMuris]やSten Linnarssonラボのマウス脳発生データベース[http://mousebrain.org]、アレン脳研究所のAllen Brain Atlas [https://portal.brain-map.org]、ブロード研究所のSingle Cell Portal [https://singlecell.broadinstitute.org/]などのデータベースが稼働している。また、異なった方法や実験で得られたscRNAseqのデータや後述の複数モダリティのシングルセルオミクスのデータを体系的に比較することも重要であり、CCA (Canonical correlation analysis)<ref><pubmed>29608179</pubmed></ref>, Seurat 3.0以降に組み込まれたMMN (Mutual Nearest Neighbors)、LIGER<ref><pubmed>31178122</pubmed></ref> 、Harmony<ref><pubmed>31740819</pubmed></ref> 、MetaNeighber<ref><pubmed>29491377</pubmed></ref>、Conos<ref><pubmed>31308548</pubmed></ref>[https://doi.org/10.1101/2020.05.22.111161]のようなアルゴリズムが開発され、後述の複数モダリティのシングルセルオミクスを組み込んだ統合サイトもでき始めている（[https://biccn.org]）。またデータベースを利用して発現類似性検索も研究されている<ref><pubmed>29608555</pubmed></ref><ref><pubmed>30744683</pubmed></ref>。<br />
<br />
===空間トランスクリプトミクス===<br />
多数の細胞を扱うscRNAseqの弱点は、組織から細胞や細胞核を解離する必要があるので、その細胞が存在していた解剖学的あるいは空間的な位置の情報を消去してしまうということである。組織切片におけるタンパク質などの分布は免疫組織化学、mRNAの分布はin situ hybridizationで検出することができるが、数多くのmRNAの分布を情報処理技術と組み合わせ一気に同定する方法がscRNAseqと同様に開発されてきている（Slide-seq<ref><pubmed>30923225</pubmed></ref><ref><pubmed> 33288904</pubmed></ref>、HDST<ref><pubmed>31501547</pubmed></ref>、Expansion sequencing[http://doi.org/10.1101/2020.05.13.094268]など<ref><pubmed>27365449</pubmed></ref>, <ref><pubmed>31932730</pubmed></ref> <ref><pubmed>30948552</pubmed></ref>）、更に10x Genomics社が市販するVisiumなどがある。現状では、大きな組織の空間トランスクリプトミクスは、空間解像度は限定されており、技術普及の観点からも課題が多い。しかし、そのデータを解析するためのアルゴリズム<ref><pubmed>29553578</pubmed></ref><ref><pubmed>29553579</pubmed></ref><ref><pubmed>32350282</pubmed></ref> [https://doi.org/10.1101/757096][https://doi.org/10.1101/701680] [https://doi.org/10.1101/431957]、<br />
更にMerFish <ref><pubmed>25858977</pubmed></ref>、corrFISH<ref><pubmed>27271198</pubmed></ref>のように、subcellularレベルで多数のmRNAを検出する方法が多数開発されてきており（文献：<ref><pubmed>25549890</pubmed></ref> osmFISH<ref><pubmed>30377364</pubmed></ref> 30377364、STARmap (spatially-resolved transcript amplicon readout mapping) <ref><pubmed>29930089</pubmed></ref>、seqFISH+<ref><pubmed>27764670</pubmed></ref>、pciSeq(probabilistic cell typing by in situ sequencing)[https://doi.org/10.1101/431957]、DSP(Digital Spatial Profiling) <ref><pubmed>32393914</pubmed></ref>、scRNAseqと組み合わせることで、その弱点を補う空間トランスクリプトミクスにも利用され始め<ref><pubmed>30385464</pubmed></ref>[https://doi.org/10.1101/2020.06.04.105700]、今後の発展が期待される分野である。<br />
===統合解析 ===<br />
同一の細胞からscRNAseqの情報だけでなく、ゲノム配列、ATAC-seqなどによるエピゲノム解析、少数のタンパク質、あるいはプロテオームなど複数のモダリティを同時に観察するオミクス（Single-cell multimodal omics）が注目されている<ref><pubmed>31907462</pubmed></ref><ref><pubmed>30696980</pubmed></ref>。2019年には、Nature Methodsの「Methods of the Year」に選ばれており、現状については、その特集号などを参考にされたい。例えば、細胞表面に提示されているマーカー分子に対する抗体にDNAを付加することで、そのマーカーを発現する細胞のトランスクリプトームを解析するCITE-seq<ref><pubmed>28759029</pubmed></ref>、 REAP-seq<ref><pubmed>28854175</pubmed></ref>も、既知の細胞表面マーカーの発現とscRNAseqが同時に観察できる方法である。<br />
<br />
複数モダリティのシングルセルオミクスとして、神経科学分野で注目されるのは、scRNAseqをパッチクランプによる電気生理学的情報と組み合わせたPatch-seq<ref><pubmed>26689544</pubmed></ref> <ref><pubmed>26689543</pubmed></ref>である。また、ゲノムDNAとscRNAseqを同時に観察することによって、近年、精神疾患の観点から注目されている発生途中で生じる遺伝子変異を研究するPRDD-seqは今後の展開が注目される[https://doi.org/10.1101/2020.04.19.046904]。最後に、BARseq (barcoded anatomy resolved by sequencing) <ref><pubmed>31626774</pubmed></ref>、CONNECTID[https://doi.org/10.1101/378760]、Epi-Retro-seq[https://doi.org/10.1101/2020.04.01.019612]のような方法は、[[コネクトーム]]（神経細胞の結合性）と遺伝子発現を記録できるオミクスの新たな方向として興味深い。<br />
== 関連項目 ==<br />
*[[ゲノムワイド関連解析 ]]<br />
*[[ディファレンシャルディスプレイ ]]<br />
*[[In situハイブリダイゼーション法 ]]<br />
*[[免疫組織化学法]]<br />
*[[エピジェネティクス]]<br />
== 参考文献 ==<br />
<references /></div>
Masahitoyamagata
https://bsd.neuroinf.jp/w/index.php?title=%E3%82%B7%E3%83%B3%E3%82%B0%E3%83%AB%E3%82%BB%E3%83%ABRNA%E3%82%B7%E3%83%BC%E3%82%B1%E3%83%B3%E3%82%B7%E3%83%B3%E3%82%B0&diff=45298
シングルセルRNAシーケンシング
2020-12-12T19:03:30Z
<p>Masahitoyamagata: </p>
<hr />
<div><div align="right"> <br />
<font size="+1">[http://researchmap.jp/yamagatm 山形方人]</font><br><br />
''Harvard University''<br><br />
DOI：<selfdoi /> 原稿受付日：年月日 原稿完成日：年月日<br><br />
担当編集委員：<br><br />
</div><br />
英：single-cell RNA sequencing, scRNAseq<br />
{{box|text=<br />
シングルセルRNAシーケンシング(single-cell RNA sequencing, 以下scRNAseq)は、[[次世代シーケンサー]] （next generation sequencer、以下NGS）を用いることで、個々の細胞が保持しているmRNA全体を質的、量的に網羅的に調べる方法である。次元圧縮などの数理的な解析と組み合わせることで、遺伝子発現の状態に基づいた細胞の分類を行うことが可能であり、従来の組織学的、あるいは細胞生物学的手法では知られなかった新規の細胞種の同定や細胞状態の推定を行うことが可能になった。また、遺伝子発現プロファイルの変化に基づく擬時系列解析によって、刺激や発生に伴う細胞状態の遷移の描写ができる。神経系では、この方法により、神経細胞や非神経細胞の分類や状態についての知見が深まり、新しい神経細胞タイプ、細胞マーカー、病態の理解、更に機能的な遺伝子の同定などが系統的かつ網羅的に行われるようになった。scRNAseqに、空間的情報、エピゲノム情報、タンパク質情報などの複数モダリティを取り入れた統合解析（multimodal single-cell omics）も行われている。<br />
}}<br />
<br />
==scRNAseqの背景==<br />
===トランスクリプトーム===<br />
トランスクリプトーム（transcriptome）は、細胞中に存在する全ての転写産物（タンパク質をコードするmRNA、タンパク質をコードしない[[ノンコーディングRNA]]、[[マイクロRNA]]など）の総体である<ref><pubmed>19015660</pubmed></ref><ref><pubmed>31341269 </pubmed></ref>。トランスクリプトームは、[[ゲノム]]とは異なり、同一の個体でも、組織ごとに、更には発生段階や細胞外環境や刺激によって変化する。トランスクリプトームは、同質あるいは異質の多数の細胞集団（組織、培養細胞）からRNA抽出後、cDNAに変換し、それを1990年代に出現した[[DNAマイクロアレイ]]のように数多くの既知mRNAを識別する技術によって解析されるようになった。その後、NGSの利用により、希少mRNAやノンコーディングRNAを含めた未知の転写産物の高感度検出が可能になるとともに、[[スプライシング]]で成熟していく過程のmRNAなど、転写産物の種類だけでなく、転写産物の構造的差異（スプライシングバリアント、SNPs、変異など）の解析もできるようになった。加えて、ヒトやモデル実験生物（[[マウス]]、[[ゼブラフィッシュ]]、[[ショウジョウバエ]]、[[線虫]]など）だけでなく、多種多様な生物のトランスクリプトームの把握も可能になった。従来から行われてきた組織全体などの多数の細胞を対象としたRNA-seq（バルクRNAseq）では、複数の細胞における転写産物の平均を観察しているが、本項目では個々の細胞における転写産物を解析するscRNA-seqの原理とその応用について概説する。<br />
<br />
===scRNAseqとその開発史===<br />
1つの細胞の持つ生体物質を解明し、定量しようとする試みは古くからあった。1960年代になると、フローサイトメトリーを利用した[[蛍光活性化セルソーティング]]（Fluorescence-activated cell sorting, FACS）が発明され、標識抗体などのプローブと組み合わせることで、多数の細胞集団の中で１つの細胞が保持している生体分子の種類や量についての断片的な研究が可能になり、この方法は現在でも汎用されている<ref><pubmed>22271369</pubmed></ref>。その後、[[免疫組織化学]]や[[in situ hybridization]]nなどにより、タンパク質やmRNAの種類や量が観察できるようになり、組織中に存在するそれぞれの細胞の同定などに活用されてきている。最近では、それぞれの細胞が持つ抗原分子を、異なった金属イオンで標識した抗体とフローサイトメトリーを組み合わせた方法で検出する[[マスサイトメトリー]]（CyTOFなど）も開発されてきている<ref><pubmed>27153492</pubmed></ref>。<br />
<br />
細胞種にもよるが、1つの細胞内にある全RNA（ribosomal RNAを含む）は細胞種にもよるが1-50pgである。そのうち、mRNAの占める割合は1-5%程度である<ref><pubmed>15239941</pubmed></ref>。この微量のmRNAをcDNAに変換してから大幅に増幅できる方法が発明されたことで、1つの細胞が発現するmRNAを高感度で検出できるようになった<ref><pubmed>1557406</pubmed></ref><ref><pubmed>7541630</pubmed></ref> 。例えば、1991年、Linda BuckとRichard Axelは、[[嗅覚受容体]]が[[Gタンパク質]]であると仮定し、個々の嗅覚細胞で特異的に観察されるGタンパク質mRNAを比較することで、嗅覚受容体の同定に成功した<ref><pubmed>1840504</pubmed></ref>。1995年になると、Catherine DulacとRichard Axelは、異なる[[鋤鼻神経細胞]]で特異的に発現する遺伝子を１つの細胞から作製したcDNAライブラリーを比較するディファレンシャル・スクリーニングを行うことで、[[フェロモン受容体]]を同定した<ref><pubmed>7585937</pubmed></ref>。同じ手法で異なる種類の神経細胞で発現している遺伝子も同定され<ref><pubmed>9778248</pubmed></ref><ref><pubmed>12230981</pubmed></ref>、１つの細胞の持つトランスクリプトームを比較するアプローチが神経細胞で特徴的に発現している遺伝子の同定に効果的なことが示された。<br />
<br />
一方で多くの種類のmRNAを１細胞レベルで一挙に観察するための技術には感度やスループット、そしてコストの観点からブレークスルーが待たれた。1つの問題は多種類のcDNAを簡便に識別することを可能にする方法の開発であった。これを可能にしたのが、[[PCR]]などのcDNA増幅法の改良と[[マイクロアレイ]]の利用であった<ref><pubmed>12736331</pubmed></ref><ref><pubmed>16547197</pubmed></ref>。しかしながら、細胞ごとに高価なマイクロアレイを使用することは、多数の細胞のトランスクリプトームの観察には限界があった。2009年になると、これらの問題を解決できる可能性として、NGSを利用するscRNAseqプロトコールがAzim Suraniのグループによって報告された<ref><pubmed>19349980</pubmed></ref>。しかしながら、多数のマイクロアレイでなく1回のNGS使用で済ませることができるものの、この報告でもわずか8個の細胞の解析に留まっており、1つの細胞ごとに処理を行うという操作が必要で、多数の細胞についてのトランスクリプームを一挙に理解することはできなかった。また、塩基配列の違うcDNAごとにPCR効率に差がある結果生じる増幅バイアス、また3’末端側が選択的に補足されることなどの課題があった。<br />
<br />
==scRNAseqの現状==<br />
===scRNAseqの分子生物学的反応=== <br />
その後、5’末端側の領域まで効率よく増幅するscRNAseqのプロトコールが考案された<ref><pubmed>32518403</pubmed></ref>。特に、SMART-seq（Switching mechanism at the 5' End of RNA Templates）<ref><pubmed>22820318</pubmed></ref>およびその改良されたプロトコールであるSMART-seq2<ref><pubmed>24056875</pubmed></ref> <ref><pubmed>24385147</pubmed></ref>の使用例が多い（既に、SMART-seq3という改良プロトコールもある<ref><pubmed>32518404</pubmed></ref>が、以下SMART-seqと呼ぶ）。また、類似法としてSTRT（single-cell tagged reverse transcription）<ref><pubmed>21543516</pubmed></ref>などがある。<br />
<br />
一方、CEL-seq（Cell Expression by Linear amplification and Sequencing）<ref><pubmed>22939981</pubmed></ref>、CEL-seq2<ref><pubmed> 27121950 </pubmed></ref> 、MARS-seq（Massively parallel single-cell RNA-seq）<ref><pubmed>24531970 </pubmed></ref>では、[[T7 RNAポリメラーゼ]]による[[in vitro転写]]を用いることにより、ＰＣＲによる増幅で見られるバイアスを低減させようとしている。<br />
<br />
また、Quartz-SeqやQuartz-Seq2ではPCR用のアダプターを付加する反応にポリAテーリングを利用することで、他の手法と比較して1.5-5倍程度の遺伝子を検出できる<ref><pubmed> 32518403</ref></pubmed>。<br />
===バーコード技術 ===<br />
増幅バイアス除去のアプローチとして特に重要なのは、2011年に発表された核酸配列バーコードを利用した方法で、分子識別子（unique molecular identifiers: UMI）を持つcDNAを増幅させ、NGS後の情報処理を用いるものであると考えられる<ref><pubmed>22101854</pubmed></ref>。この方法では逆転写反応の際、ランダム塩基配列から構成されるUMIをcDNA末端に付加した後、増幅反応、NGSを行い、cDNA配列とUMI配列の両方を読む。cDNAにはRNA1分子に1つのUMIが付加されるので、同一のUMIを持っていれば、逆転写時に同一のcDNA由来とカウントする。UMIをカウントすることで、増幅前のmRNAのコピー数を知ることができる<ref><pubmed>21543516</pubmed></ref><ref><pubmed>24363023</pubmed></ref><ref><pubmed>28192419</pubmed></ref> <ref><pubmed>29474909</pubmed></ref><ref><pubmed> 28818938 </pubmed></ref><ref><pubmed>29545511</pubmed></ref>。<br />
===多様なプラットフォーム===<br />
細胞を分別するプラットフォームには、マイクロピペットによる捕獲、セルソーター、[[レーザー捕獲]]などを用いるマルチウェル法、あるいは半導体集積回路様の製作技術で作った流体回路を利用するFluidigm C1の装置（C1 Single- Cell Auto Prep<br />
）[https://jp.fluidigm.com] 、更にドロップレット使用（下記）などがある<ref><pubmed>30405621</pubmed></ref>[https://doi.org/10.1101/742304]。これらは、SMART-seqと組み合わせて利用されることが多い。SMART-seqプロトコールの特徴は、全長mRNAのトランスクリプトーム情報を得ることができることであり、mRNAのスプライシングバリアントなどのアイソフォーム、SNPsの情報を利用したアリル特異的発現、変異の検出にも利用できる。また、それぞれ細胞ごとの反応を独立した場所で行うため、反応中に別の細胞の反応と混じる可能性が低い。小型のナノウェルを用いるSeq-Wellも同様に反応自体が混じる可能性が低い<ref><pubmed>28192419</pubmed></ref>。これらの点が、次に説明するドロップレットを使用して3’末端のみを標的にしたscRNAseqと比べた場合の長所であるが、その高コスト（1細胞あたり数十ドル）と処理可能な細胞数の少なさが短所である。<br />
<br />
これらとは別に、ハイスループットで安価な方法として、それぞれの細胞を独立に標識するのではなく、プールされた細胞を異なるウェルにランダムに振り分け、ウェル固有のバーコードで転写物を標識していく操作を複数回繰り返していくことで細胞を区別するSplit-seqやsci-RNA-seq3などの方法も用いられている<ref><pubmed>29545511</pubmed></ref><ref><pubmed>30787437</pubmed></ref>。<br />
===ドロップレット使用の3’エンドリード法===<br />
scRNAseqのプラットフォームと方法について重要と考えられる進歩は、2015年、Harvard Medical Schoolの独立した２つのグループが、inDrops<ref><pubmed>26000487</pubmed></ref>そしてDrop-seq<ref><pubmed>26000488 </pubmed></ref>という類似した2つのハイスループットな方法を開発したことであろう（inDropsはT7RNAポリメラーゼ、Drop-seqはPCRで増幅）。これらの方法では、[[マイクロ流体力学]] (Microfluidics) 、 UMI（上述）と細胞ごとのバーコード（Cell Barcode）という2種類のDNAバーコーディング、そしてNGSと情報解析法を利用している。そして、多く細胞のサンプル調製の自動化と容易さから、1つの細胞あたりに要するコストを大幅に低下させることに成功した（Drop-seqは発表時で、１細胞あたり約5セント）。つまり、細胞1つずつをマイクロ流体力学によるエマルジョン作製技術を利用した装置に流入させ、その１細胞を1つのドロップレットに自動的に閉じ込める。そのドロップレット中には、ドロップレットごとにCell barcode/UMIとしてユニークなDNAバーコードを持つゲルビーズ(Gel Beads in Emulsion, GEMs)が入っており、それを足場に3’末端のみを標的にしたcDNA合成反応を実施することで、同じ細胞に含まれていた1分子のmRNAが同じCell barcodeを持つcDNAとして合成され、そのmRNA/cDNAが由来した細胞を識別できるということを利用している（図１）。<br />
<br />
DropSeqはコストが低いが、細胞の取得率と検出感度が低い弱点がある。inDropsはDropSeqより細胞取得率が高く、パラメータを調整することにより、低レベルで発現される遺伝子の検出にも有利であるとされる<ref><pubmed>30472192</pubmed></ref>。DropSeqのセットアップはDolomite Bio ([https://www.dolomite-bio.com])、inDropは1 Cellbio社から販売されている[https://1cell-bio.com]。しかし、その後、10x Genomics社が同様の原理を用いた「Chromium」と命名された機器とそのための試薬を市販することで、多くの研究者が容易に利用できるようになっている<ref><pubmed>28091601</pubmed></ref>[https://www.10xgenomics.com/jp/]。Svenssonらによる最近のデータベース[https://doi.org/10.1101/742304], [http://www.nxn.se/single-cell-studies/gui]では、scRNAseqを用いた論文で用いられた方法について調査している。この数年、10x Genomics社Chromiumを用いた論文が飛躍的に増加している。10x Genomics社Chromiumのシステムは市販であるので導入が容易であり、DropSeqやinDropsに比べ多くの転写産物の検出が可能であるが、それらよりランニングコストは高価である<ref><pubmed>30472192</pubmed></ref>。なお、3’エンドリード法だけでなく、抗体やT 細胞レセプターのN末端側に位置する可変領域の配列決定が可能である5'末端のシーケンシングには5’エンドリード法が利用されることがある。<br />
<br />
[[ファイル:scFig1.jpg|サムネイル|300px|'''図1．ドロップレット使用の3’エンドリード法 '''<br>組織から解離させた細胞それぞれを、マイクロ流体力学を利用した装置で、バーコードプライマーが結合したゲルビーズとともにドロップレットに封じ込める。ドロップレット中には、ドロップレットごとにCell barcode/UMIとしてユニークなDNA配列を持つゲルビーズ(GEMs)が入っており、それを足場にcDNA合成反応を実施することで、同じ細胞に含まれていたmRNAが同じCell barcodeを持つDNAとして合成され、それを増幅する。]]<br />
==scRNAseqの実際==<br />
ここでは主流になっている10x Genomics社のChromiumなどのドロップレットを用いた方法とSMART-seqなどを用いた他のプラットフォームに共通する方法の実際について概説する。scRNAseqの利用には、4つのステップがある（図２）<ref><pubmed> 31217225</pubmed></ref><ref><pubmed>30089861</pubmed></ref>。１）個体や組織を採集し、そこから細胞あるいは細胞核を個別に解離された状態にすること。２）ドロップレット法やSMART-seq対応のプラットフォームなどによる個々の細胞からのライブラリーの作製とNGS。３）得られた配列情報の前処理（preprocessing）。４）下流解析と生物学的な情報を得るコンピューター生物学。これらのうち、２）の段階については、上に記述したように市販の機器や試薬を利用する機会が多くなっているので、詳細は説明しない<br />
[[ファイル:ScFig2c.jpg|サムネイル|500px|'''図２．scRNAseqの実際のステップ '''<br>細胞の単離、ライブラリ作製とNGS、データの前処理から次元圧縮、下流解析。図の一部は2016 DBCLS TogoTV、あるいはSeuratを用いて10x Genomics社のPBMCデータ（[https://support.10xgenomics.com/single-cell-gene-expression/datasets]から執筆者が作製。]]<br />
===組織からの細胞、細胞核の分離===<br />
浮遊細胞（血液細胞など）ではない場合、物理的あるいは酵素処理などによって解離することで、生組織から状態の良い個々に分散した細胞を調製する必要がある。神経系組織の酵素処理には、パパインを用いる方法が広く用いられている<ref><pubmed>29970990</pubmed></ref>。ここで、しばしば問題となるのが、酵素処理による短時間加温や機械的刺激で、発現量が変化する遺伝子が存在することである<ref><pubmed>27090946</pubmed></ref>。特に、脳の[[ミクログリア]]の解析には、低温下で組織をホモゲナイズするなどの工夫が必要であった<ref><pubmed>30471926</pubmed></ref>。また、このような現象を抑制するために、酵素処理時に転写阻害剤である[[アクチノマイシン]]で処理したり<ref><pubmed>29024657</pubmed></ref>、ヒマラヤ氷河から得られた細菌Bacillus licheniformisから得られた低温プロテアーゼを用いる方法も報告されている<ref><pubmed>28851704</pubmed></ref><ref><pubmed>31623682</pubmed></ref>。また、細胞解離後に、メタノールで固定しscRNAseqに使用したり<ref><pubmed>28526029</pubmed></ref>、クロスリンカーを用いる方法もある<ref><pubmed>29391536</pubmed></ref>。<br />
<br />
単離した細胞は、そのまま10x GenomicsのChromiumのプラットフォームに導入することができるが、細胞表面分子マーカーに対する抗体や蛍光タンパク質レポーターなどを用いたFACS、[[パニング]]、MACS(磁気ビーズカラム)などによって、細胞の選択的濃縮や除去を行う場合もある。更に、抗体に抗体表示バーコードDNAをカップリングさせるCITE-seq(Cellular Indexing of Transcriptomes and Epitopes by Sequencing) については、下記の「統合解析」でも述べる。<br />
<br />
なお、ヒト組織や希少生物などから生細胞を得ることは困難なことが多い。この場合、scRNAseqの変法として、凍結した組織から、各細胞由来の核を調製し、核内のmRNAを分析するsnRNAseq (single-nucleus RNA-seq)が利用されている。ただ、snRNAseqでは、FACSなどによる特定細胞集団の分離が困難であることが多い。また、細胞質を持つ生細胞を利用したscRNAseqとは違って、スプライシングの途上にある未成熟な核内転写産物を検出すること、更に検出できる遺伝子数も少なく、同等な結果が必ずしも得られない<ref><pubmed>24248345</pubmed></ref><ref><pubmed>26890679</pubmed></ref> <ref><pubmed>27471252</pubmed></ref><ref><pubmed>28846088</pubmed></ref><ref><pubmed>29220646</pubmed></ref><ref><pubmed>28846088</pubmed></ref><ref><pubmed>30586455</pubmed></ref><ref><pubmed>28729663</pubmed></ref><ref><pubmed>31728515</pubmed></ref><ref><pubmed>32341560</pubmed></ref> <ref><pubmed>32518403</pubmed></ref>。一方で、snRNA-seqでは、組織をそのまま凍結することから開始することが可能であるので、上述したscRNAseqの問題である細胞解離酵素による処理などを避けることができる。更に、核を用いることで、大きな細胞体はマイクロ流体力学の流路で詰まりやすいなど、特に神経細胞で顕著である細胞の形状の多様性に伴うバイアスを減らすことができるといったメリットもある。こうしたプロトコールの一部は、protocols.ioのHuman Cell Atlasのグループ[https://www.protocols.io/groups/hca]で公開されている。<br />
通常のscRNAseqは、ポリアデニル化されたmRNAを検出しているが、MATQ-seq（multiple annealing and dC-tailing-based quantitative single-cell RNA-seq）、RamDA-seqなどを用いると、ポリアデニル化されていないRNAの検出も可能である<ref><pubmed> 28092691</pubmed></ref> <ref><pubmed>29434199 </pubmed></ref>[https://doi.org/10.1101/2020.06.02.131060]。更に、RNAを分析するscRNAseqではないが、遺伝子発現との関係が想定される[[オープンクロマチン]]領域を[[トランスポゾン]]を用いることで個々の細胞レベルで選択的に検出するsingle cell ATAC-seq (Assay for Transposase-Accessible Chromatin) <ref><pubmed>26083756</pubmed></ref>, <ref><pubmed>29434377</pubmed></ref><ref><pubmed>25953818</pubmed></ref>, single cell THS-seq (transposome hypersensitive-site) <ref><pubmed>29227469</pubmed></ref>や [[DNAメチル化]]領域を観察するsnmC-seq、RRBSのような方法も利用されている<ref><pubmed>28798132</pubmed></ref><ref><pubmed>30237449</pubmed></ref><ref><pubmed> 20852635</pubmed></ref>。<br />
===scRNAseqデータ処理の流れ===<br />
====総論====<br />
10x Genomics社のChromium、Illumina社のNGSを利用した場合、Cell Rangerのmkrefコマンド(Linux上で作動, [https://support.10xgenomics.com/single-cell-gene-expression/software/pipelines/latest/using/tutorial_mr])などにより、各生物種ごとのレファレンス配列リスト（[https://www.ncbi.nlm.nih.gov/grc]、マウスやヒトでは既製のものを利用できる）などを参考にしながら、細胞と転写産物量の対応マトリックスを作製する。その後のデータの処理についても、10x Genomics社がソフトウェアLoupeを提供している。しかしながら、その後の下流解析を考慮して、[[R]], [[Python]], MATLABなどのデータ解析のための汎用プログラミング言語やコードで扱えるオブジェクトに変換するのが通常である。<br />
<br />
scRNAseq解析のためには、数多くのツールが公開されている。これらのツールは、バージョンが更新されたり、新しいものに置き換えられることがあるので、実際に利用する場合は最新の動向に注意を払う必要がある。scRNAseqの解析に必要なツールは、scRNA-tools [https://www.scrna-tools.org], Awesome single cell [https://github.com/seandavi/awesome-single-cell], Bioconductor[https://www.bioconductor.org]などで紹介されており、ほとんどがダウンロード可能である。また、bioRxivなどの査読前のプレプリントサーバで公開されて、随時試用、評価されていくものが多く、scRNAseqのデータ（下記参考）とともに、オープンサイエンス実践の好例となっている。<br />
====Seurat====<br />
ここでは、scRNAseqデータ解析のために最もよく利用されているRを用いたパッケージ「Seurat」<ref><pubmed> 29608179 </pubmed></ref> <ref><pubmed> 31178118 </pubmed></ref>を中心に紹介しておきたい。なお、一部の解析操作は、University of WashingtonのCole Trapnell研究室で開発されてきた軌道推定（下記参考）によく使用されるMonocle3でも可能である（[https://cole-trapnell-lab.github.io/monocle3/]）。Pythonを利用したものでは、ドイツ・ミュンヘンInstitute of Computational Biologyの Fabian Theisらが開発しているScanpyが有名である<ref><pubmed> 29409532</pubmed></ref>。<br />
<br />
New York UniversityのRahul Satija研究室が開発しているSeurat（画家スーラに由来）は、scRNAseqデータ解析のために広く利用されているRパッケージであり、2020年秋現在、Seurat4のβバージョンが公開されている。論文の正式発表前から、サポート情報提供やコード修正なども頻繁に行っており、Satija研究室のウェッブサイト（ [http://satijalab.org/Seurat]）、Github([https://github.com/satijalab/Seurat])、更にTwitterアカウント（@satijalab）などで最新情報を得ることできる。<br />
====品質の検討事項====<br />
最初に行うのは、scRNAseqデータの品質管理である。ここでは、質の低い細胞のデータ（例えば、壊れた細胞では、転写産物の種類が少なくミトコンドリア由来の転写産物が多い）を取り除く。また、複数の試料を組み合わせる場合には、バッチごとの違いについて検討する<ref><pubmed>29608177</pubmed></ref><ref><pubmed> 28045081<br />
</pubmed></ref><ref><pubmed>31948481</pubmed></ref> <ref><pubmed>32854757</pubmed></ref>。現実には、実験ごとのバッチの違いによる影響（Batch effect）がscRNAseqの最大の問題であると示されてきており、試料の処理を同時に行うなど実験デザインを工夫する必要がある<ref><pubmed>29121214</pubmed></ref>。<br />
<br />
また、ドロップレットを使用するscRNAseqでしばしば問題になるのが、ドロップレットに２つ以上の細胞が封じ込められ、それらが同一のCell barcodeを持ってしまうアーティファクトである。通常「Doublet」「Multilet」と呼ばれるこの問題は下流解析を混乱させるので、細胞単離の段階から注意する必要があるが、scRNAseqデータ取得後にもデータ処理で解決できる可能性もある<ref><pubmed>30954476</pubmed></ref><ref><pubmed>30954475</pubmed></ref> <ref><pubmed>31693907</pubmed></ref><ref><pubmed>32592658</pubmed></ref> <ref><pubmed>29227470</pubmed></ref><ref><pubmed>31836005</pubmed></ref><ref><pubmed>31856883</pubmed></ref><ref><pubmed>30567574</pubmed></ref> <ref><pubmed>31266958</pubmed></ref> [https://doi.org/10.1101/2019.12.17.879304][https://doi.org/10.1101/699637][http://dx.doi.org/10.2139/ssrn.3646565]。なお、この手法を利用することで、バッチ効果を抑えるために、異なるバーコードを持つ複数の試料を混ぜて一つの試料として扱い、計算機的に再び分離、解析するdemultiplexingという手法が注目されている<ref><pubmed>32483174</pubmed></ref>。<br />
<br />
scRNAseqデータの次のノイズは、ある遺伝子の発現が低いために、本来同じタイプの細胞であっても、その遺伝子の発現が全く見られない「Dropout」と呼ばれる現象であり解析に影響を与えるので、これについても検討が必要である<ref><pubmed> 24056876<br />
</pubmed></ref><ref><pubmed>32127540</pubmed></ref>。<br />
====次元圧縮====<br />
このような品質管理、ノーマライゼーションの過程を経て<ref><pubmed>28504683</pubmed></ref>、scRNAseqのデータ解析において、最初に行うのが、[[次元圧縮]] (dimensionality reduction)である<ref><pubmed>30617341</pubmed></ref><ref><pubmed>31780648</pubmed></ref><ref><pubmed>31955711</pubmed></ref><ref><pubmed>31823809</pubmed></ref>。PCA (Principal component analysis, 主成分分析)、更に発展させたUMAP（Uniform Manifold Approximation and Projection, 均一マニフォールド近似と投影）、Diffusion maps<ref><pubmed> 26002886<br />
</pubmed></ref>, tSNE(t-distributed Stochastic Neighbor Embedding , t分布型確率的近傍埋込み)などの手法が用いられる。 特に、tSNE[http://www.jmlr.org/papers/v9/vandermaaten08a.html]とUMAP[https://arxiv.org/abs/1802.03426]は、高次元データを低次元の点の集合として可視化することで、それぞれの細胞の持つトランスクリプトームの類似度についての直観的な表示が可能でありしばしば用いられる（図３）。tSNEよりUMAPの方が迅速に類似集団間の関係が明確になるので、最近はUMAPを利用することが多くなってきている。次に、[[Louvainアルゴリズム]]などでクラスタリング（コミュニティ分割）を行いグラフ上に表示できる（図３の色分け）。こうして、異なる転写状態を示す細胞の集合が別のクラスターとして表示され、同定可能になる<ref><pubmed>31500660</pubmed></ref>。<br />
[[ファイル:scFig3.jpg|サムネイル|250px|'''図３． tSNEとUMAPによる同じデータの可視化'''<br>網膜（ニワトリ）の視細胞のデータを用いて執筆者が作製[https://doi.org/10.1101/2020.10.09.333633<br />
}。]]<br />
==下流解析==<br />
===細胞クラスターの解釈とマーカー遺伝子候補の発見===<br />
scRNAseqデータから得られる生物学的知見には、内在的に存在する細胞の種類、外部刺激や環境で変化した細胞の状態、そして種類や変化により特徴的に発現するマーカー遺伝子候補の発見がある<ref><pubmed>27824854</pubmed></ref><ref><pubmed>32033589</pubmed></ref><br />
。クラスタリングにより、異なった細胞集団の存在が認識されると、それぞれのクラスター（群）に特徴的に発現している具体的な遺伝子を探索し、細胞集団の持つバイオマーカーによって、そのクラスター（群）の同定が可能になる。例えば、既に神経細胞とグリア細胞に特異的に発現する典型的マーカーはよく知られており、それぞれのクラスターの識別は容易である。更に、神経細胞のタイプ（下記参考）を区別できるマーカーや、外部刺激によって遺伝子発現が変化した神経細胞の状態は、In situ hybridizationや免疫組織化学などにより確認できる。このようなクラスターごとに発現が異なる遺伝子（差次的発現遺伝子）を見つけるためには（Differential expression analysis, DE analysis）、SeuratのFindMarkersコマンド中でも利用可能であるコード（MAST、DESeq2など<ref><pubmed>26653891</pubmed></ref><ref><pubmed>25516281</pubmed></ref><ref><pubmed>30658573</pubmed></ref>）を用いることができる。細胞ごとの差次的発現遺伝子のVisualization（表示可視化）には、ドットプロット（dot plot）、ヴァイオリンプロット（violin plot）、リッジプロット（Ridge plot, joy plot）、UMAPなどの次元圧縮図上に転写物量をプロットするFeatureプロット（feature plot）などが、目的に応じて頻繁に用いられる（図４）。<br />
[[ファイル:scFig4.jpg|サムネイル|300px|'''図４．scRNAseqデータの可視化の例 '''<br>A. ドットプロット。B.ヴァイオリンプロット。C. リッジプロット。D. UMAP（灰色）に転写物量（青）をプロットした Featureプロット。網膜の視細胞のデータを用いて執筆者が作製[https://doi.org/10.1101/2020.10.09.333633<br />
]。]]<br />
===擬時系列解析===<br />
実験的なノイズとは別に生物学的に意味のある遺伝子発現の変動には、位置情報、[[細胞周期]]、[[概日リズム]]、発現変動が大きい破裂型プロモーターの作動などの理由で 変動が見られるものもある<ref><pubmed> 31217225 </pubmed></ref><ref><pubmed> 26000846</pubmed></ref>。特に、刺激・薬剤処理やさまざまな病態の進行や治療に伴う細胞の変化、発生途上にある細胞系譜や細胞分化といった細胞の遷移状態の解析（[[軌道推定]]（Trajectory inference）；[[擬時系列解析]]（擬似時系列解析、偽時系列解析）、Pseudo-time analysis ）には、scRNAseqデータを用いることが効果的である<ref><pubmed>29576429</pubmed></ref><ref><pubmed>28813177</pubmed></ref><ref><pubmed>29565398</pubmed></ref>。しばしば用いられるMonocle3 <ref><pubmed>30787437</pubmed></ref>[https://cole-trapnell-lab.github.io/monocle3/]など、多くのコードを収集、比較しているサイトがある [https://dynverse.org][https://github.com/agitter/single-cell-pseudotime]。RNA velocityといったスプライシングされていく転写産物の量から細胞の分化状態を推定する方法もある<ref><pubmed>30089906</pubmed></ref><ref><pubmed> 32747759</pubmed></ref>。しかし、これらの方法は、あくまで[[細胞系譜]]や細胞分化の推定に過ぎない。細胞系譜を更に確実に観察しつつ、scRNAseqを行うことで、細胞タイプの系統関係を調べる方法として、CRISPR-Cas9を用いた[[ゲノム編集]]による痕跡追跡記録法を導入したscGESTALT<ref><pubmed>29608178</pubmed></ref>、ScarTrace<ref><pubmed>29590089</pubmed></ref> 、LINNAEUS<ref><pubmed>29644996</pubmed></ref>、あるいはアデノシンデアミナーゼでRNA編集を行いタイムスタンプを入れる方法<ref><pubmed>33077959</pubmed></ref>がある。1塩基バリアント（Single-nucleotide variants: SNV）の系統的解析は、細胞の不均一性や系統的な関係を明らかにするための最も有望なアプローチの一つである<ref><pubmed>31744515</pubmed></ref>。<br />
===遺伝子制御ネットワーク、パスウェイ解析など===<br />
また細胞分化や刺激などによる変動に伴う特徴的な遺伝子発現をscRNAseqで観察することは、遺伝子制御ネットワーク（例、SCENIC<ref><pubmed>28991892</pubmed></ref>, [https://github.com/aertslab/SCENIC]）、[[代謝経路]]や[[シグナル伝達系]]のための[[パスウェイ解析]](例、Metascape<ref><pubmed>30944313</pubmed></ref>, [http://metascape.org]、Gene Ontolgoy[http://geneontology.org])を理解するシステム生物学的な研究として有用である<ref><pubmed>32051003</pubmed></ref>。更に、scRNAseqで得られた結果をもとに、細胞間相互作用の理解を深めるのを目的とするCellPhoneDB<ref><pubmed>32103204</pubmed></ref>[https://github.com/Teichlab/cellphonedb]、NicheNet<ref><pubmed>3181926</pubmed></ref>, SVCA<ref><pubmed>31577949</pubmed></ref>などがある。特に、Perturb-seq<ref><pubmed>27984732</pubmed></ref> やその変法<ref><pubmed> 32231336</pubmed></ref>は、CRISPRライブラリーによるゲノム編集を施した細胞をscRNAseqで解析することで、ゲノム編集で破壊された遺伝子の機能や遺伝子間の相互作用の理解を可能にしている後述する複数モダリティ情報を取り込んだscRNAseqの１つであり、注目されている。<br />
==scRNAseqの神経科学研究への適用==<br />
===神経系細胞ビッグデータとしてのscRNAseq===<br />
様々な神経・精神疾患について理解しその診断や治療に役立てるためには、神経細胞、[[グリア細胞]]を中心にした神経系にある細胞の種類や状態を識別し、それぞれの細胞における分子的な変化を観察することが重要である <ref><pubmed>28775344</pubmed></ref><ref><pubmed>29738987</pubmed></ref>。本項目で解説してきたscRNAseq技術は、神経系に見られるそれぞれの細胞のトランスクリプトームについて[[ビッグデータ]]を提供することで、この細胞の種類や状態の識別に新たな判断材料を与えつつある。近年、中枢神経系の[[アストロサイト]]、[[オリゴデンドロサイト]]、ミクログリアといったグリア細胞も均一ではなく、内在的な多様性や外部因子による状態の変動が報告されてきている。神経細胞は、著しく多様であり、この多様性が神経系の多彩で複雑な機能発現の基盤となっている。従来の神経科学では、神経細胞の多様性は、それぞれの神経細胞の解剖学的な位置、発現している分子、電気生理学、結合性、形態、神経伝達物質、神経伝達物質受容体とシグナル伝達によって識別されてきている。こうした神経細胞の多様性を便宜的に記述するのに、タイプ（type）、クラス（class）、サブクラス（subclass）、サブタイプ（subtype） というような用語が用いられてきた。しかし、ここでは混乱を防ぐため、Masland（2004）<ref><pubmed>15242626</pubmed></ref>が提唱し、広く受けいれられている「クラス」と「タイプ」という単語を用いることとする。タイプは、これ以上分類することができないとされる階層であり、共通性を持つタイプの集団がクラスである。例えば、大脳皮質の錐体細胞、網膜神経節細胞といった大雑把な区分はクラスである。大脳皮質の錐体細胞というクラスは、層や領野によって異なるタイプ、網膜神経節細胞には視覚情報に対して応答が異なるタイプが存在する。scRNAseqは、「タイプ」の理解に新たな視点を提供している。<br />
===神経系へのscRNAseqの適用===<br />
scRNAseqの神経系での利用については、次々と新しい論文やプレプリントが発表されており、ここではscRNAseqで得られてきた情報の典型例を紹介することにとどめる。<br />
<br />
[[大脳皮質]]には、[[錐体細胞]]や[[非錐体細胞]]などの神経細胞や様々なグリア細胞などが見られ、古くから神経細胞タイプの識別が行われてきた。初期のFluidigm C1を用いたscRNAseq技術でも、マウス皮質の小規模な細胞数を分類した研究で、これまで知られていた主要な神経細胞タイプとは違うタイプが見つかりscRNAseqの有効性が示された<ref><pubmed>25700174</pubmed></ref>。その後のドロップレット使用の3’エンドリード法を利用した多数の細胞数の解析で、更に多数の神経細胞のタイプが見つかっている<ref><pubmed>32839617</pubmed></ref><ref><pubmed>28846088</pubmed></ref><ref><pubmed>30096299</pubmed></ref><ref><pubmed>30096314</pubmed></ref><ref><pubmed>30382198</pubmed></ref><ref><pubmed>29320739</pubmed></ref><ref><pubmed>28846088</pubmed></ref>[https://doi.org/10.1101/2020.03.14.991018][https://doi.org/10.1101/2020.06.04.105700] [https://doi.org/10.1101/2020.07.02.184051]。特に、GABA作動性介在神経細胞タイプの多様性とその発生<ref><pubmed>28942923</pubmed></ref><ref><pubmed>28134272</pubmed></ref><ref><pubmed>29472441</pubmed></ref><ref><pubmed>29513653</pubmed></ref>についての、これまでの組織化学的な研究からは得られていなかった多くの情報は重要であろう。また、初期の発生過程<ref><pubmed>26940868</pubmed></ref><ref><pubmed>30485812</pubmed></ref><ref><pubmed>31073041</pubmed></ref><ref><pubmed>30635555</pubmed></ref><ref><pubmed>30625322</pubmed></ref>、老化<ref><pubmed>31551601</pubmed></ref>の理解が、scRNASeq技術を利用することで進んでいる。更に、[[神経活動]]や[[臨界期]]に伴い変化するmRNAも細胞ごとに調査され興味深い<ref><pubmed>29230054</pubmed></ref> <ref><pubmed>32404418</pubmed></ref>。 ヒトを含めた霊長類の大脳についても発達段階を含めてscRNAseqが適用されてきている<ref><pubmed>26060301</pubmed></ref><ref><pubmed>27339989</pubmed></ref><ref><pubmed>29539641</pubmed></ref><ref><pubmed>29217575</pubmed></ref><ref><pubmed>28846088</pubmed></ref><ref><pubmed>29227469</pubmed></ref><ref><pubmed>31303374</pubmed></ref><ref><pubmed>29867213</pubmed></ref><ref><pubmed>31435019</pubmed></ref><ref><pubmed>32424074</pubmed></ref> [https://doi.org/10.1101/709501][https://doi.org/10.1101/2020.03.31.016972][https://doi.org/10.1101/2020.04.23.056390]。ヒトや霊長類に特徴的とされる[[島]]のvon Economo神経細胞（紡錘細胞）のような希少な神経細胞のscRNAseqにも成功している<ref><pubmed>32127543</pubmed></ref>。<br />
<br />
[[海馬]]<ref><pubmed>29241552</pubmed></ref><ref><pubmed>29912866</pubmed></ref><ref><pubmed>29335606</pubmed></ref><ref><pubmed>31942070</pubmed></ref>では、これまでの研究で記載されてきた神経細胞のタイプの存在が確認され、更に新規のタイプが見つかった。中枢神経系では、その他、[[外側膝状体]]<ref><pubmed>29343640</pubmed></ref>、[[大脳基底核]](足底核)<ref><pubmed>28384468</pubmed></ref> 、[[視床下部]]<ref><pubmed>28166221</pubmed></ref><ref><pubmed>28355573</pubmed></ref> <ref><pubmed>27991900</pubmed></ref><ref><pubmed>30385464</pubmed></ref> <ref><pubmed>31249056</pubmed></ref><ref><pubmed>30858605</pubmed></ref>、[[線条体]]<ref><pubmed>27425622</pubmed></ref><ref><pubmed>30134177</pubmed></ref><ref><pubmed>31875543</pubmed></ref>、[[中脳]]<ref><pubmed>27716510</pubmed></ref><ref><pubmed>29499164</pubmed></ref> <ref><pubmed>30718509</pubmed></ref> 、[[手綱]]<ref><pubmed>29576475</pubmed></ref>、発生中の[[間脳]]<ref><pubmed>30872278</pubmed></ref> 、さらに[[小脳]]<ref><pubmed>30220501</pubmed></ref><ref><pubmed>30735127</pubmed></ref><ref><pubmed>30690467</pubmed></ref>などの結果が報告されてきている。例えば、構成する細胞についての情報が詳細に研究されてきたと思われていたマウスの小脳においても、分子層にこれまでの星状細胞、バスケット細胞というカテゴリーとは違ったギャップジャンクションに特徴を持つ２種類の神経細胞があることが示唆されている[https://doi.org/10.1101/2020.03.04.976407]。<br />
<br />
脳の外部では、[[運動神経]][https://doi.org/10.1101/2020.03.16.992958]、[[感覚神経]]<ref><pubmed>25420068</pubmed></ref><ref><pubmed>26691752</pubmed></ref>、[[らせん神経節]]<ref><pubmed>30078709</pubmed></ref><ref><pubmed>30209249</pubmed></ref> 、[[臭覚神経]]<ref><pubmed>26541607</pubmed></ref> <ref><pubmed>32059767</pubmed></ref>、[[腸神経系]] <ref><pubmed>29483303</pubmed></ref>[https://doi.org/10.1101/2020.03.02.955757] 、[[網膜]]<ref><pubmed>27565351</pubmed></ref><ref><pubmed>29909983</pubmed></ref><ref><pubmed>30018341</pubmed></ref><ref><pubmed>31260032</pubmed></ref><ref><pubmed>31128945</pubmed></ref><ref><pubmed>30712875</pubmed></ref><ref><pubmed>30548510</pubmed></ref><ref><pubmed>31075224</pubmed></ref><ref><pubmed>31399471</pubmed></ref><ref><pubmed>31848347</pubmed></ref><ref><pubmed>31673015</pubmed></ref><ref><pubmed>31653841</pubmed></ref><ref><pubmed>31784286</pubmed></ref>[https://doi.org/10.1101/2020.02.26.966093][https://doi.org/10.1101/779694][https://www.biorxiv.org/content/10.1101/617555] [https://doi.org/10.1101/2020.10.09.333633]でのscRNAseqデータがある。<br />
<br />
また[[iPS細胞]]や[[ES細胞]]由来の神経組織[[オルガノイド]]に含まれる神経細胞タイプを知る上でも利用されている<ref><pubmed>28094016</pubmed></ref><ref><pubmed>28279351</pubmed></ref><ref><pubmed>31168097</pubmed></ref><ref><pubmed>31996853</pubmed></ref><ref><pubmed>31968264</pubmed></ref><ref><pubmed><ref><pubmed>32221280</pubmed></ref>。このようなアプローチは、ネアンデルタール人型の遺伝子を持つ脳オルガノイドの解析<ref><pubmed> 32559457</pubmed></ref>やSARS-CoV-2に感染する脳オルガノイド中の細胞の同定<ref><pubmed> 33113348</pubmed></ref>など、新たな応用例が発表されてきており興味深い。<br />
<br />
===神経細胞以外の細胞===<br />
[[上衣細胞]]<ref><pubmed>29727663</pubmed></ref>は、[[神経幹細胞]]としての役割が示唆されてきたが、scRNAseqによる解析ではその可能性が支持されなかった。グリア細胞では、[[ラジアルグリア]]<ref><pubmed>26406371</pubmed></ref><ref><pubmed>25734491</pubmed></ref><ref><pubmed>29281841</pubmed></ref><ref><pubmed>29217575</pubmed></ref><ref><pubmed>29539641</pubmed></ref>、アストロサイト<ref><pubmed>32139688</pubmed></ref><ref><pubmed>32203496</pubmed></ref>[https://doi.org/10.1101/2020.04.27.064881]に多様性があることが示唆されてきている。また、オリゴデンドロサイト<ref><pubmed>27284195</pubmed></ref><ref><pubmed>30078729</pubmed></ref><ref><pubmed>30257220</pubmed></ref><ref><pubmed>30747918</pubmed></ref><ref><pubmed>31958186</pubmed></ref>[https://doi.org/10.1101/2020.03.06.981373]については、これまで細胞生物学的に研究されてきた分化の過程がscRNAseqにより詳細に解析されている。ミクログリアは、神経系の発達、老化、損傷などに伴う重要なトランスクリプトームの変化がscRNAseqにより詳細に明らかになった<ref><pubmed>27338705</pubmed></ref><ref><pubmed>29020624</pubmed></ref><ref><pubmed>30206190</pubmed></ref><ref><pubmed>30471926</pubmed></ref><ref><pubmed>31209379</pubmed></ref><br />
<ref><pubmed>31835035</pubmed></ref>。また、[[CNS境界関連マクロファージ]](BAM) <ref><pubmed>31061494</pubmed></ref>や[[脳血管系]]<ref><pubmed>29443965</pubmed></ref>のscRNAseqも実施されている。<br />
===疾患===<br />
scRNAseqは、疾患の理解にも有用である。scRNAseqでは、疾患に伴う遺伝子発現の変化を細胞タイプごとに観察することができるので、バルクRNAseqでは埋もれていた遺伝子発現の変化や細胞ごとの変化を検出できるという長所がある。<br />
例えば、筋萎縮性側索硬化症<ref><pubmed>30948552</pubmed></ref>、多発性硬化症<ref><pubmed>30747918</pubmed></ref><ref><pubmed>30420755</pubmed></ref><ref><pubmed>32313246</pubmed></ref> <br />
、アルツハイマー病やそのモデル動物<ref><pubmed>31042697</pubmed></ref><ref><pubmed>31399126</pubmed></ref><ref><pubmed>29020624</pubmed></ref><br />
[https://doi.org/10.1101/628347]<ref><pubmed>28602351</pubmed></ref><ref><pubmed>32341542</pubmed></ref>、統合失調症<ref><pubmed>29785013</pubmed></ref><ref><pubmed>32203495</pubmed></ref>、自閉症やレット症候群<ref><pubmed>31097668</pubmed></ref><ref><pubmed>30455458</pubmed></ref>、シャルコー・マリー・トゥース病<ref><pubmed>29888333</pubmed></ref>、ダウン症[https://www.biorxiv.org/content/10.1101/2020.01.01.892398v1]、パーキンソン病<ref><pubmed>30503143</pubmed></ref> <ref><pubmed>32826893</pubmed></ref>、がん<ref><pubmed>31327527</pubmed></ref><ref><pubmed>28360267</pubmed></ref>などに適用されている。最近、Perturb-seqにより、自閉症に関わる遺伝子の欠損に伴う細胞状態の変化などもscRNAseqで報告されており<ref><pubmed>33243861</ref></pubmed>、疾患の理解のための新たな実験系の開発も始まりつつある。<br />
==scRNAseqの展望==<br />
===神経系の多様性と進化===<br />
NGSを用いることで、どんな生物種にも適用可能なscRNAseqは、既に多様な生物の神経系の細胞の理解、更には種間の相同性や差異の研究に利用されており、神経系の進化を細胞レベルで考察するのに有用であろう（例、線虫<ref><pubmed> 28818938 </pubmed></ref>、ショウジョウバエ <ref><pubmed>29909982</pubmed></ref><ref><pubmed>29149607</pubmed></ref><ref><pubmed>30703584</pubmed></ref><ref><pubmed>29909983</pubmed></ref><ref><pubmed>33125872</pubmed></ref>、カタユウレイボヤCiona intestinalis <ref><pubmed>30069052</pubmed></ref><ref><pubmed>30228204</pubmed></ref>、ゼブラフィッシュ<ref><pubmed>31018142</pubmed></ref><ref><pubmed>30929901</pubmed></ref>、アカミミガメTrachemys scripta elegans、トカゲPogona vitticeps, pv<ref><pubmed>29724907</pubmed></ref>、ニワトリ[https://doi.org/10.1101/2020.10.09.333633]、霊長類<ref><pubmed>30730291</pubmed></ref><ref><pubmed>31619793</pubmed></ref>[https://doi.org/10.1101/2020.03.31.016972]）。ただ、遺伝子やトランスクリプトームの研究が進んでいる生物種では比較的容易であるが、遺伝子のアノテーションが十分でない生物種を用いる場合、scRNAseqのデータ解析は困難を伴う。また種を超えた細胞タイプの相同性の理解には様々な工夫が必要である<ref><pubmed>31552245</pubmed></ref><ref><pubmed>30712875</pubmed></ref>[https://doi.org/10.1101/2020.03.31.016972]。<br />
===データベースと統合===<br />
獲得されたscRNAseqのデータは様々な目的で利用できるので、データベース化し利用できるようにする必要がある。神経系のトランスクリプトーム一般のデータベースが多数公開されており<ref><pubmed>29437890</pubmed></ref>、scRNAseqのデータも基本的にNCBIのGene Expression Omnibus[https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/]に登録されている。また、オープンサイエンス推進のためにcommon coordinate framework (CCF) やcentral annotation platform (CAP)という概念のもと、特にscRNAseqを意識したものとして、米国のBRAIN Initiative Cell Census Consortium<ref><pubmed>29096072</pubmed></ref> 、Human Cell Atlas ProjectのHuman Cell Atlas Data Portal [https://data.humancellatlas.org]、そのマウス版であるTabula Muris <ref><pubmed>30283141</pubmed></ref>[https://genome.ucsc.edu/cgi-bin/hgTrackUi?db=mm10&g=tabulaMuris]やSten Linnarssonラボのマウス脳発生データベース[http://mousebrain.org]、アレン脳研究所のAllen Brain Atlas [https://portal.brain-map.org]、ブロード研究所のSingle Cell Portal [https://singlecell.broadinstitute.org/]などのデータベースが稼働している。また、異なった方法や実験で得られたscRNAseqのデータや後述の複数モダリティのシングルセルオミクスのデータを体系的に比較することも重要であり、CCA (Canonical correlation analysis)<ref><pubmed>29608179</pubmed></ref>, Seurat 3.0以降に組み込まれたMMN (Mutual Nearest Neighbors)、LIGER<ref><pubmed>31178122</pubmed></ref> 、Harmony<ref><pubmed>31740819</pubmed></ref> 、MetaNeighber<ref><pubmed>29491377</pubmed></ref>、Conos<ref><pubmed>31308548</pubmed></ref>[https://doi.org/10.1101/2020.05.22.111161]のようなアルゴリズムが開発され、後述の複数モダリティのシングルセルオミクスを組み込んだ統合サイトもでき始めている（[https://biccn.org]）。またデータベースを利用して発現類似性検索も研究されている<ref><pubmed>29608555</pubmed></ref><ref><pubmed>30744683</pubmed></ref>。<br />
<br />
===空間トランスクリプトミクス===<br />
多数の細胞を扱うscRNAseqの弱点は、組織から細胞や細胞核を解離する必要があるので、その細胞が存在していた解剖学的あるいは空間的な位置の情報を消去してしまうということである。組織切片におけるタンパク質などの分布は免疫組織化学、mRNAの分布はin situ hybridizationで検出することができるが、数多くのmRNAの分布を情報処理技術と組み合わせ一気に同定する方法がscRNAseqと同様に開発されてきている（Slide-seq<ref><pubmed>30923225</pubmed></ref><ref><pubmed> 33288904</pubmed></ref>、HDST<ref><pubmed>31501547</pubmed></ref>、Expansion sequencing[http://doi.org/10.1101/2020.05.13.094268]など<ref><pubmed>27365449</pubmed></ref>, <ref><pubmed>31932730</pubmed></ref> <ref><pubmed>30948552</pubmed></ref>）、更に10x Genomics社が市販するVisiumなどがある。現状では、大きな組織の空間トランスクリプトミクスは、空間解像度は限定されており、技術普及の観点からも課題が多い。しかし、そのデータを解析するためのアルゴリズム<ref><pubmed>29553578</pubmed></ref><ref><pubmed>29553579</pubmed></ref><ref><pubmed>32350282</pubmed></ref> [https://doi.org/10.1101/757096][https://doi.org/10.1101/701680] [https://doi.org/10.1101/431957]、<br />
更にMerFish <ref><pubmed>25858977</pubmed></ref>、corrFISH<ref><pubmed>27271198</pubmed></ref>のように、subcellularレベルで多数のmRNAを検出する方法が多数開発されてきており（文献：<ref><pubmed>25549890</pubmed></ref> osmFISH<ref><pubmed>30377364</pubmed></ref> 30377364、STARmap (spatially-resolved transcript amplicon readout mapping) <ref><pubmed>29930089</pubmed></ref>、seqFISH+<ref><pubmed>27764670</pubmed></ref>、pciSeq(probabilistic cell typing by in situ sequencing)[https://doi.org/10.1101/431957]、DSP(Digital Spatial Profiling) <ref><pubmed>32393914</pubmed></ref>、scRNAseqと組み合わせることで、その弱点を補う空間トランスクリプトミクスにも利用され始め<ref><pubmed>30385464</pubmed></ref>[https://doi.org/10.1101/2020.06.04.105700]、今後の発展が期待される分野である。<br />
===統合解析 ===<br />
同一の細胞からscRNAseqの情報だけでなく、ゲノム配列、ATAC-seqなどによるエピゲノム解析、少数のタンパク質、あるいはプロテオームなど複数のモダリティを同時に観察するオミクス（Single-cell multimodal omics）が注目されている<ref><pubmed>31907462</pubmed></ref><ref><pubmed>30696980</pubmed></ref>。2019年には、Nature Methodsの「Methods of the Year」に選ばれており、現状については、その特集号などを参考にされたい。例えば、細胞表面に提示されているマーカー分子に対する抗体にDNAを付加することで、そのマーカーを発現する細胞のトランスクリプトームを解析するCITE-seq<ref><pubmed>28759029</pubmed></ref>、 REAP-seq<ref><pubmed>28854175</pubmed></ref>も、既知の細胞表面マーカーの発現とscRNAseqが同時に観察できる方法である。<br />
<br />
複数モダリティのシングルセルオミクスとして、神経科学分野で注目されるのは、scRNAseqをパッチクランプによる電気生理学的情報と組み合わせたPatch-seq<ref><pubmed>26689544</pubmed></ref> <ref><pubmed>26689543</pubmed></ref>である。また、ゲノムDNAとscRNAseqを同時に観察することによって、近年、精神疾患の観点から注目されている発生途中で生じる遺伝子変異を研究するPRDD-seqは今後の展開が注目される[https://doi.org/10.1101/2020.04.19.046904]。最後に、BARseq (barcoded anatomy resolved by sequencing) <ref><pubmed>31626774</pubmed></ref>、CONNECTID[https://doi.org/10.1101/378760]、Epi-Retro-seq[https://doi.org/10.1101/2020.04.01.019612]のような方法は、[[コネクトーム]]（神経細胞の結合性）と遺伝子発現を記録できるオミクスの新たな方向として興味深い。<br />
== 関連項目 ==<br />
*[[ゲノムワイド関連解析 ]]<br />
*[[ディファレンシャルディスプレイ ]]<br />
*[[In situハイブリダイゼーション法 ]]<br />
*[[免疫組織化学法]]<br />
*[[エピジェネティクス]]<br />
== 参考文献 ==<br />
<references /></div>
Masahitoyamagata
https://bsd.neuroinf.jp/w/index.php?title=%E3%82%B7%E3%83%B3%E3%82%B0%E3%83%AB%E3%82%BB%E3%83%ABRNA%E3%82%B7%E3%83%BC%E3%82%B1%E3%83%B3%E3%82%B7%E3%83%B3%E3%82%B0&diff=45297
シングルセルRNAシーケンシング
2020-12-12T18:10:50Z
<p>Masahitoyamagata: </p>
<hr />
<div><div align="right"> <br />
<font size="+1">[http://researchmap.jp/yamagatm 山形方人]</font><br><br />
''Harvard University''<br><br />
DOI：<selfdoi /> 原稿受付日：年月日 原稿完成日：年月日<br><br />
担当編集委員：<br><br />
</div><br />
英：single-cell RNA sequencing, scRNAseq<br />
{{box|text=<br />
シングルセルRNAシーケンシング(single-cell RNA sequencing, 以下scRNAseq)は、[[次世代シーケンサー]] （next generation sequencer、以下NGS）を用いることで、個々の細胞が保持しているmRNA全体を質的、量的に網羅的に調べる方法である。次元圧縮などの数理的な解析と組み合わせることで、遺伝子発現の状態に基づいた細胞の分類を行うことが可能であり、従来の組織学的、あるいは細胞生物学的手法では知られなかった新規の細胞種の同定や細胞状態の推定を行うことが可能になった。また、遺伝子発現プロファイルの変化に基づく擬時系列解析によって、刺激や発生に伴う細胞状態の遷移の描写ができる。神経系では、この方法により、神経細胞や非神経細胞の分類や状態についての知見が深まり、新しい神経細胞タイプ、細胞マーカー、病態の理解、更に機能的な遺伝子の同定などが系統的かつ網羅的に行われるようになった。scRNAseqに、空間的情報、エピゲノム情報、タンパク質情報なども取り入れた複数のモダリティを考慮した研究も行われている。<br />
}}<br />
<br />
==scRNAseqの背景==<br />
===トランスクリプトーム===<br />
トランスクリプトーム（transcriptome）は、細胞中に存在する全ての転写産物（タンパク質をコードするmRNA、タンパク質をコードしない[[ノンコーディングRNA]]、[[マイクロRNA]]など）の総体である<ref><pubmed>19015660</pubmed></ref><ref><pubmed>31341269 </pubmed></ref>。トランスクリプトームは、[[ゲノム]]とは異なり、同一の個体でも、組織ごとに、更には発生段階や細胞外環境や刺激によって変化する。トランスクリプトームは、同質あるいは異質の多数の細胞集団（組織、培養細胞）からRNA抽出後、cDNAに変換し、それを1990年代に出現した[[DNAマイクロアレイ]]のように数多くの既知mRNAを識別する技術によって解析されるようになった。その後、NGSの利用により、希少mRNAやノンコーディングRNAを含めた未知の転写産物の高感度検出が可能になるとともに、[[スプライシング]]で成熟していく過程のmRNAなど、転写産物の種類だけでなく、転写産物の構造的差異（スプライシングバリアント、SNPs、変異など）の解析もできるようになった。加えて、ヒトやモデル実験生物（[[マウス]]、[[ゼブラフィッシュ]]、[[ショウジョウバエ]]、[[線虫]]など）だけでなく、多種多様な生物のトランスクリプトームの把握も可能になった。従来から行われてきた組織全体などの多数の細胞を対象としたRNA-seq（バルクRNAseq）では、複数の細胞における転写産物の平均を観察しているが、本項目では個々の細胞における転写産物を解析するscRNA-seqの原理とその応用について概説する。<br />
<br />
===scRNAseqとその開発史===<br />
1つの細胞の持つ生体物質を解明し、定量しようとする試みは古くからあった。1960年代になると、フローサイトメトリーを利用した[[蛍光活性化セルソーティング]]（Fluorescence-activated cell sorting, FACS）が発明され、標識抗体などのプローブと組み合わせることで、多数の細胞集団の中で１つの細胞が保持している生体分子の種類や量についての断片的な研究が可能になり、この方法は現在でも汎用されている<ref><pubmed>22271369</pubmed></ref>。その後、[[免疫組織化学]]や[[in situ hybridization]]nなどにより、タンパク質やmRNAの種類や量が観察できるようになり、組織中に存在するそれぞれの細胞の同定などに活用されてきている。最近では、それぞれの細胞が持つ抗原分子を、異なった金属イオンで標識した抗体とフローサイトメトリーを組み合わせた方法で検出する[[マスサイトメトリー]]（CyTOFなど）も開発されてきている<ref><pubmed>27153492</pubmed></ref>。<br />
<br />
細胞種にもよるが、1つの細胞内にある全RNA（ribosomal RNAを含む）は細胞種にもよるが1-50pgである。そのうち、mRNAの占める割合は1-5%程度である<ref><pubmed>15239941</pubmed></ref>。この微量のmRNAをcDNAに変換してから大幅に増幅できる方法が発明されたことで、1つの細胞が発現するmRNAを高感度で検出できるようになった<ref><pubmed>1557406</pubmed></ref><ref><pubmed>7541630</pubmed></ref> 。例えば、1991年、Linda BuckとRichard Axelは、[[嗅覚受容体]]が[[Gタンパク質]]であると仮定し、個々の嗅覚細胞で特異的に観察されるGタンパク質mRNAを比較することで、嗅覚受容体の同定に成功した<ref><pubmed>1840504</pubmed></ref>。1995年になると、Catherine DulacとRichard Axelは、異なる[[鋤鼻神経細胞]]で特異的に発現する遺伝子を１つの細胞から作製したcDNAライブラリーを比較するディファレンシャル・スクリーニングを行うことで、[[フェロモン受容体]]を同定した<ref><pubmed>7585937</pubmed></ref>。同じ手法で異なる種類の神経細胞で発現している遺伝子も同定され<ref><pubmed>9778248</pubmed></ref><ref><pubmed>12230981</pubmed></ref>、１つの細胞の持つトランスクリプトームを比較するアプローチが神経細胞で特徴的に発現している遺伝子の同定に効果的なことが示された。<br />
<br />
一方で多くの種類のmRNAを１細胞レベルで一挙に観察するための技術には感度やスループット、そしてコストの観点からブレークスルーが待たれた。1つの問題は多種類のcDNAを簡便に識別することを可能にする方法の開発であった。これを可能にしたのが、[[PCR]]などのcDNA増幅法の改良とマイクロアレイの利用であった<ref><pubmed>12736331</pubmed></ref><ref><pubmed>16547197</pubmed></ref>。しかしながら、細胞ごとに高価なマイクロアレイを使用することは、多数の細胞のトランスクリプトームの観察には限界があった。2009年になると、これらの問題を解決できる可能性として、NGSを利用するscRNAseqプロトコールがAzim Suraniのグループによって報告された<ref><pubmed>19349980</pubmed></ref>。しかしながら、多数のマイクロアレイでなく1回のNGS使用で済ませることができるものの、この報告でもわずか8個の細胞の解析に留まっており、1つの細胞ごとに処理を行うという操作が必要で、多数の細胞についてのトランスクリプームを一挙に理解することはできなかった。また、塩基配列の違うcDNAごとにPCR効率に差がある結果生じる増幅バイアス、また3’末端側が選択的に補足されることなどの課題があった。<br />
<br />
==scRNAseqの現状==<br />
===scRNAseqの分子生物学的反応===<br />
その後、5’末端側の領域まで効率よく増幅するscRNAseqのプロトコールが考案された<ref><pubmed>32518403</pubmed></ref>。特に、SMART-seq（Switching mechanism at the 5' End of RNA Templates）<ref><pubmed>22820318</pubmed></ref>およびその改良されたプロトコールであるSMART-seq2<ref><pubmed>24056875</pubmed></ref> <ref><pubmed>24385147</pubmed></ref>の使用例が多い（既に、SMART-seq3という改良プロトコールもある<ref><pubmed>32518404</pubmed></ref>が、以下SMART-seqと呼ぶ）。また、類似法としてSTRT（single-cell tagged reverse transcription）<ref><pubmed>21543516</pubmed></ref>などがある。<br />
<br />
一方、CEL-seq（Cell Expression by Linear amplification and Sequencing）<ref><pubmed>22939981</pubmed></ref>、CEL-seq2<ref><pubmed> 27121950 </pubmed></ref> 、MARS-seq（Massively parallel single-cell RNA-seq）<ref><pubmed>24531970 </pubmed></ref>では、[[T7 RNAポリメラーゼ]]による[[in vitro転写]]を用いることにより、ＰＣＲによる増幅で見られるバイアスを低減させようとしている。<br />
<br />
また、Quartz-SeqやQuartz-Seq2ではPCR用のアダプターを付加する反応にポリAテーリングを利用することで、他の手法と比較して1.5-5倍程度の遺伝子を検出できる<ref><pubmed> 32518403</ref></pubmed>。<br />
===バーコード技術 ===<br />
増幅バイアス除去のアプローチとして特に重要なのは、2011年に発表された方法で、分子識別子（unique molecular identifiers: UMI）を持つcDNAを増幅させ、NGS後の情報処理を用いるものであると考えられる<ref><pubmed>22101854</pubmed></ref>。この方法では逆転写反応の際、ランダム塩基配列から構成されるUMIをcDNA末端に付加した後、増幅反応、NGSを行い、cDNA配列とUMI配列の両方を読む。cDNAにはRNA1分子に1つのUMIが付加されるので、同一のUMIを持っていれば、逆転写時に同一のcDNA由来とカウントする。UMIをカウントすることで、増幅前のmRNAのコピー数を知ることができる<ref><pubmed>21543516</pubmed></ref><ref><pubmed>24363023</pubmed></ref><ref><pubmed>28192419</pubmed></ref> <ref><pubmed>29474909</pubmed></ref><ref><pubmed> 28818938 </pubmed></ref><ref><pubmed>29545511</pubmed></ref>。<br />
===多様なプラットフォーム===<br />
細胞を分別するプラットフォームには、マイクロピペットによる捕獲、セルソーター、[[レーザー捕獲]]などを用いるマルチウェル法、あるいは半導体集積回路様の製作技術で作った流体回路を利用するFluidigm C1の装置（C1 Single- Cell Auto Prep<br />
）[https://jp.fluidigm.com] 、更にドロップレット使用（下記）などがある<ref><pubmed>30405621</pubmed></ref>[https://doi.org/10.1101/742304]。これらは、SMART-seqと組み合わせて利用されることが多い。SMART-seqプロトコールの特徴は、全長mRNAのトランスクリプトーム情報を得ることができることであり、mRNAのスプライシングバリアントなどのアイソフォーム、SNPsの情報を利用したアリル特異的発現、変異の検出にも利用できる。また、それぞれ細胞ごとの反応を独立した場所で行うため、反応中に別の細胞の反応と混じる可能性が低い。小型のナノウェルを用いるSeq-Wellも同様に反応自体が混じる可能性が低い<ref><pubmed>28192419</pubmed></ref>。これらの点が、次に説明するドロップレットを使用して3’末端のみを標的にしたscRNAseqと比べた場合の長所であるが、その高コスト（1細胞あたり数十ドル）と処理可能な細胞数の少なさが短所である。<br />
<br />
これらとは別に、ハイスループットで安価な方法として、それぞれの細胞を独立に標識するのではなく、プールされた細胞を異なるウェルにランダムに振り分け、ウェル固有のバーコードで転写物を標識していく操作を複数回繰り返していくことで細胞を区別するSplit-seqやsci-RNA-seq3などの方法も用いられている<ref><pubmed>29545511</pubmed></ref><ref><pubmed>30787437</pubmed></ref>。<br />
===ドロップレット使用の3’エンドリード法===<br />
scRNAseqのプラットフォームと方法について重要と考えられる進歩は、2015年、Harvard Medical Schoolの独立した２つのグループが、inDrops<ref><pubmed>26000487</pubmed></ref>そしてDrop-seq<ref><pubmed>26000488 </pubmed></ref>という類似した2つのハイスループットな方法を開発したことであろう（inDropsはT7RNAポリメラーゼ、Drop-seqはPCRで増幅）。これらの方法では、[[マイクロ流体力学]] (Microfluidics) 、 UMI（上述）と細胞ごとのバーコード（Cell Barcode）という2種類のDNAバーコーディング、そしてNGSと情報解析法を利用している。そして、多く細胞のサンプル調製の自動化と容易さから、1つの細胞あたりに要するコストを大幅に低下させることに成功した（Drop-seqは発表時で、１細胞あたり約5セント）。つまり、細胞1つずつをマイクロ流体力学によるエマルジョン作製技術を利用した装置に流入させ、その１細胞を1つのドロップレットに自動的に閉じ込める。そのドロップレット中には、ドロップレットごとにCell barcode/UMIとしてユニークなDNAバーコードを持つゲルビーズ(Gel Beads in Emulsion, GEMs)が入っており、それを足場に3’末端のみを標的にしたcDNA合成反応を実施することで、同じ細胞に含まれていた1分子のmRNAが同じCell barcodeを持つcDNAとして合成され、そのmRNA/cDNAが由来した細胞を識別できるということを利用している（図１）。<br />
<br />
なお、DropSeqはコストが低いが、細胞の取得率と検出感度が低い弱点がある。inDropsはDropSeqより細胞取得率が高く、パラメータを調整することにより、低レベルで発現される遺伝子の検出にも有利であるとされる<ref><pubmed>30472192</pubmed></ref>。DropSeqのセットアップはDolomite Bio ([https://www.dolomite-bio.com])、inDropは1 Cellbio社から販売されている[https://1cell-bio.com]。しかし、その後、10x Genomics社が同様の原理を用いた「Chromium」と命名された機器とそのための試薬を市販することで、多くの研究者が容易に利用できるようになっている<ref><pubmed>28091601</pubmed></ref>[https://www.10xgenomics.com/jp/]。Svenssonらによる最近のデータベース[https://doi.org/10.1101/742304], [http://www.nxn.se/single-cell-studies/gui]では、scRNAseqを用いた論文で用いられた方法について調査している。この数年、10x Genomics社Chromiumを用いた論文が飛躍的に増加している。10x Genomics社Chromiumのシステムは市販であるので導入が容易であり、DropSeqやinDropsに比べ多くの転写産物の検出が可能であるが、それらよりランニングコストは高価である<ref><pubmed>30472192</pubmed></ref>。なお、3’エンドリード法だけでなく、抗体やT 細胞レセプターのN末端側に位置する可変領域の配列決定が可能である5'末端のシーケンシングには5’エンドリード法が利用されることがある。<br />
<br />
[[ファイル:scFig1.jpg|サムネイル|300px|'''図1．ドロップレット使用の3’エンドリード法 '''<br>組織から解離させた細胞それぞれを、マイクロ流体力学を利用した装置で、バーコードプライマーが結合したゲルビーズとともにドロップレットに封じ込める。ドロップレット中には、ドロップレットごとにCell barcode/UMIとしてユニークなDNA配列を持つゲルビーズ(GEMs)が入っており、それを足場にcDNA合成反応を実施することで、同じ細胞に含まれていたmRNAが同じCell barcodeを持つDNAとして合成され、それを増幅する。]]<br />
==scRNAseqの実際==<br />
ここでは主流になっている10x Genomics社のChromiumなどのドロップレットを用いた方法とSMART-seqなどを用いた方法に共通する方法の実際について概説する。scRNAseqの利用には、4つのステップがある（図２）<ref><pubmed> 31217225</pubmed></ref><ref><pubmed>30089861</pubmed></ref>。１）個体や組織を採集し、そこから細胞あるいは細胞核を個別に解離された状態にすること。２）ドロップレット法やSMART-seq対応のプラットフォームなどによる個々の細胞からのライブラリーの作製とNGS。３）得られた配列情報の前処理（preprocessing）。４）下流解析と生物学的な情報を得るコンピューター生物学。これらのうち、２）の段階については、上に記述したように市販の機器や試薬を利用する機会が多くなっているので、詳細は説明しない<br />
[[ファイル:ScFig2c.jpg|サムネイル|500px|'''図２．scRNAseqの実際のステップ '''<br>細胞の単離、ライブラリ作製とNGS、データの前処理から次元圧縮、下流解析。図の一部は2016 DBCLS TogoTV、あるいはSeuratを用いて10x Genomics社のPBMCデータ（[https://support.10xgenomics.com/single-cell-gene-expression/datasets]から執筆者が作製。]]<br />
===組織からの細胞、細胞核の分離===<br />
浮遊細胞（血液細胞など）ではない場合、物理的あるいは酵素処理などによって解離することで、生組織から状態の良い個々に分散した細胞を調製する必要がある。神経系組織の酵素処理には、パパインを用いる方法が広く用いられている<ref><pubmed>29970990</pubmed></ref>。ここで、しばしば問題となるのが、酵素処理による短時間加温や機械的刺激で、発現量が変化する遺伝子が存在することである<ref><pubmed>27090946</pubmed></ref>。特に、脳の[[ミクログリア]]の解析には、低温下で組織をホモゲナイズするなどの工夫が必要であった<ref><pubmed>30471926</pubmed></ref>。また、このような現象を抑制するために、酵素処理時に転写阻害剤である[[アクチノマイシン]]で処理したり<ref><pubmed>29024657</pubmed></ref>、ヒマラヤ氷河から得られた細菌Bacillus licheniformisから得られた低温プロテアーゼを用いる方法も報告されている<ref><pubmed>28851704</pubmed></ref><ref><pubmed>31623682</pubmed></ref>。また、細胞解離後に、メタノールで固定しscRNAseqに使用したり<ref><pubmed>28526029</pubmed></ref>、クロスリンカーを用いる方法もある<ref><pubmed>29391536</pubmed></ref>。<br />
<br />
単離した細胞は、そのまま10x GenomicsのChromiumのプラットフォームに導入することができるが、細胞表面分子マーカーに対する抗体や蛍光タンパク質レポーターなどを用いたFACS、[[パニング]]、MACS(磁気ビーズカラム)などによって、細胞の選択的濃縮や除去を行う場合もある。更に、抗体に抗体表示バーコードDNAをカップリングさせるCITE-seq(Cellular Indexing of Transcriptomes and Epitopes by Sequencing) については、下記の複数モダリティのオミクスの項目で述べる。<br />
<br />
なお、ヒト組織や希少生物などから生細胞を得ることは困難なことが多い。この場合、scRNAseqの変法として、凍結した組織から、各細胞由来の核を調製し、核内のmRNAを分析するsnRNAseq (single-nucleus RNA-seq)が利用されている。ただ、snRNAseqでは、FACSなどによる特定細胞集団の分離が困難であることが多い。また、細胞質を持つ生細胞を利用したscRNAseqとは違って、スプライシングの途上にある未成熟な核内転写産物を検出すること、更に検出できる遺伝子数も少なく、同等な結果が必ずしも得られない<ref><pubmed>24248345</pubmed></ref><ref><pubmed>26890679</pubmed></ref> <ref><pubmed>27471252</pubmed></ref><ref><pubmed>28846088</pubmed></ref><ref><pubmed>29220646</pubmed></ref><ref><pubmed>28846088</pubmed></ref><ref><pubmed>30586455</pubmed></ref><ref><pubmed>28729663</pubmed></ref><ref><pubmed>31728515</pubmed></ref><ref><pubmed>32341560</pubmed></ref> <ref><pubmed>32518403</pubmed></ref>。一方で、snRNA-seqでは、組織をそのまま凍結することから開始することが可能であるので、上述したscRNAseqの問題である細胞解離酵素による処理などを避けることができる。更に、核を用いることで、大きな細胞体はマイクロ流体力学の流路で詰まりやすいなど、特に神経細胞で顕著である細胞の形状の多様性に伴うバイアスを減らすことができるといったメリットもある。こうしたプロトコールの一部は、protocols.ioのHuman Cell Atlasのグループ[https://www.protocols.io/groups/hca]で公開されている。<br />
通常のscRNAseqは、ポリアデニル化されたmRNAを検出しているが、MATQ-seq（multiple annealing and dC-tailing-based quantitative single-cell RNA-seq）、RamDA-seqなどを用いると、ポリアデニル化されていないRNAの検出も可能である<ref><pubmed> 28092691</pubmed></ref> <ref><pubmed>29434199 </pubmed></ref>[https://doi.org/10.1101/2020.06.02.131060]。更に、RNAを分析するscRNAseqではないが、遺伝子発現との関係が想定される[[オープンクロマチン]]領域を[[トランスポゾン]]を用いることで個々の細胞レベルで選択的に検出するsingle cell ATAC-seq (Assay for Transposase-Accessible Chromatin) <ref><pubmed>26083756</pubmed></ref>, <ref><pubmed>29434377</pubmed></ref><ref><pubmed>25953818</pubmed></ref>, single cell THS-seq (transposome hypersensitive-site) <ref><pubmed>29227469</pubmed></ref>や [[DNAメチル化]]領域を観察するsnmC-seq、RRBSのような方法も利用されている<ref><pubmed>28798132</pubmed></ref><ref><pubmed>30237449</pubmed></ref><ref><pubmed> 20852635</pubmed></ref>。<br />
===scRNAseqデータ処理の流れ===<br />
====総論====<br />
10x Genomics社のChromium、Illumina社のNGSを利用した場合、Cell Rangerのmkrefコマンド(Linux上で作動, [https://support.10xgenomics.com/single-cell-gene-expression/software/pipelines/latest/using/tutorial_mr])などにより、各生物種ごとのレファレンス配列リスト（[https://www.ncbi.nlm.nih.gov/grc]、マウスやヒトでは既製のものを利用できる）などを参考にしながら、細胞と転写産物量の対応マトリックスを作製する。その後のデータの処理についても、10x Genomics社がソフトウェアLoupeを提供している。しかしながら、その後の下流解析を考慮して、[[R]], [[Python]], MATLABなどのデータ解析のための汎用プログラミング言語やコードで扱えるオブジェクトに変換するのが通常である。<br />
<br />
scRNAseq解析のためには、数多くのツールが公開されている。これらのツールは、バージョンが変わったり、新しいものに置き換えられることがあるので、実際に利用する場合は最新の動向に注意を払う必要がある。scRNAseqの解析に必要なツールは、scRNA-tools [https://www.scrna-tools.org], Awesome single cell [https://github.com/seandavi/awesome-single-cell], Bioconductor[https://www.bioconductor.org]などで紹介されており、ほとんどがダウンロード可能である。また、bioRxivなどの査読前のプレプリントサーバで公開されて、随時試用、評価されていくものが多く、scRNAseqのデータ（下記参考）とともに、オープンサイエンス実践の好例となっている。<br />
====Seurat====<br />
ここでは、scRNAseqデータ解析のために最もよく利用されているRを用いたパッケージ「Seurat」<ref><pubmed> 29608179 </pubmed></ref> <ref><pubmed> 31178118 </pubmed></ref>を中心に紹介しておきたい。なお、一部の解析操作は、University of WashingtonのCole Trapnell研究室で開発されてきた軌道推定（下記参考）によく使用されるMonocle3でも可能である（[https://cole-trapnell-lab.github.io/monocle3/]）。Pythonを利用したものでは、ドイツ・ミュンヘンInstitute of Computational Biologyの Fabian Theisらが開発しているScanpyが有名である<ref><pubmed> 29409532</pubmed></ref>。<br />
<br />
New York UniversityのRahul Satija研究室が開発しているSeurat（画家スーラに由来）は、scRNAseqデータ解析のために広く利用されているRパッケージであり、2020年秋現在、Seurat4のβバージョンが公開されている。論文の正式発表前から、サポート情報提供やコード修正なども頻繁に行っており、Satija研究室のウェッブサイト（ [http://satijalab.org/Seurat]）、Github([https://github.com/satijalab/Seurat])、更にTwitterアカウント（@satijalab）などで最新情報を得ることできる。<br />
====品質の検討事項====<br />
最初に行うのは、scRNAseqデータの品質管理である。ここでは、質の低い細胞のデータ（例えば、壊れた細胞では、転写産物の種類が少なくミトコンドリア由来の転写産物が多い）を取り除く。また、複数の試料を組み合わせる場合には、バッチごとの違いについて検討する<ref><pubmed>29608177</pubmed></ref><ref><pubmed> 28045081<br />
</pubmed></ref><ref><pubmed>31948481</pubmed></ref> <ref><pubmed>32854757</pubmed></ref>。現実には、実験ごとのバッチの違いによる影響（Batch effect）がscRNAseqの最大の問題であると示されてきており、試料の処理を同時に行うなど実験デザインを工夫する必要がある<ref><pubmed>29121214</pubmed></ref>。<br />
<br />
また、ドロップレットを使用するscRNAseqでしばしば問題になるのが、ドロップレットに２つ以上の細胞が封じ込められ、それらが同一のCell barcodeを持ってしまうアーティファクトである。通常「Doublet」「Multilet」と呼ばれるこの問題は下流解析を混乱させるので、細胞単離の段階から注意する必要があるが、scRNAseqデータ取得後にもデータ処理で解決できる可能性もある<ref><pubmed>30954476</pubmed></ref><ref><pubmed>30954475</pubmed></ref> <ref><pubmed>31693907</pubmed></ref><ref><pubmed>32592658</pubmed></ref> <ref><pubmed>29227470</pubmed></ref><ref><pubmed>31836005</pubmed></ref><ref><pubmed>31856883</pubmed></ref><ref><pubmed>30567574</pubmed></ref> <ref><pubmed>31266958</pubmed></ref> [https://doi.org/10.1101/2019.12.17.879304][https://doi.org/10.1101/699637][http://dx.doi.org/10.2139/ssrn.3646565]。なお、この手法を利用することで、バッチ効果を抑えるために、異なるバーコードを持つ複数の試料を混ぜて一つの試料として扱い、計算機的に再び分離、解析するdemultiplexingという手法が注目されている<ref><pubmed>32483174</pubmed></ref>。<br />
<br />
scRNAseqデータの次のノイズは、ある遺伝子の発現が低いために、本来同じタイプの細胞であっても、その遺伝子の発現が全く見られない「Dropout」と呼ばれる現象であり解析に影響を与えるので、これについても検討が必要である<ref><pubmed> 24056876<br />
</pubmed></ref><ref><pubmed>32127540</pubmed></ref>。<br />
====次元圧縮====<br />
このような品質管理、ノーマライゼーションの過程を経て<ref><pubmed>28504683</pubmed></ref>、scRNAseqのデータ解析において、最初に行うのが、[[次元圧縮]] (dimensionality reduction)である<ref><pubmed>30617341</pubmed></ref><ref><pubmed>31780648</pubmed></ref><ref><pubmed>31955711</pubmed></ref><ref><pubmed>31823809</pubmed></ref>。PCA (Principal component analysis, 主成分分析)、更に発展させたUMAP（Uniform Manifold Approximation and Projection, 均一マニフォールド近似と投影）、Diffusion maps<ref><pubmed> 26002886<br />
</pubmed></ref>, tSNE(t-distributed Stochastic Neighbor Embedding , t分布型確率的近傍埋込み)などの手法が用いられる。 特に、tSNE[http://www.jmlr.org/papers/v9/vandermaaten08a.html]とUMAP[https://arxiv.org/abs/1802.03426]は、高次元データを低次元の点の集合として可視化することで、それぞれの細胞の持つトランスクリプトームの類似度についての直観的な表示が可能でありしばしば用いられる（図３）。tSNEよりUMAPの方が迅速に類似集団間の関係が明確になるので、最近はUMAPを利用することが多くなってきている。次に、[[Louvainアルゴリズム]]などでクラスタリング（コミュニティ分割）を行いグラフ上に表示できる（図３の色分け）。こうして、異なる転写状態を示す細胞の集合が別のクラスターとして表示され、同定可能になる<ref><pubmed>31500660</pubmed></ref>。<br />
[[ファイル:scFig3.jpg|サムネイル|250px|'''図３． tSNEとUMAPによる同じデータの可視化'''<br>網膜（ニワトリ）の視細胞のデータを用いて執筆者が作製[https://doi.org/10.1101/2020.10.09.333633<br />
}。]]<br />
==下流解析==<br />
===細胞クラスターの解釈とマーカー遺伝子候補の発見===<br />
scRNAseqデータから得られる生物学的知見には、内在的に存在する細胞の種類、外部刺激や環境で変化した細胞の状態、そして種類や変化により特徴的に発現するマーカー遺伝子候補の発見がある<ref><pubmed>27824854</pubmed></ref><ref><pubmed>32033589</pubmed></ref><br />
。クラスタリングにより、異なった細胞集団の存在が認識されると、それぞれのクラスター（群）に特徴的に発現している具体的な遺伝子を探索し、細胞集団の持つバイオマーカーによって、そのクラスター（群）の同定が可能になる。例えば、既に神経細胞とグリア細胞に特異的に発現する典型的マーカーはよく知られており、それぞれのクラスターの識別は容易である。更に、神経細胞のタイプ（下記参考）を区別できるマーカーや、外部刺激によって遺伝子発現が変化した神経細胞の状態は、In situ hybridizationや免疫組織化学などにより確認できる。このようなクラスターごとに発現が異なる遺伝子（差次的発現遺伝子）を見つけるためには（Differential expression analysis, DE analysis）、SeuratのFindMarkersコマンド中でも利用可能であるコード（MAST、DESeq2など<ref><pubmed>26653891</pubmed></ref><ref><pubmed>25516281</pubmed></ref><ref><pubmed>30658573</pubmed></ref>）を用いることができる。細胞ごとの差次的発現遺伝子のVisualization（表示可視化）には、ドットプロット（dot plot）、ヴァイオリンプロット（violin plot）、リッジプロット（Ridge plot, joy plot）、UMAPなどの次元圧縮図上に転写物量をプロットするFeatureプロット（feature plot）などが、目的に応じて頻繁に用いられる（図４）。<br />
[[ファイル:scFig4.jpg|サムネイル|300px|'''図４．scRNAseqデータの可視化の例 '''<br>A. ドットプロット。B.ヴァイオリンプロット。C. リッジプロット。D. UMAP（灰色）に転写物量（青）をプロットした Featureプロット。網膜の視細胞のデータを用いて執筆者が作製[https://doi.org/10.1101/2020.10.09.333633<br />
]。]]<br />
===擬時系列解析===<br />
実験的なノイズとは別に生物学的に意味のある遺伝子発現の変動には、位置情報、[[細胞周期]]、[[概日リズム]]、発現変動が大きい破裂型プロモーターの作動などの理由で 変動が見られるものもある<ref><pubmed> 31217225 </pubmed></ref><ref><pubmed> 26000846</pubmed></ref>。特に、刺激・薬剤処理やさまざまな病態の進行や治療に伴う細胞の変化、発生途上にある細胞系譜や細胞分化といった細胞の遷移状態の解析（[[軌道推定]]（Trajectory inference）；[[擬時系列解析]]（擬似時系列解析、偽時系列解析）、Pseudo-time analysis ）には、scRNAseqデータを用いることが効果的である<ref><pubmed>29576429</pubmed></ref><ref><pubmed>28813177</pubmed></ref><ref><pubmed>29565398</pubmed></ref>。しばしば用いられるMonocle3 <ref><pubmed>30787437</pubmed></ref>[https://cole-trapnell-lab.github.io/monocle3/]など、多くのコードを収集、比較しているサイトがある [https://dynverse.org][https://github.com/agitter/single-cell-pseudotime]。RNA velocityといったスプライシングされていく転写産物の量から細胞の分化状態を推定する方法もある<ref><pubmed>30089906</pubmed></ref><ref><pubmed> 32747759</pubmed></ref>。しかし、これらの方法は、あくまで[[細胞系譜]]や細胞分化の推定に過ぎない。細胞系譜を更に確実に観察しつつ、scRNAseqを行うことで、細胞タイプの系統関係を調べる方法として、CRISPR-Cas9を用いた[[ゲノム編集]]による痕跡追跡記録法を導入したscGESTALT<ref><pubmed>29608178</pubmed></ref>、ScarTrace<ref><pubmed>29590089</pubmed></ref> 、LINNAEUS<ref><pubmed>29644996</pubmed></ref>、あるいはアデノシンデアミナーゼでRNA編集を行いタイムスタンプを入れる方法<ref><pubmed>33077959</pubmed></ref>がある。1塩基バリアント（Single-nucleotide variants: SNV）の系統的解析は、細胞の不均一性や系統的な関係を明らかにするための最も有望なアプローチの一つである<ref><pubmed>31744515</pubmed></ref>。<br />
===遺伝子制御ネットワーク、パスウェイ解析など===<br />
また細胞分化や刺激などによる変動に伴う特徴的な遺伝子発現をscRNAseqで観察することは、遺伝子制御ネットワーク（例、SCENIC<ref><pubmed>28991892</pubmed></ref>, [https://github.com/aertslab/SCENIC]）、[[代謝経路]]や[[シグナル伝達系]]のための[[パスウェイ解析]](例、Metascape<ref><pubmed>30944313</pubmed></ref>, [http://metascape.org]、Gene Ontolgoy[http://geneontology.org])を理解するシステム生物学的な研究として有用である<ref><pubmed>32051003</pubmed></ref>。更に、scRNAseqで得られた結果をもとに、細胞間相互作用の理解を深めるのを目的とするCellPhoneDB<ref><pubmed>32103204</pubmed></ref>[https://github.com/Teichlab/cellphonedb]、NicheNet<ref><pubmed>3181926</pubmed></ref>, SVCA<ref><pubmed>31577949</pubmed></ref>などがある。特に、Perturb-seq<ref><pubmed>27984732</pubmed></ref> やその変法<ref><pubmed> 32231336</pubmed></ref>は、CRISPRライブラリーによるゲノム編集を施した細胞をscRNAseqで解析することで、ゲノム編集で破壊された遺伝子の機能や遺伝子間の相互作用の理解を可能にしている後述する複数モダリティ情報を取り込んだscRNAseqの１つであり、注目されている。<br />
==scRNAseqの神経科学研究への適用==<br />
===神経系細胞ビッグデータとしてのscRNAseq===<br />
様々な神経・精神疾患について理解しその診断や治療に役立てるためには、神経細胞、[[グリア細胞]]を中心にした神経系にある細胞の種類や状態を識別し、それぞれの細胞における分子的な変化を観察することが重要である <ref><pubmed>28775344</pubmed></ref><ref><pubmed>29738987</pubmed></ref>。本項目で解説してきたscRNAseq技術は、神経系に見られるそれぞれの細胞のトランスクリプトームについて[[ビッグデータ]]を提供することで、この細胞の種類や状態の識別に新たな判断材料を与えつつある。近年、中枢神経系の[[アストロサイト]]、[[オリゴデンドロサイト]]、ミクログリアといったグリア細胞も均一ではなく、内在的な多様性や外部因子による状態の変動が報告されてきている。神経細胞は、著しく多様であり、この多様性が神経系の多彩で複雑な機能発現の基盤となっている。従来の神経科学では、神経細胞の多様性は、それぞれの神経細胞の解剖学的な位置、発現している分子、電気生理学、結合性、形態、神経伝達物質、神経伝達物質受容体とシグナル伝達によって識別されてきている。こうした神経細胞の多様性を便宜的に記述するのに、タイプ（type）、クラス（class）、サブクラス（subclass）、サブタイプ（subtype） というような用語が用いられてきた。しかし、ここでは混乱を防ぐため、Masland（2004）<ref><pubmed>15242626</pubmed></ref>が提唱し、広く受けいれられている「クラス」と「タイプ」という単語を用いることとする。タイプは、これ以上分類することができないとされる階層であり、共通性を持つタイプの集団がクラスである。例えば、大脳皮質の錐体細胞、網膜神経節細胞といった大雑把な区分はクラスである。大脳皮質の錐体細胞というクラスは、層や領野によって異なるタイプ、網膜神経節細胞には視覚情報に対して応答が異なるタイプが存在する。scRNAseqは、「タイプ」の理解に新たな視点を提供している。<br />
===神経系へのscRNAseqの適用===<br />
scRNAseqの神経系での利用については、次々と新しい論文やプレプリントが発表されており、ここではscRNAseqで得られてきた情報の典型例を紹介することにとどめる。<br />
<br />
[[大脳皮質]]には、[[錐体細胞]]や[[非錐体細胞]]などの神経細胞や様々なグリア細胞などが見られ、古くから神経細胞タイプの識別が行われてきた。初期のFluidigm C1を用いたscRNAseq技術でも、マウス皮質の小規模な細胞数を分類した研究で、これまで知られていた主要な神経細胞タイプとは違うタイプが見つかりその有効性が示された<ref><pubmed>25700174</pubmed></ref>。その後のドロップレット使用の3’エンドリード法を利用した多数の細胞数の解析で、更に多数の神経細胞のタイプが見つかっている<ref><pubmed>32839617</pubmed></ref><ref><pubmed>28846088</pubmed></ref><ref><pubmed>30096299</pubmed></ref><ref><pubmed>30096314</pubmed></ref><ref><pubmed>30382198</pubmed></ref><ref><pubmed>29320739</pubmed></ref><ref><pubmed>28846088</pubmed></ref>[https://doi.org/10.1101/2020.03.14.991018][https://doi.org/10.1101/2020.06.04.105700] [https://doi.org/10.1101/2020.07.02.184051]。特に、GABA作動性介在神経細胞タイプの多様性とその発生<ref><pubmed>28942923</pubmed></ref><ref><pubmed>28134272</pubmed></ref><ref><pubmed>29472441</pubmed></ref><ref><pubmed>29513653</pubmed></ref>についての、これまでの組織化学的な研究からは得られていなかった多くの情報は重要であろう。また、初期の発生過程<ref><pubmed>26940868</pubmed></ref><ref><pubmed>30485812</pubmed></ref><ref><pubmed>31073041</pubmed></ref><ref><pubmed>30635555</pubmed></ref><ref><pubmed>30625322</pubmed></ref>、老化<ref><pubmed>31551601</pubmed></ref>の理解が、scRNASeq技術を利用することで進んでいる。更に、[[神経活動]]や[[臨界期]]に伴い変化するmRNAも細胞ごとに調査され興味深い<ref><pubmed>29230054</pubmed></ref> <ref><pubmed>32404418</pubmed></ref>。 ヒトを含めた霊長類の大脳についても発達段階を含めてscRNAseqが適用されてきている<ref><pubmed>26060301</pubmed></ref><ref><pubmed>27339989</pubmed></ref><ref><pubmed>29539641</pubmed></ref><ref><pubmed>29217575</pubmed></ref><ref><pubmed>28846088</pubmed></ref><ref><pubmed>29227469</pubmed></ref><ref><pubmed>31303374</pubmed></ref><ref><pubmed>29867213</pubmed></ref><ref><pubmed>31435019</pubmed></ref><ref><pubmed>32424074</pubmed></ref> [https://doi.org/10.1101/709501][https://doi.org/10.1101/2020.03.31.016972][https://doi.org/10.1101/2020.04.23.056390]。ヒトや霊長類に特徴的とされる[[島]]のvon Economo神経細胞（紡錘細胞）のような希少な神経細胞のscRNAseqにも成功している<ref><pubmed>32127543</pubmed></ref>。<br />
<br />
[[海馬]]<ref><pubmed>29241552</pubmed></ref><ref><pubmed>29912866</pubmed></ref><ref><pubmed>29335606</pubmed></ref><ref><pubmed>31942070</pubmed></ref>では、これまでの研究で記載されてきた神経細胞のタイプの存在が確認され、更に新規のタイプが見つかった。中枢神経系では、その他、[[外側膝状体]]<ref><pubmed>29343640</pubmed></ref>、[[大脳基底核]](足底核)<ref><pubmed>28384468</pubmed></ref> 、[[視床下部]]<ref><pubmed>28166221</pubmed></ref><ref><pubmed>28355573</pubmed></ref> <ref><pubmed>27991900</pubmed></ref><ref><pubmed>30385464</pubmed></ref> <ref><pubmed>31249056</pubmed></ref><ref><pubmed>30858605</pubmed></ref>、[[線条体]]<ref><pubmed>27425622</pubmed></ref><ref><pubmed>30134177</pubmed></ref><ref><pubmed>31875543</pubmed></ref>、[[中脳]]<ref><pubmed>27716510</pubmed></ref><ref><pubmed>29499164</pubmed></ref> <ref><pubmed>30718509</pubmed></ref> 、[[手綱]]<ref><pubmed>29576475</pubmed></ref>、発生中の[[間脳]]<ref><pubmed>30872278</pubmed></ref> 、さらに[[小脳]]<ref><pubmed>30220501</pubmed></ref><ref><pubmed>30735127</pubmed></ref><ref><pubmed>30690467</pubmed></ref>などの結果が報告されてきている。例えば、構成する細胞についての情報が詳細に研究されてきたと思われていたマウスの小脳においても、分子層にこれまでの星状細胞、バスケット細胞というカテゴリーとは違ったギャップジャンクションに特徴を持つ２種類の神経細胞があることが示唆されている[https://doi.org/10.1101/2020.03.04.976407]。<br />
<br />
脳の外部では、[[運動神経]][https://doi.org/10.1101/2020.03.16.992958]、[[感覚神経]]<ref><pubmed>25420068</pubmed></ref><ref><pubmed>26691752</pubmed></ref>、[[らせん神経節]]<ref><pubmed>30078709</pubmed></ref><ref><pubmed>30209249</pubmed></ref> 、[[臭覚神経]]<ref><pubmed>26541607</pubmed></ref> <ref><pubmed>32059767</pubmed></ref>、[[腸神経系]] <ref><pubmed>29483303</pubmed></ref>[https://doi.org/10.1101/2020.03.02.955757] 、[[網膜]]<ref><pubmed>27565351</pubmed></ref><ref><pubmed>29909983</pubmed></ref><ref><pubmed>30018341</pubmed></ref><ref><pubmed>31260032</pubmed></ref><ref><pubmed>31128945</pubmed></ref><ref><pubmed>30712875</pubmed></ref><ref><pubmed>30548510</pubmed></ref><ref><pubmed>31075224</pubmed></ref><ref><pubmed>31399471</pubmed></ref><ref><pubmed>31848347</pubmed></ref><ref><pubmed>31673015</pubmed></ref><ref><pubmed>31653841</pubmed></ref><ref><pubmed>31784286</pubmed></ref>[https://doi.org/10.1101/2020.02.26.966093][https://doi.org/10.1101/779694][https://www.biorxiv.org/content/10.1101/617555] [https://doi.org/10.1101/2020.10.09.333633]でのscRNAseqデータがある。<br />
<br />
また[[iPS細胞]]や[[ES細胞]]由来の神経組織[[オルガノイド]]に含まれる神経細胞タイプを知る上でも利用されている<ref><pubmed>28094016</pubmed></ref><ref><pubmed>28279351</pubmed></ref><ref><pubmed>31168097</pubmed></ref><ref><pubmed>31996853</pubmed></ref><ref><pubmed>31968264</pubmed></ref><ref><pubmed><ref><pubmed>32221280</pubmed></ref>。このようなアプローチは、ネアンデルタール人型の遺伝子を持つ脳オルガノイドの解析<ref><pubmed> 32559457</pubmed></ref>やSARS-CoV-2に感染する脳オルガノイド中の細胞の同定<ref><pubmed> 33113348</pubmed></ref>など、新たな応用例が発表されてきており興味深い。<br />
<br />
===神経細胞以外の細胞===<br />
[[上衣細胞]]<ref><pubmed>29727663</pubmed></ref>は、[[神経幹細胞]]としての役割が示唆されてきたが、scRNAseqによる解析ではその可能性が支持されなかった。グリア細胞では、[[ラジアルグリア]]<ref><pubmed>26406371</pubmed></ref><ref><pubmed>25734491</pubmed></ref><ref><pubmed>29281841</pubmed></ref><ref><pubmed>29217575</pubmed></ref><ref><pubmed>29539641</pubmed></ref>、アストロサイト<ref><pubmed>32139688</pubmed></ref><ref><pubmed>32203496</pubmed></ref>[https://doi.org/10.1101/2020.04.27.064881]に多様性があることが示唆されてきている。また、オリゴデンドロサイト<ref><pubmed>27284195</pubmed></ref><ref><pubmed>30078729</pubmed></ref><ref><pubmed>30257220</pubmed></ref><ref><pubmed>30747918</pubmed></ref><ref><pubmed>31958186</pubmed></ref>[https://doi.org/10.1101/2020.03.06.981373]については、これまで細胞生物学的に研究されてきた分化の過程がscRNAseqにより詳細に解析されている。ミクログリアは、神経系の発達、老化、損傷などに伴う重要なトランスクリプトームの変化がscRNAseqにより詳細に明らかになった<ref><pubmed>27338705</pubmed></ref><ref><pubmed>29020624</pubmed></ref><ref><pubmed>30206190</pubmed></ref><ref><pubmed>30471926</pubmed></ref><ref><pubmed>31209379</pubmed></ref><br />
<ref><pubmed>31835035</pubmed></ref>。また、[[CNS境界関連マクロファージ]](BAM) <ref><pubmed>31061494</pubmed></ref>や[[脳血管系]]<ref><pubmed>29443965</pubmed></ref>のscRNAseqも実施されている。<br />
===疾患===<br />
scRNAseqは、疾患の理解にも有用である。scRNAseqでは、疾患に伴う遺伝子発現の変化を細胞タイプごとに観察することができるので、バルクRNAseqでは埋もれていた遺伝子発現の変化や細胞ごとの変化を検出できるという長所がある。<br />
例えば、筋萎縮性側索硬化症<ref><pubmed>30948552</pubmed></ref>、多発性硬化症<ref><pubmed>30747918</pubmed></ref><ref><pubmed>30420755</pubmed></ref><ref><pubmed>32313246</pubmed></ref> <br />
、アルツハイマー病やそのモデル動物<ref><pubmed>31042697</pubmed></ref><ref><pubmed>31399126</pubmed></ref><ref><pubmed>29020624</pubmed></ref><br />
[https://doi.org/10.1101/628347]<ref><pubmed>28602351</pubmed></ref><ref><pubmed>32341542</pubmed></ref>、統合失調症<ref><pubmed>29785013</pubmed></ref><ref><pubmed>32203495</pubmed></ref>、自閉症やレット症候群<ref><pubmed>31097668</pubmed></ref><ref><pubmed>30455458</pubmed></ref>、シャルコー・マリー・トゥース病<ref><pubmed>29888333</pubmed></ref>、ダウン症[https://www.biorxiv.org/content/10.1101/2020.01.01.892398v1]、パーキンソン病<ref><pubmed>30503143</pubmed></ref> <ref><pubmed>32826893</pubmed></ref>、がん<ref><pubmed>31327527</pubmed></ref><ref><pubmed>28360267</pubmed></ref>などに適用されている。最近、Perturb-seqにより、自閉症に関わる遺伝子の欠損に伴う細胞状態の変化などもscRNAseqで報告されており<ref><pubmed>33243861</ref></pubmed>、疾患の理解のための新たな実験系の開発も始まりつつある。<br />
==scRNAseqの展望==<br />
===神経系の多様性と進化===<br />
NGSを用いることで、どんな生物種にも適用可能なscRNAseqは、既に多様な生物の神経系の細胞の理解、更には種間の相同性や差異の研究に利用されており、神経系の進化を細胞レベルで考察するのに有用であろう（例、線虫<ref><pubmed> 28818938 </pubmed></ref>、ショウジョウバエ <ref><pubmed>29909982</pubmed></ref><ref><pubmed>29149607</pubmed></ref><ref><pubmed>30703584</pubmed></ref><ref><pubmed>29909983</pubmed></ref><ref><pubmed>33125872</pubmed></ref>、カタユウレイボヤCiona intestinalis <ref><pubmed>30069052</pubmed></ref><ref><pubmed>30228204</pubmed></ref>、ゼブラフィッシュ<ref><pubmed>31018142</pubmed></ref><ref><pubmed>30929901</pubmed></ref>、アカミミガメTrachemys scripta elegans、トカゲPogona vitticeps, pv<ref><pubmed>29724907</pubmed></ref>、ニワトリ[https://doi.org/10.1101/2020.10.09.333633]、霊長類<ref><pubmed>30730291</pubmed></ref><ref><pubmed>31619793</pubmed></ref>[https://doi.org/10.1101/2020.03.31.016972]）。ただ、遺伝子やトランスクリプトームの研究が進んでいる生物種では比較的容易であるが、遺伝子のアノテーションが十分でない生物種を用いる場合、scRNAseqのデータ解析は困難を伴う。また種を超えた細胞タイプの相同性の理解には様々な工夫が必要である<ref><pubmed>31552245</pubmed></ref><ref><pubmed>30712875</pubmed></ref>[https://doi.org/10.1101/2020.03.31.016972]。<br />
===データベースと統合===<br />
獲得されたscRNAseqのデータは様々な目的で利用できるので、データベース化し利用できるようにする必要がある。神経系のトランスクリプトーム一般のデータベースが多数公開されており<ref><pubmed>29437890</pubmed></ref>、scRNAseqのデータも基本的にNCBIのGene Expression Omnibus[https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/]に登録されている。また、オープンサイエンス推進のためにcommon coordinate framework (CCF) やcentral annotation platform (CAP)という概念のもと、特にscRNAseqを意識したものとして、米国のBRAIN Initiative Cell Census Consortium<ref><pubmed>29096072</pubmed></ref> 、Human Cell Atlas ProjectのHuman Cell Atlas Data Portal [https://data.humancellatlas.org]、そのマウス版であるTabula Muris <ref><pubmed>30283141</pubmed></ref>[https://genome.ucsc.edu/cgi-bin/hgTrackUi?db=mm10&g=tabulaMuris]やSten Linnarssonラボのマウス脳発生データベース[http://mousebrain.org]、アレン脳研究所のAllen Brain Atlas [https://portal.brain-map.org]、ブロード研究所のSingle Cell Portal [https://singlecell.broadinstitute.org/]などのデータベースが稼働している。また、異なった方法や実験で得られたscRNAseqのデータや後述の複数モダリティのシングルセルオミクスのデータを体系的に比較することも重要であり、CCA (Canonical correlation analysis)<ref><pubmed>29608179</pubmed></ref>, Seurat 3.0以降に組み込まれたMMN (Mutual Nearest Neighbors)、LIGER<ref><pubmed>31178122</pubmed></ref> 、Harmony<ref><pubmed>31740819</pubmed></ref> 、MetaNeighber<ref><pubmed>29491377</pubmed></ref>、Conos<ref><pubmed>31308548</pubmed></ref>[https://doi.org/10.1101/2020.05.22.111161]のようなアルゴリズムが開発され、後述の複数モダリティのシングルセルオミクスを組み込んだ統合サイトもでき始めている（[https://biccn.org]）。またデータベースを利用して発現類似性検索も研究されている<ref><pubmed>29608555</pubmed></ref><ref><pubmed>30744683</pubmed></ref>。<br />
<br />
===空間トランスクリプトミクス===<br />
多数の細胞を扱うscRNAseqの弱点は、組織から細胞や細胞核を解離する必要があるので、その細胞が存在していた解剖学的あるいは空間的な位置の情報を消去してしまうということである。組織切片におけるタンパク質などの分布は免疫組織化学、mRNAの分布はin situ hybridizationで検出することができるが、数多くのmRNAの分布を情報処理技術と組み合わせ一気に同定する方法がscRNAseqと同様に開発されてきている（Slide-seq<ref><pubmed>30923225</pubmed></ref>[https://doi.org/10.1101/2020.03.12.989806]、HDST<ref><pubmed>31501547</pubmed></ref>、Expansion sequencing[http://doi.org/10.1101/2020.05.13.094268]など<ref><pubmed>27365449</pubmed></ref>, <ref><pubmed>31932730</pubmed></ref> <ref><pubmed>30948552</pubmed></ref>）、更に10x Genomics社が市販するVisiumなどがある。現状では、大きな組織の空間トランスクリプトミクスは、空間解像度は限定されており、技術普及の観点からも課題が多い。しかし、そのデータを解析するためのアルゴリズム<ref><pubmed>29553578</pubmed></ref><ref><pubmed>29553579</pubmed></ref><ref><pubmed>32350282</pubmed></ref> [https://doi.org/10.1101/757096][https://doi.org/10.1101/701680] [https://doi.org/10.1101/431957]、<br />
更にMerFish <ref><pubmed>25858977</pubmed></ref>、corrFISH<ref><pubmed>27271198</pubmed></ref>のように、subcellularレベルで多数のmRNAを検出する方法が多数開発されてきており（文献：<ref><pubmed>25549890</pubmed></ref> osmFISH<ref><pubmed>30377364</pubmed></ref> 30377364、STARmap (spatially-resolved transcript amplicon readout mapping) <ref><pubmed>29930089</pubmed></ref>、seqFISH+<ref><pubmed>27764670</pubmed></ref>、pciSeq(probabilistic cell typing by in situ sequencing)[https://doi.org/10.1101/431957]、DSP(Digital Spatial Profiling) <ref><pubmed>32393914</pubmed></ref>、scRNAseqと組み合わせることで、その弱点を補う空間トランスクリプトミクスにも利用され始め<ref><pubmed>30385464</pubmed></ref>[https://doi.org/10.1101/2020.06.04.105700]、今後の発展が期待される分野である。<br />
===統合解析 ===<br />
同一の細胞からscRNAseqの情報だけでなく、ゲノム配列、ATAC-seqなどによるエピゲノム解析、少数のタンパク質、あるいはプロテオームなど複数のモダリティを同時に観察するオミクス（Single-cell multimodal omics）が注目されている<ref><pubmed>31907462</pubmed></ref><ref><pubmed>30696980</pubmed></ref>。2019年には、Nature Methodsの「Methods of the Year」に選ばれており、現状については、その特集号などを参考にされたい。例えば、細胞表面に提示されているマーカー分子に対する抗体にDNAを付加することで、そのマーカーを発現する細胞のトランスクリプトームを解析するCITE-seq<ref><pubmed>28759029</pubmed></ref>、 REAP-seq<ref><pubmed>28854175</pubmed></ref>も、既知の細胞表面マーカーの発現とscRNAseqが同時に観察できる方法である。<br />
<br />
複数モダリティのシングルセルオミクスとして、神経科学分野で注目されるのは、scRNAseqをパッチクランプによる電気生理学的情報と組み合わせたPatch-seq<ref><pubmed>26689544</pubmed></ref> <ref><pubmed>26689543</pubmed></ref>である。また、ゲノムDNAとscRNAseqを同時に観察することによって、近年、精神疾患の観点から注目されている発生途中で生じる遺伝子変異を研究するPRDD-seqは今後の展開が注目される[https://doi.org/10.1101/2020.04.19.046904]。最後に、BARseq (barcoded anatomy resolved by sequencing) <ref><pubmed>31626774</pubmed></ref>、CONNECTID[https://doi.org/10.1101/378760]、Epi-Retro-seq[https://doi.org/10.1101/2020.04.01.019612]のような方法は、[[コネクトーム]]（神経細胞の結合性）と遺伝子発現を記録できるオミクスの新たな方向として興味深い。<br />
== 関連項目 ==<br />
*[[ゲノムワイド関連解析 ]]<br />
*[[ディファレンシャルディスプレイ ]]<br />
*[[In situハイブリダイゼーション法 ]]<br />
*[[免疫組織化学法]]<br />
*[[エピジェネティクス]]<br />
== 参考文献 ==<br />
<references /></div>
Masahitoyamagata
https://bsd.neuroinf.jp/w/index.php?title=%E3%83%95%E3%82%A1%E3%82%A4%E3%83%AB:ScFig2c.jpg&diff=45296
ファイル:ScFig2c.jpg
2020-12-12T01:13:11Z
<p>Masahitoyamagata: </p>
<hr />
<div></div>
Masahitoyamagata
https://bsd.neuroinf.jp/w/index.php?title=%E3%82%B7%E3%83%B3%E3%82%B0%E3%83%AB%E3%82%BB%E3%83%ABRNA%E3%82%B7%E3%83%BC%E3%82%B1%E3%83%B3%E3%82%B7%E3%83%B3%E3%82%B0&diff=45295
シングルセルRNAシーケンシング
2020-12-12T01:12:35Z
<p>Masahitoyamagata: </p>
<hr />
<div><div align="right"> <br />
<font size="+1">[http://researchmap.jp/yamagatm 山形方人]</font><br><br />
''Harvard University''<br><br />
DOI：<selfdoi /> 原稿受付日：年月日 原稿完成日：年月日<br><br />
担当編集委員：<br><br />
</div><br />
英：single-cell RNA sequencing, scRNAseq<br />
{{box|text=<br />
シングルセルRNAシーケンシング(single-cell RNA sequencing, 以下scRNAseq)は、[[次世代シーケンサー]] （next generation sequencer、以下NGS）を用いることで、個々の細胞が保持しているmRNA全体を質的、量的に網羅的に調べる方法である。次元圧縮などの数理的な解析と組み合わせることで、遺伝子発現の状態に基づいた細胞の分類を行うことが可能であり、従来の組織学的、あるいは細胞生物学的手法では知られなかった新規の細胞種の同定や細胞状態の推定を行うことが可能になった。また、時系列解析によって遺伝子発現プロファイルの変化に基づいて、刺激や発生に伴う細胞状態の遷移の描写ができる。神経系では、この方法により、神経細胞や非神経細胞の分類や状態についての知見が深まり、新しい神経細胞タイプ、細胞マーカー、病態の理解、更に機能的な遺伝子の同定などが系統的かつ網羅的に行われるようになった。scRNAseqとともに、空間的情報、エピゲノム情報、タンパク質情報なども取り入れた複数のモダリティを考慮した研究も行われている。<br />
}}<br />
<br />
==scRNAseqの背景==<br />
===トランスクリプトーム===<br />
トランスクリプトーム（transcriptome）は、細胞中に存在する全ての転写産物（タンパク質をコードするmRNA、タンパク質をコードしない[[ノンコーディングRNA]]、[[マイクロRNA]]など）の総体である<ref><pubmed>19015660</pubmed></ref><ref><pubmed>31341269 </pubmed></ref>。トランスクリプトームは、[[ゲノム]]とは異なり、同一の個体でも、組織ごとに、更には発生段階や細胞外環境や刺激によって変化する。トランスクリプトームは、同質あるいは異質の多数の細胞集団（組織、培養細胞）からRNA抽出後、cDNAに変換し、それを1990年代に出現した[[DNAマイクロアレイ]]のように数多くの既知mRNAを識別する技術によって解析されるようになった。その後、NGSの利用により、希少mRNAやノンコーディングRNAを含めた未知の転写産物の高感度検出が可能になるとともに、[[スプライシング]]で成熟していく過程のmRNAなど、転写産物の種類だけでなく、転写産物の構造的差異（スプライシングバリアント、SNPs、変異など）の解析もできるようになった。加えて、ヒトやモデル実験生物（[[マウス]]、[[ゼブラフィッシュ]]、[[ショウジョウバエ]]、[[線虫]]など）だけでなく、多種多様な生物のトランスクリプトームの把握も可能になった。従来から行われてきた組織全体などの多数の細胞を対象としたRNA-seq（バルクRNAseq）では、複数の細胞における転写産物の平均を観察しているが、本項目では個々の細胞における転写産物を解析するscRNA-seqの原理とその応用について概説する。<br />
<br />
===scRNAseqとその開発史===<br />
1つの細胞の持つ生体物質を解明し、定量しようとする試みは古くからあった。1960年代になると、フローサイトメトリーを利用した[[蛍光活性化セルソーティング]]（Fluorescence-activated cell sorting, FACS）が発明され、標識抗体などのプローブと組み合わせることで、多数の細胞集団の中で１つの細胞が保持している生体分子の種類や量についての断片的な研究が可能になり、この方法は現在でも汎用されている<ref><pubmed>22271369</pubmed></ref>。その後、[[免疫組織化学]]や[[in situ hybridization]]nなどにより、タンパク質やmRNAの種類や量が観察できるようになり、組織中に存在するそれぞれの細胞の同定などに活用されてきている。最近では、それぞれの細胞が持つ抗原分子を、異なった金属イオンで標識した抗体とフローサイトメトリーを組み合わせた方法で検出する[[マスサイトメトリー]]（CyTOFなど）も開発されてきている<ref><pubmed>27153492</pubmed></ref>。<br />
<br />
細胞種にもよるが、1つの細胞内にある全RNA（ribosomal RNAを含む）は細胞種にもよるが1-50pgである。そのうち、mRNAの占める割合は1-5%程度である<ref><pubmed>15239941</pubmed></ref>。この微量のmRNAをcDNAに変換してから大幅に増幅できる方法が発明されたことで、1つの細胞が発現するmRNAを高感度で検出できるようになった<ref><pubmed>1557406</pubmed></ref><ref><pubmed>7541630</pubmed></ref> 。例えば、1991年、Linda BuckとRichard Axelは、[[嗅覚受容体]]が[[Gタンパク質]]であると仮定し、個々の嗅覚細胞で特異的に観察されるGタンパク質mRNAを比較することで、嗅覚受容体の同定に成功した<ref><pubmed>1840504</pubmed></ref>。1995年になると、Catherine DulacとRichard Axelは、異なる[[鋤鼻神経細胞]]で特異的に発現する遺伝子を１つの細胞から作製したcDNAライブラリーを比較するディファレンシャル・スクリーニングを行うことで、[[フェロモン受容体]]を同定した<ref><pubmed>7585937</pubmed></ref>。同じ手法で異なる種類の神経細胞で発現している遺伝子も同定され<ref><pubmed>9778248</pubmed></ref><ref><pubmed>12230981</pubmed></ref>、１つの細胞の持つトランスクリプトームを比較するアプローチが神経細胞で特徴的に発現している遺伝子の同定に効果的なことが示された。<br />
<br />
一方で多くの種類のmRNAを１細胞レベルで一挙に観察するための技術には感度やスループット、そしてコストの観点からブレークスルーが待たれた。1つの問題は多種類のcDNAを簡便に識別することを可能にする方法の開発であった。これを可能にしたのが、[[PCR]]などのcDNA増幅法の改良とマイクロアレイの利用であった<ref><pubmed>12736331</pubmed></ref><ref><pubmed>16547197</pubmed></ref>。しかしながら、細胞ごとに高価なマイクロアレイを使用することは、多数の細胞のトランスクリプトームの観察には限界があった。2009年になると、これらの問題を解決できる可能性として、NGSを利用するscRNAseqプロトコールがAzim Suraniのグループによって報告された<ref><pubmed>19349980</pubmed></ref>。しかしながら、多数のマイクロアレイでなく1回のNGS使用で済ませることができるものの、この報告でもわずか8個の細胞の解析に留まっており、1つの細胞ごとに処理を行うという操作が必要で、多数の細胞についてのトランスクリプームを一挙に理解することはできなかった。また、塩基配列の違うcDNAごとにPCR効率に差がある結果生じる増幅バイアス、また3’末端側が選択的に補足されることなどの課題があった。<br />
<br />
===scRNAseqの現状===<br />
その後、5’末端側の領域まで効率よく増幅するscRNAseqのプロトコールが考案された<ref><pubmed>32518403</pubmed></ref>。特に、SMART-seq（Switching mechanism at the 5' End of RNA Templates）<ref><pubmed>22820318</pubmed></ref>およびその改良されたプロトコールであるSMART-seq2<ref><pubmed>24056875</pubmed></ref> <ref><pubmed>24385147</pubmed></ref>の使用例が多い（既に、SMART-seq3という改良プロトコールもある<ref><pubmed>32518404</pubmed></ref>が、以下SMART-seqと呼ぶ）。また、類似法としてSTRT（single-cell tagged reverse transcription）<ref><pubmed>21543516</pubmed></ref>などがある。<br />
<br />
一方、CEL-seq（Cell Expression by Linear amplification and Sequencing）<ref><pubmed>22939981</pubmed></ref>、CEL-seq2<ref><pubmed> 27121950 </pubmed></ref> 、MARS-seq（Massively parallel single-cell RNA-seq）<ref><pubmed>24531970 </pubmed></ref>では、[[T7 RNAポリメラーゼ]]による[[in vitro転写]]を用いることにより、ＰＣＲによる増幅で見られるバイアスを低減させようとしている。<br />
<br />
また、Quartz-SeqやQuartz-Seq2ではPCR用のアダプターを付加する反応にポリAテーリングを利用することで、他の手法と比較して1.5-5倍程度の遺伝子を検出できる<ref><pubmed> 32518403</ref></pubmed>。<br />
<br />
増幅バイアス除去のアプローチとして特に重要なのは、2011年に発表された方法で、分子識別子（unique molecular identifiers: UMI）を持つcDNAを増幅させ、NGS後の情報処理を用いるものである<ref><pubmed>22101854</pubmed></ref>。この方法では逆転写反応の際、ランダム塩基配列から構成されるUMIをcDNA末端に付加した後、増幅反応、NGSを行い、cDNA配列とUMI配列の両方を読む。cDNAにはRNA1分子に1つのUMIが付加されるので、同一のUMIを持っていれば、逆転写時に同一のcDNA由来とカウントする。UMIをカウントすることで、増幅前のmRNAのコピー数を知ることができる<ref><pubmed>21543516</pubmed></ref><ref><pubmed>24363023</pubmed></ref><ref><pubmed>28192419</pubmed></ref> <ref><pubmed>29474909</pubmed></ref><ref><pubmed> 28818938 </pubmed></ref><ref><pubmed>29545511</pubmed></ref>。<br />
<br />
これらの方法のうち、SMART-seqは、マイクロピペットによる捕獲、セルソーター、[[レーザー捕獲]]などを用いるマルチウェル法、あるいは半導体集積回路の製作技術で作った流体集積回路を利用するFluidigm C1の装置（C1 Single- Cell Auto Prep<br />
）[https://jp.fluidigm.com] など、様々な組み合わせに対応できる<ref><pubmed>30405621</pubmed></ref>[https://doi.org/10.1101/742304]。SMART-seqプロトコールの特徴は、全長mRNAのトランスクリプトーム情報を得ることができることであり、mRNAのスプライシングバリアントなどのアイソフォーム、SNPsの情報を利用したアリル特異的発現、変異の検出にも利用できる。また、それぞれ細胞ごとの反応を独立した場所で行うため、反応中に別の細胞の反応と混じる可能性が低い。小型のナノウェルを用いるSeq-Wellも同様に反応自体が混じる可能性が低い<ref><pubmed>28192419</pubmed></ref>。これらの点が、次に説明するドロップレットを使用して3’末端のみを標的にしたscRNAseqと比べた場合の長所であるが、その高コスト（1細胞あたり数十ドル）と処理可能な細胞数の少なさが短所である。<br />
<br />
===ドロップレット使用の3’エンドリード法===<br />
しかしながら、scRNAseqの方法論についての顕著な進歩は、2015年、Harvard Medical Schoolの独立した２つのグループが、inDrops<ref><pubmed>26000487</pubmed></ref>そしてDrop-seq<ref><pubmed>26000488 </pubmed></ref>という類似した2つのハイスループットな方法を開発したことであろう（inDropsはT7RNAポリメラーゼ、Drop-seqはPCRで増幅）。これらの方法では、[[マイクロ流体力学]] (Microfluidics) 、 UMI（上述）と細胞ごとのバーコード（Cell Barcode）という2種類のDNAバーコーディング、そしてNGSと情報解析法を利用している。そして、多く細胞のサンプル調製の自動化と容易さから、1つの細胞あたりに要するコストを大幅に低下させることに成功した（Drop-seqは発表時で、１細胞あたり約5セント）。つまり、細胞1つずつをマイクロ流体力学によるエマルジョン作製技術を利用した装置に流入させ、その１細胞を1つのドロップレットに自動的に閉じ込める。そのドロップレット中には、ドロップレットごとにCell barcode/UMIとしてユニークなDNAバーコードを持つゲルビーズ(Gel Beads in Emulsion, GEMs)が入っており、それを足場に3’末端のみを標的にしたcDNA合成反応を実施することで、同じ細胞に含まれていた1分子のmRNAが同じCell barcodeを持つcDNAとして合成され、そのmRNA/cDNAが由来した細胞を識別できるということを利用している（図１）。<br />
<br />
なお、DropSeqはコストが低いが、細胞の取得率と検出感度が低い弱点がある。inDropsはDropSeqより細胞取得率が高く、パラメータを調整することにより、低レベルで発現される遺伝子の検出にも有利であるとされる<ref><pubmed>30472192</pubmed></ref>。DropSeqのセットアップはDolomite Bio ([https://www.dolomite-bio.com])、inDropは1 Cellbio社から販売されている[https://1cell-bio.com]。しかし、その後、10x Genomics社が同様の原理を用いた「Chromium」と命名された機器とそのための試薬を市販することで、多くの研究者が容易に利用できるようになっている<ref><pubmed>28091601</pubmed></ref>[https://www.10xgenomics.com/jp/]。Svenssonらによる最近のデータベース[https://doi.org/10.1101/742304], [http://www.nxn.se/single-cell-studies/gui]では、scRNAseqを用いた論文で用いられた方法について調査している。この数年、10x Genomics社Chromiumを用いた論文が飛躍的に増加している。10x Genomics社Chromiumのシステムは市販であるので導入が容易であり、DropSeqやinDropsに比べ多くの転写産物の検出が可能であるが、それらよりランニングコストは高価である<ref><pubmed>30472192</pubmed></ref>。なお、3’エンドリード法だけでなく、抗体やT 細胞レセプターのN末端側に位置する可変領域の配列決定が可能である5'末端のシーケンシングには5’エンドリード法が利用されることがある。<br />
<br />
これらとは別に、ハイスループットで安価な方法として、それぞれの細胞を独立に標識するのではなく、プールされた細胞を異なるウェルにランダムに振り分け、ウェル固有のバーコードで転写物を標識していく操作を複数回繰り返していくことで細胞を区別するSplit-seqやsci-RNA-seq3などの方法も用いられている<ref><pubmed>29545511</pubmed></ref><ref><pubmed>30787437</pubmed></ref>。<br />
<br />
<br />
[[ファイル:scFig1.jpg|サムネイル|300px|'''図1．ドロップレット使用の3’エンドリード法 '''<br>組織から解離させた細胞それぞれを、マイクロ流体力学を利用した装置で、バーコードプライマーが結合したゲルビーズとともにドロップレットに封じ込める。ドロップレット中には、ドロップレットごとにCell barcode/UMIとしてユニークなDNA配列を持つゲルビーズ(GEMs)が入っており、それを足場にcDNA合成反応を実施することで、同じ細胞に含まれていたmRNAが同じCell barcodeを持つDNAとして合成され、それを増幅する。]]<br />
<br />
==scRNAseqの実際==<br />
ここでは主流になっている10x Genomics社のChromiumなどのドロップレットを用いた方法とSMART-seqなどを用いた方法に共通する方法の実際について概説する。scRNAseqの利用には、4つのステップがある（図２）<ref><pubmed> 31217225</pubmed></ref><ref><pubmed>30089861</pubmed></ref>。１）個体や組織を採集し、そこから細胞あるいは細胞核を個別に解離された状態にすること。２）ドロップレット法やSMART-seqなどによる個々の細胞からのライブラリーの作製とNGS。３）得られた配列情報の前処理（preprocessing）。４）ダウンストリーム解析と生物学的な情報を得るコンピューター生物学。これらのうち、２）の段階については、上に記述したように市販の機器や試薬を利用する機会が多くなっているので、詳細は説明しない<br />
[[ファイル:ScFig2c.jpg|サムネイル|500px|'''図２．scRNAseqの実際のステップ '''<br>細胞の単離、ライブラリ作製とNGS、データの前処理から次元圧縮、ダウンストリーム解析。図の一部は2016 DBCLS TogoTV、あるいはSeuratを用いて10x Genomics社のPBMCデータ（[https://support.10xgenomics.com/single-cell-gene-expression/datasets]から執筆者が作製。]]<br />
<br />
===組織からの細胞、細胞核の分離===<br />
浮遊細胞（血液細胞など）ではない場合、物理的あるいは酵素処理などによって解離することで、生組織から状態の良い個々に分散した細胞を調製する必要がある。神経系組織の酵素処理には、パパインを用いる方法が広く用いられている<ref><pubmed>29970990</pubmed></ref>。ここで、しばしば問題となるのが、酵素処理による短時間加温や機械的刺激で、発現量が変化する遺伝子が存在することである<ref><pubmed>27090946</pubmed></ref>。特に、脳の[[ミクログリア]]の解析には、低温下で組織をホモゲナイズするなどの工夫が必要であった<ref><pubmed>30471926</pubmed></ref>。また、このような現象を抑制するために、酵素処理時に転写阻害剤である[[アクチノマイシン]]で処理したり<ref><pubmed>29024657</pubmed></ref>、ヒマラヤ氷河から得られた細菌Bacillus licheniformisから得られた低温プロテアーゼを用いる方法も報告されている<ref><pubmed>28851704</pubmed></ref><ref><pubmed>31623682</pubmed></ref>。また、細胞解離後に、メタノールで固定しscRNAseqに使用したり<ref><pubmed>28526029</pubmed></ref>、クロスリンカーを用いる方法もある<ref><pubmed>29391536</pubmed></ref>。<br />
<br />
単離した細胞は、そのまま10x GenomicsのChromiumのプラットフォームに導入することができるが、細胞表面分子マーカーに対する抗体や蛍光タンパク質レポーターなどを用いたFACS、[[パニング]]、MACS(磁気ビーズカラム)などによって、細胞の選択的濃縮や除去を行う場合もある。更に、抗体に抗体表示バーコードDNAをカップリングさせるCITE-seq(Cellular Indexing of Transcriptomes and Epitopes by Sequencing) については、下記の複数モダリティのオミクスの項目で述べる。<br />
<br />
なお、ヒト組織や希少生物などから生細胞を得ることは困難なことが多い。この場合、scRNAseqの変法として、凍結した組織から、各細胞由来の核を調製し、核内のmRNAを分析するsnRNAseq (single-nucleus RNA-seq)が利用されている。ただ、snRNAseqでは、FACSなどによる特定細胞集団の分離が困難であることが多い。また、細胞質を持つ生細胞を利用したscRNAseqとは違って、スプライシングの途上にある未成熟な核内転写産物を検出すること、更に検出できる遺伝子数も少なく、同等な結果が必ずしも得られない<ref><pubmed>24248345</pubmed></ref><ref><pubmed>26890679</pubmed></ref> <ref><pubmed>27471252</pubmed></ref><ref><pubmed>28846088</pubmed></ref><ref><pubmed>29220646</pubmed></ref><ref><pubmed>28846088</pubmed></ref><ref><pubmed>30586455</pubmed></ref><ref><pubmed>28729663</pubmed></ref><ref><pubmed>31728515</pubmed></ref><ref><pubmed>32341560</pubmed></ref> <ref><pubmed>32518403</pubmed></ref>。一方で、snRNA-seqでは、組織をそのまま凍結することから開始することが可能であるので、上述したscRNAseqの問題である細胞解離酵素による処理などを避けることができる。更に、核を用いることで、大きな細胞体はマイクロ流体力学の流路で詰まりやすいなど、特に神経細胞で顕著である細胞の形状の多様性に伴うバイアスを減らすことができるといったメリットもある。こうしたプロトコールの一部は、protocols.ioのHuman Cell Atlasのグループ[https://www.protocols.io/groups/hca]で公開されている。<br />
通常のscRNAseqは、ポリアデニル化されたmRNAを検出しているが、MATQ-seq（multiple annealing and dC-tailing-based quantitative single-cell RNA-seq）、RamDA-seqなどを用いると、ポリアデニル化されていないRNAの検出も可能である<ref><pubmed> 28092691</pubmed></ref> <ref><pubmed>29434199 </pubmed></ref>[https://doi.org/10.1101/2020.06.02.131060]。更に、RNAを分析するscRNAseqではないが、遺伝子発現との関係が想定される[[オープンクロマチン]]領域を[[トランスポゾン]]を用いることで個々の細胞レベルで選択的に検出するsingle cell ATAC-seq (Assay for Transposase-Accessible Chromatin) <ref><pubmed>26083756</pubmed></ref>, <ref><pubmed>29434377</pubmed></ref><ref><pubmed>25953818</pubmed></ref>, single cell THS-seq (transposome hypersensitive-site) <ref><pubmed>29227469</pubmed></ref>や [[DNAメチル化]]領域を観察するsnmC-seq、RRBSのような方法も利用されている<ref><pubmed>28798132</pubmed></ref><ref><pubmed>30237449</pubmed></ref><ref><pubmed> 20852635</pubmed></ref>。<br />
<br />
<br />
===scRNAseqデータの前処理===<br />
10x Genomics社のChromium、Illumina社のNGSを利用した場合、Cell Rangerのmkrefコマンド(Linux上で作動, [https://support.10xgenomics.com/single-cell-gene-expression/software/pipelines/latest/using/tutorial_mr])などにより、各生物種ごとのレファレンス配列リスト（[https://www.ncbi.nlm.nih.gov/grc]、マウスやヒトでは既製のものを利用できる）などを参考にしながら、細胞と転写産物量の対応マトリックスを作製する。その後のデータの処理についても、10x Genomics社がソフトウェアLoupeを提供している。しかしながら、その後の下流解析を考慮して、[[R]], [[Python]], MATLABなどのデータ解析のための汎用プログラミング言語やコードで扱えるオブジェクトに変換するのが通常である。ここでは、scRNAseqデータ解析のために最もよく利用されているRを用いたパッケージ「Seurat」<ref><pubmed> 29608179 </pubmed></ref> <ref><pubmed> 31178118 </pubmed></ref>を中心に紹介したい。なお、一部の解析操作は、University of WashingtonのCole Trapnell研究室で開発されてきた軌道推定（下記参考）によく使用されるMonocle3でも可能である（[https://cole-trapnell-lab.github.io/monocle3/]）。Pythonを利用したものでは、ドイツ・ミュンヘンInstitute of Computational Biologyの Fabian Theisらが開発しているScanpyが有名である<ref><pubmed> 29409532</pubmed></ref>。<br />
<br />
New York UniversityのRahul Satija研究室が開発しているSeurat（画家スーラに由来）は、scRNAseqデータ解析のために広く利用されているRパッケージであり、2020年秋現在、Seurat4のβバージョンが公開されている。論文の正式発表前から、サポート情報提供やコード修正なども頻繁に行っており、Satija研究室のウェッブサイト（ [http://satijalab.org/Seurat]）、Github([https://github.com/satijalab/Seurat])、更にTwitterアカウント（@satijalab）などで最新情報を得ることできる。<br />
<br />
最初に行うのは、scRNAseqデータの品質管理である。ここでは、質の低い細胞のデータ（例えば、壊れた細胞では、転写産物の種類が少なくミトコンドリア由来の転写産物が多い）を取り除く。また、複数の試料を組み合わせる場合には、バッチごとの違いについて検討する<ref><pubmed>29608177</pubmed></ref><ref><pubmed> 28045081<br />
</pubmed></ref><ref><pubmed>31948481</pubmed></ref> <ref><pubmed>32854757</pubmed></ref>。現実には、実験ごとのバッチの違いによる影響（Batch effect）がscRNAseqの最大の問題であると示されてきており、試料の処理を同時に行うなど実験デザインを工夫する必要がある<ref><pubmed>29121214</pubmed></ref>。<br />
<br />
また、Dropletを使用するscRNAseqでしばしば問題になるのが、Dropletに２つ以上の細胞が封じ込められ、それらが同一のCell barcodeを持ってしまうアーティファクトである。通常「Doublet」「Multilet」と呼ばれるこの問題はダウンストリーム解析を混乱させるので、細胞単離の段階から注意する必要があるが、scRNAseqデータ取得後にもデータ処理で解決できる可能性もある<ref><pubmed>30954476</pubmed></ref><ref><pubmed>30954475</pubmed></ref> <ref><pubmed>31693907</pubmed></ref><ref><pubmed>32592658</pubmed></ref> <ref><pubmed>29227470</pubmed></ref><ref><pubmed>31836005</pubmed></ref><ref><pubmed>31856883</pubmed></ref><ref><pubmed>30567574</pubmed></ref> <ref><pubmed>31266958</pubmed></ref> [https://doi.org/10.1101/2019.12.17.879304][https://doi.org/10.1101/699637][ http://dx.doi.org/10.2139/ssrn.3646565]。なお、この手法を利用することで、バッチ効果を抑えるために、異なるバーコードを持つ複数の試料を混ぜて一つの試料として扱い、計算機的に再び分離、解析するdemultiplexingが注目されている<ref><pubmed>32483174</pubmed></ref>。<br />
<br />
scRNAseqデータの次のノイズは、ある遺伝子の発現が低いために、本来同じタイプの細胞であっても、その遺伝子の発現が全く見られない「Dropout」と呼ばれる現象であり解析に影響を与えるので、これについても検討が必要である<ref><pubmed> 24056876<br />
</pubmed></ref><ref><pubmed>32127540</pubmed></ref>。<br />
<br />
このような品質管理、ノーマライゼーションの過程を経て<ref><pubmed>28504683</pubmed></ref>、scRNAseqのデータ解析において、最初に行うのが、[[次元圧縮]] (dimensionality reduction)である<ref><pubmed>30617341</pubmed></ref><ref><pubmed>31780648</pubmed></ref><ref><pubmed>31955711</pubmed></ref><ref><pubmed>31823809</pubmed></ref>。PCA (Principal component analysis, 主成分分析)、更に発展させたUMAP（Uniform Manifold Approximation and Projection, 均一マニフォールド近似と投影）、Diffusion maps<ref><pubmed> 26002886<br />
</pubmed></ref>, tSNE(t-distributed Stochastic Neighbor Embedding , t分布型確率的近傍埋込み)などの手法が用いられる。 特に、tSNE[http://www.jmlr.org/papers/v9/vandermaaten08a.html]とUMAP[https://arxiv.org/abs/1802.03426]は、高次元データを低次元の点の集合として可視化することで、それぞれの細胞の持つトランスクリプトームの類似度についての直観的な表示が可能でありしばしば用いられる（図３）。tSNEよりUMAPの方が迅速に類似集団間の関係が明確になるので、最近はUMAPを利用することが多くなってきている。次に、[[Louvainアルゴリズム]]などでクラスタリング（コミュニティ分割）を行いグラフ上に表示できる（図３の色分け）。こうして、異なる転写状態を示す細胞の集合が別のクラスターとして表示され、同定可能になる<ref><pubmed>31500660</pubmed></ref>。<br />
[[ファイル:scFig3.jpg|サムネイル|250px|'''図３． tSNEとUMAPによる同じデータの可視化'''<br>網膜（ニワトリ）の視細胞のデータを用いて執筆者が作製[https://doi.org/10.1101/2020.10.09.333633<br />
}。]]<br />
<br />
==下流解析==<br />
===細胞クラスターの解釈とマーカー遺伝子候補の発見===<br />
scRNAseqデータから得られる生物学的知見には、内在的に存在する細胞の種類、外部刺激や環境で変化した細胞の状態、そして種類や変化により特徴的に発現するマーカー遺伝子候補の発見がある<ref><pubmed>27824854</pubmed></ref><ref><pubmed>32033589</pubmed></ref><br />
。クラスタリングにより、異なった細胞集団の存在が認識されると、それぞれのクラスター（群）に特徴的に発現している具体的な遺伝子を探索し、細胞集団の持つバイオマーカーによって、そのクラスター（群）の同定が可能になる。例えば、既に神経細胞とグリア細胞に特異的に発現する典型的マーカーはよく知られており、それぞれのクラスターの識別は容易である。更に、神経細胞のタイプ（下記参考）を区別できるマーカーや、外部刺激によって遺伝子発現が変化した神経細胞の状態は、In situ hybridizationや免疫組織化学などにより確認できる。このようなクラスターごとに発現が異なる遺伝子（差次的発現遺伝子）を見つけるためには（Differential expression analysis, DE analysis）、SeuratのFindMarkersコマンド中でも利用可能であるコード（MAST、DESeq2など<ref><pubmed>26653891</pubmed></ref><ref><pubmed>25516281</pubmed></ref><ref><pubmed>30658573</pubmed></ref>）を用いることができる。scRNAseqの解析に必要なコードは、scRNA-tools [https://www.scrna-tools.org], Awesome single cell [https://github.com/seandavi/awesome-single-cell], Bioconductor[https://www.bioconductor.org]などで紹介されており、ほとんどがダウンロード可能である。また、最新の情報については、bioRxivなどのプレプリントサーバで公開されていることが多く、scRNAseqのデータ（下記参考）とともに、オープンサイエンス実践の好例となっている。細胞ごとの差次的発現遺伝子のVisualization（表示可視化）には、ドットプロット（dot plot）、ヴァイオリンプロット（violin plot）、リッジプロット（Ridge plot, joy plot）、UMAPなどの次元圧縮図上に上書きするFeatureプロット（feature plot）などが、目的に応じて頻繁に用いられる（図４）。<br />
[[ファイル:scFig4.jpg|サムネイル|300px|'''図４．scRNAseqデータの可視化の例 '''<br>A. ドットプロット。B.ヴァイオリンプロット。C. リッジプロット。D. UMAPと重ねたFeatureプロット。網膜の視細胞のデータを用いて執筆者が作製[https://doi.org/10.1101/2020.10.09.333633<br />
]。]]<br />
<br />
===擬時系列解析、遺伝子制御ネットワーク、パスウェイ解析===<br />
実験的なノイズとは別に生物学的に意味のある遺伝子発現の変動には、位置情報、[[細胞周期]]、[[概日リズム]]、発現変動が大きい破裂型プロモーターの作動などの理由で 変動が見られるものもある<ref><pubmed> 31217225 </pubmed></ref><ref><pubmed> 26000846</pubmed></ref>。特に、刺激・薬剤処理やさまざまな病態の進行や治療に伴う細胞の変化、発生途上にある細胞系譜や細胞分化といった細胞の遷移状態の解析（[[軌道推定]]（Trajectory inference）；[[擬時系列解析]]（擬似時系列解析、偽時系列解析）、Pseudo-time analysis ）には、scRNAseqデータを用いることが効果的である<ref><pubmed>29576429</pubmed></ref><ref><pubmed>28813177</pubmed></ref><ref><pubmed>29565398</pubmed></ref>。しばしば用いられるMonocle3 <ref><pubmed>30787437</pubmed></ref>[https://cole-trapnell-lab.github.io/monocle3/]など、多くのコードを収集、比較しているサイトがある [https://dynverse.org][https://github.com/agitter/single-cell-pseudotime]。RNA velocityといったスプライシングされていく転写産物の量から細胞の分化状態を推定する方法もある<ref><pubmed>30089906</pubmed></ref><ref><pubmed> 32747759</pubmed></ref>。しかし、これらの方法は、あくまで[[細胞系譜]]や細胞分化の推定に過ぎない。細胞系譜を更に確実に観察しつつ、scRNAseqを行うことで、細胞タイプの系統関係を調べる方法として、CRISPR-Cas9を用いた[[ゲノム編集]]による痕跡追跡記録法を導入したscGESTALT<ref><pubmed>29608178</pubmed></ref>、ScarTrace<ref><pubmed>29590089</pubmed></ref> 、LINNAEUS<ref><pubmed>29644996</pubmed></ref>、あるいはアデノシンデアミナーゼでRNA編集を行いタイムスタンプを入れる方法<ref><pubmed>33077959</pubmed></ref>がある。1塩基バリアント（Single-nucleotide variants: SNV）の系統的解析は、細胞の不均一性や系統的な関係を明らかにするための最も有望なアプローチの一つである<ref><pubmed>31744515</pubmed></ref>。<br />
<br />
また細胞分化や刺激などによる変動に伴う特徴的な遺伝子発現をscRNAseqで観察することは、遺伝子制御ネットワーク（例、SCENIC<ref><pubmed>28991892</pubmed></ref>, [https://github.com/aertslab/SCENIC]）、[[代謝経路]]や[[シグナル伝達系]]のための[[パスウェイ解析]](例、Metascape<ref><pubmed>30944313</pubmed></ref>, [http://metascape.org]、Gene Ontolgoy[http://geneontology.org])を理解するシステム生物学的な研究として有用である<ref><pubmed>32051003</pubmed></ref>。更に、scRNAseqで得られた結果をもとに、細胞間相互作用の理解を深めるのを目的とするCellPhoneDB<ref><pubmed>32103204</pubmed></ref>[https://github.com/Teichlab/cellphonedb]、NicheNet<ref><pubmed>3181926</pubmed></ref>, SVCA<ref><pubmed>31577949</pubmed></ref>などがある。特に、Perturb-seq<ref><pubmed>27984732</pubmed></ref> やその変法<ref><pubmed> 32231336</pubmed></ref>は、CRISPRライブラリーによるゲノム編集を施した細胞をscRNAseqで解析することで、ゲノム編集で破壊された遺伝子の機能や遺伝子間の相互作用の理解を可能にしている後述するマルチモーダルなscRNAseqの１つであり、注目されている。<br />
<br />
==scRNAseqの神経科学研究への適用==<br />
===神経系細胞ビッグデータとしてのscRNAseq===<br />
様々な神経・精神疾患について理解しその診断や治療に役立てるためには、神経細胞、[[グリア細胞]]を中心にした神経系にある細胞の種類や状態を識別し、それぞれの細胞における分子的な変化を観察することが重要である <ref><pubmed>28775344</pubmed></ref><ref><pubmed>29738987</pubmed></ref>。本項目で解説してきたscRNAseq技術は、神経系に見られるそれぞれの細胞のトランスクリプトームについて[[ビッグデータ]]を提供することで、この細胞の種類や状態の識別に新たな判断材料を与えつつある。近年、中枢神経系の[[アストロサイト]]、[[オリゴデンドロサイト]]、ミクログリアといったグリア細胞も均一ではなく、内在的な多様性や外部因子による状態の変動が報告されてきている。神経細胞は、著しく多様であり、この多様性が神経系の多彩で複雑な機能発現の基盤となっている。従来の神経科学では、神経細胞の多様性は、それぞれの神経細胞の解剖学的な位置、発現している分子、電気生理学、結合性、形態、神経伝達物質、神経伝達物質受容体とシグナル伝達によって識別されてきている。こうした神経細胞の多様性を便宜的に記述するのに、タイプ（type）、クラス（class）、サブクラス（subclass）、サブタイプ（subtype） というような用語が用いられてきた。しかし、ここでは混乱を防ぐため、Masland（2004）<ref><pubmed>15242626</pubmed></ref>が提唱し、広く受けいれられている「クラス」と「タイプ」という単語を用いることとする。タイプは、これ以上分類することができないとされる階層であり、共通性を持つタイプの集団がクラスである。例えば、大脳皮質の錐体細胞、網膜神経節細胞といった大雑把な区分はクラスである。大脳皮質の錐体細胞というクラスは、層や領野によって異なるタイプ、網膜神経節細胞には視覚情報に対して応答が異なるタイプが存在する。scRNAseqは、「タイプ」の理解に新たな視点を提供している。<br />
<br />
===神経系へのscRNAseqの適用===<br />
scRNAseqの神経系での利用については、次々と新しい論文やプレプリントが発表されており、ここではscRNAseqで得られてきた情報の典型例を紹介することにとどめる。<br />
<br />
[[大脳皮質]]には、[[錐体細胞]]や[[非錐体細胞]]などの神経細胞や様々なグリア細胞などが見られ、古くから神経細胞タイプの識別が行われてきた。初期のFluidigm C1を用いたscRNAseq技術でも、マウス皮質の小規模な細胞数を分類した研究で、これまで知られていた主要な神経細胞タイプとは違うタイプが見つかりその有効性が示された<ref><pubmed>25700174</pubmed></ref>。その後のDroplet使用の3’エンドリード法を利用した多数の細胞数の解析で、更に多数の神経細胞のタイプが見つかっている<ref><pubmed>32839617</pubmed></ref><ref><pubmed>28846088</pubmed></ref><ref><pubmed>30096299</pubmed></ref><ref><pubmed>30096314</pubmed></ref><ref><pubmed>30382198</pubmed></ref><ref><pubmed>29320739</pubmed></ref><ref><pubmed>28846088</pubmed></ref>[https://doi.org/10.1101/2020.03.14.991018][https://doi.org/10.1101/2020.06.04.105700] [https://doi.org/10.1101/2020.07.02.184051]。特に、GABA作動性介在神経細胞タイプの多様性とその発生<ref><pubmed>28942923</pubmed></ref><ref><pubmed>28134272</pubmed></ref><ref><pubmed>29472441</pubmed></ref><ref><pubmed>29513653</pubmed></ref>についての、これまでの組織化学的な研究からは得られていなかった多くの情報は重要であろう。また、初期の発生過程<ref><pubmed>26940868</pubmed></ref><ref><pubmed>30485812</pubmed></ref><ref><pubmed>31073041</pubmed></ref><ref><pubmed>30635555</pubmed></ref><ref><pubmed>30625322</pubmed></ref>、老化<ref><pubmed>31551601</pubmed></ref><の理解が、scRNASeq技術を利用することで進んでいる。更に、[[神経活動]]や[[臨界期]]によって変化するmRNA量の変化も細胞ごとに調査され興味深い<ref><pubmed>29230054</pubmed></ref> <ref><pubmed>32404418</pubmed></ref>。 ヒトを含めた霊長類の大脳についても発達段階を含めてscRNAseqが適用されてきている<ref><pubmed>26060301</pubmed></ref><ref><pubmed>27339989</pubmed></ref><ref><pubmed>29539641</pubmed></ref><ref><pubmed>29217575</pubmed></ref><ref><pubmed>28846088</pubmed></ref><ref><pubmed>29227469</pubmed></ref><ref><pubmed>31303374</pubmed></ref><ref><pubmed>29867213</pubmed></ref><ref><pubmed>31435019</pubmed></ref><ref><pubmed>32424074</pubmed></ref> [https://doi.org/10.1101/709501][https://doi.org/10.1101/2020.03.31.016972][https://doi.org/10.1101/2020.04.23.056390]。ヒトや霊長類に特徴的とされる[[島]]のvon Economo神経細胞（紡錘細胞）のような希少な神経細胞のscRNAseqにも成功している<ref><pubmed>32127543</pubmed></ref>。<br />
<br />
[[海馬]]<ref><pubmed>29241552</pubmed></ref><ref><pubmed>29912866</pubmed></ref><ref><pubmed>29335606</pubmed></ref><ref><pubmed>31942070</pubmed></ref>では、これまでの研究で記載されてきた神経細胞のタイプの存在が確認され、更に新規のタイプが見つかった。中枢神経系では、その他、[[外側膝状体]]<ref><pubmed>29343640</pubmed></ref>、[[大脳基底核]](足底核)<ref><pubmed>28384468</pubmed></ref> 、[[視床下部]]<ref><pubmed>28166221</pubmed></ref><ref><pubmed>28355573</pubmed></ref> <ref><pubmed>27991900</pubmed></ref><ref><pubmed>30385464</pubmed></ref> <ref><pubmed>31249056</pubmed></ref><ref><pubmed>30858605</pubmed></ref>、[[線条体]]<ref><pubmed>27425622</pubmed></ref><ref><pubmed>30134177</pubmed></ref><ref><pubmed>31875543</pubmed></ref>、[[中脳]]<ref><pubmed>27716510</pubmed></ref><ref><pubmed>29499164</pubmed></ref> <ref><pubmed>30718509</pubmed></ref> 、[[手綱]]<ref><pubmed>29576475</pubmed></ref>、発生中の[[間脳]]<ref><pubmed>30872278</pubmed></ref> 、さらに[[小脳]]<ref><pubmed>30220501</pubmed></ref><ref><pubmed>30735127</pubmed></ref><ref><pubmed>30690467</pubmed></ref>などの結果が報告されてきている。例えば、構成する細胞についての情報が詳細に研究されてきたと思われていたマウスの小脳においても、分子層にこれまでの星状細胞、バスケット細胞というカテゴリーとは違ったギャップジャンクションに特徴を持つ２種類の神経細胞があることが示唆されている[https://doi.org/10.1101/2020.03.04.976407]。<br />
<br />
脳の外部では、[[運動神経]][https://doi.org/10.1101/2020.03.16.992958]、[[感覚神経]]<ref><pubmed>25420068</pubmed></ref><ref><pubmed>26691752</pubmed></ref>、[[らせん神経節]]<ref><pubmed>30078709</pubmed></ref><ref><pubmed>30209249</pubmed></ref> 、[[臭覚神経]]<ref><pubmed>26541607</pubmed></ref> <ref><pubmed>32059767</pubmed></ref>、[[腸神経系]] <ref><pubmed>29483303</pubmed></ref>[https://doi.org/10.1101/2020.03.02.955757] 、[[網膜]]<ref><pubmed>27565351</pubmed></ref><ref><pubmed>29909983</pubmed></ref><ref><pubmed>30018341</pubmed></ref><ref><pubmed>31260032</pubmed></ref><ref><pubmed>31128945</pubmed></ref><ref><pubmed>30712875</pubmed></ref><ref><pubmed>30548510</pubmed></ref><ref><pubmed>31075224</pubmed></ref><ref><pubmed>31399471</pubmed></ref><ref><pubmed>31848347</pubmed></ref><ref><pubmed>31673015</pubmed></ref><ref><pubmed>31653841</pubmed></ref><ref><pubmed>31784286</pubmed></ref>[https://doi.org/10.1101/2020.02.26.966093][https://doi.org/10.1101/779694][https://www.biorxiv.org/content/10.1101/617555][A]でのscRNAseqデータがある。また[[iPS細胞]]や[[ES細胞]]由来の神経組織[[オルガノイド]]に含まれる神経細胞タイプを知る上でも利用されている<ref><pubmed>28094016</pubmed></ref><ref><pubmed>28279351</pubmed></ref><ref><pubmed>31168097</pubmed></ref><ref><pubmed>31996853</pubmed></ref><ref><pubmed>31968264</pubmed></ref><ref><pubmed><ref><pubmed>32221280</pubmed></ref>。このようなアプローチは、ネアンデルタール人型の遺伝子を持つ脳オルガノイドの解析<ref><pubmed> 32559457</pubmed></ref>やSARS-CoV-2に感染する脳オルガノイド中の細胞の同定<ref><pubmed> 33113348</pubmed></ref>など、新たな応用例が発表されてきており興味深い。<br />
<br />
===神経細胞以外の細胞===<br />
[[上衣細胞]]<ref><pubmed>29727663</pubmed></ref>は、[[神経幹細胞]]としての役割が示唆されてきたが、scRNAseqによる解析ではその可能性が支持されなかった。グリア細胞では、[[ラジアルグリア]]<ref><pubmed>26406371</pubmed></ref><ref><pubmed>25734491</pubmed></ref><ref><pubmed>29281841</pubmed></ref><ref><pubmed>29217575</pubmed></ref><ref><pubmed>29539641</pubmed></ref>[A]、アストロサイト<ref><pubmed>32139688</pubmed></ref><ref><pubmed>32203496</pubmed></ref>[https://doi.org/10.1101/2020.04.27.064881]に多様性があることが示唆されてきている。また、オリゴデンドロサイト<ref><pubmed>27284195</pubmed></ref><ref><pubmed>30078729</pubmed></ref><ref><pubmed>30257220</pubmed></ref><ref><pubmed>30747918</pubmed></ref><ref><pubmed>31958186</pubmed></ref>[https://doi.org/10.1101/2020.03.06.981373]については、これまで細胞生物学的に研究されてきた分化の過程がscRNAseqにより詳細に解析されている。ミクログリアは、神経系の発達、老化、損傷などに伴う重要なトランスクリプトームの変化がscRNAseqにより詳細に明らかになった<ref><pubmed>27338705</pubmed></ref><ref><pubmed>29020624</pubmed></ref><ref><pubmed>30206190</pubmed></ref><ref><pubmed>30471926</pubmed></ref><ref><pubmed>31209379</pubmed></ref><br />
<ref><pubmed>31835035</pubmed></ref>。また、[[CNS境界関連マクロファージ]](BAM) <ref><pubmed>31061494</pubmed></ref>や[[脳血管系]]<ref><pubmed>29443965</pubmed></ref>のscRNAseqも実施されている。<br />
<br />
===疾患===<br />
scRNAseqは、疾患の理解にも有用である。scRNAseqでは、疾患に伴う遺伝子発現の変化を細胞タイプごとに観察することができるので、バルクRNAseqでは埋もれていた遺伝子発現の変化や細胞ごとの変化を検出できるという長所がある。<br />
例えば、筋萎縮性側索硬化症<ref><pubmed>30948552</pubmed></ref>、多発性硬化症<ref><pubmed>30747918</pubmed></ref><ref><pubmed>30420755</pubmed></ref><ref><pubmed>32313246</pubmed></ref> <br />
、アルツハイマー病やそのモデル動物<ref><pubmed>31042697</pubmed></ref><ref><pubmed>31399126</pubmed></ref><ref><pubmed>29020624</pubmed></ref><br />
[https://doi.org/10.1101/628347]<ref><pubmed>28602351</pubmed></ref><ref><pubmed>32341542</pubmed></ref>、統合失調症<ref><pubmed>29785013</pubmed></ref><ref><pubmed>32203495</pubmed></ref>、自閉症やレット症候群<ref><pubmed>31097668</pubmed></ref><ref><pubmed>30455458</pubmed></ref>、シャルコー・マリー・トゥース病<ref><pubmed>29888333</pubmed></ref>、ダウン症[https://www.biorxiv.org/content/10.1101/2020.01.01.892398v1]、パーキンソン病<ref><pubmed>30503143</pubmed></ref> <ref><pubmed>32826893</pubmed></ref>、がん<ref><pubmed>31327527</pubmed></ref><ref><pubmed>28360267</pubmed></ref>などに適用されている。最近、Perturb-seqにより、自閉症に関わる遺伝子の欠損に伴う細胞状態の変化などもscRNAseqで報告されており<ref><pubmed>33243861</ref></pubmed>、疾患の理解のための新たな実験系の開発も始まりつつある。<br />
<br />
==scRNAseqの展望==<br />
===神経系の多様性と進化===<br />
NGSを用いることで、どんな生物種にも適用可能なscRNAseqは、既に多様な生物の神経系の細胞の理解、更には種間の相同性や差異の研究に利用されており、神経系の進化を細胞レベルで考察するのに有用であろう（例、センチュウ<ref><pubmed> 28818938 </pubmed></ref>、ショウジョウバエ <ref><pubmed>29909982</pubmed></ref><ref><pubmed>29149607</pubmed></ref><ref><pubmed>30703584</pubmed></ref><ref><pubmed>29909983</pubmed></ref><ref><pubmed>33125872</pubmed></ref>、カタユウレイボヤCiona intestinalis <ref><pubmed>30069052</pubmed></ref><ref><pubmed>30228204</pubmed></ref>、ゼブラフィッシュ<ref><pubmed>31018142</pubmed></ref><ref><pubmed>30929901</pubmed></ref>、アカミミガメTrachemys scripta elegans、トカゲPogona vitticeps, pv<ref><pubmed>29724907</pubmed></ref>、ニワトリ[https://doi.org/10.1101/2020.10.09.333633]、霊長類<ref><pubmed>30730291</pubmed></ref><ref><pubmed>31619793</pubmed></ref>[https://doi.org/10.1101/2020.03.31.016972]）。ただ、遺伝子やトランスクリプトームの研究が進んでいる生物種では比較的容易であるが、遺伝子のアノテーションが十分でない生物種を用いる場合、scRNAseqのデータ解析は困難を伴う。また種を超えた細胞タイプの相同性の理解には様々な工夫が必要である<ref><pubmed>31552245</pubmed></ref><ref><pubmed>30712875</pubmed></ref>[https://doi.org/10.1101/2020.03.31.016972]。<br />
<br />
===データベースと統合===<br />
獲得されたscRNAseqのデータは様々な目的で利用できるので、データベース化し利用できるようにする必要がある。神経系のトランスクリプトーム一般のデータベースが多数公開されており<ref><pubmed>29437890</pubmed></ref>、scRNAseqのデータも基本的にNCBIのGene Expression Omnibus[https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/]に登録されている。また、オープンサイエンス推進のためにcommon coordinate framework (CCF) やcentral annotation platform (CAP)という概念のもと、特にscRNAseqを意識したものとして、米国のBRAIN Initiative Cell Census Consortium<ref><pubmed>29096072</pubmed></ref> 、Human Cell Atlas ProjectのHuman Cell Atlas Data Portal [https://data.humancellatlas.org]、そのマウス版であるTabula Muris <ref><pubmed>30283141</pubmed></ref>[https://genome.ucsc.edu/cgi-bin/hgTrackUi?db=mm10&g=tabulaMuris]やSten Linnarssonラボのマウス脳発生データベース[http://mousebrain.org]、アレン脳研究所のAllen Brain Atlas [https://portal.brain-map.org]、ブロード研究所のSingle Cell Portal [https://singlecell.broadinstitute.org/]などのデータベースが稼働している。また、異なった方法や実験で得られたscRNAseqのデータや後述のマルチモーダルなシングルセルオミクスのデータを体系的に比較することも重要であり、CCA (Canonical correlation analysis)<ref><pubmed>29608179</pubmed></ref>, Seurat 3.0以降に組み込まれたMMN (Mutual Nearest Neighbors)、LIGER<ref><pubmed>31178122</pubmed></ref> 、Harmony<ref><pubmed>31740819</pubmed></ref> 、MetaNeighber<ref><pubmed>29491377</pubmed></ref>、Conos<ref><pubmed>31308548</pubmed></ref>[https://doi.org/10.1101/2020.05.22.111161]のようなアルゴリズムが開発され、後述のマルチモーダルなシングルセルオミクスを組み込んだ統合サイトもでき始めている（[https://biccn.org]）。またデータベースを利用して発現類似性検索も研究されている<ref><pubmed>29608555</pubmed></ref><ref><pubmed>30744683</pubmed></ref>。<br />
<br />
===空間トランスクリプトミクス===<br />
多数の細胞を扱うscRNAseqの弱点は、組織から細胞や細胞核を解離する必要があるので、その細胞が存在していた解剖学的あるいは空間的な位置の情報を消去してしまうということである。組織切片におけるタンパク質などの分布は免疫組織化学、mRNAの分布はin situ hybridizationで検出することができるが、数多くのmRNAの分布を情報処理技術と組み合わせ一気に同定する方法がscRNAseqと同様に開発されてきている（Slide-seq<ref><pubmed>30923225</pubmed></ref>[https://doi.org/10.1101/2020.03.12.989806]、HDST<ref><pubmed>31501547</pubmed></ref>、Expansion sequencing[http://doi.org/10.1101/2020.05.13.094268]など<ref><pubmed>27365449</pubmed></ref>, <ref><pubmed>31932730</pubmed></ref> <ref><pubmed>30948552</pubmed></ref>）、更に10x Genomics社が市販するVisiumなどがある。現状では、大きな組織の空間トランスクリプトミクスは、空間解像度は限定されており、技術普及の観点からも課題が多い。しかし、そのデータを解析するためのアルゴリズム<ref><pubmed>29553578</pubmed></ref><ref><pubmed>29553579</pubmed></ref><ref><pubmed>32350282</pubmed></ref> [https://doi.org/10.1101/757096][ https://doi.org/10.1101/701680] [https://doi.org/10.1101/431957]、<br />
更にMerFish <ref><pubmed>25858977</pubmed></ref>、corrFISH<ref><pubmed>27271198</pubmed></ref>のように、subcellularレベルで多数のmRNAを検出する方法が多数開発されてきており（文献：<ref><pubmed>25549890</pubmed></ref> osmFISH<ref><pubmed>30377364</pubmed></ref> 30377364、STARmap (spatially-resolved transcript amplicon readout mapping) <ref><pubmed>29930089</pubmed></ref>、seqFISH+<ref><pubmed>27764670</pubmed></ref>、pciSeq(probabilistic cell typing by in situ sequencing)[https://doi.org/10.1101/431957]、DSP(Digital Spatial Profiling) <ref><pubmed>32393914</pubmed></ref>、scRNAseqと組み合わせることで、その弱点を補う空間トランスクリプトミクスにも利用され始め<ref><pubmed>30385464</pubmed></ref>[https://doi.org/10.1101/2020.06.04.105700]、今後の発展が期待される分野である。<br />
<br />
<br />
===複数モダリティのシングルセルオミクス===<br />
同一の細胞からscRNAseqの情報だけでなく、ゲノム配列、ATAC-seqなどによるエピゲノム解析、少数のタンパク質、あるいはプロテオームなど複数のモダリティを同時に観察するオミクス（Single-cell multimodal omics）が注目されている<ref><pubmed>31907462</pubmed></ref><ref><pubmed>30696980</pubmed></ref>。2019年には、Nature Methodsの「Methods of the Year」に選ばれており、現状については、その特集号などを参考にされたい。例えば、細胞表面に提示されているマーカー分子に対する抗体にDNAを付加することで、そのマーカーを発現する細胞のトランスクリプトームを解析するCITE-seq<ref><pubmed>28759029</pubmed></ref>、 REAP-seq<ref><pubmed>28854175</pubmed></ref>も、既知の細胞表面マーカーの発現とscRNAseqが同時に観察できる方法である。<br />
<br />
同様な複数モダリティのシングルセルオミクスとして、神経科学分野で注目されるのは、scRNAseqをパッチクランプによる電気生理学的情報と組み合わせたPatch-seq<ref><pubmed>26689544</pubmed></ref> <ref><pubmed>26689543</pubmed></ref>である。また、ゲノムDNAとscRNAseqを同時に観察することによって、近年、精神疾患の観点から注目されている発生途中で生じる遺伝子変異を研究するPRDD-seqは今後の展開が注目される[https://doi.org/10.1101/2020.04.19.046904]。最後に、BARseq (barcoded anatomy resolved by sequencing) <ref><pubmed>31626774</pubmed></ref>、CONNECTID[https://doi.org/10.1101/378760]、Epi-Retro-seq[https://doi.org/10.1101/2020.04.01.019612]のような方法は、[[コネクトーム]]（神経細胞の結合性）と遺伝子発現を記録できるオミクスの新たな方向として興味深い。<br />
<br />
<br />
== 関連項目 ==<br />
*[[ゲノムワイド関連解析 ]]<br />
*[[ディファレンシャルディスプレイ ]]<br />
*[[In situハイブリダイゼーション法 ]]<br />
*[[免疫組織化学法]]<br />
*[[エピジェネティクス]]<br />
== 参考文献 ==<br />
<references />c</div>
Masahitoyamagata
https://bsd.neuroinf.jp/w/index.php?title=%E3%82%B7%E3%83%B3%E3%82%B0%E3%83%AB%E3%82%BB%E3%83%ABRNA%E3%82%B7%E3%83%BC%E3%82%B1%E3%83%B3%E3%82%B7%E3%83%B3%E3%82%B0&diff=45074
シングルセルRNAシーケンシング
2020-11-13T22:29:06Z
<p>Masahitoyamagata: </p>
<hr />
<div><div align="right"> <br />
<font size="+1">[http://researchmap.jp/yamagatm 山形方人]</font><br><br />
''Harvard University''<br><br />
DOI：<selfdoi /> 原稿受付日：年月日 原稿完成日：年月日<br><br />
担当編集委員：<br><br />
</div><br />
英：single cell RNA sequencing, scRNAseq<br />
{{box|text=<br />
シングルセルRNAシーケンシング(single cell RNA sequencing, 以下scRNAseq)は、[[次世代シーケンシング]] （next generation sequencing、以下NGS）技術を使用して個々の細胞が発現しているmRNA全体、つまり[[トランスクリプトーム]]を質的、量的に網羅的に調べ、細胞ごとの違いを高解像度で検出し、数理的に解析する分子生物学的、コンピュータ生物学的技術である。組織内にある細胞の分類を行うことで、未知あるいは希少な細胞の種類や状態の検出に有効である。また、刺激、発生など細胞の状況に応じて、個々の細胞のトランスクリプトームの情報を得ることで、細胞系譜などの疑時系列解析や疾患のバイオマーカーの研究も可能である。特に多様な神経細胞が存在する神経系では、この方法により、神経細胞や非神経細胞の分類や状態についての知見が深まり、新しい細胞マーカーや機能的な遺伝子の同定などが系統的かつ網羅的に行われるようになった。空間的情報、エピゲノム情報、タンパク質情報なども取り入れながら、特定の細胞タイプでの発現変化を探索するマルチモーダル解析の発展も著しい。<br />
}}<br />
<br />
==scRNAseqの背景==<br />
===トランスクリプトーム===<br />
トランスクリプトーム（transcriptome）は、細胞中に存在する全ての転写産物（タンパク質をコードするmRNA、タンパク質をコードしない[[ノンコーディングRNA]]、[[マイクロRNA]]など）の総体である<ref><pubmed>19015660</pubmed></ref><ref><pubmed>31341269 </pubmed></ref>。トランスクリプトームは、[[ゲノム]]とは異なり、同一の個体でも、組織ごとに、更には発生段階や細胞外環境や刺激によって変化する。トランスクリプトームは、同質あるいは異質の多数の細胞集団（組織、培養細胞）からRNA抽出後、cDNAに変換し、それを1990年代に出現した[[DNAマイクロアレイ]]のように数多くの既知mRNAを識別する技術によって解析されるようになった。その後、NGSの利用により、希少mRNAやノンコーディングRNAを含めた未知の転写産物の高感度検出が可能になるとともに、[[スプライシング]]で成熟していく過程のmRNAなど、転写産物の種類だけでなく、転写産物の構造的差異（スプライシングバリアント、SNPs、変異など）の解析もできるようになった。加えて、ヒトやモデル実験生物（[[マウス]]、[[ゼブラフィッシュ]]、[[ショウジョウバエ]]、[[センチュウ]]など）だけでなく、多種多様な生物のトランスクリプトームの把握も可能になった。ここでは、このような多数の細胞集団、つまり個体や特定の組織全体（bulk RNAseq）ではなく、細胞1つの持つトランスクリプトームを解析する方法（scRNAseq）とそのscRNAseqデータを利用することで得られる情報について概説する。<br />
<br />
===scRNAseqとその開発史===<br />
1つの細胞の持つ生体物質を解明し、定量しようとする試みは古くからあった。1960年代になると、フローサイトメトリーを利用した[[蛍光活性化セルソーティング]]（Fluorescence-activated cell sorting, FACS）が発明され、標識抗体などのプローブと組み合わせることで、多数の細胞集団の中で１つの細胞が持っている分子の種類や量についての断片的な研究が可能になり、この方法は現在でも汎用されている<ref><pubmed>22271369</pubmed></ref>。その後、[[免疫組織化学]]や[[in situ hybridization]]nなどにより、タンパク質やmRNAの種類や量が観察できるようになり、組織中に存在するそれぞれの細胞の同定などに活用されてきている。最近では、それぞれの細胞が持つ抗原分子を、異なった金属イオンで標識した抗体とフローサイトメトリーを組み合わせた方法で検出する[[マスサイトメトリー]]（CyTOFなど）も開発されてきている<ref><pubmed>27153492</pubmed></ref>。<br />
<br />
1つの細胞内にある全RNA（ribosomal RNAを含む）は細胞種にもよるが1-50pgである。そのうち、mRNAの占める割合は1-5%程度である<ref><pubmed>15239941</pubmed></ref>。この微量のmRNAをcDNAに変換してから大幅に増幅できる方法が発明されたことで、1つの細胞が発現するmRNAを高感度で検出できるようになった<ref><pubmed>1557406</pubmed></ref><ref><pubmed>7541630</pubmed></ref> 。例えば、1991年、Linda BuckとRichard Axelは、[[嗅覚受容体]]が[[Gタンパク質]]であると仮定し、個々の嗅覚細胞で特異的に観察されるGタンパク質mRNAを比較することで、嗅覚受容体の同定に成功した<ref><pubmed>1840504</pubmed></ref>。1995年になると、Catherine DulacとRichard Axelは、異なる[[鋤鼻神経細胞]]で特異的に発現する遺伝子を１つの細胞から作製したcDNAライブラリーを比較するディファレンシャル・スクリーニングを行うことで、[[フェロモン受容体]]を同定した<ref><pubmed>7585937</pubmed></ref>。同じ手法で異なる種類の神経細胞で発現している遺伝子も同定され<ref><pubmed>9778248</pubmed></ref><ref><pubmed>12230981</pubmed></ref>、１つの細胞の持つトランスクリプトームを比較するアプローチが神経細胞で特徴的に発現している遺伝子の同定に効果的なことを示した。<br />
<br />
一方で多くの種類のmRNAを１細胞レベルで一挙に観察するトランスクリプトームのための技術にはブレークスルーが待たれた。1つの問題は多種類のcDNAを簡便に識別することを可能にする方法の開発であった。これを可能にしたのが、[[PCR]]などのcDNA増幅法の改良とマイクロアレイの利用であった<ref><pubmed>12736331</pubmed></ref><ref><pubmed>16547197</pubmed></ref>。しかしながら、細胞ごとに高価なマイクロアレイを使用することは、多数の細胞のトランスクリプトームの観察には限界があった。2009年になると、これらの問題を解決できる可能性として、NGSを利用するscRNAseqプロトコールがAzim Suraniのグループによって報告された<ref><pubmed>19349980</pubmed></ref>。しかしながら、この報告でもわずか8個の細胞の解析に留まっており、1つの細胞ごとに処理を行うという操作が必要で、多数の細胞についてのトランスクリプームを一挙に理解することはできなかった。また、塩基配列の違うcDNAごとにPCR効率に差がある結果生じる増幅バイアス、また3’末端側が選択的に補足されることなどの課題を残した。<br />
<br />
===scRNAseqの現状===<br />
その後、5’末端側も含めた完全長cDNAを増幅するscRNAseqのプロトコールが考案された。特に、SMART-seq（Switch mechanism at the 5' End of RNA Templates）<ref><pubmed>22820318</pubmed></ref>およびその改良されたプロトコールであるSMART-seq2<ref><pubmed>24056875</pubmed></ref> <ref><pubmed>24385147</pubmed></ref>の使用例が多い（既に、SMART-seq3という改良プロトコールもある<ref><pubmed>32518404</pubmed></ref>が、以下SMART-seqと呼ぶ）。また、類似法としてSTRT（single-cell tagged reverse transcription）<ref><pubmed>21543516</pubmed></ref>などがある。一方、MARS-seq（Massively parallel single-cell RNA-seq）<ref><pubmed>24531970 </pubmed></ref>、CEL-seq（Cell Expression by Linear amplification and Sequencing）<ref><pubmed>22939981</pubmed></ref>、CEL-seq2<ref><pubmed> 27121950 </pubmed></ref>では、[[T7 RNAポリメラーゼ]]による[[in vitro転写]]を用いることにより、PCRで顕著な増幅バイアスを減少させようとしている。<br />
<br />
増幅バイアス除去のアプローチとして特に重要なのは、2011年に発表された分子識別子（unique molecular identifiers: UMI）を持つcDNAを増幅させ、NGS後の情報処理を用いる方法である<ref><pubmed>22101854</pubmed></ref>。この方法では逆転写反応の際、ランダムなUMIをcDNA末端に付加した後、増幅反応、NGSを行い、cDNA配列とUMI配列の両方を読む。同一のUMIを持っていれば、逆転写時に同一のcDNA由来とカウントする。UMIをカウントすることで、増幅前のmRNAのコピー数を知ることができる<ref><pubmed>21543516</pubmed></ref><ref><pubmed>24363023</pubmed></ref><ref><pubmed>28192419</pubmed></ref> <ref><pubmed>29474909</pubmed></ref><ref><pubmed> 28818938 </pubmed></ref><ref><pubmed>29545511</pubmed></ref>。2013年には、このような１細胞のシーケンシング技術が、Nature Methods誌のMethod of the Year に選ばれた[https://www.nature.com/collections/mysbdwgfll]。<br />
<br />
これらの方法のうち、SMART-seqは、マイクロピペットによる捕獲、セルソーター、[[レーザー捕獲]]などを用いるマルチウェル法、あるいは半導体集積回路製作技術で作った流体集積回路を利用するFluidigm C1の装置[https://jp.fluidigm.com]と組み合わせることで利用される機会が多い<ref><pubmed>30405621</pubmed></ref>[https://doi.org/10.1101/742304]。SMART-seqプロトコールの特徴は、全長トランスクリプトームを得ることができることであり、mRNAのスプライシングバリアントなどのアイソフォーム、アリルごとの発現情報が得られるSNPs、変異の検出にも利用できる。また、それぞれ細胞ごとの反応を独立した場所で行うため、別の細胞の反応と混じる可能性がない。小型ウェルを用いるSeq-Wellも同様である<ref><pubmed>28192419</pubmed></ref>。これらの点が、次に説明するDropletを使用して3’末端のみを標的にしたscRNAseqに比べた場合の長所であるが、その高コスト（1細胞あたり数十ドル）と処理可能な細胞数の少なさが短所である。<br />
<br />
===Droplet使用の3’エンドリード法===<br />
しかしながら、もっとも重要なscRNAseqの方法論についての進歩は、2015年、Harvard Medical Schoolの独立した２つのグループが、inDrops<ref><pubmed>26000487</pubmed></ref>そしてDrop-seq<ref><pubmed>26000488 </pubmed></ref>という類似した2つの高スループットな方法を開発したことであろう（inDropsはT7RNAポリメラーゼ、Drop-seqはPCRで増幅）。これらの方法では、[[マイクロ流体力学]] (Microfluidics) 、 UMI（上述）と細胞ごとのバーコード（Cell Barcode）という2種類のDNAバーコーディング、そしてNGSと情報解析を利用している。そして、多く細胞のサンプル調製の自動化と容易さから、1つの細胞あたりに要するコストを大幅に低下させることに成功した（Drop-seqは発表時で、１細胞あたり約5セント）。つまり、細胞1つずつをマイクロ流体力学によるエマルジョン技術を利用した装置に流入させ、その１細胞を1つのDroplet（油中水滴）に自動的に閉じ込める。そのDroplet中には、DropletごとにCell barcode/UMIとしてユニークなDNAバーコードを持つゲルビーズ(Gel Beads in Emulsion, GEMs)が入っており、それを足場に3’末端のみを標的にしたcDNA合成反応を実施することで、同じ細胞に含まれていたmRNAが同じCell barcodeを持つcDNAとして合成され、そのmRNA/cDNAが由来した細胞を識別できるということを利用している（図１）。<br />
<br />
なお、DropSeqはコストが低いが、細胞の取得率と検出感度が低い弱点がある。inDropsはDropSeqより細胞取得率が高く、パラメータを調整することにより、低レベルで発現される遺伝子の検出にも有利であるとされる<ref><pubmed>30472192</pubmed></ref>。DropSeqのセットアップはDolomite Bio ([https://www.dolomite-bio.com])、inDropは1 Cellbio社から販売されている[https://1cell-bio.com]。しかし、特に重要なのは10x Genomics社が同様の原理を用いた「Chromium」と命名された機器と試薬のシステムを市販することで、多くの研究者が容易に利用できることになったことである<ref><pubmed>28091601</pubmed></ref>[https://www.10xgenomics.com/jp/]。Svenssonらによる最近のデータベース[https://doi.org/10.1101/742304], [http://www.nxn.se/single-cell-studies/gui]では、scRNAseqを用いた論文で用いられた方法について調査しているが、この数年、10x Genomics社Chromiumを用いた論文が飛躍的に増加し、scRNAseqの方法として一般的になりつつあることがわかる（現在、10x Genomics社とBioRad社の間で関連特許をめぐる係争がある。）。このシステムは市販であるので導入が容易であり、DropSeqやinDropsに比べ多くの転写産物の高感度検出が可能であるが、ランニングコストは高い<ref><pubmed>30472192</pubmed></ref>。なお、3’エンドリード法だけでなく、N末端側に位置する抗体の可変領域などの検出には5’エンドリード法が利用されることがある。<br />
[[ファイル:scFig1.jpg|サムネイル|300px|'''図1．Droplet使用の3’エンドリード法 '''<br>組織から解離させた細胞それぞれを、マイクロ流体力学を利用した装置で、バーコードプライマーが結合したゲルビーズとともにDropletに封じ込める。Droplet中には、DropletごとにCell barcode/UMIとしてユニークなDNA配列を持つゲルビーズ(GEMs)が入っており、それを足場にcDNA合成反応を実施することで、同じ細胞に含まれていたmRNAが同じCell barcodeを持つDNAとして合成され、それを増幅する。]]<br />
<br />
==scRNAseqの実際==<br />
ここでは主流になっている10x Genomics社のChromiumなどのDropletを用いた方法とSMART-seqなどを用いた方法に共通する方法の実際について俯瞰する。scRNAseqの利用には、4つのステップがある（図２）<ref><pubmed> 31217225</pubmed></ref><ref><pubmed>30089861</pubmed></ref>。１）個体や組織を採集し、そこから細胞あるいは細胞核を個別にすること。２）Droplet法やSMART-seqなどによる個々の細胞からのライブラリーの作製とNGS。３）前処理（preprocessing、得られた配列の整理）。４）ダウンストリーム解析（生物学的な情報を得るコンピューター生物学）。これらのうち、２）の段階については、上に記述したように市販の機器や試薬を利用する機会が多くなっているので、そのためのマニュアル等が参考になるはずである。<br />
[[ファイル:scFig2.jpg|サムネイル|500px|'''図２．scRNAseqの実際のステップ '''<br>細胞の単離、ライブラリ作製とNGS、データの前処理から次元圧縮、ダウンストリーム解析。図の一部は2016 DBCLS TogoTV、あるいはSeuratを用いて10x Genomics社のPBMCデータ（[https://support.10xgenomics.com/single-cell-gene-expression/datasets]から執筆者が作製。]]<br />
<br />
===組織からの細胞、細胞核の分離===<br />
血液細胞のように浮遊した細胞ではない場合、物理的あるいは酵素処理などによって解離することで、生組織から状態の良いバラバラになった細胞を調製する必要がある。神経系組織の酵素処理には、パパインを用いる方法が広く用いられている。ここで、しばしば問題となるのが、酵素処理による短時間加温や機械的刺激で、発現量が変化する遺伝子が存在することである<ref><pubmed>27090946</pubmed></ref>。特に、脳の[[ミクログリア]]の解析には、低温下で組織をホモゲナイズするなどの工夫が必要であった<ref><pubmed>30471926</pubmed></ref>。また、このような現象を抑制するために、酵素処理時に転写阻害剤である[[アクチノマイシン]]で処理したり<ref><pubmed>29024657</pubmed></ref>、ヒマラヤ氷河から得られた細菌Bacillus licheniformisから得られた低温プロテアーゼを用いる方法も報告されている<ref><pubmed>28851704</pubmed></ref>。また、細胞解離後に、メタノールで固定しscRNAseqに使用したり<ref><pubmed>28526029</pubmed></ref>、クロスリンカーを用いる方法もある<ref><pubmed>29391536</pubmed></ref>。<br />
<br />
単離した細胞は、そのまま10x GenomicsのChromiumのプラットフォームに導入することができるが、抗体や蛍光タンパク質レポーターなどを用いたFACS、[[パニング]]、MACS(磁気ビーズカラム)などによる特定のマーカーを細胞表面などに発現する細胞の選択的濃縮や除去を行う場合もある。更に、抗体に抗体表示バーコードDNAをカップリングさせるCITE-seq(Cellular Indexing of Transcriptomes and Epitopes by Sequencing) については、下記のマルチモーダルなオミクスの項目で述べる。<br />
<br />
なお、ヒト組織や希少生物などから生細胞を得ることは困難なことが多い。この場合、scRNAseqの変法として、凍結した組織から、各細胞由来の核を調製し、核内のmRNAを分析するsnRNAseq (single-nucleus RNA-seq)が利用されている。ただ、snRNAseqでは、FACSなどによる特定細胞集団の分離が困難であることが多く、細胞質を持つ生細胞を利用した場合より検出できる遺伝子数が少なく同等な結果が必ずしも得られない<ref><pubmed>24248345</pubmed></ref><ref><pubmed>26890679</pubmed></ref> <ref><pubmed>27471252</pubmed></ref><ref><pubmed>28846088</pubmed></ref><ref><pubmed>29220646</pubmed></ref><ref><pubmed>28846088</pubmed></ref><ref><pubmed>30586455</pubmed></ref><ref><pubmed>28729663</pubmed></ref><ref><pubmed>31728515</pubmed></ref><ref><pubmed>32341560</pubmed></ref> <ref><pubmed>32518403</pubmed></ref>。一方で、snRNA-seqでは、組織をそのまま凍結することから開始するので、上述したscRNAseqの問題である酵素処理などを避けることができる。更に、核を用いることで、大きな細胞体はマイクロ流体力学の流路で詰まりやすいなど、細胞の形状に伴うバイアスを減らすことができるといったメリットもある。こうしたプロトコールの一部は、protocols.ioのHuman Cell Atlasのグループ[https://www.protocols.io/groups/hca]で公開されている。<br />
通常のscRNAseqは、ポリアデニル化されたmRNAを検出しているが、MATQ-seq（multiple annealing and dC-tailing-based quantitative single-cell RNA-seq）を用いると、ポリアデニル化されていないRNAの検出も可能である<ref><pubmed> 28092691</pubmed></ref>。更に、RNAを分析するscRNAseqではないが、遺伝子発現との関係が想定される[[オープンクロマチン]]領域を[[トランスポゾン]]を用いることで個々の細胞レベルで選択的に検出するsingle cell ATAC-seq (Assay for Transposase-Accessible Chromatin)やsnATAC-seq <ref><pubmed>26083756</pubmed></ref>, <ref><pubmed>29434377</pubmed></ref><ref><pubmed>25953818</pubmed></ref>, single cell THS-seq (transposome hypersensitive-site) <ref><pubmed>29227469</pubmed></ref>、や[[DNAメチル化]]領域を観察するsnmC-seqのような方法も利用されている<ref><pubmed>28798132</pubmed></ref><ref><pubmed>30237449</pubmed></ref>。<br />
<br />
<br />
===scRNAseqデータの前処理===<br />
10x Genomics社のChromium、Illumina社のNGSを利用した場合、Cell Rangerのmkrefコマンド(Linux上で作動, [https://support.10xgenomics.com/single-cell-gene-expression/software/pipelines/latest/using/tutorial_mr])により、各生物種ごとのレファレンス配列リスト（[https://www.ncbi.nlm.nih.gov/grc]）、EggNOG ([http://eggnogdb.embl.de])などを参考にしながら、細胞とトランスクリプトームの対応マトリックスを作製する。マウスやヒトでは既製のものを利用できる。その後のデータの処理についても、10x Genomics社がソフトウェアLoupeを提供している。しかしながら、その後のダウンストリーム解析を考慮して、[[R]], [[Python]], MATLABなどのデータ解析のための汎用プログラミング言語やコードで扱えるオブジェクトに変換するのが通常である。ここでは、scRNAseqデータ解析のために最もよく利用されているRを用いたパッケージ「Seurat」<ref><pubmed> 29608179 </pubmed></ref> <ref><pubmed> 31178118 </pubmed></ref>を中心に紹介したい。また、その一部はUniversity of WashingtonのCole Trapnell研究室で開発されてきたmonocle3でも可能である（[https://cole-trapnell-lab.github.io/monocle3/]）。Pythonを利用したものでは、ドイツ・ミュンヘンInstitute of Computational Biologyの Fabian Theisらが開発しているScanpyが有名である<ref><pubmed> 29409532</pubmed></ref>。<br />
<br />
New York UniversityのRahul Satija研究室が開発しているSeurat（画家スーラに由来）は、scRNAseqデータ解析のために広く利用されているRパッケージであり、2020年秋現在、Seurat4のβバージョンが公開されている。論文の正式発表前から、サポート情報提供やコード修正なども頻繁に行っており、Satija研究室のウェッブサイト（ [http://satijalab.org/Seurat]）、Github([https://github.com/satijalab/Seurat])、更にTwitterアカウント（@satijalab）などで最新情報を得ることできる。<br />
<br />
最初に行うのは、scRNAseqデータの品質管理である。ここでは、質の低い細胞のデータ（壊れた細胞では、転写産物の種類が少なくミトコンドリア由来の転写産物が多い）を取り除く。また、複数の試料を組み合わせる場合には、バッチごとの違いについて検討する<ref><pubmed>29608177</pubmed></ref><ref><pubmed> 28045081<br />
</pubmed></ref>。現実には、実験ごとのバッチの違いによる影響（Batch effect）がscRNAseqの最大の問題であると示されてきており、実験デザインを工夫する必要がある<ref><pubmed>29121214</pubmed></ref>。<br />
<br />
また、Dropletを使用するscRNAseqでしばしば問題になるのが、Dropletに２つ以上の細胞が封じ込められ、それらが同一のCell barcodeを持ってしまうアーティファクトである。通常「Doublet」「Multilet」と呼ばれるこの問題はダウンストリーム解析を混乱させるので、細胞単離の段階から注意する必要があるが、scRNAseqデータ取得後にもデータ処理で検討することは可能である<ref><pubmed>30954476</pubmed></ref><ref><pubmed>30954475</pubmed></ref> <ref><pubmed>31693907</pubmed></ref><ref><pubmed>32592658</pubmed></ref> <ref><pubmed>29227470</pubmed></ref><ref><pubmed>31836005</pubmed></ref><ref><pubmed>31856883</pubmed></ref><ref><pubmed>30567574</pubmed></ref> <ref><pubmed>31266958</pubmed></ref> [https://doi.org/10.1101/2019.12.17.879304][https://doi.org/10.1101/699637]。なお、この手法を利用することで、バッチ効果を抑えるために、異なるバーコードを持つ複数の試料を混ぜて一つの試料として扱い、計算機的に再び分離、解析するdemultiplexingが注目されている<ref><pubmed>32483174</pubmed></ref>。<br />
<br />
scRNAseqデータのもうひとつのノイズは、ある遺伝子の発現が低いために、本来同じタイプの細胞であっても、その遺伝子の発現が全く見られない「Dropout」と呼ばれる現象であり解析に影響を与えるので、これについても検討が必要である<ref><pubmed> 24056876<br />
</pubmed></ref><ref><pubmed>32127540</pubmed></ref>。<br />
<br />
このようなノーマライゼーションの過程を経て<ref><pubmed>28504683</pubmed></ref>、scRNAseqのデータ解析において、最初に行うのが、[[次元圧縮]] (dimensionality reduction)である<ref><pubmed>30617341</pubmed></ref><ref><pubmed>31780648</pubmed></ref>。PCA (Principal component analysis, 主成分分析)、UMAP（Uniform Manifold Approximation and Projection, 均一マニフォールド近似と投影）、Diffusion maps<ref><pubmed> 26002886<br />
</pubmed></ref>, tSNE(t-distributed Stochastic Neighbor Embedding , t分布型確率的近傍埋込み)などの手法が用いられる。 特に、tSNE[http://www.jmlr.org/papers/v9/vandermaaten08a.html]とUMAP[https://arxiv.org/abs/1802.03426]は、高次元データを低次元の点の集合として可視化することで、それぞれの細胞の持つトランスクリプトームの類似度についての直観的な表示が可能でありしばしば用いられる（図３）。tSNEよりUMAPの方が迅速に類似集団間の関係が明確になるので、最近はUMAPを利用することが多くなってきている。次に、[[Louvainアルゴリズム]]などでクラスタリング（コミュニティ分割）を行いグラフ上に表示できる（図３の色分け）。こうして、違ったタイプの細胞の集合が別のクラスターとして表示される。<br />
[[ファイル:scFig3.jpg|サムネイル|250px|'''図３． tSNEとUMAPによる同じデータの可視化'''<br>網膜（ニワトリ）の視細胞のデータを用いて執筆者が作製[https://doi.org/10.1101/2020.10.09.333633<br />
}。]]<br />
<br />
==ダウンストリーム解析==<br />
===細胞クラスターの解釈とマーカー遺伝子候補の発見===<br />
scRNAseqデータから得られる生物学的知見には、内在的に存在する細胞の種類、外部刺激や環境で変化した細胞の状態、そして種類や変化により特徴的に発現するマーカー遺伝子候補の発見がある<ref><pubmed>27824854</pubmed></ref><ref><pubmed>32033589</pubmed></ref><br />
。クラスタリングにより、異なった細胞集団の存在が認識されると、それぞれのクラスターに特徴的に発現している遺伝子を具体的に探索し、細胞集団の持つバイオマーカーによって、そのクラスターの同定が可能になる。例えば、既に神経細胞とグリア細胞に特異的に発現する典型的マーカーはよく知られており、それぞれのクラスターの識別は容易である。更に、神経細胞のタイプを区別できるマーカーや、外部刺激によって遺伝子発現が変化した神経細胞の状態は、In situ hybridizationや免疫組織化学などにより確認できる。このようなクラスターごとに発現が異なる遺伝子（差次的発現遺伝子）を見つけるためには（Differential expression analysis, DE analysis）、SeuratのFindMarkersコマンド中でも利用可能である専用コード（MAST <ref><pubmed>26653891</pubmed></ref>、DESeq2 <ref><pubmed>25516281</pubmed></ref>など）を用いることができる。scRNAseqの解析に必要なコードは、scRNA-tools [https://www.scrna-tools.org], Awesome single cell [https://github.com/seandavi/awesome-single-cell], Bioconductor[https://www.bioconductor.org]などで紹介されており、ほとんどがダウンロード可能である。また、最新の情報については、bioRxivなどのプレプリントサーバで公開されていることが多く、scRNAseqのデータ（下記参考）とともに、オープンサイエンス実践の好例となっている。細胞ごとの差次的発現遺伝子の可視化には、ドットプロット（dot plot）、ヴァイオリンプロット（violin plot）、リッジプロット（Ridge plot, joy plot）、UMAPなどの次元圧縮図に重ねるFeatureプロット（feature plot）などが、目的に応じて頻繁に用いられる（図４）。<br />
[[ファイル:scFig4.jpg|サムネイル|300px|'''図４．scRNAseqデータの可視化の例 '''<br>A. ドットプロット。B.ヴァイオリンプロット。C. リッジプロット。D. UMAPと重ねたFeatureプロット。網膜の視細胞のデータを用いて執筆者が作製[https://doi.org/10.1101/2020.10.09.333633<br />
]。]]<br />
<br />
===偽時系列解析、遺伝子制御ネットワーク、パスウェイ解析===<br />
実験的なノイズとは別に生物学的に意味のある遺伝子発現の変動には、位置情報、[[細胞周期]]、[[概日リズム]]、発現変動が大きい破裂型プロモーターの作動などの理由で 変動が見られるものもある<ref><pubmed> 31217225 </pubmed></ref><ref><pubmed> 26000846</pubmed></ref>。特に、刺激・薬剤処理やさまざまな病態の進行や治療に伴う細胞の変化、発生途上の細胞系譜や細胞分化といった細胞の遷移状態の解析（[[軌道推定]]（Trajectory inference）；[[偽時系列解析]]Pseudo-time analysis ）には、scRNAseqデータを用いることが効果的である<ref><pubmed>29576429</pubmed></ref><ref><pubmed>28813177</pubmed></ref><ref><pubmed>29565398</pubmed></ref>。しばしば用いられるmonocle3 <ref><pubmed>30787437</pubmed></ref>[https://cole-trapnell-lab.github.io/monocle3/]など、多くのコードを収集、比較しているサイトがある [https://dynverse.org][https://github.com/agitter/single-cell-pseudotime]。RNA velocityといった転写産物のスプライシングの状態から細胞の分化状態を推定する方法もある<ref><pubmed>30089906</pubmed></ref>。しかし、これらの方法は、あくまで発生途上の[[細胞系譜]]や細胞分化の推定に過ぎない。細胞系譜を更に確実に観察しつつ、scRNAseqを行うことで、細胞タイプの系統関係を調べる方法として、CRISPR-Cas9を用いた[[ゲノム編集]]による記録法を導入したscGESTALT<ref><pubmed>29608178</pubmed></ref>、ScarTrace<ref><pubmed>29590089</pubmed></ref> 、LINNAEUS<ref><pubmed>29644996</pubmed></ref>、あるいはアデノシンデアミナーゼでRNA編集を行いタイムスタンプを入れる方法<ref><pubmed>33077959</pubmed></ref>がある。<br />
<br />
また細胞分化や変動に伴う特徴的な遺伝子発現をscRNAseqで観察することは、遺伝子制御ネットワーク（例、SCENIC<ref><pubmed>28991892</pubmed></ref>, [https://github.com/aertslab/SCENIC]）や[[代謝経路]]や[[シグナル伝達系]]のための[[パスウェイ解析]](例、Metascape<ref><pubmed>30944313</pubmed></ref>, [http://metascape.org])を理解するシステム生物学的な研究として有用である。更に、scRNAseqで得られた結果をもとに、細胞間相互作用の理解を深めるのを目的とするCellPhoneDB<ref><pubmed>32103204</pubmed></ref>[https://github.com/Teichlab/cellphonedb]、NicheNet<ref><pubmed>3181926</pubmed></ref>, SVCA<ref><pubmed>31577949</pubmed></ref>などがある。特に、Perturb-seq<ref><pubmed>27984732</pubmed></ref> やその変法<ref><pubmed> 32231336</pubmed></ref>は、CRISPRライブラリーによるゲノム編集を施した細胞をscRNAseqで解析することで、ゲノム編集で破壊された遺伝子の機能や遺伝子間の相互作用の理解を可能にしている後述するマルチモーダルなscRNAseqの１つであり、注目されている。<br />
<br />
==scRNAseqの神経科学研究への適用==<br />
===神経系細胞ビッグデータとしてのscRNAseq===<br />
様々な神経・精神疾患について理解しその診断や治療に役立てるためには、神経細胞、[[グリア細胞]]を中心にした神経系にある細胞の種類や状態を識別し、それぞれの細胞における分子的な変化を観察することが重要である <ref><pubmed>28775344</pubmed></ref><ref><pubmed>29738987</pubmed></ref>。本本項目で解説してきたscRNAseq技術は、神経系に見られるそれぞれの細胞のトランスクリプトームについて[[ビッグデータ]]を提供することで、この細胞の種類や状態の識別に新たな根拠を与えつつある。近年、中枢神経系の[[アストロサイト]]、[[オリゴデンドロサイト]]、ミクログリアといったグリア細胞も均一ではなく、内在的な多様性や外部因子による状態の変動が報告されてきている。神経細胞は、著しく多様であり、この多様性が神経系を特徴づけており、その多彩で複雑な機能の発現に必須である。従来の神経科学では、神経細胞の多様性は、それぞれの神経細胞の解剖学的な位置、発現している分子、電気生理学、結合性、形態、神経伝達物質、神経伝達物質受容体とシグナル伝達によって識別されてきている。こうした神経細胞の多様性を便宜的に記述するのに、タイプ（type）、クラス（class）、サブクラス（subclass）、サブタイプ（subtype） というような用語が用いられてきた。しかし、ここでは混乱を防ぐため、Masland（2004）<ref><pubmed>15242626</pubmed></ref>が提唱し、広く受けいれられている「クラス」と「タイプ」という単語を用いることとする。タイプは、これ以上分類することができないとされる階層であり、共通性を持つタイプの集団がクラスである。例えば、大脳皮質の錐体細胞、網膜神経節細胞といった大雑把な区分はクラスである。大脳皮質の錐体細胞というクラスは、層や領野によって異なるタイプ、網膜神経節細胞には視覚情報に対して応答が異なるタイプが存在する。scRNAseqは、「タイプ」の理解に新たな視点を提供している。<br />
<br />
===神経系へのscRNAseqの適用===<br />
scRNAseqの神経系での利用については、次々と新しい論文やプレプリントが発表されており、ここではscRNAseqで得られてきた情報の典型例を紹介することにとどめる。<br />
<br />
[[大脳皮質]]には、[[錐体細胞]]や[[非錐体細胞]]などの神経細胞や様々なグリア細胞などが見られ、古くから神経細胞タイプの識別が行われてきた。初期のscRNAseq技術でも、マウス皮質の小規模な細胞数を分類した研究で、これまで知られていた主要な神経細胞タイプとは違うタイプが見つかりその有効性が示された<ref><pubmed>25700174</pubmed></ref>。その後のDroplet使用の3’エンドリード法を利用した多数の細胞数の解析で、更に多数の神経細胞のタイプが見つかっている<ref><pubmed>32839617</pubmed></ref><ref><pubmed>28846088</pubmed></ref><ref><pubmed>30096299</pubmed></ref><ref><pubmed>30096314</pubmed></ref><ref><pubmed>30382198</pubmed></ref><ref><pubmed>29320739</pubmed></ref><ref><pubmed>28846088</pubmed></ref>[https://doi.org/10.1101/2020.03.14.991018][https://doi.org/10.1101/2020.06.04.105700] [https://doi.org/10.1101/2020.07.02.184051]。特に、GABA作動性介在神経細胞タイプの多様性とその発生<ref><pubmed>28942923</pubmed></ref><ref><pubmed>28134272</pubmed></ref><ref><pubmed>29472441</pubmed></ref><ref><pubmed>29513653</pubmed></ref>についての情報は重要であろう。また、初期の発生過程<ref><pubmed>26940868</pubmed></ref><ref><pubmed>30485812</pubmed></ref><ref><pubmed>31073041</pubmed></ref><ref><pubmed>30635555</pubmed></ref><ref><pubmed>30625322</pubmed></ref>、老化<ref><pubmed>31551601</pubmed></ref><の理解が、scRNASeq技術を利用することで進んでいる。更に、[[神経活動]]によって変化するトランスクリプトームの変化も細胞ごとに調査され興味深い<ref><pubmed>29230054</pubmed></ref> 。 ヒトを含めた霊長類の大脳についても発達段階を含めてscRNAseqが適用されてきている<ref><pubmed>26060301</pubmed></ref><ref><pubmed>27339989</pubmed></ref><ref><pubmed>29539641</pubmed></ref><ref><pubmed>29217575</pubmed></ref><ref><pubmed>28846088</pubmed></ref><ref><pubmed>29227469</pubmed></ref><ref><pubmed>31303374</pubmed></ref><ref><pubmed>29867213</pubmed></ref><ref><pubmed>31435019</pubmed></ref><ref><pubmed>32424074</pubmed></ref> [https://doi.org/10.1101/709501][https://doi.org/10.1101/2020.03.31.016972][https://doi.org/10.1101/2020.04.23.056390]。ヒトや霊長類に特徴的とされる[[島]]のvon Economo神経細胞（紡錘細胞）のような希少な神経細胞のscRNAseqにも成功している<ref><pubmed>32127543</pubmed></ref>。<br />
<br />
[[海馬]]<ref><pubmed>29241552</pubmed></ref><ref><pubmed>29912866</pubmed></ref><ref><pubmed>29335606</pubmed></ref><ref><pubmed>31942070</pubmed></ref>では、これまでの研究で記載されてきた神経細胞のタイプの存在が確認され、更に新規のタイプが見つかった。中枢神経系では、その他、[[外側膝状体]]<ref><pubmed>29343640</pubmed></ref>、[[大脳基底核]](足底核)<ref><pubmed>28384468</pubmed></ref> 、[[視床下部]]<ref><pubmed>28166221</pubmed></ref><ref><pubmed>28355573</pubmed></ref> <ref><pubmed>27991900</pubmed></ref><ref><pubmed>30385464</pubmed></ref> <ref><pubmed>31249056</pubmed></ref><ref><pubmed>30858605</pubmed></ref>、[[線条体]]<ref><pubmed>27425622</pubmed></ref><ref><pubmed>30134177</pubmed></ref><ref><pubmed>31875543</pubmed></ref>、[[中脳]]<ref><pubmed>27716510</pubmed></ref><ref><pubmed>29499164</pubmed></ref> <ref><pubmed>30718509</pubmed></ref> 、[[手綱]]<ref><pubmed>29576475</pubmed></ref>、発生中の[[間脳]]<ref><pubmed>30872278</pubmed></ref> 、さらに[[小脳]]<ref><pubmed>30220501</pubmed></ref><ref><pubmed>30735127</pubmed></ref><ref><pubmed>30690467</pubmed></ref>などの結果が得られている。マウスの小脳においては、分子層にこれまでの星状細胞、バスケット細胞というカテゴリーとは違ったギャップジャンクションに特徴を持つ２種類の神経細胞があることが示唆されている[https://doi.org/10.1101/2020.03.04.976407]。<br />
<br />
脳の外部では、[[運動神経]][https://doi.org/10.1101/2020.03.16.992958]、[[感覚神経]]<ref><pubmed>25420068</pubmed></ref><ref><pubmed>26691752</pubmed></ref>、[[らせん神経節]]<ref><pubmed>30078709</pubmed></ref><ref><pubmed>30209249</pubmed></ref> 、[[臭覚神経]]<ref><pubmed>26541607</pubmed></ref> <ref><pubmed>32059767</pubmed></ref>、[[腸神経系]] <ref><pubmed>29483303</pubmed></ref>[https://doi.org/10.1101/2020.03.02.955757] 、[[網膜]]<ref><pubmed>27565351</pubmed></ref><ref><pubmed>29909983</pubmed></ref><ref><pubmed>30018341</pubmed></ref><ref><pubmed>31260032</pubmed></ref><ref><pubmed>31128945</pubmed></ref><ref><pubmed>30712875</pubmed></ref><ref><pubmed>30548510</pubmed></ref><ref><pubmed>31075224</pubmed></ref><ref><pubmed>31399471</pubmed></ref><ref><pubmed>31848347</pubmed></ref><ref><pubmed>31673015</pubmed></ref><ref><pubmed>31653841</pubmed></ref><ref><pubmed>31784286</pubmed></ref>[https://doi.org/10.1101/2020.02.26.966093][https://doi.org/10.1101/779694][https://www.biorxiv.org/content/10.1101/617555][A]でのscRNAseqデータがある。また[[iPS細胞]]や[[ES細胞]]由来の神経組織[[オルガノイド]]に含まれる神経細胞タイプを知る上でも利用されている<ref><pubmed>28094016</pubmed></ref><ref><pubmed>28279351</pubmed></ref><ref><pubmed>31168097</pubmed></ref><ref><pubmed>31996853</pubmed></ref><ref><pubmed>31968264</pubmed></ref><ref><pubmed><ref><pubmed>32221280</pubmed></ref>。<br />
<br />
===神経細胞以外の細胞===<br />
[[上衣細胞]]<ref><pubmed>29727663</pubmed></ref>は、[[神経幹細胞]]としての役割が示唆されてきたが、scRNAseqによる解析ではその可能性が支持されなかった。グリア細胞では、[[ラジアルグリア]]<ref><pubmed>26406371</pubmed></ref><ref><pubmed>25734491</pubmed></ref><ref><pubmed>29281841</pubmed></ref><ref><pubmed>29217575</pubmed></ref><ref><pubmed>29539641</pubmed></ref>[A]、アストロサイト<ref><pubmed>32139688</pubmed></ref><ref><pubmed>32203496</pubmed></ref>[https://doi.org/10.1101/2020.04.27.064881]に多様性があることが示唆されてきている。また、オリゴデンドロサイト<ref><pubmed>27284195</pubmed></ref><ref><pubmed>30078729</pubmed></ref><ref><pubmed>30257220</pubmed></ref><ref><pubmed>30747918</pubmed></ref><ref><pubmed>31958186</pubmed></ref>[https://doi.org/10.1101/2020.03.06.981373]については、これまで細胞生物学的に研究されてきた分化の過程がscRNAseqにより詳細に確認されている。ミクログリアは、神経系の発達、老化、損傷などに伴う重要なトランスクリプトームの変化がscRNAseqにより詳細に明らかになった<ref><pubmed>27338705</pubmed></ref><ref><pubmed>29020624</pubmed></ref><ref><pubmed>30206190</pubmed></ref><ref><pubmed>30471926</pubmed></ref><ref><pubmed>31209379</pubmed></ref><br />
<ref><pubmed>31835035</pubmed></ref>。また、[[CNS境界関連マクロファージ]](BAM) <ref><pubmed>31061494</pubmed></ref>や[[脳血管系]]<ref><pubmed>29443965</pubmed></ref>のscRNAseqも実施されている。<br />
<br />
===疾患===<br />
scRNAseqは、疾患の理解にも有用である。scRNAseqでは、疾患に伴う遺伝子発現の変化を細胞タイプごとに観察することができるので、bulk RNAseqでは埋もれていた遺伝子発現の変化や細胞ごとの変化を検出できるという長所がある。<br />
例えば、筋萎縮性側索硬化症<ref><pubmed>30948552</pubmed></ref>、多発性硬化症<ref><pubmed>30747918</pubmed></ref><ref><pubmed>30420755</pubmed></ref><ref><pubmed>32313246</pubmed></ref> <br />
、アルツハイマー病やそのモデル動物<ref><pubmed>31042697</pubmed></ref><ref><pubmed>31399126</pubmed></ref><ref><pubmed>29020624</pubmed></ref><br />
[https://doi.org/10.1101/628347]<ref><pubmed>28602351</pubmed></ref><ref><pubmed>32341542</pubmed></ref>、統合失調症<ref><pubmed>29785013</pubmed></ref><ref><pubmed>32203495</pubmed></ref>、自閉症やレット症候群<ref><pubmed>31097668</pubmed></ref><ref><pubmed>30455458</pubmed></ref>、シャルコー・マリー・トゥース病<ref><pubmed>29888333</pubmed></ref>、ダウン症[https://www.biorxiv.org/content/10.1101/2020.01.01.892398v1]、パーキンソン病<ref><pubmed>30503143</pubmed></ref> <ref><pubmed>32826893</pubmed></ref>、がん<ref><pubmed>31327527</pubmed></ref><ref><pubmed>28360267</pubmed></ref>などに適用されている。<br />
<br />
==scRNAseqの展望==<br />
===神経系の多様性と進化===<br />
NGSを用いることで、どんな生物種にも適用可能なscRNAseqは、既に多様な生物の神経系の細胞の理解、更には種間の相同性や差異の研究に利用されており、神経系の進化を細胞レベルで考察するのに有用であろう（例、センチュウ<ref><pubmed> 28818938 </pubmed></ref>、ショウジョウバエ <ref><pubmed>29909982</pubmed></ref><ref><pubmed>29149607</pubmed></ref><ref><pubmed>30703584</pubmed></ref><ref><pubmed>29909983</pubmed></ref><ref><pubmed>33125872</pubmed></ref>、カタユウレイボヤCiona intestinalis <ref><pubmed>30069052</pubmed></ref><ref><pubmed>30228204</pubmed></ref>、ゼブラフィッシュ<ref><pubmed>31018142</pubmed></ref><ref><pubmed>30929901</pubmed></ref>、アカミミガメTrachemys scripta elegans、トカゲPogona vitticeps, pv<ref><pubmed>29724907</pubmed></ref>、ニワトリ[https://doi.org/10.1101/2020.10.09.333633]、霊長類<ref><pubmed>30730291</pubmed></ref><ref><pubmed>31619793</pubmed></ref>[https://doi.org/10.1101/2020.03.31.016972]）。ただ、遺伝子やトランスクリプトームの研究が進んでいる生物種では比較的容易であるが、遺伝子のアノテーションが十分でない生物種を用いる場合、scRNAseqのデータ解析は困難を伴う。また種を超えた細胞タイプの相同性の理解には様々な工夫が必要である<ref><pubmed>31552245</pubmed></ref><ref><pubmed>30712875</pubmed></ref>[https://doi.org/10.1101/2020.03.31.016972]。<br />
<br />
===データベースと統合===<br />
獲得されたscRNAseqのデータは様々な目的で利用できるので、データベース化し利用できるようにする必要がある。神経系のトランスクリプトーム一般のデータベースが多数公開されており<ref><pubmed>29437890</pubmed></ref>、scRNAseqのデータも基本的にNCBIのGene Expression Omnibus[https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/]に登録されている。また、オープンサイエンス推進のためにcommon coordinate framework (CCF) やcentral annotation platform (CAP)という概念のもと、特にscRNAseqを意識したものとして、米国のBRAIN Initiative Cell Census Consortium<ref><pubmed>29096072</pubmed></ref> 、Human Cell Atlas ProjectのHuman Cell Atlas Data Portal [https://data.humancellatlas.org]、そのマウス版であるTabula Muris <ref><pubmed>30283141</pubmed></ref>[https://genome.ucsc.edu/cgi-bin/hgTrackUi?db=mm10&g=tabulaMuris]やSten Linnarssonラボのマウス脳発生データベース[http://mousebrain.org]、アレン脳研究所のAllen Brain Atlas [https://portal.brain-map.org]、ブロード研究所のSingle Cell Portal [https://singlecell.broadinstitute.org/]などのデータベースが稼働している。また、異なった方法や実験で得られたscRNAseqのデータや後述のマルチモーダルなシングルセルオミクスのデータを体系的に比較することも重要であり、CCA (Canonical correlation analysis)<ref><pubmed>29608179</pubmed></ref>, Seurat 3.0以降に組み込まれたMMN (Mutual Nearest Neighbors)、LIGER<ref><pubmed>31178122</pubmed></ref> 、Harmony<ref><pubmed>31740819</pubmed></ref> 、MetaNeighber<ref><pubmed>29491377</pubmed></ref>、Conos<ref><pubmed>31308548</pubmed></ref>のようなアルゴリズムが開発され、後述のマルチモーダルなシングルセルオミクスを組み込んだ統合サイトもでき始めている（[https://biccn.org]）。<br />
<br />
===空間トランスクリプトミクス===<br />
多数の細胞を扱うscRNAseqの弱点は、組織から細胞や細胞核を解離する必要があるので、その細胞が存在していた解剖学的あるいは空間的な位置の情報を消去してしまうということである。組織切片におけるタンパク質などの分布は免疫組織化学、mRNAの分布はin situ hybridizationで検出することができるが、数多くのmRNAの分布を情報処理技術と組み合わせ一気に同定する方法がscRNAseqと同様に開発されてきている（Slide-seq<ref><pubmed>30923225</pubmed></ref>[https://doi.org/10.1101/2020.03.12.989806]、HDST<ref><pubmed>31501547</pubmed></ref>、Expansion sequencing[http://doi.org/10.1101/2020.05.13.094268]など<ref><pubmed>27365449</pubmed></ref>, <ref><pubmed>31932730</pubmed></ref> <ref><pubmed>30948552</pubmed></ref>）、更に10x Genomics社が市販するVisiumなどがある。現状では、大きな組織の空間トランスクリプトミクスは、空間解像度は限定されており、技術普及の観点からも課題が多い。しかし、そのデータを解析するためのアルゴリズム<ref><pubmed>29553578</pubmed></ref><ref><pubmed>29553579</pubmed></ref><ref><pubmed>32350282</pubmed></ref> [https://doi.org/10.1101/757096][ https://doi.org/10.1101/701680] [https://doi.org/10.1101/431957]、<br />
更にMerFish <ref><pubmed>25858977</pubmed></ref>、corrFISH<ref><pubmed>27271198</pubmed></ref>のように、subcellularレベルで多数のmRNAを検出する方法が多数開発されてきており（文献：<ref><pubmed>25549890</pubmed></ref> osmFISH<ref><pubmed>30377364</pubmed></ref> 30377364、STARmap (spatially-resolved transcript amplicon readout mapping) <ref><pubmed>29930089</pubmed></ref>、seqFISH+<ref><pubmed>27764670</pubmed></ref>、pciSeq(probabilistic cell typing by in situ sequencing)[https://doi.org/10.1101/431957]、DSP(Digital Spatial Profiling) <ref><pubmed>32393914</pubmed></ref>）<br />
、scRNAseqと組み合わせることで、その弱点を補う空間トランスクリプトミクスにも利用され始め<ref><pubmed>30385464</pubmed></ref>[https://doi.org/10.1101/2020.06.04.105700]、今後の発展が期待される分野である。<br />
<br />
<br />
===マルチモーダルなシングルセルオミクス===<br />
同一の細胞からscRNAseqの情報だけでなく、ゲノム配列、ATAC-seqなどによるエピゲノム解析、少数のタンパク質、あるいはプロテオームなどを、同時に記録するマルチモーダルなオミクスが注目されている<ref><pubmed>31907462</pubmed></ref><ref><pubmed>30696980</pubmed></ref>。2019年には、Nature Methodsの「Methods of the Year」に選ばれており、現状については、その特集号などを参考にされたい。例えば、細胞表面分子に対する抗体にDNAを付加することで、マーカーを発現する細胞のトランスクリプトームを観察するCITE-seq<ref><pubmed>28759029</pubmed></ref>、 REAP-seq<ref><pubmed>28854175</pubmed></ref>は既知の細胞表面マーカーの発現とscRNAseqが同時に観察できるマルチモーダルなオミクスである。<br />
<br />
マルチモーダルなシングルセルオミクスとして、神経科学分野で注目されるのは、scRNAseqをパッチクランプによる電気生理学的情報と組み合わせたPatch-seq<ref><pubmed>26689544</pubmed></ref> <ref><pubmed>26689543</pubmed></ref>である。また、ゲノムDNAとscRNAseqを同時に観察することによって、近年、精神疾患の観点から注目されている発生途中で生じる遺伝子変異を研究するPRDD-seqは今後の展開が注目される[https://doi.org/10.1101/2020.04.19.046904]。最後に、BARseq (barcoded anatomy resolved by sequencing) <ref><pubmed>31626774</pubmed></ref>、CONNECTID[https://doi.org/10.1101/378760]、Epi-Retro-seq[https://doi.org/10.1101/2020.04.01.019612]のような方法は、[[コネクトーム]]（神経細胞の結合性）と遺伝子発現を記録できるオミクスの新たな方向として興味深い。<br />
<br />
<br />
== 関連項目 ==<br />
*[[ゲノムワイド関連解析 ]]<br />
*[[ディファレンシャルディスプレイ ]]<br />
*[[In situハイブリダイゼーション法 ]]<br />
*[[免疫組織化学法]]<br />
*[[エピジェネティクス]]<br />
== 参考文献 ==<br />
<references /></div>
Masahitoyamagata
https://bsd.neuroinf.jp/w/index.php?title=%E3%82%B7%E3%83%B3%E3%82%B0%E3%83%AB%E3%82%BB%E3%83%ABRNA%E3%82%B7%E3%83%BC%E3%82%B1%E3%83%B3%E3%82%B7%E3%83%B3%E3%82%B0&diff=45073
シングルセルRNAシーケンシング
2020-11-13T22:10:22Z
<p>Masahitoyamagata: </p>
<hr />
<div><div align="right"> <br />
<font size="+1">[http://researchmap.jp/yamagatm 山形方人]</font><br><br />
''Harvard University''<br><br />
DOI：<selfdoi /> 原稿受付日：年月日 原稿完成日：年月日<br><br />
担当編集委員：<br><br />
</div><br />
英：single cell RNA sequencing, scRNAseq<br />
{{box|text=<br />
シングルセルRNAシーケンシング(single cell RNA sequencing, 以下scRNAseq)は、[[次世代シーケンシング]] （next generation sequencing、以下NGS）技術を使用して個々の細胞が発現しているmRNA全体、つまり[[トランスクリプトーム]]を質的、量的に網羅的に調べ、細胞ごとの違いを高解像度で検出し、数理的に解析する分子生物学的、コンピュータ生物学的技術である。組織内にある細胞の分類を行うことで、未知あるいは希少な細胞の種類や状態の検出に有効である。また、刺激、発生など細胞の状況に応じて、個々の細胞のトランスクリプトームの情報を得ることで、細胞系譜などの疑時系列解析や疾患のバイオマーカーの研究も可能である。特に多様な神経細胞が存在する神経系では、この方法により、神経細胞や非神経細胞の分類や状態についての知見が深まり、新しい細胞マーカーや機能的な遺伝子の同定などが系統的かつ網羅的に行われるようになった。空間的情報、エピゲノム情報、タンパク質情報なども取り入れながら、特定の細胞タイプでの発現変化を探索するマルチモーダル解析の発展も著しい。<br />
}}<br />
<br />
==scRNAseqの背景==<br />
===トランスクリプトーム===<br />
トランスクリプトーム（transcriptome）は、細胞中に存在する全ての転写産物（タンパク質をコードするmRNA、タンパク質をコードしない[[ノンコーディングRNA]]、[[マイクロRNA]]など）の総体である<ref><pubmed>19015660</pubmed></ref><ref><pubmed>31341269 </pubmed></ref>。トランスクリプトームは、[[ゲノム]]とは異なり、同一の個体でも、組織ごとに、更には発生段階や細胞外環境や刺激によって変化する。トランスクリプトームは、同質あるいは異質の多数の細胞集団（組織、培養細胞）からRNA抽出後、cDNAに変換し、それを1990年代に出現した[[DNAマイクロアレイ]]のように数多くの既知mRNAを識別する技術によって解析されるようになった。その後、NGSの利用により、希少mRNAやノンコーディングRNAを含めた未知の転写産物の高感度検出が可能になるとともに、[[スプライシング]]で成熟していく過程のmRNAなど、転写産物の種類だけでなく、転写産物の構造的差異（スプライシングバリアント、SNPs、変異など）の解析もできるようになった。加えて、ヒトやモデル実験生物（[[マウス]]、[[ゼブラフィッシュ]]、[[ショウジョウバエ]]、[[センチュウ]]など）だけでなく、多種多様な生物のトランスクリプトームの把握も可能になった。ここでは、このような多数の細胞集団、つまり個体や特定の組織全体（bulk RNAseq）ではなく、細胞1つの持つトランスクリプトームを解析する方法（scRNAseq）とそのscRNAseqデータを利用することで得られる情報について概説する。<br />
<br />
===scRNAseqとその開発史===<br />
1つの細胞の持つ生体物質を解明し、定量しようとする試みは古くからあった。1960年代になると、フローサイトメトリーを利用した[[蛍光活性化セルソーティング]]（Fluorescence-activated cell sorting, FACS）が発明され、標識抗体などのプローブと組み合わせることで、多数の細胞集団の中で１つの細胞が持っている分子の種類や量についての断片的な研究が可能になり、この方法は現在でも汎用されている<ref><pubmed>22271369</pubmed></ref>。その後、[[免疫組織化学]]や[[in situ hybridization]]nなどにより、タンパク質やmRNAの種類や量が観察できるようになり、組織中に存在するそれぞれの細胞の同定などに活用されてきている。最近では、それぞれの細胞が持つ抗原分子を、異なった金属イオンで標識した抗体とフローサイトメトリーを組み合わせた方法で検出する[[マスサイトメトリー]]（CyTOFなど）も開発されてきている<ref><pubmed>27153492</pubmed></ref>。<br />
<br />
1つの細胞内にある全RNA（ribosomal RNAを含む）は細胞種にもよるが1-50pgである。そのうち、mRNAの占める割合は1-5%程度である<ref><pubmed>15239941</pubmed></ref>。この微量のmRNAをcDNAに変換してから大幅に増幅できる方法が発明されたことで、1つの細胞が発現するmRNAを高感度で検出できるようになった<ref><pubmed>1557406</pubmed></ref><ref><pubmed>7541630</pubmed></ref> 。例えば、1991年、Linda BuckとRichard Axelは、[[嗅覚受容体]]が[[Gタンパク質]]であると仮定し、個々の嗅覚細胞で特異的に観察されるGタンパク質mRNAを比較することで、嗅覚受容体の同定に成功した<ref><pubmed>1840504</pubmed></ref>。1995年になると、Catherine DulacとRichard Axelは、異なる[[鋤鼻神経細胞]]で特異的に発現する遺伝子を１つの細胞から作製したcDNAライブラリーを比較するディファレンシャル・スクリーニングを行うことで、[[フェロモン受容体]]を同定した<ref><pubmed>7585937</pubmed></ref>。同じ手法で異なる種類の神経細胞で発現している遺伝子も同定され<ref><pubmed>9778248</pubmed></ref><ref><pubmed>12230981</pubmed></ref>、１つの細胞の持つトランスクリプトームを比較するアプローチが神経細胞で特徴的に発現している遺伝子の同定に効果的なことを示した。<br />
<br />
一方で多くの種類のmRNAを１細胞レベルで一挙に観察するトランスクリプトームのための技術にはブレークスルーが待たれた。1つの問題は多種類のcDNAを簡便に識別することを可能にする方法の開発であった。これを可能にしたのが、[[PCR]]などのcDNA増幅法の改良とマイクロアレイの利用であった<ref><pubmed>12736331</pubmed></ref><ref><pubmed>16547197</pubmed></ref>。しかしながら、細胞ごとに高価なマイクロアレイを使用することは、多数の細胞のトランスクリプトームの観察には限界があった。2009年になると、これらの問題を解決できる可能性として、NGSを利用するscRNAseqプロトコールがAzim Suraniのグループによって報告された<ref><pubmed>19349980</pubmed></ref>。しかしながら、この報告でもわずか8個の細胞の解析に留まっており、1つの細胞ごとに処理を行うという操作が必要で、多数の細胞についてのトランスクリプームを一挙に理解することはできなかった。また、塩基配列の違うcDNAごとにPCR効率に差がある結果生じる増幅バイアス、また3’末端側が選択的に補足されることなどの課題を残した。<br />
<br />
===scRNAseqの現状===<br />
その後、5’末端側も含めた完全長cDNAを増幅するscRNAseqのプロトコールが考案された。特に、SMART-seq（Switch mechanism at the 5' End of RNA Templates）<ref><pubmed>22820318</pubmed></ref>およびその改良されたプロトコールであるSMART-seq2<ref><pubmed>24056875</pubmed></ref> <ref><pubmed>24385147</pubmed></ref>の使用例が多い（既に、SMART-seq3という改良プロトコールもある<ref><pubmed>32518404</pubmed></ref>が、以下SMART-seqと呼ぶ）。また、類似法としてSTRT（single-cell tagged reverse transcription）<ref><pubmed>21543516</pubmed></ref>などがある。一方、MARS-seq（Massively parallel single-cell RNA-seq）<ref><pubmed>24531970 </pubmed></ref>、CEL-seq（Cell Expression by Linear amplification and Sequencing）<ref><pubmed>22939981</pubmed></ref>、CEL-seq2<ref><pubmed> 27121950 </pubmed></ref>では、[[T7 RNAポリメラーゼ]]による[[in vitro転写]]を用いることにより、PCRで顕著な増幅バイアスを減少させようとしている。<br />
<br />
増幅バイアス除去のアプローチとして特に重要なのは、2011年に発表された分子識別子（unique molecular identifiers: UMI）を持つcDNAを増幅させ、NGS後の情報処理を用いる方法である<ref><pubmed>22101854</pubmed></ref>。この方法では逆転写反応の際、ランダムなUMIをcDNA末端に付加した後、増幅反応、NGSを行い、cDNA配列とUMI配列の両方を読む。同一のUMIを持っていれば、逆転写時に同一のcDNA由来とカウントする。UMIをカウントすることで、増幅前のmRNAのコピー数を知ることができる<ref><pubmed>21543516</pubmed></ref><ref><pubmed>24363023</pubmed></ref><ref><pubmed>28192419</pubmed></ref> <ref><pubmed>29474909</pubmed></ref><ref><pubmed> 28818938 </pubmed></ref><ref><pubmed>29545511</pubmed></ref>。2013年には、このような１細胞のシーケンシング技術が、Nature Methods誌のMethod of the Year に選ばれた[https://www.nature.com/collections/mysbdwgfll]。<br />
<br />
これらの方法のうち、SMART-seqは、マイクロピペットによる捕獲、セルソーター、[[レーザー捕獲]]などを用いるマルチウェル法、あるいは半導体集積回路製作技術で作った流体集積回路を利用するFluidigm C1の装置[https://jp.fluidigm.com]と組み合わせることで利用される機会が多い<ref><pubmed>30405621</pubmed></ref>[https://doi.org/10.1101/742304]。SMART-seqプロトコールの特徴は、全長トランスクリプトームを得ることができることであり、mRNAのスプライシングバリアントなどのアイソフォーム、アリルごとの発現情報が得られるSNPs、変異の検出にも利用できる。また、それぞれ細胞ごとの反応を独立した場所で行うため、別の細胞の反応と混じる可能性がない。小型ウェルを用いるSeq-Wellも同様である<ref><pubmed>28192419</pubmed></ref>。これらの点が、次に説明するDropletを使用して3’末端のみを標的にしたscRNAseqに比べた場合の長所であるが、その高コスト（1細胞あたり数十ドル）と処理可能な細胞数の少なさが短所である。<br />
<br />
===Droplet使用の3’エンドリード法===<br />
しかしながら、もっとも重要なscRNAseqの方法論についての進歩は、2015年、Harvard Medical Schoolの独立した２つのグループが、inDrops<ref><pubmed>26000487</pubmed></ref>そしてDrop-seq<ref><pubmed>26000488 </pubmed></ref>という類似した2つの高スループットな方法を開発したことであろう（inDropsはT7RNAポリメラーゼ、Drop-seqはPCRで増幅）。これらの方法では、[[マイクロ流体力学]] (Microfluidics) 、 UMI（上述）と細胞ごとのバーコード（Cell Barcode）という2種類のDNAバーコーディング、そしてNGSと情報解析を利用している。そして、多く細胞のサンプル調製の自動化と容易さから、1つの細胞あたりに要するコストを大幅に低下させることに成功した（Drop-seqは発表時で、１細胞あたり約5セント）。つまり、細胞1つずつをマイクロ流体力学によるエマルジョン技術を利用した装置に流入させ、その１細胞を1つのDroplet（油中水滴）に自動的に閉じ込める。そのDroplet中には、DropletごとにCell barcode/UMIとしてユニークなDNAバーコードを持つゲルビーズ(Gel Beads in Emulsion, GEMs)が入っており、それを足場に3’末端のみを標的にしたcDNA合成反応を実施することで、同じ細胞に含まれていたmRNAが同じCell barcodeを持つcDNAとして合成され、そのmRNA/cDNAが由来した細胞を識別できるということを利用している（図１）。<br />
<br />
なお、DropSeqはコストが低いが、細胞の取得率と検出感度が低い弱点がある。inDropsはDropSeqより細胞取得率が高く、パラメータを調整することにより、低レベルで発現される遺伝子の検出にも有利であるとされる<ref><pubmed>30472192</pubmed></ref>。<br />
[http://www.youtube.com/watch?v=fHq9ewdYEWM]<br />
DropSeqのセットアップはDolomite Bio ([https://www.dolomite-bio.com])、inDropは1 Cellbio社から販売されている[https://1cell-bio.com]。しかし、特に重要なのは10x Genomics社が同様の原理を用いた「Chromium」と命名された機器と試薬のシステムを市販することで、多くの研究者が容易に利用できることになったことである<ref><pubmed>28091601<br />
</pubmed></ref>[https://www.10xgenomics.com/jp/]。Svenssonらによる最近のデータベース[https://doi.org/10.1101/742304], [http://www.nxn.se/single-cell-studies/gui]では、scRNAseqを用いた論文で用いられた方法について調査しているが、この数年、10x Genomics社Chromiumを用いた論文が飛躍的に増加し、scRNAseqの方法として一般的になりつつあることがわかる（現在、10x Genomics社とBioRad社の間で関連特許をめぐる係争がある。）。このシステムは市販であるので導入が容易であり、DropSeqやinDropsに比べ多くの転写産物の高感度検出が可能であるが、ランニングコストは高い<ref><pubmed>30472192</pubmed></ref>。なお、3’エンドリード法だけでなく、N末端側に位置する抗体の可変領域などの検出には5’エンドリード法が利用されることがある。<br />
[[ファイル:scFig1.jpg|サムネイル|300px|'''図1．Droplet使用の3’エンドリード法 '''<br>組織から解離させた細胞それぞれを、マイクロ流体力学を利用した装置で、バーコードプライマーが結合したゲルビーズとともにオイルドロップレットに封じ込める。mRNAを逆転写した後、PCRで増幅する。]]<br />
<br />
==scRNAseqの実際==<br />
ここでは主流になっている10x Genomics社のChromiumなどのDropletを用いた方法とSMART-seqなどを用いた方法に共通する方法の実際について俯瞰する。scRNAseqの利用には、4つのステップがある（図２）<ref><pubmed> 31217225</pubmed></ref><ref><pubmed>30089861</pubmed></ref>。１）個体や組織を採集し、そこから細胞あるいは細胞核を個別にすること。２）Droplet法やSMART-seqなどによる個々の細胞からのライブラリーの作製とNGS。３）前処理（preprocessing、得られた配列の整理）。４）ダウンストリーム解析（生物学的な情報を得るコンピューター生物学）。これらのうち、２）の段階については、上に記述したように市販の機器や試薬を利用する機会が多くなっているので、そのためのマニュアル等が参考になるはずである。<br />
[[ファイル:scFig2.jpg|サムネイル|500px|'''図２．scRNAseqの実際のステップ '''<br>細胞の単離、ライブラリ作製とNGS、データの前処理から次元圧縮、ダウンストリーム解析。図の一部は2016 DBCLS TogoTV、あるいはSeuratを用いて10x Genomics社のPBMCデータ（[https://support.10xgenomics.com/single-cell-gene-expression/datasets]から執筆者が作製。]]<br />
<br />
===組織からの細胞、細胞核の分離===<br />
血液細胞のように浮遊した細胞ではない場合、物理的あるいは酵素処理などによって解離することで、生組織から状態の良いバラバラになった細胞を調製する必要がある。神経系組織の酵素処理には、パパインを用いる方法が広く用いられている。ここで、しばしば問題となるのが、酵素処理による短時間加温や機械的刺激で、発現量が変化する遺伝子が存在することである<ref><pubmed>27090946</pubmed></ref>。特に、脳の[[ミクログリア]]の解析には、低温下で組織をホモゲナイズするなどの工夫が必要であった<ref><pubmed>30471926</pubmed></ref>。また、このような現象を抑制するために、酵素処理時に転写阻害剤である[[アクチノマイシン]]で処理したり<ref><pubmed>29024657</pubmed></ref>、ヒマラヤ氷河から得られた細菌Bacillus licheniformisから得られた低温プロテアーゼを用いる方法も報告されている<ref><pubmed>28851704</pubmed></ref>。また、細胞解離後に、メタノールで固定しscRNAseqに使用したり<ref><pubmed>28526029</pubmed></ref>、クロスリンカーを用いる方法もある<ref><pubmed>29391536</pubmed></ref>。<br />
<br />
単離した細胞は、そのまま10x GenomicsのChromiumのプラットフォームに導入することができるが、抗体や蛍光タンパク質レポーターなどを用いたFACS、[[パニング]]、MACS(磁気ビーズカラム)などによる特定のマーカーを細胞表面などに発現する細胞の選択的濃縮や除去を行う場合もある。更に、抗体に抗体表示バーコードDNAをカップリングさせるCITE-seq(Cellular Indexing of Transcriptomes and Epitopes by Sequencing) については、下記のマルチモーダルなオミクスの項目で述べる。<br />
<br />
なお、ヒト組織や希少生物などから生細胞を得ることは困難なことが多い。この場合、scRNAseqの変法として、凍結した組織から、各細胞由来の核を調製し、核内のmRNAを分析するsnRNAseq (single-nucleus RNA-seq)が利用されている。ただ、snRNAseqでは、FACSなどによる特定細胞集団の分離が困難であることが多く、細胞質を持つ生細胞を利用した場合より検出できる遺伝子数が少なく同等な結果が必ずしも得られない<ref><pubmed>24248345</pubmed></ref><ref><pubmed>26890679</pubmed></ref> <ref><pubmed>27471252</pubmed></ref><ref><pubmed>28846088</pubmed></ref><ref><pubmed>29220646</pubmed></ref><ref><pubmed>28846088</pubmed></ref><ref><pubmed>30586455</pubmed></ref><ref><pubmed>28729663</pubmed></ref><ref><pubmed>31728515</pubmed></ref><ref><pubmed>32341560</pubmed></ref> <ref><pubmed>32518403</pubmed></ref>。一方で、snRNA-seqでは、組織をそのまま凍結することから開始するので、上述したscRNAseqの問題である酵素処理などを避けることができる。更に、核を用いることで、大きな細胞体はマイクロ流体力学の流路で詰まりやすいなど、細胞の形状に伴うバイアスを減らすことができるといったメリットもある。こうしたプロトコールの一部は、protocols.ioのHuman Cell Atlasのグループ[https://www.protocols.io/groups/hca]で公開されている。<br />
通常のscRNAseqは、ポリアデニル化されたmRNAを検出しているが、MATQ-seq（multiple annealing and dC-tailing-based quantitative single-cell RNA-seq）を用いると、ポリアデニル化されていないRNAの検出も可能である<ref><pubmed> 28092691</pubmed></ref>。更に、RNAを分析するscRNAseqではないが、遺伝子発現との関係が想定される[[オープンクロマチン]]領域を[[トランスポゾン]]を用いることで個々の細胞レベルで選択的に検出するsingle cell ATAC-seq (Assay for Transposase-Accessible Chromatin)やsnATAC-seq <ref><pubmed>26083756</pubmed></ref>, <ref><pubmed>29434377</pubmed></ref><ref><pubmed>25953818</pubmed></ref>, single cell THS-seq (transposome hypersensitive-site) <ref><pubmed>29227469</pubmed></ref>、や[[DNAメチル化]]領域を観察するsnmC-seqのような方法も利用されている<ref><pubmed>28798132</pubmed></ref><ref><pubmed>30237449</pubmed></ref>。<br />
<br />
<br />
===scRNAseqデータの前処理===<br />
10x Genomics社のChromium、Illumina社のNGSを利用した場合、Cell Rangerのmkrefコマンド(Linux上で作動, [https://support.10xgenomics.com/single-cell-gene-expression/software/pipelines/latest/using/tutorial_mr])により、各生物種ごとのレファレンス配列リスト（[https://www.ncbi.nlm.nih.gov/grc]）、EggNOG ([http://eggnogdb.embl.de])などを参考にしながら、細胞とトランスクリプトームの対応マトリックスを作製する。マウスやヒトでは既製のものを利用できる。その後のデータの処理についても、10x Genomics社がソフトウェアLoupeを提供している。しかしながら、その後のダウンストリーム解析を考慮して、[[R]], [[Python]], MATLABなどのデータ解析のための汎用プログラミング言語やコードで扱えるオブジェクトに変換するのが通常である。ここでは、scRNAseqデータ解析のために最もよく利用されているRを用いたパッケージ「Seurat」<ref><pubmed> 29608179 </pubmed></ref> <ref><pubmed> 31178118 </pubmed></ref>を中心に紹介したい。また、その一部はUniversity of WashingtonのCole Trapnell研究室で開発されてきたmonocle3でも可能である（[https://cole-trapnell-lab.github.io/monocle3/]）。Pythonを利用したものでは、ドイツ・ミュンヘンInstitute of Computational Biologyの Fabian Theisらが開発しているScanpyが有名である<ref><pubmed> 29409532</pubmed></ref>。<br />
<br />
New York UniversityのRahul Satija研究室が開発しているSeurat（画家スーラに由来）は、scRNAseqデータ解析のために広く利用されているRパッケージであり、2020年秋現在、Seurat4のβバージョンが公開されている。論文の正式発表前から、サポート情報提供やコード修正なども頻繁に行っており、Satija研究室のウェッブサイト（ [http://satijalab.org/Seurat]）、Github([https://github.com/satijalab/Seurat])、更にTwitterアカウント（@satijalab）などで最新情報を得ることできる。<br />
<br />
最初に行うのは、scRNAseqデータの品質管理である。ここでは、質の低い細胞のデータ（壊れた細胞では、転写産物の種類が少なくミトコンドリア由来の転写産物が多い）を取り除く。また、複数の試料を組み合わせる場合には、バッチごとの違いについて検討する<ref><pubmed>29608177</pubmed></ref><ref><pubmed> 28045081<br />
</pubmed></ref>。現実には、実験ごとのバッチの違いによる影響（Batch effect）がscRNAseqの最大の問題であると示されてきており、実験デザインを工夫する必要がある<ref><pubmed>29121214</pubmed></ref>。<br />
<br />
また、Dropletを使用するscRNAseqでしばしば問題になるのが、Dropletに２つ以上の細胞が封じ込められ、それらが同一のCell barcodeを持ってしまうアーティファクトである。通常「Doublet」「Multilet」と呼ばれるこの問題はダウンストリーム解析を混乱させるので、細胞単離の段階から注意する必要があるが、scRNAseqデータ取得後にもデータ処理で検討することは可能である<ref><pubmed>30954476</pubmed></ref><ref><pubmed>30954475</pubmed></ref> <ref><pubmed>31693907</pubmed></ref><ref><pubmed>32592658</pubmed></ref> <ref><pubmed>29227470</pubmed></ref><ref><pubmed>31836005</pubmed></ref><ref><pubmed>31856883</pubmed></ref><ref><pubmed>30567574</pubmed></ref> <ref><pubmed>31266958</pubmed></ref> [https://doi.org/10.1101/2019.12.17.879304][https://doi.org/10.1101/699637]。なお、この手法を利用することで、バッチ効果を抑えるために、異なるバーコードを持つ複数の試料を混ぜて一つの試料として扱い、計算機的に再び分離、解析するdemultiplexingが注目されている<ref><pubmed>32483174</pubmed></ref>。<br />
<br />
scRNAseqデータのもうひとつのノイズは、ある遺伝子の発現が低いために、本来同じタイプの細胞であっても、その遺伝子の発現が全く見られない「Dropout」と呼ばれる現象であり解析に影響を与えるので、これについても検討が必要である<ref><pubmed> 24056876<br />
</pubmed></ref><ref><pubmed>32127540</pubmed></ref>。<br />
<br />
このようなノーマライゼーションの過程を経て<ref><pubmed>28504683</pubmed></ref>、scRNAseqのデータ解析において、最初に行うのが、[[次元圧縮]] (dimensionality reduction)である<ref><pubmed>30617341</pubmed></ref><ref><pubmed>31780648</pubmed></ref>。PCA (Principal component analysis, 主成分分析)、UMAP（Uniform Manifold Approximation and Projection, 均一マニフォールド近似と投影）、Diffusion maps<ref><pubmed> 26002886<br />
</pubmed></ref>, tSNE(t-distributed Stochastic Neighbor Embedding , t分布型確率的近傍埋込み)などの手法が用いられる。 特に、tSNE[http://www.jmlr.org/papers/v9/vandermaaten08a.html]とUMAP[https://arxiv.org/abs/1802.03426]は、高次元データを低次元の点の集合として可視化することで、それぞれの細胞の持つトランスクリプトームの類似度についての直観的な表示が可能でありしばしば用いられる（図３）。tSNEよりUMAPの方が迅速に類似集団間の関係が明確になるので、最近はUMAPを利用することが多くなってきている。次に、[[Louvainアルゴリズム]]などでクラスタリング（コミュニティ分割）を行いグラフ上に表示できる（図３の色分け）。こうして、違ったタイプの細胞の集合が別のクラスターとして表示される。<br />
[[ファイル:scFig3.jpg|サムネイル|250px|'''図３．tSNEとUMAPによる同じデータの可視化'''<br>ニワトリ網膜の視細胞のデータを用いて作製[https://doi.org/10.1101/2020.10.09.333633<br />
}。]]<br />
<br />
==ダウンストリーム解析==<br />
===細胞クラスターの解釈とマーカー遺伝子候補の発見===<br />
scRNAseqデータから得られる生物学的知見には、内在的に存在する細胞の種類、外部刺激や環境で変化した細胞の状態、そして種類や変化により特徴的に発現するマーカー遺伝子候補の発見がある<ref><pubmed>27824854</pubmed></ref><ref><pubmed>32033589</pubmed></ref><br />
。クラスタリングにより、異なった細胞集団の存在が認識されると、それぞれのクラスターに特徴的に発現している遺伝子を具体的に探索し、細胞集団の持つバイオマーカーによって、そのクラスターの同定が可能になる。例えば、既に神経細胞とグリア細胞に特異的に発現する典型的マーカーはよく知られており、それぞれのクラスターの識別は容易である。更に、神経細胞のタイプを区別できるマーカーや、外部刺激によって遺伝子発現が変化した神経細胞の状態は、In situ hybridizationや免疫組織化学などにより確認できる。このようなクラスターごとに発現が異なる遺伝子（差次的発現遺伝子）を見つけるためには（Differential expression analysis, DE analysis）、SeuratのFindMarkersコマンド中でも利用可能である専用コード（MAST <ref><pubmed>26653891</pubmed></ref>、DESeq2 <ref><pubmed>25516281</pubmed></ref>など）を用いることができる。scRNAseqの解析に必要なコードは、scRNA-tools [https://www.scrna-tools.org], Awesome single cell [https://github.com/seandavi/awesome-single-cell], Bioconductor[https://www.bioconductor.org]などで紹介されており、ほとんどがダウンロード可能である。また、最新の情報については、bioRxivなどのプレプリントサーバで公開されていることが多く、scRNAseqのデータ（下記参考）とともに、オープンサイエンス実践の好例となっている。細胞ごとの差次的発現遺伝子の可視化には、ドットプロット（dot plot）、ヴァイオリンプロット（violin plot）、リッジプロット（Ridge plot, joy plot）、UMAPなどの次元圧縮図に重ねるFeatureプロット（feature plot）などが、目的に応じて頻繁に用いられる（図４）。<br />
[[ファイル:scFig4.jpg|サムネイル|300px|'''図４．scRNAseqデータの可視化の例 '''<br>A. ドットプロット。B.ヴァイオリンプロット。C. リッジプロット。D. UMAPと重ねたFeatureプロット。ニワトリ網膜の視細胞のデータを用いて作製[https://doi.org/10.1101/2020.10.09.333633<br />
]。]]<br />
<br />
===偽時系列解析、遺伝子制御ネットワーク、パスウェイ解析===<br />
実験的なノイズとは別に生物学的に意味のある遺伝子発現の変動には、位置情報、[[細胞周期]]、[[概日リズム]]、発現変動が大きい破裂型プロモーターの作動などの理由で 変動が見られるものもある<ref><pubmed> 31217225 </pubmed></ref><ref><pubmed> 26000846</pubmed></ref>。特に、刺激・薬剤処理やさまざまな病態の進行や治療に伴う細胞の変化、発生途上の細胞系譜や細胞分化といった細胞の遷移状態の解析（[[軌道推定]]（Trajectory inference）；[[偽時系列解析]]Pseudo-time analysis ）には、scRNAseqデータを用いることが効果的である<ref><pubmed>29576429</pubmed></ref><ref><pubmed>28813177</pubmed></ref><ref><pubmed>29565398</pubmed></ref>。しばしば用いられるmonocle3 <ref><pubmed>30787437</pubmed></ref>[https://cole-trapnell-lab.github.io/monocle3/]など、多くのコードを収集、比較しているサイトがある [https://dynverse.org][https://github.com/agitter/single-cell-pseudotime]。RNA velocityといった転写産物のスプライシングの状態から細胞の分化状態を推定する方法もある<ref><pubmed>30089906</pubmed></ref>。しかし、これらの方法は、あくまで発生途上の[[細胞系譜]]や細胞分化の推定に過ぎない。細胞系譜を更に確実に観察しつつ、scRNAseqを行うことで、細胞タイプの系統関係を調べる方法として、CRISPR-Cas9を用いた[[ゲノム編集]]による記録法を導入したscGESTALT<ref><pubmed>29608178</pubmed></ref>、ScarTrace<ref><pubmed>29590089</pubmed></ref> 、LINNAEUS<ref><pubmed>29644996</pubmed></ref>、あるいはアデノシンデアミナーゼでRNA編集を行いタイムスタンプを入れる方法<ref><pubmed>33077959</pubmed></ref>がある。<br />
<br />
また細胞分化や変動に伴う特徴的な遺伝子発現をscRNAseqで観察することは、遺伝子制御ネットワーク（例、SCENIC<ref><pubmed>28991892</pubmed></ref>, [https://github.com/aertslab/SCENIC]）や[[代謝経路]]や[[シグナル伝達系]]のための[[パスウェイ解析]](例、Metascape<ref><pubmed>30944313</pubmed></ref>, [http://metascape.org])を理解するシステム生物学的な研究として有用である。更に、scRNAseqで得られた結果をもとに、細胞間相互作用の理解を深めるのを目的とするCellPhoneDB<ref><pubmed>32103204</pubmed></ref>[https://github.com/Teichlab/cellphonedb]、NicheNet<ref><pubmed>3181926</pubmed></ref>, SVCA<ref><pubmed>31577949</pubmed></ref>などがある。特に、Perturb-seq<ref><pubmed>27984732</pubmed></ref> やその変法<ref><pubmed> 32231336</pubmed></ref>は、CRISPRライブラリーによるゲノム編集を施した細胞をscRNAseqで解析することで、ゲノム編集で破壊された遺伝子の機能や遺伝子間の相互作用の理解を可能にしている後述するマルチモーダルなscRNAseqの１つであり、注目されている。<br />
<br />
==scRNAseqの神経科学研究への適用==<br />
===神経系細胞ビッグデータとしてのscRNAseq===<br />
様々な神経・精神疾患について理解しその診断や治療に役立てるためには、神経細胞、[[グリア細胞]]を中心にした神経系にある細胞の種類や状態を識別し、それぞれの細胞における分子的な変化を観察することが重要である <ref><pubmed>28775344</pubmed></ref><ref><pubmed>29738987</pubmed></ref>。本本項目で解説してきたscRNAseq技術は、神経系に見られるそれぞれの細胞のトランスクリプトームについて[[ビッグデータ]]を提供することで、この細胞の種類や状態の識別に新たな根拠を与えつつある。近年、中枢神経系の[[アストロサイト]]、[[オリゴデンドロサイト]]、ミクログリアといったグリア細胞も均一ではなく、内在的な多様性や外部因子による状態の変動が報告されてきている。神経細胞は、著しく多様であり、この多様性が神経系を特徴づけており、その多彩で複雑な機能の発現に必須である。従来の神経科学では、神経細胞の多様性は、それぞれの神経細胞の解剖学的な位置、発現している分子、電気生理学、結合性、形態、神経伝達物質、神経伝達物質受容体とシグナル伝達によって識別されてきている。こうした神経細胞の多様性を便宜的に記述するのに、タイプ（type）、クラス（class）、サブクラス（subclass）、サブタイプ（subtype） というような用語が用いられてきた。しかし、ここでは混乱を防ぐため、Masland（2004）<ref><pubmed>15242626</pubmed></ref>が提唱し、広く受けいれられている「クラス」と「タイプ」という単語を用いることとする。タイプは、これ以上分類することができないとされる階層であり、共通性を持つタイプの集団がクラスである。例えば、大脳皮質の錐体細胞、網膜神経節細胞といった大雑把な区分はクラスである。大脳皮質の錐体細胞というクラスは、層や領野によって異なるタイプ、網膜神経節細胞には視覚情報に対して応答が異なるタイプが存在する。scRNAseqは、「タイプ」の理解に新たな視点を提供している。<br />
<br />
===神経系へのscRNAseqの適用===<br />
scRNAseqの神経系での利用については、次々と新しい論文やプレプリントが発表されており、ここではscRNAseqで得られてきた情報の典型例を紹介することにとどめる。<br />
<br />
[[大脳皮質]]には、[[錐体細胞]]や[[非錐体細胞]]などの神経細胞や様々なグリア細胞などが見られ、古くから神経細胞タイプの識別が行われてきた。初期のscRNAseq技術でも、マウス皮質の小規模な細胞数を分類した研究で、これまで知られていた主要な神経細胞タイプとは違うタイプが見つかりその有効性が示された<ref><pubmed>25700174</pubmed></ref>。その後のDroplet使用の3’エンドリード法を利用した多数の細胞数の解析で、更に多数の神経細胞のタイプが見つかっている<ref><pubmed>32839617</pubmed></ref><ref><pubmed>28846088</pubmed></ref><ref><pubmed>30096299</pubmed></ref><ref><pubmed>30096314</pubmed></ref><ref><pubmed>30382198</pubmed></ref><ref><pubmed>29320739</pubmed></ref><ref><pubmed>28846088</pubmed></ref>[https://doi.org/10.1101/2020.03.14.991018][https://doi.org/10.1101/2020.06.04.105700] [https://doi.org/10.1101/2020.07.02.184051]。特に、GABA作動性介在神経細胞タイプの多様性とその発生<ref><pubmed>28942923</pubmed></ref><ref><pubmed>28134272</pubmed></ref><ref><pubmed>29472441</pubmed></ref><ref><pubmed>29513653</pubmed></ref>についての情報は重要であろう。また、初期の発生過程<ref><pubmed>26940868</pubmed></ref><ref><pubmed>30485812</pubmed></ref><ref><pubmed>31073041</pubmed></ref><ref><pubmed>30635555</pubmed></ref><ref><pubmed>30625322</pubmed></ref>、老化<ref><pubmed>31551601</pubmed></ref><の理解が、scRNASeq技術を利用することで進んでいる。更に、[[神経活動]]によって変化するトランスクリプトームの変化も細胞ごとに調査され興味深い<ref><pubmed>29230054</pubmed></ref> 。 ヒトを含めた霊長類の大脳についても発達段階を含めてscRNAseqが適用されてきている<ref><pubmed>26060301</pubmed></ref><ref><pubmed>27339989</pubmed></ref><ref><pubmed>29539641</pubmed></ref><ref><pubmed>29217575</pubmed></ref><ref><pubmed>28846088</pubmed></ref><ref><pubmed>29227469</pubmed></ref><ref><pubmed>31303374</pubmed></ref><ref><pubmed>29867213</pubmed></ref><ref><pubmed>31435019</pubmed></ref><ref><pubmed>32424074</pubmed></ref> [https://doi.org/10.1101/709501][https://doi.org/10.1101/2020.03.31.016972][https://doi.org/10.1101/2020.04.23.056390]。ヒトや霊長類に特徴的とされる[[島]]のvon Economo神経細胞（紡錘細胞）のような希少な神経細胞のscRNAseqにも成功している<ref><pubmed>32127543</pubmed></ref>。<br />
<br />
[[海馬]]<ref><pubmed>29241552</pubmed></ref><ref><pubmed>29912866</pubmed></ref><ref><pubmed>29335606</pubmed></ref><ref><pubmed>31942070</pubmed></ref>では、これまでの研究で記載されてきた神経細胞のタイプの存在が確認され、更に新規のタイプが見つかった。中枢神経系では、その他、[[外側膝状体]]<ref><pubmed>29343640</pubmed></ref>、[[大脳基底核]](足底核)<ref><pubmed>28384468</pubmed></ref> 、[[視床下部]]<ref><pubmed>28166221</pubmed></ref><ref><pubmed>28355573</pubmed></ref> <ref><pubmed>27991900</pubmed></ref><ref><pubmed>30385464</pubmed></ref> <ref><pubmed>31249056</pubmed></ref><ref><pubmed>30858605</pubmed></ref>、[[線条体]]<ref><pubmed>27425622</pubmed></ref><ref><pubmed>30134177</pubmed></ref><ref><pubmed>31875543</pubmed></ref>、[[中脳]]<ref><pubmed>27716510</pubmed></ref><ref><pubmed>29499164</pubmed></ref> <ref><pubmed>30718509</pubmed></ref> 、[[手綱]]<ref><pubmed>29576475</pubmed></ref>、発生中の[[間脳]]<ref><pubmed>30872278</pubmed></ref> 、さらに[[小脳]]<ref><pubmed>30220501</pubmed></ref><ref><pubmed>30735127</pubmed></ref><ref><pubmed>30690467</pubmed></ref>などの結果が得られている。マウスの小脳においては、分子層にこれまでの星状細胞、バスケット細胞というカテゴリーとは違ったギャップジャンクションに特徴を持つ２種類の神経細胞があることが示唆されている[https://doi.org/10.1101/2020.03.04.976407]。<br />
<br />
脳の外部では、[[運動神経]][https://doi.org/10.1101/2020.03.16.992958]、[[感覚神経]]<ref><pubmed>25420068</pubmed></ref><ref><pubmed>26691752</pubmed></ref>、[[らせん神経節]]<ref><pubmed>30078709</pubmed></ref><ref><pubmed>30209249</pubmed></ref> 、[[臭覚神経]]<ref><pubmed>26541607</pubmed></ref> <ref><pubmed>32059767</pubmed></ref>、[[腸神経系]] <ref><pubmed>29483303</pubmed></ref>[https://doi.org/10.1101/2020.03.02.955757] 、[[網膜]]<ref><pubmed>27565351</pubmed></ref><ref><pubmed>29909983</pubmed></ref><ref><pubmed>30018341</pubmed></ref><ref><pubmed>31260032</pubmed></ref><ref><pubmed>31128945</pubmed></ref><ref><pubmed>30712875</pubmed></ref><ref><pubmed>30548510</pubmed></ref><ref><pubmed>31075224</pubmed></ref><ref><pubmed>31399471</pubmed></ref><ref><pubmed>31848347</pubmed></ref><ref><pubmed>31673015</pubmed></ref><ref><pubmed>31653841</pubmed></ref><ref><pubmed>31784286</pubmed></ref>[https://doi.org/10.1101/2020.02.26.966093][https://doi.org/10.1101/779694][https://www.biorxiv.org/content/10.1101/617555][A]でのscRNAseqデータがある。また[[iPS細胞]]や[[ES細胞]]由来の神経組織[[オルガノイド]]に含まれる神経細胞タイプを知る上でも利用されている<ref><pubmed>28094016</pubmed></ref><ref><pubmed>28279351</pubmed></ref><ref><pubmed>31168097</pubmed></ref><ref><pubmed>31996853</pubmed></ref><ref><pubmed>31968264</pubmed></ref><ref><pubmed><ref><pubmed>32221280</pubmed></ref></pubmed></ref>。<br />
<br />
===神経細胞以外の細胞===<br />
[[上衣細胞]]<ref><pubmed>29727663</pubmed></ref>は、[[神経幹細胞]]としての役割が示唆されてきたが、scRNAseqによる解析ではその可能性が支持されなかった。グリア細胞では、[[ラジアルグリア]]<ref><pubmed>26406371</pubmed></ref><ref><pubmed>25734491</pubmed></ref><ref><pubmed>29281841</pubmed></ref><ref><pubmed>29217575</pubmed></ref><ref><pubmed>29539641</pubmed></ref>[A]、アストロサイト<ref><pubmed>32139688</pubmed></ref><ref><pubmed>32203496</pubmed></ref>[https://doi.org/10.1101/2020.04.27.064881]に多様性があることが示唆されてきている。また、オリゴデンドロサイト<ref><pubmed>27284195</pubmed></ref><ref><pubmed>30078729</pubmed></ref><ref><pubmed>30257220</pubmed></ref><ref><pubmed>30747918</pubmed></ref><ref><pubmed>31958186</pubmed></ref>[https://doi.org/10.1101/2020.03.06.981373]については、これまで細胞生物学的に研究されてきた分化の過程がscRNAseqにより詳細に確認されている。ミクログリアは、神経系の発達、老化、損傷などに伴う重要なトランスクリプトームの変化がscRNAseqにより詳細に明らかになった<ref><pubmed>27338705</pubmed></ref><ref><pubmed>29020624</pubmed></ref><ref><pubmed>30206190</pubmed></ref><ref><pubmed>30471926</pubmed></ref><ref><pubmed>31209379</pubmed></ref><br />
<ref><pubmed>31835035</pubmed></ref>。また、[[CNS境界関連マクロファージ]](BAM) <ref><pubmed>31061494</pubmed></ref>や[[脳血管系]]<ref><pubmed>29443965</pubmed></ref>のscRNAseqも実施されている。<br />
<br />
===疾患===<br />
scRNAseqは、疾患の理解にも有用である。scRNAseqでは、疾患に伴う遺伝子発現の変化を細胞タイプごとに観察することができるので、bulk RNAseqでは埋もれていた遺伝子発現の変化や細胞ごとの変化を検出できるという長所がある。<br />
例えば、筋萎縮性側索硬化症<ref><pubmed>30948552</pubmed></ref>、多発性硬化症<ref><pubmed>30747918</pubmed></ref><ref><pubmed>30420755</pubmed></ref><ref><pubmed>32313246</pubmed></ref> <br />
、アルツハイマー病やそのモデル動物<ref><pubmed>31042697</pubmed></ref><ref><pubmed>31399126</pubmed></ref><ref><pubmed>29020624</pubmed></ref><br />
[https://doi.org/10.1101/628347]<ref><pubmed>28602351</pubmed></ref><ref><pubmed>32341542</pubmed></ref>、統合失調症<ref><pubmed>29785013</pubmed></ref><ref><pubmed>32203495</pubmed></ref>、自閉症やレット症候群<ref><pubmed>31097668</pubmed></ref><ref><pubmed>30455458</pubmed></ref>、シャルコー・マリー・トゥース病<ref><pubmed>29888333</pubmed></ref>、ダウン症[https://www.biorxiv.org/content/10.1101/2020.01.01.892398v1]、パーキンソン病<ref><pubmed>30503143</pubmed></ref> <ref><pubmed>32826893</pubmed></ref>、がん<ref><pubmed>31327527</pubmed></ref><ref><pubmed>28360267</pubmed></ref>などに適用されている。<br />
<br />
==scRNAseqの展望==<br />
===神経系の多様性と進化===<br />
NGSを用いることで、どんな生物種にも適用可能なscRNAseqは、既に多様な生物の神経系の細胞の理解、更には種間の相同性や差異の研究に利用されており、神経系の進化を細胞レベルで考察するのに有用であろう（例、センチュウ<ref><pubmed> 28818938 </pubmed></ref>、ショウジョウバエ <ref><pubmed>29909982</pubmed></ref><ref><pubmed>29149607</pubmed></ref><ref><pubmed>30703584</pubmed></ref><ref><pubmed>29909983</pubmed></ref><ref><pubmed>33125872</pubmed></ref>、カタユウレイボヤCiona intestinalis <ref><pubmed>30069052</pubmed></ref><ref><pubmed>30228204</pubmed></ref>、ゼブラフィッシュ<ref><pubmed>31018142</pubmed></ref><ref><pubmed>30929901</pubmed></ref>、アカミミガメTrachemys scripta elegans、トカゲPogona vitticeps, pv<ref><pubmed>29724907</pubmed></ref>、ニワトリ[https://doi.org/10.1101/2020.10.09.333633]、霊長類<ref><pubmed>30730291</pubmed></ref><ref><pubmed>31619793</pubmed></ref>[https://doi.org/10.1101/2020.03.31.016972]）。ただ、遺伝子やトランスクリプトームの研究が進んでいる生物種では比較的容易であるが、遺伝子のアノテーションが十分でない生物種を用いる場合、scRNAseqのデータ解析は困難を伴う。また種を超えた細胞タイプの相同性の理解には様々な工夫が必要である<ref><pubmed>31552245</pubmed></ref><ref><pubmed>30712875</pubmed></ref>[https://doi.org/10.1101/2020.03.31.016972]。<br />
<br />
===データベースと統合===<br />
獲得されたscRNAseqのデータは様々な目的で利用できるので、データベース化し利用できるようにする必要がある。神経系のトランスクリプトーム一般のデータベースが多数公開されており<ref><pubmed>29437890</pubmed></ref>、scRNAseqのデータも基本的にNCBIのGene Expression Omnibus[https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/]に登録されている。また、オープンサイエンス推進のためにcommon coordinate framework (CCF) やcentral annotation platform (CAP)という概念のもと、特にscRNAseqを意識したものとして、米国のBRAIN Initiative Cell Census Consortium<ref><pubmed>29096072</pubmed></ref> 、Human Cell Atlas ProjectのHuman Cell Atlas Data Portal [https://data.humancellatlas.org]、そのマウス版であるTabula Muris <ref><pubmed>30283141</pubmed></ref>[https://genome.ucsc.edu/cgi-bin/hgTrackUi?db=mm10&g=tabulaMuris]やSten Linnarssonラボのマウス脳発生データベース[http://mousebrain.org]、アレン脳研究所のAllen Brain Atlas [https://portal.brain-map.org]、ブロード研究所のSingle Cell Portal [https://singlecell.broadinstitute.org/]などのデータベースが稼働している。また、異なった方法や実験で得られたscRNAseqのデータや後述のマルチモーダルなシングルセルオミクスのデータを体系的に比較することも重要であり、CCA (Canonical correlation analysis)<ref><pubmed>29608179</pubmed></ref>, Seurat 3.0以降に組み込まれたMMN (Mutual Nearest Neighbors)、LIGER<ref><pubmed>31178122</pubmed></ref> 、Harmony<ref><pubmed>31740819</pubmed></ref> 、MetaNeighber<ref><pubmed>29491377</pubmed></ref>、Conos<ref><pubmed>31308548</pubmed></ref>のようなアルゴリズムが開発され、後述のマルチモーダルなシングルセルオミクスを組み込んだ統合サイトもでき始めている（[https://biccn.org]）。<br />
<br />
===空間トランスクリプトミクス===<br />
多数の細胞を扱うscRNAseqの弱点は、組織から細胞や細胞核を解離する必要があるので、その細胞が存在していた解剖学的あるいは空間的な位置の情報を消去してしまうということである。組織切片におけるタンパク質などの分布は免疫組織化学、mRNAの分布はin situ hybridizationで検出することができるが、数多くのmRNAの分布を情報処理技術と組み合わせ一気に同定する方法がscRNAseqと同様に開発されてきている（Slide-seq<ref><pubmed>30923225</pubmed></ref>[https://doi.org/10.1101/2020.03.12.989806]、HDST<ref><pubmed>31501547</pubmed></ref>、Expansion sequencing[http://doi.org/10.1101/2020.05.13.094268]など<ref><pubmed>27365449</pubmed></ref>, <ref><pubmed>31932730</pubmed></ref> <ref><pubmed>30948552</pubmed></ref>）、更に10x Genomics社が市販するVisiumなどがある。現状では、大きな組織の空間トランスクリプトミクスは、空間解像度は限定されており、技術普及の観点からも課題が多い。しかし、そのデータを解析するためのアルゴリズム<ref><pubmed>29553578</pubmed></ref><ref><pubmed>29553579</pubmed></ref><ref><pubmed>32350282</pubmed></ref> [https://doi.org/10.1101/757096][ https://doi.org/10.1101/701680] [https://doi.org/10.1101/431957]、<br />
更にMerFish <ref><pubmed>25858977</pubmed></ref>、corrFISH<ref><pubmed>27271198</pubmed></ref>のように、subcellularレベルで多数のmRNAを検出する方法が多数開発されてきており（文献：<ref><pubmed>25549890</pubmed></ref> osmFISH<ref><pubmed>30377364</pubmed></ref> 30377364、STARmap (spatially-resolved transcript amplicon readout mapping) <ref><pubmed>29930089</pubmed></ref>、seqFISH+<ref><pubmed>27764670</pubmed></ref>、pciSeq(probabilistic cell typing by in situ sequencing)[https://doi.org/10.1101/431957]、DSP(Digital Spatial Profiling) <ref><pubmed>32393914</pubmed></ref>）<br />
、scRNAseqと組み合わせることで、その弱点を補う空間トランスクリプトミクスにも利用され始め<ref><pubmed>30385464</pubmed></ref>[https://doi.org/10.1101/2020.06.04.105700]、今後の発展が期待される分野である。<br />
<br />
<br />
===マルチモーダルなシングルセルオミクス===<br />
同一の細胞からscRNAseqの情報だけでなく、ゲノム配列、ATAC-seqなどによるエピゲノム解析、少数のタンパク質、あるいはプロテオームなどを、同時に記録するマルチモーダルなオミクスが注目されている<ref><pubmed>31907462</pubmed></ref><ref><pubmed>30696980</pubmed></ref>。2019年には、Nature Methodsの「Methods of the Year」に選ばれており、現状については、その特集号などを参考にされたい。例えば、細胞表面分子に対する抗体にDNAを付加することで、マーカーを発現する細胞のトランスクリプトームを観察するCITE-seq<ref><pubmed>28759029</pubmed></ref>、 REAP-seq<ref><pubmed>28854175</pubmed></ref>は既知の細胞表面マーカーの発現とscRNAseqが同時に観察できるマルチモーダルなオミクスである。<br />
<br />
マルチモーダルなシングルセルオミクスとして、神経科学分野で注目されるのは、scRNAseqをパッチクランプによる電気生理学的情報と組み合わせたPatch-seq<ref><pubmed>26689544</pubmed></ref> <ref><pubmed>26689543</pubmed></ref>である。また、ゲノムDNAとscRNAseqを同時に観察することによって、近年、精神疾患の観点から注目されている発生途中で生じる遺伝子変異を研究するPRDD-seqは今後の展開が注目される[https://doi.org/10.1101/2020.04.19.046904]。最後に、BARseq (barcoded anatomy resolved by sequencing) <ref><pubmed>31626774</pubmed></ref>、CONNECTID[https://doi.org/10.1101/378760]、Epi-Retro-seq[https://doi.org/10.1101/2020.04.01.019612]のような方法は、[[コネクトーム]]（神経細胞の結合性）と遺伝子発現を記録できるオミクスの新たな方向として興味深い。<br />
<br />
<br />
== 関連項目 ==<br />
*[[ゲノムワイド関連解析 ]]<br />
*[[ディファレンシャルディスプレイ ]]<br />
*[[In situハイブリダイゼーション法 ]]<br />
*[[免疫組織化学法]]<br />
*[[エピジェネティクス]]<br />
== 参考文献 ==<br />
<references /></div>
Masahitoyamagata
https://bsd.neuroinf.jp/w/index.php?title=%E3%82%B7%E3%83%B3%E3%82%B0%E3%83%AB%E3%82%BB%E3%83%ABRNA%E3%82%B7%E3%83%BC%E3%82%B1%E3%83%B3%E3%82%B7%E3%83%B3%E3%82%B0&diff=45072
シングルセルRNAシーケンシング
2020-11-13T15:52:37Z
<p>Masahitoyamagata: </p>
<hr />
<div><div align="right"> <br />
<font size="+1">[http://researchmap.jp/yamagatm 山形方人]</font><br><br />
''Harvard University''<br><br />
DOI：<selfdoi /> 原稿受付日：年月日 原稿完成日：年月日<br><br />
担当編集委員：<br><br />
</div><br />
<br />
英：single cell RNA sequencing, scRNAseq<br />
{{box|text=<br />
シングルセルRNAシーケンシング(single cell RNA sequencing, 以下scRNAseq)は、[[次世代シーケンシング]] （next generation sequencing、以下NGS）技術を使用して個々の細胞が発現しているmRNA全体、つまり[[トランスクリプトーム]]を質的、量的に網羅的に調べ、細胞ごとの違いを高解像度で検出し、数理的に解析する分子生物学的、コンピュータ生物学的技術である。組織内にある細胞の分類を行うことで、未知あるいは希少な細胞の種類や状態の検出に有効である。また、刺激、発生など細胞の状況に応じて、個々の細胞のトランスクリプトームの情報を得ることで、細胞系譜などの疑時系列解析や疾患のバイオマーカーの研究も可能である。特に多様な神経細胞が存在する神経系では、この方法により、神経細胞や非神経細胞の分類や状態についての知見が深まり、新しい細胞マーカーや機能遺伝子の同定などが系統的かつ網羅的に行われるようになった。空間的情報、エピゲノム情報、タンパク質情報などを取り入れながら、細胞タイプ間の発現変化を探索するマルチモーダル技術の発展も著しい。<br />
}}<br />
<br />
==scRNA-seqとその開発史==<br />
===トランスクリプトーム===<br />
トランスクリプトーム（transcriptome）は、細胞中に存在する全ての転写産物（タンパク質をコードするmRNA、タンパク質をコードしない[[ノンコーディングRNA]]、[[マイクロRNA]]など）の総体である<ref><pubmed>19015660</pubmed></ref><ref><pubmed>31341269 </pubmed></ref>。トランスクリプトームは、[[ゲノム]]とは異なり、同一の個体でも、組織ごとに、更には発生段階や細胞外環境や刺激によって変化する。トランスクリプトームは、同質あるいは異質の多数の細胞集団（組織、培養細胞）からRNA抽出後、cDNAに変換し、それを1990年代に出現した[[DNAマイクロアレイ]]のように数多くの既知mRNAを識別する技術によって解析されるようになった。その後、NGSの利用により、希少mRNAやノンコーディングRNAを含めた未知の転写産物の高感度検出が可能になるとともに、[[スプライシング]]で成熟していく過程のmRNAなど、転写産物の種類だけでなく、転写産物の構造的差異（スプライシングバリアント、SNPs、変異など）の解析もできるようになった。加えて、ヒトやモデル実験生物（[[マウス]]、[[ゼブラフィッシュ]]、[[ショウジョウバエ]]、[[センチュウ]]など）だけでなく、多種多様な生物のトランスクリプトームの把握も可能になった。ここでは、このような多数の細胞集団、つまり個体や特定の組織全体（bulk RNAseq）ではなく、細胞1つの持つトランスクリプトームを解析する方法（scRNAseq）とそのscRNAseqデータを利用することで得られる情報について概説する。<br />
<br />
===scRNA-seqとその開発史===<br />
1つの細胞の持つ生体物質を解明し、定量しようとする試みは古くからあった。1960年代になると、フローサイトメトリーを利用した[[蛍光活性化セルソーティング]]（Fluorescence-activated cell sorting, FACS）が発明され、標識抗体などのプローブと組み合わせることで、多数の細胞集団の中で１つの細胞が持っている分子の種類や量についての断片的な研究が可能になり、この方法は現在でも汎用されている<ref><pubmed>22271369</pubmed></ref>。その後、[[免疫組織化学]]や[[in situ hybridization]]nなどにより、タンパク質やmRNAの種類や量が観察できるようになり、組織中に存在するそれぞれの細胞の同定などに活用されてきている。最近では、それぞれの細胞が持つ抗原分子を、異なった金属イオンで標識した抗体とフローサイトメトリーを組み合わせた方法で検出する[[マスサイトメトリー]]（CyTOFなど）も開発されてきている<ref><pubmed>27153492</pubmed></ref>。<br />
<br />
1つの細胞内にある全RNA（ribosomal RNAを含む）は細胞種にもよるが1-50pgである。そのうち、mRNAの占める割合は1-5%程度である<ref><pubmed>15239941</pubmed></ref>。この微量のmRNAをcDNAに変換してから大幅に増幅できる方法が発明されたことで、1つの細胞が発現するmRNAを高感度で検出できるようになった<ref><pubmed>1557406</pubmed></ref><ref><pubmed>7541630</pubmed></ref> 。例えば、1991年、Linda BuckとRichard Axelは、[[嗅覚受容体]]が[[Gタンパク質]]であると仮定し、個々の嗅覚細胞で特異的に観察されるGタンパク質mRNAを比較することで、嗅覚受容体の同定に成功した<ref><pubmed>1840504</pubmed></ref>。1995年になると、Catherine DulacとRichard Axelは、異なる[[鋤鼻神経細胞で特異的]]に発現する遺伝子を１つの細胞から作製したcDNAライブラリーを比較するディファレンシャル・スクリーニングを行うことで、[[フェロモン受容体]]を同定した<ref><pubmed>7585937</pubmed></ref>。同じ手法で異なる種類の神経細胞で発現している遺伝子も同定され<ref><pubmed>9778248</pubmed></ref><ref><pubmed>12230981</pubmed></ref>、１つの細胞の持つトランスクリプトームを比較するアプローチが神経細胞で特徴的に発現している遺伝子の同定に効果的なことを示した。<br />
<br />
一方で多くの種類のmRNAを１細胞レベルで一挙に観察するトランスクリプトームのための技術にはブレークスルーが待たれた。1つの問題は多種類のcDNAを簡便に識別することを可能にする方法の開発であった。これを可能にしたのが、[[PCR]]などのcDNA増幅法の改良とマイクロアレイの利用であった<ref><pubmed>12736331</pubmed></ref><ref><pubmed>16547197</pubmed></ref>。しかしながら、細胞ごとに高価なマイクロアレイを使用することは、多数の細胞のトランスクリプトームの観察には限界があった。2009年になると、これらの問題を解決できる可能性として、NGSを利用するscRNA-seqプロトコールがAzim Suraniのグループによって報告された<ref><pubmed>19349980</pubmed></ref>。しかしながら、この報告でもわずか8個の細胞の解析に留まっており、1つの細胞ごとに処理を行うという操作が必要で、多数の細胞についてのトランスクリプームを一挙に理解することはできなかった。また、塩基配列の違うcDNAごとにPCR効率に差がある結果生じる増幅バイアス、また3’末端側が選択的に補足されることなどの課題を残した。<br />
<br />
===scRNA-seqの現状===<br />
その後、5’末端側も含めた完全長cDNAを増幅するscRNA-seqのプロトコールが考案された。特に、SMART-seq（Switch mechanism at the 5' End of RNA Templates）<ref><pubmed>22820318</pubmed></ref>およびその改良されたプロトコールであるSMART-seq2<ref><pubmed>24056875</pubmed></ref> <ref><pubmed>24385147</pubmed></ref>の使用例が多い（既に、SMART-seq3という改良プロトコールもある<ref><pubmed>32518404</pubmed></ref>が、以下SMART-seqと呼ぶ）。また、類似法としてSTRT（single-cell tagged reverse transcription）<ref><pubmed>21543516</pubmed></ref>などがある。一方、MARS-seq（Massively parallel single-cell RNA-seq）<ref><pubmed>24531970 </pubmed></ref>、CEL-seq（Cell Expression by Linear amplification and Sequencing）<ref><pubmed>22939981</pubmed></ref>、CEL-seq2<ref><pubmed> 27121950 </pubmed></ref>では、[[T7 RNAポリメラーゼ]]による[[in vitro転写]]を用いることにより、PCRで顕著な増幅バイアスを減少させようとしている。<br />
増幅バイアス除去のアプローチとして特に重要なのは、2011年に発表された分子識別子（unique molecular identifiers: UMI）を持つcDNAを増幅させ、NGS後の情報処理を用いる方法である<ref><pubmed>22101854</pubmed></ref>。この方法では逆転写反応の際、ランダムなUMIをcDNA末端に付加した後、増幅反応、NGSを行い、cDNA配列とUMI配列の両方を読む。同一のUMIを持っていれば、逆転写時に同一のcDNA由来とカウントする。UMIをカウントすることで、増幅前のmRNAのコピー数を知ることができる<ref><pubmed>21543516</pubmed></ref><ref><pubmed>24363023</pubmed></ref><ref><pubmed>28192419</pubmed></ref> <ref><pubmed>29474909</pubmed></ref><ref><pubmed> 28818938 </pubmed></ref><ref><pubmed>29545511</pubmed></ref>。2013年には、このような１細胞のシーケンシング技術が、Nature Methods誌のMethod of the Year に選ばれた[https://www.nature.com/collections/mysbdwgfll]。<br />
<br />
これらの方法のうち、SMART-seqは、マイクロピペットによる捕獲、セルソーター、[[レーザー捕獲]]などを用いるマルチウェル法、あるいは半導体集積回路製作技術で作った流体集積回路を利用するFluidigm C1の装置[https://jp.fluidigm.com]と組み合わせることで利用される機会が多い<ref><pubmed>30405621</pubmed></ref>[https://doi.org/10.1101/742304]。SMART-seqプロトコールの特徴は、全長トランスクリプトームを得ることができることであり、mRNAのスプライシングバリアントなどのアイソフォーム、アリルごとの発現情報が得られるSNPs、変異の検出にも利用できる。また、それぞれ細胞ごとの反応を独立した場所で行うため、別の細胞の反応と混じる可能性がない。小型ウェルを用いるSeq-Wellも同様である<ref><pubmed>28192419</pubmed></ref>。これらの点が、次に説明するDropletを使用して3’末端のみを標的にしたscRNA-seqに比べた場合の長所であるが、その高コスト（1細胞あたり数十ドル）と処理可能な細胞数の少なさが短所である。<br />
<br />
===Droplet使用の3’エンドリード法===<br />
しかしながら、もっとも重要なscRNA-seqの方法論についての進歩は、2015年、Harvard Medical Schoolの独立した２つのグループが、inDrops<ref><pubmed>26000487</pubmed></ref>そしてDrop-seq<ref><pubmed>26000488 </pubmed></ref>という類似した2つの高スループットな方法を開発したことであろう（inDropsはT7RNAポリメラーゼ、Drop-seqはPCRで増幅）。これらの方法では、[[マイクロ流体力学]] (Microfluidics) 、 UMI（上述）と細胞ごとのCell Barcodeという2種類のDNAバーコーディング、そしてNGSと情報解析を利用している。そして、多く細胞のサンプル調製の自動化と容易さから、1つの細胞あたりに要するコストを大幅に低下させることに成功した（Drop-seqは発表時で、１細胞あたり約5セント）。つまり、細胞1つずつをマイクロ流体力学によるエマルジョン技術を利用した装置に流入させ、その１細胞を1つのDroplet（油中水滴）に自動的に閉じ込める。そのDroplet中には、DropletごとにCell barcode/UMIとしてユニークなDNAバーコードを持つゲルビーズ(Gel Beads in Emulsion, GEMs)が入っており、それを足場に3’末端のみを標的にしたcDNA合成反応を実施することで、同じ細胞に含まれていたmRNAが同じCell barcodeを持つcDNAとして合成され、そのmRNA/cDNAが由来した細胞を識別できるということを利用している（図１）。なお、DropSeqはコストが低いが、細胞の取得率と検出感度が低い弱点がある。inDropsはDropSeqより細胞取得率が高く、パラメータを調整することにより、低レベルで発現される遺伝子の検出にも有利であるとされる<ref><pubmed>30472192</pubmed></ref>。<br />
[http://www.youtube.com/watch?v=fHq9ewdYEWM]<br />
DropSeqのセットアップはDolomite Bio ([https://www.dolomite-bio.com])、inDropは1 Cellbio社から販売されている[https://1cell-bio.com]。しかし、特に重要なのは10x Genomics社が同様の原理を用いた「Chromium」と命名された機器と試薬のシステムを市販することで、多くの研究者が容易に利用できることになったことである<ref><pubmed>28091601<br />
</pubmed></ref>[https://www.10xgenomics.com/jp/]。Svenssonらによる最近のデータベース[https://doi.org/10.1101/742304], [http://www.nxn.se/single-cell-studies/gui]では、scRNA-seqを用いた論文で用いられた方法について調査しているが、この数年、10x Genomics社Chromiumを用いた論文が飛躍的に増加し、scRNA-seqの方法として一般的になりつつあることがわかる（現在、10x Genomics社とBioRad社の間で関連特許をめぐる係争がある。）。このシステムは市販であるので導入が容易であり、DropSeqやinDropsに比べ多くの転写産物の高感度検出が可能であるが、ランニングコストは高い<ref><pubmed>30472192</pubmed></ref>。なお、3’エンドリード法だけでなく、N末端側に位置する抗体の可変領域などの検出には5’エンドリード法が利用されることがある。<br />
[[ファイル:scFig1.jpg|サムネイル|250px|'''図1．Droplet使用の3’エンドリード法 '''<br>組織から解離させた細胞それぞれを、マイクロ流体力学を利用した装置で、バーコードプライマーが結合したゲルビーズとともにオイルドロップレットに封じ込める。mRNAを逆転写した後、PCRで増幅する。]]<br />
<br />
==scRNA-seqの実際==<br />
ここでは主流になっている10x Genomics社のChromiumなどのDropletを用いた方法とSMART-seqなどを用いた方法に共通する方法の実際について俯瞰する。scRNA-seqの利用には、4つのステップがある（図２）<ref><pubmed> 31217225</pubmed></ref><ref><pubmed>30089861</pubmed></ref>。１）個体や組織を採集し、そこから細胞あるいは細胞核を個別にすること。２）Droplet法やSMART-seqなどによる個々の細胞からのライブラリーの作製とNGS。３）前処理（preprocessing、得られた配列の整理）。４）ダウンストリーム解析（生物学的な情報を得るコンピューター生物学）。これらのうち、２）の段階については、上に記述したように市販の機器や試薬を利用する機会が多くなっているので、そのためのマニュアル等が参考になるはずである。<br />
[[ファイル:scFig2.jpg|サムネイル|250px|'''図２．scRNA-seqの実際のステップ '''<br>細胞の単離、ライブラリ作製とNGS、データの前処理から次元圧縮、ダウンストリーム解析。図の一部は2016 DBCLS TogoTV、あるいはSeuratを用いて10x Genomics社のPBMCデータ（[https://support.10xgenomics.com/single-cell-gene-expression/datasets]から執筆者が作製。]]<br />
<br />
===組織からの細胞、細胞核の分離===<br />
血液細胞のように浮遊した細胞ではない場合、物理的あるいは酵素処理などによって解離することで、生組織から状態の良いバラバラになった細胞を調製する必要がある。神経系組織の酵素処理には、パパインを用いる方法が広く用いられている。ここで、しばしば問題となるのが、酵素処理による短時間加温や機械的刺激で、発現量が変化する遺伝子が存在することである<ref><pubmed>27090946</pubmed></ref>。特に、脳の[[ミクログリア]]の解析には、低温下で組織をホモゲナイズするなどの工夫が必要であった<ref><pubmed>30471926</pubmed></ref>。また、このような現象を抑制するために、酵素処理時に転写阻害剤である[[アクチノマイシン]]で処理したり<ref><pubmed>29024657</pubmed></ref>、ヒマラヤ氷河から得られた細菌Bacillus licheniformisから得られた低温プロテアーゼを用いる方法も報告されている<ref><pubmed>28851704</pubmed></ref>。また、細胞解離後に、メタノールで固定しscRNA-seqに使用したり<ref><pubmed>28526029</pubmed></ref>、クロスリンカーを用いる方法もある<ref><pubmed>29391536</pubmed></ref>。<br />
<br />
単離した細胞は、そのまま10x GenomicsのChromiumのプラットフォームに導入することができるが、抗体や蛍光タンパク質レポーターなどを用いたFACS、[[パニング]]、MACS(磁気ビーズカラム)などによる特定のマーカーを細胞表面などに発現する細胞の選択的濃縮や除去を行う場合もある。更に、抗体に抗体表示バーコードDNAをカップリングさせるCITE-seq(Cellular Indexing of Transcriptomes and Epitopes by Sequencing) については、下記のマルチモーダルなオミクスの項目で述べる。<br />
<br />
なお、ヒト組織や希少生物などから生細胞を得ることは困難なことが多い。この場合、scRNA-seqの変法として、凍結した組織から、各細胞由来の核を調製し、核内のmRNAを分析するsnRNA-seq (single-nucleus RNA-seq)が利用されている。ただ、snRNA-seqでは、FACSなどによる特定細胞集団の分離が困難であることが多く、細胞質を持つ生細胞を利用した場合より検出できる遺伝子数が少なく同等な結果が必ずしも得られない<ref><pubmed>24248345</pubmed></ref><ref><pubmed>26890679</pubmed></ref> <ref><pubmed>27471252</pubmed></ref><ref><pubmed>28846088</pubmed></ref><<ref><pubmed>29220646</pubmed></ref><ref><pubmed>28846088</pubmed></ref><ref><pubmed>30586455</pubmed></ref><ref><pubmed>28729663</pubmed></ref><ref><pubmed>31728515</pubmed></ref><ref><pubmed>32341560</pubmed></ref> <ref><pubmed>32518403</pubmed></ref>。一方で、snRNA-seqでは、組織をそのまま凍結することから開始するので、上述したscRNA-seqの問題である酵素処理などを避けることができる。更に、核を用いることで、大きな細胞体はマイクロ流体力学の流路で詰まりやすいなど、細胞の形状に伴うバイアスを減らすことができるといったメリットもある。こうしたプロトコールの一部は、protocols.ioのHuman Cell Atlasのグループ[https://www.protocols.io/groups/hca]で公開されている。<br />
通常のscRNA-seqは、ポリアデニル化されたmRNAを検出しているが、MATQ-seq（multiple annealing and dC-tailing-based quantitative single-cell RNA-seq）を用いると、ポリアデニル化されていないRNAの検出も可能である<ref><pubmed> 28092691</pubmed></ref>。更に、RNAを分析するscRNA-seqではないが、遺伝子発現との関係が想定される[[オープンクロマチン]]領域を[[トランスポゾン]]を用いることで個々の細胞レベルで選択的に検出するsingle cell ATAC-seq (Assay for Transposase-Accessible Chromatin)やsnATAC-seq <ref><pubmed>26083756</pubmed></ref>, <ref><pubmed>29434377</pubmed></ref><ref><pubmed>25953818</pubmed></ref>, single cell THS-seq (transposome hypersensitive-site) <ref><pubmed>29227469</pubmed></ref>、や[[DNAメチル化]]領域を観察するsnmC-seqのような方法も利用されている<ref><pubmed>28798132</pubmed></ref><ref><pubmed>30237449</pubmed></ref>。<br />
<br />
<br />
===scRNA-seqデータの前処理===<br />
10x Genomics社のChromium、Illumina社のNGSを利用した場合、Cell Rangerのmkrefコマンド(Linux上で作動, https://support.10xgenomics.com/single-cell-gene-expression/software/pipelines/latest/using/tutorial_mr)を用いて、各生物種ごとのレファレンス配列リスト（[https://www.ncbi.nlm.nih.gov/grc]）を用いて、EggNOG ([http://eggnogdb.embl.de])などを参考にしながら、細胞とトランスクリプトームの対応マトリックスを作製する。マウスやヒトでは既製のものを利用できる。その後のデータの処理についても、10x Genomics社がソフトウェアLoupeを提供している。しかしながら、その後のダウンストリーム解析を考慮して、[[R言語]], [[Python]], MATLABなどのデータ解析のための汎用プログラミング言語やコードで扱えるオブジェクトに変換するのが通常である。ここでは、scRNA-seqデータ解析のために最もよく利用されているR言語を用いたパッケージ「Seurat」<ref><pubmed> 29608179 </pubmed></ref> <ref><pubmed> 31178118 </pubmed></ref>を中心に紹介したい。また、その一部はUniversity of WashingtonのCole Trapnell研究室で開発されてきたMonocle3でも可能である（[https://cole-trapnell-lab.github.io/monocle3/]）。Pythonを利用したものでは、ドイツ・ミュンヘンInstitute of Computational Biologyの Fabian Theisらが開発しているScanpyが有名である<ref><pubmed> 29409532</pubmed></ref>。<br />
<br />
New York UniversityのRahul Satija研究室が開発しているSeurat（画家スーラに由来）は、scRNA-seqデータ解析のために広く利用されているRパッケージであり、2020年秋現在、Seurat4のβバージョンが公開されている。論文の正式発表前から、サポート情報提供やコード修正なども頻繁に行っており、Satija研究室のウェッブサイト（ [http://satijalab.org/Seurat]）、Github([https://github.com/satijalab/Seurat])、更にTwitterアカウント（@satijalab）などで最新情報を得ることできる。<br />
<br />
最初に行うのは、scRNA-seqデータの品質管理である。ここでは、質の低い細胞のデータ（壊れた細胞では、転写産物の種類が少なくミトコンドリア由来の転写産物が多い）を取り除く。また、複数の試料を組み合わせる場合には、バッチごとの違いについて検討する<ref><pubmed>29608177</pubmed></ref><ref><pubmed> 28045081<br />
</pubmed></ref>。現実には、実験ごとのバッチの違いによる影響（Batch effect）がscRNA-seqの最大の問題であると示されてきており、実験デザインを工夫する必要がある<ref><pubmed>29121214</pubmed></ref>。また、Dropletを使用するscRNA-seqでしばしば問題になるのが、Dropletに２つ以上の細胞が封じ込められ、それらが同一の細胞バーコードを持ってしまうアーティファクトである。通常「Doublet」「Multilet」と呼ばれるこの問題はダウンストリーム解析を混乱させるので、細胞単離の段階から注意する必要があるが、scRNA-seqデータ取得後にもデータ処理で検討することは可能である<ref><pubmed>30954476</pubmed></ref><ref><pubmed>30954475</pubmed></ref> <ref><pubmed>31693907</pubmed></ref><ref><pubmed>32592658</pubmed></ref> <ref><pubmed>29227470</pubmed></ref><ref><pubmed>31836005</pubmed></ref><ref><pubmed>31856883</pubmed></ref><ref><pubmed>30567574</pubmed></ref> <ref><pubmed>31266958</pubmed></ref> [https://doi.org/10.1101/2019.12.17.879304][https://doi.org/10.1101/699637]。なお、この手法を利用することで、バッチ効果を抑えるために、異なるバーコードを持つ複数の試料を混ぜて一つの試料として扱い、計算機的に再び分離、解析するdemultiplexingが注目されている<ref><pubmed>32483174</pubmed></ref>。scRNA-seqデータのもうひとつのノイズは、ある遺伝子の発現が低いために、本来同じタイプの細胞であっても、その遺伝子の発現が全く見られない「Dropout」と呼ばれる現象であり解析に影響を与えるので、これについても検討が必要である<ref><pubmed> 24056876<br />
</pubmed></ref><ref><pubmed>32127540</pubmed></ref>。<br />
<br />
このようなノーマライゼーションの過程を経て<ref><pubmed>28504683</ref></pubmed>、scRNA-seqのデータ解析において、最初に行うのが、[[次元圧縮]] (dimensionality reduction)である<ref><pubmed>30617341</pubmed></ref><ref><pubmed>31780648</pubmed></ref>。PCA (Principal component analysis, 主成分分析)、UMAP（Uniform Manifold Approximation and Projection, 均一マニフォールド近似と投影）、Diffusion maps<ref><pubmed> 26002886<br />
</pubmed></ref>, tSNE(t-distributed Stochastic Neighbor Embedding , t分布型確率的近傍埋込み)などの手法が用いられる。 特に、tSNE[http://www.jmlr.org/papers/v9/vandermaaten08a.html]とUMAP[https://arxiv.org/abs/1802.03426]は、高次元データを低次元の点の集合として可視化することで、それぞれの細胞の持つトランスクリプトームの類似度についての直観的な表示が可能でありしばしば用いられる（図３）。tSNEよりUMAPの方が迅速に類似集団間の関係が明確になるので、最近はUMAPを利用することが多くなってきている。次に、[[Louvainアルゴリズム]]などでクラスタリング（コミュニティ分割）を行いグラフ上に表示できる（図３の色分け）。こうして、違ったタイプの細胞の集合が別のクラスターとして表示される。<br />
[[ファイル:scFig3.jpg|サムネイル|250px|'''図３．tSNEとUMAPによる同じデータの可視化'''<br>ニワトリ網膜の視細胞のデータを用いて作製[https://doi.org/10.1101/2020.10.09.333633<br />
}。]]<br />
<br />
==ダウンストリーム解析==<br />
===細胞クラスターの解釈とマーカー遺伝子候補の発見===<br />
scRNA-seqデータから得られる生物学的知見には、内在的に存在する細胞の種類、外部刺激や環境で変化した細胞の状態、そして種類や変化により特徴的に発現するマーカー遺伝子候補の発見がある<ref><pubmed>27824854</pubmed></ref><ref><pubmed>32033589</pubmed></ref><br />
。クラスタリングにより、異なった細胞集団の存在が認識されると、それぞれのクラスターに特徴的に発現している遺伝子を具体的に探索し、細胞集団の持つバイオマーカーによって、そのクラスターの同定が可能になる。例えば、既に神経細胞とグリア細胞に特異的に発現する典型的マーカーはよく知られており、それぞれのクラスターの識別は容易である。更に、神経細胞のタイプを区別できるマーカーや、外部刺激によって遺伝子発現が変化した神経細胞の状態は、In situ hybridizationや免疫組織化学などにより確認できる。このようなクラスターごとに発現が異なる遺伝子（差次的発現遺伝子）を見つけるためには（Differential expression analysis, DE analysis）、SeuratのFindMarkersコマンド中でも利用可能である専用コード（MAST <ref><pubmed>26653891</pubmed></ref>、DESeq2 <ref><pubmed>25516281</pubmed></ref>など）を用いることができる。scRNA-seqの解析に必要なコードは、scRNA-tools [https://www.scrna-tools.org], Awesome single cell [https://github.com/seandavi/awesome-single-cell], Bioconductor[https://www.bioconductor.org]などで紹介されており、ほとんどがダウンロード可能である。また、最新の情報については、bioRxivなどのプレプリントサーバで公開されていることが多く、scRNA-seqのデータ（下記参考）とともに、オープンサイエンス実践の好例となっている。細胞ごとの差次的発現遺伝子の可視化には、ドットプロット（dot plot）、ヴァイオリンプロット（violin plot）、リッジプロット（Ridge plot, joy plot）、UMAPなどの次元圧縮図に重ねるFeatureプロット（feature plot）などが頻繁に用いられる（図４）。<br />
[[ファイル:scFig4.jpg|サムネイル|250px|'''図4．scRNA-seqデータの可視化の例 '''<br>A. ドットプロット。B.ヴァイオリンプロット。C. リッジプロット。D. UMAPと重ねたFeatureプロット。ニワトリ網膜の視細胞のデータを用いて作製[https://doi.org/10.1101/2020.10.09.333633<br />
]。]]<br />
<br />
===偽時系列解析、遺伝子制御ネットワーク、パスウェイ解析===<br />
実験的なノイズとは別に生物学的に意味のある遺伝子発現の変動には、位置情報、[[細胞周期]]、[[概日リズム]]、発現変動が大きい破裂型プロモーターの作動などの理由で 変動が見られるものもある<ref><pubmed> 31217225 </pubmed></ref><ref><pubmed> 26000846</pubmed></ref>。特に、刺激・薬剤処理やさまざまな病態の進行や治療に伴う細胞の変化、発生途上の細胞系譜や細胞分化といった細胞の遷移状態の解析（[[軌道推定]]（Trajectory inference）；[[偽時系列解析]]Pseudo-time analysis ）には、scRNA-seqデータを用いることが効果的である<ref><pubmed>29576429</pubmed></ref><ref><pubmed>28813177</pubmed></ref><ref><pubmed>29565398</pubmed></ref>。しばしば用いられるmonocle3 <ref><pubmed>30787437</pubmed></ref>[https://cole-trapnell-lab.github.io/monocle3/]など、多くのコードを収集、比較しているサイトがある [https://dynverse.org][https://github.com/agitter/single-cell-pseudotime]。RNA velocityといった転写産物のスプライシングの状態から細胞の分化状態を推定する方法もある<ref><pubmed>30089906</pubmed></ref>。しかし、これらの方法は、あくまで発生途上の[[細胞系譜]]や細胞分化の推定に過ぎない。細胞系譜を更に確実に観察しつつ、scRNA-seqを行うことで、細胞タイプの系統関係を調べる方法として、CRISPR-Cas9を用いた[[ゲノム編集]]による記録法を導入したscGESTALT<ref><pubmed>29608178</pubmed></ref>、ScarTrace<ref><pubmed>29590089</pubmed></ref> 、LINNAEUS<ref><pubmed>29644996</pubmed></ref>、あるいはアデノシンデアミナーゼでRNA編集を行いタイムスタンプを入れる方法<ref><pubmed>33077959</pubmed></ref>がある。<br />
<br />
また細胞分化や変動に伴う特徴的な遺伝子発現をscRNA-seqで観察することは、遺伝子制御ネットワーク（例、SCENIC<ref><pubmed>28991892</pubmed></ref>, [https://github.com/aertslab/SCENIC]）や[[代謝経路]]や[[シグナル伝達系]]のための[[パスウェイ解析]](例、Metascape<ref><pubmed>30944313</pubmed></ref>, [http://metascape.org])を理解するシステム生物学的な研究として有用である。更に、scRNA-seqで得られた結果をもとに、細胞間相互作用の理解を深めるのを目的とするCellPhoneDB<ref><pubmed>32103204</pubmed></ref>[https：//github.com/Teichlab/cellphonedb]、NicheNet<ref><pubmed>3181926</pubmed></ref>, SVCA<ref><pubmed>31577949</pubmed></ref>などがある。特に、Perturb-seq<ref><pubmed>27984732</pubmed></ref> やその変法<ref><pubmed> 32231336</pubmed></ref>は、CRISPRライブラリーによるゲノム編集を施した細胞をscRNA-seqで解析することで、ゲノム編集で破壊された遺伝子の機能や遺伝子間の相互作用の理解を可能にしている後述するマルチモーダルなscRNA-seqの１つであり、注目されている。<br />
<br />
==scRNA-seqの神経科学研究への適用==<br />
===神経系細胞ビッグデータとしてのscRNA-seq===<br />
様々な神経・精神疾患について理解しその診断や治療に役立てるためには、神経細胞、[[グリア細胞]]を中心にした神経系にある細胞の種類や状態を識別し、それぞれの細胞における分子的な変化を観察することが重要である <ref><pubmed>28775344</pubmed></ref><ref><pubmed>29738987</pubmed></ref>。本本項目で解説してきたscRNA-seqの技術は、神経系に見られるそれぞれの細胞のトランスクリプトームについて[[ビッグデータ]]を提供することで、この細胞の種類や状態の識別に新たな根拠を与えつつある。近年、中枢神経系の[[アストロサイト]]、[[オリゴデンドロサイト]]、ミクログリアといったグリア細胞も均一ではなく、内在的な多様性や外部因子による状態の変動が報告されてきている。神経細胞は、著しく多様であり、この多様性が神経系を特徴づけており、その多彩で複雑な機能の発現に必須である。従来の神経科学では、神経細胞の多様性は、それぞれの神経細胞の解剖学的な位置、発現している分子、電気生理学、結合性、形態、神経伝達物質、神経伝達物質受容体とシグナル伝達によって識別されてきている。こうした神経細胞の多様性を便宜的に記述するのに、タイプ（type）、クラス（class）、サブクラス（subclass）、サブタイプ（subtype） というような用語が用いられてきた。しかし、ここでは混乱を防ぐため、Masland（2004）<ref><pubmed>15242626</pubmed></ref>が提唱し、広く受けいれられている「クラス」と「タイプ」という単語を用いることとする。タイプは、これ以上分類することができないとされる階層であり、共通性を持つタイプの集団がクラスである。例えば、大脳皮質の錐体細胞、網膜神経節細胞といった大雑把な区分はクラスである。大脳皮質の錐体細胞というクラスは、層や領野によって異なるタイプ、網膜神経節細胞には視覚情報に対して応答が異なるタイプが存在する。scRNA-seqは、「タイプ」の理解に新たな視点を提供している。<br />
<br />
===神経系へのscRNA-seqの適用===<br />
[[大脳皮質]]には、[[錐体細胞]]や[[非錐体細胞]]などの神経細胞や様々なグリア細胞などが見られ、古くから神経細胞タイプの識別が行われてきた。初期のscRNA-seq技術でも、マウス皮質の小規模な細胞数を分類した研究で、これまで知られていた主要な細胞タイプとは違うタイプが見つかりその有効性が示された<ref><pubmed>25700174</pubmed></ref>。その後のDroplet使用の3’エンドリード法を利用した多数の細胞数の解析で、更に多数の神経細胞のタイプが見つかっている<ref><pubmed>32839617</pubmed></ref><ref><pubmed>28846088</pubmed></ref><ref><pubmed>30096299</pubmed></ref><ref><pubmed>30096314</pubmed></ref><ref><pubmed>30382198</pubmed></ref><ref><pubmed>29320739</pubmed></ref><ref><pubmed>28846088</pubmed></ref>[https://doi.org/10.1101/2020.03.14.991018][https://doi.org/10.1101/2020.06.04.105700] [https://doi.org/10.1101/2020.07.02.184051]。特に、GABA作動性介在神経細胞タイプの多様性とその発生<ref><pubmed>28942923</pubmed></ref><ref><pubmed>28134272</pubmed></ref><ref><pubmed>29472441</pubmed></ref><ref><pubmed>29513653</pubmed></ref>についての情報は重要であろう。また、初期の発生過程<ref><pubmed>26940868</pubmed></ref><ref><pubmed>30485812</pubmed></ref><pubmed>31073041</pubmed></ref><ref><pubmed>30635555</pubmed></ref><ref><pubmed>30625322</pubmed></ref>、老化<ref><pubmed>31551601</pubmed></ref><の理解が、scRNA-Seq技術を利用することで進んでいる。更に、[[神経活動]]によって変化するトランスクリプトームの変化も細胞ごとに調査され興味深い<ref><pubmed>29230054</pubmed></ref> 。 ヒトを含めた霊長類の大脳についても発達段階を含めてscRNA-seqが適用されてきている<ref><pubmed>26060301</pubmed></ref><ref><pubmed>27339989</pubmed></ref><ref><pubmed>29539641</pubmed></ref><ref><pubmed>29217575</pubmed></ref><ref><pubmed>28846088</pubmed></ref><ref><pubmed>29227469</pubmed></ref><ref><pubmed>31303374</pubmed></ref><ref><pubmed>29867213</pubmed></ref><ref><pubmed>31435019</pubmed></ref><ref><pubmed>32424074</pubmed></ref> [https://doi.org/10.1101/709501[https://doi.org/10.1101/2020.03.31.016972][https://doi.org/10.1101/2020.04.23.056390]。ヒトや霊長類に特徴的とされる[[島]]のvon Economo神経細胞（紡錘細胞）のような希少な神経細胞のscRNA-seqにも成功している<ref><pubmed>32127543</pubmed></ref>。<br />
<br />
[[海馬]]<ref><pubmed>29241552</pubmed></ref><ref><pubmed>29912866</pubmed></ref><ref><pubmed>29335606</pubmed></ref><ref><pubmed>31942070</pubmed></ref>では、これまでの研究で記載されてきた神経細胞のタイプの存在が確認され、更に新規のタイプが見つかった。中枢神経系では、その他、[[外側膝状体]]<ref><pubmed>29343640</pubmed></ref>、[[大脳基底核]](足底核)<ref><pubmed>28384468</pubmed></ref> 、[[視床下部]]<ref><pubmed>28166221</pubmed></ref><ref><pubmed>28355573</pubmed></ref> <ref><pubmed>27991900</pubmed></ref><ref><pubmed>30385464</pubmed></ref> <ref><pubmed>31249056</pubmed></ref><ref><pubmed>30858605</pubmed></ref>、[[線条体]]<ref><pubmed>27425622</pubmed></ref><ref><pubmed>30134177</pubmed></ref><ref><pubmed>31875543</pubmed></ref>、[[中脳]]<ref><pubmed>27716510</pubmed></ref><ref><pubmed>29499164</pubmed></ref> <ref><pubmed>30718509</pubmed></ref> 、[[手綱]]<ref><pubmed>29576475</pubmed></ref>、発生中の[[間脳]]<ref><pubmed>30872278</pubmed></ref> 、さらに[[小脳]]<ref><pubmed>30220501</pubmed></ref><ref><pubmed>30735127</pubmed></ref><ref><pubmed>30690467</pubmed></ref>などの結果が得られている。マウスの小脳においては、分子層にこれまでの星状細胞、バスケット細胞というカテゴリーとは違ったギャップジャンクションに特徴を持つ２種類の神経細胞があることが示唆されている[https://doi.org/10.1101/2020.03.04.976407]。<br />
<br />
脳の外部では、[[運動神経]][ https://doi.org/10.1101/2020.03.16.992958]、[[感覚神経]]<ref><pubmed>25420068</pubmed></ref><ref><pubmed>26691752</pubmed></ref>、[[らせん神経節]]<ref><pubmed>30078709</pubmed></ref><ref><pubmed>30209249</pubmed></ref> 、[[臭覚神経]]<ref><pubmed>26541607</pubmed></ref> <ref><pubmed>32059767</pubmed></ref>、[[腸神経系]] <ref><pubmed>29483303</pubmed></ref>[https://doi.org/10.1101/2020.03.02.955757] 、[[網膜]]<ref><pubmed>27565351</pubmed></ref><ref><pubmed>29909983</pubmed></ref><ref><pubmed>30018341</pubmed></ref><ref><pubmed>31260032</pubmed></ref><ref><pubmed>31128945</pubmed></ref><ref><pubmed>30712875</pubmed></ref><ref><pubmed>30548510</pubmed></ref><ref><pubmed>31075224</pubmed></ref><ref><pubmed>31399471</pubmed></ref><ref><pubmed>31848347</pubmed></ref><ref><pubmed>31673015</pubmed></ref><ref><pubmed>31653841</pubmed></ref><ref><pubmed>31784286</pubmed></ref>[https://doi.org/10.1101/2020.02.26.966093][ https://doi.org/10.1101/779694][https://www.biorxiv.org/content/10.1101/617555][A]でのscRNA-seqデータがある。また[[iPS細胞]]や[[ES細胞]]由来の神経組織[[オルガノイド]]に含まれる神経細胞タイプを知る上でも利用されている<ref><pubmed>28094016</pubmed></ref><ref><pubmed>28279351</pubmed></ref><ref><pubmed>31168097</pubmed></ref><ref><pubmed>31996853</pubmed></ref><ref><pubmed>31968264</pubmed></ref><ref><pubmed><ref><pubmed>32221280</pubmed></ref></pubmed></ref>。<br />
<br />
===神経細胞以外の細胞===<br />
[[上衣細胞]]<ref><pubmed>29727663</pubmed></ref>は、[[神経幹細胞]]としての役割が示唆されてきたが、scRNA-seqによる解析ではその可能性が支持されなかった。グリア細胞では、[[ラジアルグリア]]<ref><pubmed>26406371</pubmed></ref><ref><pubmed>25734491</pubmed></ref><ref><pubmed>29281841</pubmed></ref><ref><pubmed>29217575</pubmed></ref><ref><pubmed>29539641</pubmed></ref>[A]、アストロサイト<ref><pubmed>32139688</pubmed></ref><ref><pubmed>32203496</pubmed></ref>[ https://doi.org/10.1101/2020.04.27.064881]に多様性があることが示唆されてきている。また、オリゴデンドロサイト<ref><pubmed>27284195</pubmed></ref><ref><pubmed>30078729</pubmed></ref><ref><pubmed>30257220</pubmed></ref><ref><pubmed>30747918</pubmed></ref><ref><pubmed>31958186</pubmed></ref>[https://doi.org/10.1101/2020.03.06.981373] [A]については、これまで細胞生物学的に研究されてきた分化の過程がscRNA-seqにより検出されている。ミクログリアは、神経系の発達、老化、損傷などに伴うトランスクリプトームの変化がscRNA-seqにより詳細に明らかになった<ref><pubmed>27338705</pubmed></ref><ref><pubmed>29020624</pubmed></ref><ref><pubmed>30206190</pubmed></ref><ref><pubmed>30471926</pubmed></ref><ref><pubmed>31209379</pubmed></ref><br />
<ref><pubmed>31835035</pubmed></ref>。また、[[CNS境界関連マクロファージ]](BAM) <ref><pubmed>31061494</pubmed></ref>や[[脳血管系]]<ref><pubmed>29443965</pubmed></ref>のscRNA-seqも実施されている。<br />
<br />
===疾患===<br />
scRNA-seqは、疾患の理解にも有用である。筋萎縮性側索硬化症<ref><pubmed>30948552</pubmed></ref>、多発性硬化症<ref><pubmed>30747918</pubmed></ref><ref><pubmed>30420755</pubmed></ref><ref><pubmed>32313246</pubmed></ref> <br />
、アルツハイマー病やそのモデル動物<ref><pubmed>31042697</pubmed></ref><ref><pubmed>31399126</pubmed></ref><ref><pubmed>29020624</pubmed></ref><br />
[https://doi.org/10.1101/628347]<ref><pubmed>28602351</pubmed></ref><ref><pubmed>32341542</pubmed></ref>、統合失調症<ref><pubmed>29785013</pubmed></ref><ref><pubmed>32203495</pubmed></ref>、自閉症やレット症候群<ref><pubmed>31097668</pubmed></ref><ref><pubmed>30455458</pubmed></ref>、シャルコー・マリー・トゥース病<ref><pubmed>29888333</pubmed></ref>、ダウン症[https://www.biorxiv.org/content/10.1101/2020.01.01.892398v1]、パーキンソン病<ref><pubmed>30503143</pubmed></ref> <ref><pubmed>32826893</pubmed></ref>、がん<ref><pubmed>31327527</pubmed></ref><ref><pubmed>28360267</pubmed></ref>などに適用されている。<br />
<br />
<br />
==scRNA-seqの展望==<br />
===神経系の多様性と進化===<br />
NGSを用いることで、どんな生物種にも適用可能なscRNA-seqは、既に多様な生物の神経系の細胞の理解、更には種間の相同性や差異の研究に利用されており、神経系の進化を細胞レベルで考察するのに有用であろう（例、センチュウ<ref><pubmed> 28818938 </pubmed></ref>、ショウジョウバエ <ref><pubmed>29909982</pubmed></ref><ref><pubmed>29149607</pubmed></ref><ref><pubmed>30703584</pubmed></ref><ref><pubmed>29909983</pubmed></ref>、カタユウレイボヤCiona intestinalis <ref><pubmed>30069052</pubmed></ref><ref><pubmed>30228204</pubmed></ref>、ゼブラフィッシュ<ref><pubmed>31018142</pubmed></ref><ref><pubmed>30929901</pubmed></ref>、アカミミガメTrachemys scripta elegans、トカゲPogona vitticeps, pv<ref><pubmed>29724907</pubmed></ref>、ニワトリ[https://doi.org/10.1101/2020.10.09.333633]、霊長類<ref><pubmed>30730291</pubmed></ref><ref><pubmed>31619793</pubmed></ref>[https://doi.org/10.1101/2020.03.31.016972]）。ただ、遺伝子やトランスクリプトームの研究が進んでいる生物種では比較的容易であるが、遺伝子のアノテーションが十分でない生物種を用いる場合、scRNA-seqのデータ解析は困難を伴う。また種を超えた細胞タイプの相同性の理解には様々な工夫が必要である<ref><pubmed>31552245</pubmed></ref><ref><pubmed>30712875</pubmed></ref>>[https://doi.org/10.1101/2020.03.31.016972]。<br />
<br />
===データベースと統合===<br />
獲得されたscRNA-seqのデータは様々な目的で利用できるので、データベース化し利用できるようにする必要がある。神経系のトランスクリプトーム一般のデータベースが多数公開されており<ref><pubmed>29437890</pubmed></ref>、scRNA-seqのデータも基本的にNCBIのGene Expression Omnibus[https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/]に登録されている。また、オープンサイエンス推進のためにcommon coordinate framework (CCF) やcentral annotation platform (CAP)という概念のもと、特にscRNA-seqを意識したものとして、米国のBRAIN Initiative Cell Census Consortium<ref><pubmed>29096072</pubmed></ref> 、Human Cell Atlas ProjectのHuman Cell Atlas Data Portal [https://data.humancellatlas.org]、そのマウス版であるTabula Muris <ref><pubmed>30283141</pubmed></ref>[https://genome.ucsc.edu/cgi-bin/hgTrackUi?db=mm10&g=tabulaMuris]やSten Linnarssonラボのマウス脳発生データベース[http://mousebrain.org]、アレン脳研究所のAllen Brain Atlas [https://portal.brain-map.org]、ブロード研究所のSingle Cell Portal [https://singlecell.broadinstitute.org/]などのデータベースが稼働している。また、異なった方法や実験で得られたscRNA-seqのデータを体系的に比較することも重要であり、CCA (Canonical correlation analysis)<ref><pubmed>29608179</pubmed></ref>, Seurat 3.0以降に組み込まれたMMN (Mutual Nearest Neighbors)、LIGER<ref><pubmed>31178122</pubmed></ref> 、Harmony<ref><pubmed>31740819</pubmed></ref> 、MetaNeighber<ref><pubmed>29491377</pubmed></ref>、Conos<ref><pubmed>31308548</pubmed></ref>のようなアルゴリズムが開発され、統合サイトもでき始めている（[https://biccn.org]）。<br />
<br />
===空間トランスクリプトミクス===<br />
多数の細胞を扱うscRNA-seqの弱点は、組織から細胞や細胞核を解離する必要があるので、その細胞が存在していた解剖学的あるいは空間的な位置の情報を消去してしまうということである。組織切片におけるタンパク質などの分布は免疫組織化学、mRNAの分布はin situ hybridizationで検出することができるが、数多くのmRNAの分布を情報処理技術と組み合わせ一気に同定する方法がscRNA-seqと同様に開発されてきている（Slide-seq<ref><pubmed>30923225</pubmed></ref>[ https://doi.org/10.1101/2020.03.12.989806]、HDST<ref><pubmed>31501547</pubmed></ref>、Expansion sequencing[http://doi.org/10.1101/2020.05.13.094268]など<ref><pubmed>27365449</pubmed></ref>, <ref><pubmed>31932730</pubmed></ref> <ref><pubmed>30948552</pubmed></ref>）、更に10x Genomics社が市販するVisiumなどがある。現状では、大きな組織の空間トランスクリプトミクスは、空間解像度が細胞レベルにいたっておらず、技術普及の観点からも課題が多い。しかし、そのデータを解析するためのアルゴリズム<ref><pubmed>29553578</pubmed></ref><ref><pubmed>29553579</pubmed></ref><ref><pubmed>32350282</pubmed></ref> [https://doi.org/10.1101/757096][ https://doi.org/10.1101/701680] [https://doi.org/10.1101/431957]。<br />
更にMerFish <ref><pubmed>25858977</pubmed></ref>、corrFISH <ref><pubmed>27271198</pubmed></ref>のように、subcellularレベルで多数のmRNAを検出する方法が開発されてきており（<ref><pubmed>25549890</pubmed></ref> osmFISH<ref><pubmed>30377364</pubmed></ref> 30377364、STARmap (spatially-resolved transcript amplicon readout mapping) <ref><pubmed>29930089</pubmed></ref>、seqFISH+<ref><pubmed>27764670</pubmed></ref>、pciSeq(probabilistic cell typing by in situ sequencing)[ https://doi.org/10.1101/431957]、DSP(Digital Spatial Profiling) <ref><pubmed>32393914</pubmed></ref>）<br />
、scRNA-seqと組み合わせることで、その弱点を補う空間トランスクリプトミクスにも利用され始め<ref><pubmed>30385464</pubmed></ref>[https://doi.org/10.1101/2020.06.04.105700]、今後の発展が期待される。<br />
<br />
<br />
===マルチモーダルなシングルセルオミクス===<br />
同一の細胞からscRNA-seqの情報だけでなく、ゲノム配列、ATAC-seqなどによるエピゲノム解析、少数のタンパク質、あるいはプロテオームなどを、同時に記録するマルチモーダルなオミクスが注目されている<ref><pubmed>31907462</pubmed></ref><ref><pubmed>30696980</pubmed></ref>。2019年には、Nature Methodsの「Methods of the Year」に選ばれており、現状については、その特集号などを参考にされたい。例えば、細胞表面分子に対する抗体にDNAを付加することで、マーカーを発現する細胞のトランスクリプトームを観察するCITE-seq<ref><pubmed>28759029</pubmed></ref>、 REAP-seq<ref><pubmed>28854175</pubmed></ref>は既知の細胞表面マーカーの発現とscRNA-seqが同時に観察できるマルチモーダルなオミクスである。<br />
<br />
マルチモーダルなシングルセルオミクスとして、神経科学分野で注目されるのは、scRNA-seqをパッチクランプによる電気生理学的情報と組み合わせたPatch-seq<ref><pubmed>26689544</pubmed></ref> <ref><pubmed>26689543</pubmed></ref>である。また、ゲノムDNAとscRNA-seqを同時に観察することによって、近年、精神疾患の観点から注目されている発生途中で生じる遺伝子変異を研究するPRDD-seqは今後の展開が注目される[https://doi.org/10.1101/2020.04.19.046904]。最後に、BARseq (barcoded anatomy resolved by sequencing) <ref><pubmed>31626774</pubmed></ref>、CONNECTID[https://doi.org/10.1101/378760<br />
]、Epi-Retro-seq[https://doi.org/10.1101/2020.04.01.019612]のような方法は、コネクトーム（神経細胞の結合性）と遺伝子発現を記録できるオミクスの新たな方向として興味深い。<br />
<br />
<br />
== 関連項目 ==<br />
*[[ゲノムワイド関連解析 ]]<br />
*[[ディファレンシャルディスプレイ ]]<br />
*[[In situハイブリダイゼーション法 ]]<br />
*[[免疫組織化学法]]<br />
*[[エピジェネティクス]]<br />
== 参考文献 ==<br />
<references /></div>
Masahitoyamagata
https://bsd.neuroinf.jp/w/index.php?title=%E3%83%95%E3%82%A1%E3%82%A4%E3%83%AB:ScFig4.jpg&diff=45071
ファイル:ScFig4.jpg
2020-11-13T15:51:35Z
<p>Masahitoyamagata: </p>
<hr />
<div></div>
Masahitoyamagata
https://bsd.neuroinf.jp/w/index.php?title=%E3%83%95%E3%82%A1%E3%82%A4%E3%83%AB:ScFig3.jpg&diff=45070
ファイル:ScFig3.jpg
2020-11-13T15:50:44Z
<p>Masahitoyamagata: </p>
<hr />
<div></div>
Masahitoyamagata
https://bsd.neuroinf.jp/w/index.php?title=%E3%83%95%E3%82%A1%E3%82%A4%E3%83%AB:ScFig2.jpg&diff=45069
ファイル:ScFig2.jpg
2020-11-13T15:49:58Z
<p>Masahitoyamagata: </p>
<hr />
<div></div>
Masahitoyamagata
https://bsd.neuroinf.jp/w/index.php?title=%E3%83%95%E3%82%A1%E3%82%A4%E3%83%AB:ScFig1.jpg&diff=45068
ファイル:ScFig1.jpg
2020-11-13T15:49:22Z
<p>Masahitoyamagata: </p>
<hr />
<div></div>
Masahitoyamagata
https://bsd.neuroinf.jp/w/index.php?title=%E3%82%B7%E3%83%B3%E3%82%B0%E3%83%AB%E3%82%BB%E3%83%ABRNA%E3%82%B7%E3%83%BC%E3%82%B1%E3%83%B3%E3%82%B7%E3%83%B3%E3%82%B0&diff=45067
シングルセルRNAシーケンシング
2020-11-13T15:29:52Z
<p>Masahitoyamagata: </p>
<hr />
<div><div align="right"> <br />
<font size="+1">[http://researchmap.jp/yamagatm 山形方人]</font><br><br />
''Harvard University''<br><br />
DOI：<selfdoi /> 原稿受付日：年月日 原稿完成日：年月日<br><br />
担当編集委員：<br><br />
</div><br />
<br />
英：single cell RNA sequencing, scRNAseq<br />
{{box|text=<br />
シングルセルRNAシーケンシング(single cell RNA sequencing, 以下scRNAseq)は、[[次世代シーケンシング]] （next generation sequencing、以下NGS）技術を使用して個々の細胞が発現しているmRNA全体、つまり[[トランスクリプトーム]]を質的、量的に網羅的に調べ、細胞ごとの違いを高解像度で検出し、数理的に解析する分子生物学的、コンピュータ生物学的技術である。組織内にある細胞の分類を行うことで、未知あるいは希少な細胞の種類や状態の検出に有効である。また、刺激、発生など細胞の状況に応じて、個々の細胞のトランスクリプトームの情報を得ることで、細胞系譜などの疑時系列解析や疾患のバイオマーカーの研究も可能である。特に多様な神経細胞が存在する神経系では、この方法により、神経細胞や非神経細胞の分類や状態についての知見が深まり、新しい細胞マーカーや機能遺伝子の同定などが系統的かつ網羅的に行われるようになった。空間的情報、エピゲノム情報、タンパク質情報などを取り入れながら、細胞タイプ間の発現変化を探索するマルチモーダル技術の発展も著しい。<br />
}}<br />
<br />
==scRNA-seqとその開発史==<br />
===トランスクリプトーム===<br />
トランスクリプトーム（transcriptome）は、細胞中に存在する全ての転写産物（タンパク質をコードするmRNA、タンパク質をコードしない[[ノンコーディングRNA]]、[[マイクロRNA]]など）の総体である<ref><pubmed>19015660</pubmed></ref><ref><pubmed>31341269 </pubmed></ref>。トランスクリプトームは、[[ゲノム]]とは異なり、同一の個体でも、組織ごとに、更には発生段階や細胞外環境や刺激によって変化する。トランスクリプトームは、同質あるいは異質の多数の細胞集団（組織、培養細胞）からRNA抽出後、cDNAに変換し、それを1990年代に出現した[[DNAマイクロアレイ]]のように数多くの既知mRNAを識別する技術によって解析されるようになった。その後、NGSの利用により、希少mRNAやノンコーディングRNAを含めた未知の転写産物の高感度検出が可能になるとともに、[[スプライシング]]で成熟していく過程のmRNAなど、転写産物の種類だけでなく、転写産物の構造的差異（スプライシングバリアント、SNPs、変異など）の解析もできるようになった。加えて、ヒトやモデル実験生物（[[マウス]]、[[ゼブラフィッシュ]]、[[ショウジョウバエ]]、[[センチュウ]]など）だけでなく、多種多様な生物のトランスクリプトームの把握も可能になった。ここでは、このような多数の細胞集団、つまり個体や特定の組織全体（bulk RNAseq）ではなく、細胞1つの持つトランスクリプトームを解析する方法（scRNAseq）とそのscRNAseqデータを利用することで得られる情報について概説する。<br />
<br />
===scRNA-seqとその開発史===<br />
1つの細胞の持つ生体物質を解明し、定量しようとする試みは古くからあった。1960年代になると、フローサイトメトリーを利用した[[蛍光活性化セルソーティング]]（Fluorescence-activated cell sorting, FACS）が発明され、標識抗体などのプローブと組み合わせることで、多数の細胞集団の中で１つの細胞が持っている分子の種類や量についての断片的な研究が可能になり、この方法は現在でも汎用されている<ref><pubmed>22271369</pubmed></ref>。その後、[[免疫組織化学]]や[[in situ hybridization]]nなどにより、タンパク質やmRNAの種類や量が観察できるようになり、組織中に存在するそれぞれの細胞の同定などに活用されてきている。最近では、それぞれの細胞が持つ抗原分子を、異なった金属イオンで標識した抗体とフローサイトメトリーを組み合わせた方法で検出する[[マスサイトメトリー]]（CyTOFなど）も開発されてきている<ref><pubmed>27153492</pubmed></ref>。<br />
<br />
1つの細胞内にある全RNA（ribosomal RNAを含む）は細胞種にもよるが1-50pgである。そのうち、mRNAの占める割合は1-5%程度である<ref><pubmed>15239941</pubmed></ref>。この微量のmRNAをcDNAに変換してから大幅に増幅できる方法が発明されたことで、1つの細胞が発現するmRNAを高感度で検出できるようになった<ref><pubmed>1557406</pubmed></ref><ref><pubmed>7541630</pubmed></ref> 。例えば、1991年、Linda BuckとRichard Axelは、[[嗅覚受容体]]が[[Gタンパク質]]であると仮定し、個々の嗅覚細胞で特異的に観察されるGタンパク質mRNAを比較することで、嗅覚受容体の同定に成功した<ref><pubmed>1840504</pubmed></ref>。1995年になると、Catherine DulacとRichard Axelは、異なる[[鋤鼻神経細胞で特異的]]に発現する遺伝子を１つの細胞から作製したcDNAライブラリーを比較するディファレンシャル・スクリーニングを行うことで、[[フェロモン受容体]]を同定した<ref><pubmed>7585937</pubmed></ref>。同じ手法で異なる種類の神経細胞で発現している遺伝子も同定され<ref><pubmed>9778248</pubmed></ref><ref><pubmed>12230981</pubmed></ref>、１つの細胞の持つトランスクリプトームを比較するアプローチが神経細胞で特徴的に発現している遺伝子の同定に効果的なことを示した。<br />
<br />
一方で多くの種類のmRNAを１細胞レベルで一挙に観察するトランスクリプトームのための技術にはブレークスルーが待たれた。1つの問題は多種類のcDNAを簡便に識別することを可能にする方法の開発であった。これを可能にしたのが、[[PCR]]などのcDNA増幅法の改良とマイクロアレイの利用であった<ref><pubmed>12736331</pubmed></ref><ref><pubmed>16547197</pubmed></ref>。しかしながら、細胞ごとに高価なマイクロアレイを使用することは、多数の細胞のトランスクリプトームの観察には限界があった。2009年になると、これらの問題を解決できる可能性として、NGSを利用するscRNA-seqプロトコールがAzim Suraniのグループによって報告された<ref><pubmed>19349980</pubmed></ref>。しかしながら、この報告でもわずか8個の細胞の解析に留まっており、1つの細胞ごとに処理を行うという操作が必要で、多数の細胞についてのトランスクリプームを一挙に理解することはできなかった。また、塩基配列の違うcDNAごとにPCR効率に差がある結果生じる増幅バイアス、また3’末端側が選択的に補足されることなどの課題を残した。<br />
<br />
===scRNA-seqの現状===<br />
その後、5’末端側も含めた完全長cDNAを増幅するscRNA-seqのプロトコールが考案された。特に、SMART-seq（Switch mechanism at the 5' End of RNA Templates）<ref><pubmed>22820318</pubmed></ref>およびその改良されたプロトコールであるSMART-seq2<ref><pubmed>24056875</pubmed></ref> <ref><pubmed>24385147</pubmed></ref>の使用例が多い（既に、SMART-seq3という改良プロトコールもある<ref><pubmed>32518404</pubmed></ref>が、以下SMART-seqと呼ぶ）。また、類似法としてSTRT（single-cell tagged reverse transcription）<ref><pubmed>21543516</pubmed></ref>などがある。一方、MARS-seq（Massively parallel single-cell RNA-seq）<ref><pubmed>24531970 </pubmed></ref>、CEL-seq（Cell Expression by Linear amplification and Sequencing）<ref><pubmed>22939981</pubmed></ref>、CEL-seq2<ref><pubmed> 27121950 </pubmed></ref>では、[[T7 RNAポリメラーゼ]]による[[in vitro転写]]を用いることにより、PCRで顕著な増幅バイアスを減少させようとしている。<br />
増幅バイアス除去のアプローチとして特に重要なのは、2011年に発表された分子識別子（unique molecular identifiers: UMI）を持つcDNAを増幅させ、NGS後の情報処理を用いる方法である<ref><pubmed>22101854</pubmed></ref>。この方法では逆転写反応の際、ランダムなUMIをcDNA末端に付加した後、増幅反応、NGSを行い、cDNA配列とUMI配列の両方を読む。同一のUMIを持っていれば、逆転写時に同一のcDNA由来とカウントする。UMIをカウントすることで、増幅前のmRNAのコピー数を知ることができる<ref><pubmed>21543516</pubmed></ref><ref><pubmed>24363023</pubmed></ref><ref><pubmed>28192419</pubmed></ref> <ref><pubmed>29474909</pubmed></ref><ref><pubmed> 28818938 </pubmed></ref><ref><pubmed>29545511</pubmed></ref>。2013年には、このような１細胞のシーケンシング技術が、Nature Methods誌のMethod of the Year に選ばれた[https://www.nature.com/collections/mysbdwgfll]。<br />
<br />
これらの方法のうち、SMART-seqは、マイクロピペットによる捕獲、セルソーター、[[レーザー捕獲]]などを用いるマルチウェル法、あるいは半導体集積回路製作技術で作った流体集積回路を利用するFluidigm C1の装置[https://jp.fluidigm.com]と組み合わせることで利用される機会が多い<ref><pubmed>30405621</pubmed></ref>[https://doi.org/10.1101/742304]。SMART-seqプロトコールの特徴は、全長トランスクリプトームを得ることができることであり、mRNAのスプライシングバリアントなどのアイソフォーム、アリルごとの発現情報が得られるSNPs、変異の検出にも利用できる。また、それぞれ細胞ごとの反応を独立した場所で行うため、別の細胞の反応と混じる可能性がない。小型ウェルを用いるSeq-Wellも同様である<ref><pubmed>28192419</pubmed></ref>。これらの点が、次に説明するDropletを使用して3’末端のみを標的にしたscRNA-seqに比べた場合の長所であるが、その高コスト（1細胞あたり数十ドル）と処理可能な細胞数の少なさが短所である。<br />
<br />
===Droplet使用の3’エンドリード法===<br />
しかしながら、もっとも重要なscRNA-seqの方法論についての進歩は、2015年、Harvard Medical Schoolの独立した２つのグループが、inDrops<ref><pubmed>26000487</pubmed></ref>そしてDrop-seq<ref><pubmed>26000488 </pubmed></ref>という類似した2つの高スループットな方法を開発したことであろう（inDropsはT7RNAポリメラーゼ、Drop-seqはPCRで増幅）。これらの方法では、[[マイクロ流体力学]] (Microfluidics) 、 UMI（上述）と細胞ごとのCell Barcodeという2種類のDNAバーコーディング、そしてNGSと情報解析を利用している。そして、多く細胞のサンプル調製の自動化と容易さから、1つの細胞あたりに要するコストを大幅に低下させることに成功した（Drop-seqは発表時で、１細胞あたり約5セント）。つまり、細胞1つずつをマイクロ流体力学によるエマルジョン技術を利用した装置に流入させ、その１細胞を1つのDroplet（油中水滴）に自動的に閉じ込める。そのDroplet中には、DropletごとにCell barcode/UMIとしてユニークなDNAバーコードを持つゲルビーズ(Gel Beads in Emulsion, GEMs)が入っており、それを足場に3’末端のみを標的にしたcDNA合成反応を実施することで、同じ細胞に含まれていたmRNAが同じCell barcodeを持つcDNAとして合成され、そのmRNA/cDNAが由来した細胞を識別できるということを利用している（図１）。なお、DropSeqはコストが低いが、細胞の取得率と検出感度が低い弱点がある。inDropsはDropSeqより細胞取得率が高く、パラメータを調整することにより、低レベルで発現される遺伝子の検出にも有利であるとされる<ref><pubmed>30472192</pubmed></ref>。<br />
[http://www.youtube.com/watch?v=fHq9ewdYEWM]<br />
DropSeqのセットアップはDolomite Bio ([https://www.dolomite-bio.com])、inDropは1 Cellbio社から販売されている[https://1cell-bio.com]。しかし、特に重要なのは10x Genomics社が同様の原理を用いた「Chromium」と命名された機器と試薬のシステムを市販することで、多くの研究者が容易に利用できることになったことである<ref><pubmed>28091601<br />
</pubmed></ref>[https://www.10xgenomics.com/jp/]。Svenssonらによる最近のデータベース[https://doi.org/10.1101/742304], [http://www.nxn.se/single-cell-studies/gui]では、scRNA-seqを用いた論文で用いられた方法について調査しているが、この数年、10x Genomics社Chromiumを用いた論文が飛躍的に増加し、scRNA-seqの方法として一般的になりつつあることがわかる（現在、10x Genomics社とBioRad社の間で関連特許をめぐる係争がある。）。このシステムは市販であるので導入が容易であり、DropSeqやinDropsに比べ多くの転写産物の高感度検出が可能であるが、ランニングコストは高い<ref><pubmed>30472192</pubmed></ref>。なお、3’エンドリード法だけでなく、N末端側に位置する抗体の可変領域などの検出には5’エンドリード法が利用されることがある。<br />
[[ファイル:scFig1.jpg|サムネイル|250px|'''図1．Droplet使用の3’エンドリード法 '''<br>組織から解離させた細胞それぞれを、マイクロ流体力学を利用した装置で、バーコードプライマーが結合したゲルビーズとともにオイルドロップレットに封じ込める。mRNAを逆転写した後、PCRで増幅する。]]<br />
<br />
==scRNA-seqの実際==<br />
ここでは主流になっている10x Genomics社のChromiumなどのDropletを用いた方法とSMART-seqなどを用いた方法に共通する方法の実際について俯瞰する。scRNA-seqの利用には、4つのステップがある（図２）<ref><pubmed> 31217225</pubmed></ref><ref><pubmed>30089861</pubmed></ref>。１）個体や組織を採集し、そこから細胞あるいは細胞核を個別にすること。２）Droplet法やSMART-seqなどによる個々の細胞からのライブラリーの作製とNGS。３）前処理（preprocessing、得られた配列の整理）。４）ダウンストリーム解析（生物学的な情報を得るコンピューター生物学）。これらのうち、２）の段階については、上に記述したように市販の機器や試薬を利用する機会が多くなっているので、そのためのマニュアル等が参考になるはずである。<br />
[[ファイル:scFig2.jpg|サムネイル|250px|'''図２．scRNA-seqの実際のステップ '''<br>細胞の単離、ライブラリ作製とNGS、データの前処理から次元圧縮、ダウンストリーム解析。図の一部は2016 DBCLS TogoTV、あるいはSeuratを用いて10x Genomics社のPBMCデータ（[https://support.10xgenomics.com/single-cell-gene-expression/datasets]から執筆者が作製。]]<br />
<br />
===組織からの細胞、細胞核の分離===<br />
血液細胞のように浮遊した細胞ではない場合、物理的あるいは酵素処理などによって解離することで、生組織から状態の良いバラバラになった細胞を調製する必要がある。神経系組織の酵素処理には、パパインを用いる方法が広く用いられている。ここで、しばしば問題となるのが、酵素処理による短時間加温や機械的刺激で、発現量が変化する遺伝子が存在することである<ref><pubmed>27090946</pubmed></ref>。特に、脳の[[ミクログリア]]の解析には、低温下で組織をホモゲナイズするなどの工夫が必要であった<ref><pubmed>30471926</pubmed></ref>。また、このような現象を抑制するために、酵素処理時に転写阻害剤である[[アクチノマイシン]]で処理したり<ref><pubmed>29024657</pubmed></ref>、ヒマラヤ氷河から得られた細菌Bacillus licheniformisから得られた低温プロテアーゼを用いる方法も報告されている<ref><pubmed>28851704</pubmed></ref>。また、細胞解離後に、メタノールで固定しscRNA-seqに使用したり<ref><pubmed>28526029</pubmed></ref>、クロスリンカーを用いる方法もある<ref><pubmed>29391536</pubmed></ref>。<br />
<br />
単離した細胞は、そのまま10x GenomicsのChromiumのプラットフォームに導入することができるが、抗体や蛍光タンパク質レポーターなどを用いたFACS、[[パニング]]、MACS(磁気ビーズカラム)などによる特定のマーカーを細胞表面などに発現する細胞の選択的濃縮や除去を行う場合もある。更に、抗体に抗体表示バーコードDNAをカップリングさせるCITE-seq(Cellular Indexing of Transcriptomes and Epitopes by Sequencing) については、下記のマルチモーダルなオミクスの項目で述べる。<br />
<br />
なお、ヒト組織や希少生物などから生細胞を得ることは困難なことが多い。この場合、scRNA-seqの変法として、凍結した組織から、各細胞由来の核を調製し、核内のmRNAを分析するsnRNA-seq (single-nucleus RNA-seq)が利用されている。ただ、snRNA-seqでは、FACSなどによる特定細胞集団の分離が困難であることが多く、細胞質を持つ生細胞を利用した場合より検出できる遺伝子数が少なく同等な結果が必ずしも得られない<ref><pubmed>24248345</pubmed></ref><ref><pubmed>26890679</pubmed></ref> <ref><pubmed>27471252</pubmed></ref><ref><pubmed>28846088</pubmed></ref><<ref><pubmed>29220646</pubmed></ref><ref><pubmed>28846088</pubmed></ref><ref><pubmed>30586455</pubmed></ref><ref><pubmed>28729663</pubmed></ref><ref><pubmed>31728515</pubmed></ref><ref><pubmed>32341560</pubmed></ref> <ref><pubmed>32518403</pubmed></ref>。一方で、snRNA-seqでは、組織をそのまま凍結することから開始するので、上述したscRNA-seqの問題である酵素処理などを避けることができる。更に、核を用いることで、大きな細胞体はマイクロ流体力学の流路で詰まりやすいなど、細胞の形状に伴うバイアスを減らすことができるといったメリットもある。こうしたプロトコールの一部は、protocols.ioのHuman Cell Atlasのグループ[https://www.protocols.io/groups/hca]で公開されている。<br />
通常のscRNA-seqは、ポリアデニル化されたmRNAを検出しているが、MATQ-seq（multiple annealing and dC-tailing-based quantitative single-cell RNA-seq）を用いると、ポリアデニル化されていないRNAの検出も可能である<ref><pubmed> 28092691</pubmed></ref>。更に、RNAを分析するscRNA-seqではないが、遺伝子発現との関係が想定される[[オープンクロマチン]]領域を[[トランスポゾン]]を用いることで個々の細胞レベルで選択的に検出するsingle cell ATAC-seq (Assay for Transposase-Accessible Chromatin)やsnATAC-seq <ref><pubmed>26083756</pubmed></ref>, <ref><pubmed>29434377</pubmed></ref><ref><pubmed>25953818</pubmed></ref>, single cell THS-seq (transposome hypersensitive-site) <ref><pubmed>29227469</pubmed></ref>、や[[DNAメチル化]]領域を観察するsnmC-seqのような方法も利用されている<ref><pubmed>28798132</pubmed></ref><ref><pubmed>30237449</pubmed></ref>。<br />
<br />
<br />
===scRNA-seqデータの前処理===<br />
10x Genomics社のChromium、Illumina社のNGSを利用した場合、Cell Rangerのmkrefコマンド(Linux上で作動, https://support.10xgenomics.com/single-cell-gene-expression/software/pipelines/latest/using/tutorial_mr)を用いて、各生物種ごとのレファレンス配列リスト（[https://www.ncbi.nlm.nih.gov/grc]）を用いて、EggNOG ([http://eggnogdb.embl.de])などを参考にしながら、細胞とトランスクリプトームの対応マトリックスを作製する。マウスやヒトでは既製のものを利用できる。その後のデータの処理についても、10x Genomics社がソフトウェアLoupeを提供している。しかしながら、その後のダウンストリーム解析を考慮して、[[R言語]], [[Python]], MATLABなどのデータ解析のための汎用プログラミング言語やコードで扱えるオブジェクトに変換するのが通常である。ここでは、scRNA-seqデータ解析のために最もよく利用されているR言語を用いたパッケージ「Seurat」<ref><pubmed> 29608179 </pubmed></ref> <ref><pubmed> 31178118 </pubmed></ref>を中心に紹介したい。また、その一部はUniversity of WashingtonのCole Trapnell研究室で開発されてきたMonocle3でも可能である（[https://cole-trapnell-lab.github.io/monocle3/]）。Pythonを利用したものでは、ドイツ・ミュンヘンInstitute of Computational Biologyの Fabian Theisらが開発しているScanpyが有名である<ref><pubmed> 29409532</pubmed></ref>。<br />
<br />
New York UniversityのRahul Satija研究室が開発しているSeurat（画家スーラに由来）は、scRNA-seqデータ解析のために広く利用されているRパッケージであり、2020年秋現在、Seurat4のβバージョンが公開されている。論文の正式発表前から、サポート情報提供やコード修正なども頻繁に行っており、Satija研究室のウェッブサイト（ [http://satijalab.org/Seurat]）、Github([https://github.com/satijalab/Seurat])、更にTwitterアカウント（@satijalab）などで最新情報を得ることできる。<br />
<br />
最初に行うのは、scRNA-seqデータの品質管理である。ここでは、質の低い細胞のデータ（壊れた細胞では、転写産物の種類が少なくミトコンドリア由来の転写産物が多い）を取り除く。また、複数の試料を組み合わせる場合には、バッチごとの違いについて検討する<ref><pubmed>29608177</pubmed></ref><ref><pubmed> 28045081<br />
</pubmed></ref>。現実には、実験ごとのバッチの違いによる影響（Batch effect）がscRNA-seqの最大の問題であると示されてきており、実験デザインを工夫する必要がある<ref><pubmed>29121214</pubmed></ref>。また、Dropletを使用するscRNA-seqでしばしば問題になるのが、Dropletに２つ以上の細胞が封じ込められ、それらが同一の細胞バーコードを持ってしまうアーティファクトである。通常「Doublet」「Multilet」と呼ばれるこの問題はダウンストリーム解析を混乱させるので、細胞単離の段階から注意する必要があるが、scRNA-seqデータ取得後にもデータ処理で検討することは可能である<ref><pubmed>30954476</pubmed></ref><ref><pubmed>30954475</pubmed></ref> <ref><pubmed>31693907</pubmed></ref><ref><pubmed>32592658</pubmed></ref> <ref><pubmed>29227470</pubmed></ref><ref><pubmed>31836005</pubmed></ref><ref><pubmed>31856883</pubmed></ref><ref><pubmed>30567574</pubmed></ref> <ref><pubmed>31266958</pubmed></ref> [https://doi.org/10.1101/2019.12.17.879304][https://doi.org/10.1101/699637]。なお、この手法を利用することで、バッチ効果を抑えるために、異なるバーコードを持つ複数の試料を混ぜて一つの試料として扱い、計算機的に再び分離、解析するdemultiplexingが注目されている<ref><pubmed>32483174</pubmed></ref>。scRNA-seqデータのもうひとつのノイズは、ある遺伝子の発現が低いために、本来同じタイプの細胞であっても、その遺伝子の発現が全く見られない「Dropout」と呼ばれる現象であり解析に影響を与えるので、これについても検討が必要である<ref><pubmed> 24056876<br />
</pubmed></ref><ref><pubmed>32127540</pubmed></ref>。<br />
<br />
このようなノーマライゼーションの過程を経て<ref><pubmed>28504683</ref></pubmed>、scRNA-seqのデータ解析において、最初に行うのが、[[次元圧縮]] (dimensionality reduction)である<ref><pubmed>30617341</pubmed></ref><ref><pubmed>31780648</pubmed></ref>。PCA (Principal component analysis, 主成分分析)、UMAP（Uniform Manifold Approximation and Projection, 均一マニフォールド近似と投影）、Diffusion maps<ref><pubmed> 26002886<br />
</pubmed></ref>, tSNE(t-distributed Stochastic Neighbor Embedding , t分布型確率的近傍埋込み)などの手法が用いられる。 特に、tSNE[http://www.jmlr.org/papers/v9/vandermaaten08a.html]とUMAP[https://arxiv.org/abs/1802.03426]は、高次元データを低次元の点の集合として可視化することで、それぞれの細胞の持つトランスクリプトームの類似度についての直観的な表示が可能でありしばしば用いられる（図３）。tSNEよりUMAPの方が迅速に類似集団間の関係が明確になるので、最近はUMAPを利用することが多くなってきている。次に、[[Louvainアルゴリズム]]などでクラスタリング（コミュニティ分割）を行いグラフ上に表示できる（図３の色分け）。こうして、違ったタイプの細胞の集合が別のクラスターとして表示される。<br />
[[ファイル:scFig3.jpg|サムネイル|250px|'''図３．tSNEとUMAPによる同じデータの可視化'''<br>ニワトリ網膜の視細胞のデータを用いて作製[https://doi.org/10.1101/2020.10.09.333633<br />
}。]]<br />
<br />
==ダウンストリーム解析==<br />
===細胞クラスターの解釈とマーカー遺伝子候補の発見===<br />
scRNA-seqデータから得られる生物学的知見には、内在的に存在する細胞の種類、外部刺激や環境で変化した細胞の状態、そして種類や変化により特徴的に発現するマーカー遺伝子候補の発見がある<ref><pubmed>27824854</pubmed></ref><ref><pubmed>32033589</pubmed></ref><br />
。クラスタリングにより、異なった細胞集団の存在が認識されると、それぞれのクラスターに特徴的に発現している遺伝子を具体的に探索し、細胞集団の持つバイオマーカーによって、そのクラスターの同定が可能になる。例えば、既に神経細胞とグリア細胞に特異的に発現する典型的マーカーはよく知られており、それぞれのクラスターの識別は容易である。更に、神経細胞のタイプを区別できるマーカーや、外部刺激によって遺伝子発現が変化した神経細胞の状態は、In situ hybridizationや免疫組織化学などにより確認できる。このようなクラスターごとに発現が異なる遺伝子（差次的発現遺伝子）を見つけるためには（Differential expression analysis, DE analysis）、SeuratのFindMarkersコマンド中でも利用可能である専用コード（MAST <ref><pubmed>26653891</pubmed></ref>、DESeq2 <ref><pubmed>25516281</pubmed></ref>など）を用いることができる。scRNA-seqの解析に必要なコードは、scRNA-tools [https://www.scrna-tools.org], Awesome single cell [https://github.com/seandavi/awesome-single-cell], Bioconductor[https://www.bioconductor.org]などで紹介されており、ほとんどがダウンロード可能である。また、最新の情報については、bioRxivなどのプレプリントサーバで公開されていることが多く、scRNA-seqのデータ（下記参考）とともに、オープンサイエンス実践の好例となっている。細胞ごとの差次的発現遺伝子の可視化には、ドットプロット（dot plot）、ヴァイオリンプロット（violin plot）、リッジプロット（Ridge plot, joy plot）、UMAPなどの次元圧縮図に重ねるFeatureプロット（feature plot）などが頻繁に用いられる（図４）。<br />
[[ファイル:scFig4.jpg|サムネイル|250px|'''図３．scRNA-seqデータの可視化の例 '''<br>A. ドットプロット。B.ヴァイオリンプロット。C. リッジプロット。D. UMAPと重ねたFeatureプロット。ニワトリ網膜の視細胞のデータを用いて作製[https://doi.org/10.1101/2020.10.09.333633<br />
]。]]<br />
<br />
===偽時系列解析、遺伝子制御ネットワーク、パスウェイ解析===<br />
実験的なノイズとは別に生物学的に意味のある遺伝子発現の変動には、位置情報、[[細胞周期]]、[[概日リズム]]、発現変動が大きい破裂型プロモーターの作動などの理由で 変動が見られるものもある<ref><pubmed> 31217225 </pubmed></ref><ref><pubmed> 26000846</pubmed></ref>。特に、刺激・薬剤処理やさまざまな病態の進行や治療に伴う細胞の変化、発生途上の細胞系譜や細胞分化といった細胞の遷移状態の解析（[[軌道推定]]（Trajectory inference）；[[偽時系列解析]]Pseudo-time analysis ）には、scRNA-seqデータを用いることが効果的である<ref><pubmed>29576429</pubmed></ref><ref><pubmed>28813177</pubmed></ref><ref><pubmed>29565398</pubmed></ref>。しばしば用いられるmonocle3 <ref><pubmed>30787437</pubmed></ref>[https://cole-trapnell-lab.github.io/monocle3/]など、多くのコードを収集、比較しているサイトがある [https://dynverse.org][https://github.com/agitter/single-cell-pseudotime]。RNA velocityといった転写産物のスプライシングの状態から細胞の分化状態を推定する方法もある<ref><pubmed>30089906</pubmed></ref>。しかし、これらの方法は、あくまで発生途上の[[細胞系譜]]や細胞分化の推定に過ぎない。細胞系譜を更に確実に観察しつつ、scRNA-seqを行うことで、細胞タイプの系統関係を調べる方法として、CRISPR-Cas9を用いた[[ゲノム編集]]による記録法を導入したscGESTALT<ref><pubmed>29608178</pubmed></ref>、ScarTrace<ref><pubmed>29590089</pubmed></ref> 、LINNAEUS<ref><pubmed>29644996</pubmed></ref>、あるいはアデノシンデアミナーゼでRNA編集を行いタイムスタンプを入れる方法<ref><pubmed>33077959</pubmed></ref>がある。<br />
<br />
また細胞分化や変動に伴う特徴的な遺伝子発現をscRNA-seqで観察することは、遺伝子制御ネットワーク（例、SCENIC<ref><pubmed>28991892</pubmed></ref>, [https://github.com/aertslab/SCENIC]）や[[代謝経路]]や[[シグナル伝達系]]のための[[パスウェイ解析]](例、Metascape<ref><pubmed>30944313</pubmed></ref>, [http://metascape.org])を理解するシステム生物学的な研究として有用である。更に、scRNA-seqで得られた結果をもとに、細胞間相互作用の理解を深めるのを目的とするCellPhoneDB<ref><pubmed>32103204</pubmed></ref>[https：//github.com/Teichlab/cellphonedb]、NicheNet<ref><pubmed>3181926</pubmed></ref>, SVCA<ref><pubmed>31577949</pubmed></ref>などがある。特に、Perturb-seq<ref><pubmed>27984732</pubmed></ref> やその変法<ref><pubmed> 32231336</pubmed></ref>は、CRISPRライブラリーによるゲノム編集を施した細胞をscRNA-seqで解析することで、ゲノム編集で破壊された遺伝子の機能や遺伝子間の相互作用の理解を可能にしている後述するマルチモーダルなscRNA-seqの１つであり、注目されている。<br />
<br />
==scRNA-seqの神経科学研究への適用==<br />
===神経系細胞ビッグデータとしてのscRNA-seq===<br />
様々な神経・精神疾患について理解しその診断や治療に役立てるためには、神経細胞、[[グリア細胞]]を中心にした神経系にある細胞の種類や状態を識別し、それぞれの細胞における分子的な変化を観察することが重要である <ref><pubmed>28775344</pubmed></ref><ref><pubmed>29738987</pubmed></ref>。本本項目で解説してきたscRNA-seqの技術は、神経系に見られるそれぞれの細胞のトランスクリプトームについて[[ビッグデータ]]を提供することで、この細胞の種類や状態の識別に新たな根拠を与えつつある。近年、中枢神経系の[[アストロサイト]]、[[オリゴデンドロサイト]]、ミクログリアといったグリア細胞も均一ではなく、内在的な多様性や外部因子による状態の変動が報告されてきている。神経細胞は、著しく多様であり、この多様性が神経系を特徴づけており、その多彩で複雑な機能の発現に必須である。従来の神経科学では、神経細胞の多様性は、それぞれの神経細胞の解剖学的な位置、発現している分子、電気生理学、結合性、形態、神経伝達物質、神経伝達物質受容体とシグナル伝達によって識別されてきている。こうした神経細胞の多様性を便宜的に記述するのに、タイプ（type）、クラス（class）、サブクラス（subclass）、サブタイプ（subtype） というような用語が用いられてきた。しかし、ここでは混乱を防ぐため、Masland（2004）<ref><pubmed>15242626</pubmed></ref>が提唱し、広く受けいれられている「クラス」と「タイプ」という単語を用いることとする。タイプは、これ以上分類することができないとされる階層であり、共通性を持つタイプの集団がクラスである。例えば、大脳皮質の錐体細胞、網膜神経節細胞といった大雑把な区分はクラスである。大脳皮質の錐体細胞というクラスは、層や領野によって異なるタイプ、網膜神経節細胞には視覚情報に対して応答が異なるタイプが存在する。scRNA-seqは、「タイプ」の理解に新たな視点を提供している。<br />
<br />
===神経系へのscRNA-seqの適用===<br />
[[大脳皮質]]には、[[錐体細胞]]や[[非錐体細胞]]などの神経細胞や様々なグリア細胞などが見られ、古くから神経細胞タイプの識別が行われてきた。初期のscRNA-seq技術でも、マウス皮質の小規模な細胞数を分類した研究で、これまで知られていた主要な細胞タイプとは違うタイプが見つかりその有効性が示された<ref><pubmed>25700174</pubmed></ref>。その後のDroplet使用の3’エンドリード法を利用した多数の細胞数の解析で、更に多数の神経細胞のタイプが見つかっている<ref><pubmed>32839617</pubmed></ref><ref><pubmed>28846088</pubmed></ref><ref><pubmed>30096299</pubmed></ref><ref><pubmed>30096314</pubmed></ref><ref><pubmed>30382198</pubmed></ref><ref><pubmed>29320739</pubmed></ref><ref><pubmed>28846088</pubmed></ref>[https://doi.org/10.1101/2020.03.14.991018][https://doi.org/10.1101/2020.06.04.105700] [https://doi.org/10.1101/2020.07.02.184051]。特に、GABA作動性介在神経細胞タイプの多様性とその発生<ref><pubmed>28942923</pubmed></ref><ref><pubmed>28134272</pubmed></ref><ref><pubmed>29472441</pubmed></ref><ref><pubmed>29513653</pubmed></ref>についての情報は重要であろう。また、初期の発生過程<ref><pubmed>26940868</pubmed></ref><ref><pubmed>30485812</pubmed></ref><pubmed>31073041</pubmed></ref><ref><pubmed>30635555</pubmed></ref><ref><pubmed>30625322</pubmed></ref>、老化<ref><pubmed>31551601</pubmed></ref><の理解が、scRNA-Seq技術を利用することで進んでいる。更に、[[神経活動]]によって変化するトランスクリプトームの変化も細胞ごとに調査され興味深い<ref><pubmed>29230054</pubmed></ref> 。 ヒトを含めた霊長類の大脳についても発達段階を含めてscRNA-seqが適用されてきている<ref><pubmed>26060301</pubmed></ref><ref><pubmed>27339989</pubmed></ref><ref><pubmed>29539641</pubmed></ref><ref><pubmed>29217575</pubmed></ref><ref><pubmed>28846088</pubmed></ref><ref><pubmed>29227469</pubmed></ref><ref><pubmed>31303374</pubmed></ref><ref><pubmed>29867213</pubmed></ref><ref><pubmed>31435019</pubmed></ref><ref><pubmed>32424074</pubmed></ref> [https://doi.org/10.1101/709501[https://doi.org/10.1101/2020.03.31.016972][https://doi.org/10.1101/2020.04.23.056390]。ヒトや霊長類に特徴的とされる[[島]]のvon Economo神経細胞（紡錘細胞）のような希少な神経細胞のscRNA-seqにも成功している<ref><pubmed>32127543</pubmed></ref>。<br />
<br />
[[海馬]]<ref><pubmed>29241552</pubmed></ref><ref><pubmed>29912866</pubmed></ref><ref><pubmed>29335606</pubmed></ref><ref><pubmed>31942070</pubmed></ref>では、これまでの研究で記載されてきた神経細胞のタイプの存在が確認され、更に新規のタイプが見つかった。中枢神経系では、その他、[[外側膝状体]]<ref><pubmed>29343640</pubmed></ref>、[[大脳基底核]](足底核)<ref><pubmed>28384468</pubmed></ref> 、[[視床下部]]<ref><pubmed>28166221</pubmed></ref><ref><pubmed>28355573</pubmed></ref> <ref><pubmed>27991900</pubmed></ref><ref><pubmed>30385464</pubmed></ref> <ref><pubmed>31249056</pubmed></ref><ref><pubmed>30858605</pubmed></ref>、[[線条体]]<ref><pubmed>27425622</pubmed></ref><ref><pubmed>30134177</pubmed></ref><ref><pubmed>31875543</pubmed></ref>、[[中脳]]<ref><pubmed>27716510</pubmed></ref><ref><pubmed>29499164</pubmed></ref> <ref><pubmed>30718509</pubmed></ref> 、[[手綱]]<ref><pubmed>29576475</pubmed></ref>、発生中の[[間脳]]<ref><pubmed>30872278</pubmed></ref> 、さらに[[小脳]]<ref><pubmed>30220501</pubmed></ref><ref><pubmed>30735127</pubmed></ref><ref><pubmed>30690467</pubmed></ref>などの結果が得られている。マウスの小脳においては、分子層にこれまでの星状細胞、バスケット細胞というカテゴリーとは違ったギャップジャンクションに特徴を持つ２種類の神経細胞があることが示唆されている[https://doi.org/10.1101/2020.03.04.976407]。<br />
<br />
脳の外部では、[[運動神経]][ https://doi.org/10.1101/2020.03.16.992958]、[[感覚神経]]<ref><pubmed>25420068</pubmed></ref><ref><pubmed>26691752</pubmed></ref>、[[らせん神経節]]<ref><pubmed>30078709</pubmed></ref><ref><pubmed>30209249</pubmed></ref> 、[[臭覚神経]]<ref><pubmed>26541607</pubmed></ref> <ref><pubmed>32059767</pubmed></ref>、[[腸神経系]] <ref><pubmed>29483303</pubmed></ref>[https://doi.org/10.1101/2020.03.02.955757] 、[[網膜]]<ref><pubmed>27565351</pubmed></ref><ref><pubmed>29909983</pubmed></ref><ref><pubmed>30018341</pubmed></ref><ref><pubmed>31260032</pubmed></ref><ref><pubmed>31128945</pubmed></ref><ref><pubmed>30712875</pubmed></ref><ref><pubmed>30548510</pubmed></ref><ref><pubmed>31075224</pubmed></ref><ref><pubmed>31399471</pubmed></ref><ref><pubmed>31848347</pubmed></ref><ref><pubmed>31673015</pubmed></ref><ref><pubmed>31653841</pubmed></ref><ref><pubmed>31784286</pubmed></ref>[https://doi.org/10.1101/2020.02.26.966093][ https://doi.org/10.1101/779694][https://www.biorxiv.org/content/10.1101/617555][A]でのscRNA-seqデータがある。また[[iPS細胞]]や[[ES細胞]]由来の神経組織[[オルガノイド]]に含まれる神経細胞タイプを知る上でも利用されている<ref><pubmed>28094016</pubmed></ref><ref><pubmed>28279351</pubmed></ref><ref><pubmed>31168097</pubmed></ref><ref><pubmed>31996853</pubmed></ref><ref><pubmed>31968264</pubmed></ref><ref><pubmed><ref><pubmed>32221280</pubmed></ref></pubmed></ref>。<br />
<br />
===神経細胞以外の細胞===<br />
[[上衣細胞]]<ref><pubmed>29727663</pubmed></ref>は、[[神経幹細胞]]としての役割が示唆されてきたが、scRNA-seqによる解析ではその可能性が支持されなかった。グリア細胞では、[[ラジアルグリア]]<ref><pubmed>26406371</pubmed></ref><ref><pubmed>25734491</pubmed></ref><ref><pubmed>29281841</pubmed></ref><ref><pubmed>29217575</pubmed></ref><ref><pubmed>29539641</pubmed></ref>[A]、アストロサイト<ref><pubmed>32139688</pubmed></ref><ref><pubmed>32203496</pubmed></ref>[ https://doi.org/10.1101/2020.04.27.064881]に多様性があることが示唆されてきている。また、オリゴデンドロサイト<ref><pubmed>27284195</pubmed></ref><ref><pubmed>30078729</pubmed></ref><ref><pubmed>30257220</pubmed></ref><ref><pubmed>30747918</pubmed></ref><ref><pubmed>31958186</pubmed></ref>[https://doi.org/10.1101/2020.03.06.981373] [A]については、これまで細胞生物学的に研究されてきた分化の過程がscRNA-seqにより検出されている。ミクログリアは、神経系の発達、老化、損傷などに伴うトランスクリプトームの変化がscRNA-seqにより詳細に明らかになった<ref><pubmed>27338705</pubmed></ref><ref><pubmed>29020624</pubmed></ref><ref><pubmed>30206190</pubmed></ref><ref><pubmed>30471926</pubmed></ref><ref><pubmed>31209379</pubmed></ref><br />
<ref><pubmed>31835035</pubmed></ref>。また、[[CNS境界関連マクロファージ]](BAM) <ref><pubmed>31061494</pubmed></ref>や[[脳血管系]]<ref><pubmed>29443965</pubmed></ref>のscRNA-seqも実施されている。<br />
<br />
===疾患===<br />
scRNA-seqは、疾患の理解にも有用である。筋萎縮性側索硬化症<ref><pubmed>30948552</pubmed></ref>、多発性硬化症<ref><pubmed>30747918</pubmed></ref><ref><pubmed>30420755</pubmed></ref><ref><pubmed>32313246</pubmed></ref> <br />
、アルツハイマー病やそのモデル動物<ref><pubmed>31042697</pubmed></ref><ref><pubmed>31399126</pubmed></ref><ref><pubmed>29020624</pubmed></ref><br />
[https://doi.org/10.1101/628347]<ref><pubmed>28602351</pubmed></ref><ref><pubmed>32341542</pubmed></ref>、統合失調症<ref><pubmed>29785013</pubmed></ref><ref><pubmed>32203495</pubmed></ref>、自閉症やレット症候群<ref><pubmed>31097668</pubmed></ref><ref><pubmed>30455458</pubmed></ref>、シャルコー・マリー・トゥース病<ref><pubmed>29888333</pubmed></ref>、ダウン症[https://www.biorxiv.org/content/10.1101/2020.01.01.892398v1]、パーキンソン病<ref><pubmed>30503143</pubmed></ref> <ref><pubmed>32826893</pubmed></ref>、がん<ref><pubmed>31327527</pubmed></ref><ref><pubmed>28360267</pubmed></ref>などに適用されている。<br />
<br />
<br />
==scRNA-seqの展望==<br />
===神経系の多様性と進化===<br />
NGSを用いることで、どんな生物種にも適用可能なscRNA-seqは、既に多様な生物の神経系の細胞の理解、更には種間の相同性や差異の研究に利用されており、神経系の進化を細胞レベルで考察するのに有用であろう（例、センチュウ<ref><pubmed> 28818938 </pubmed></ref>、ショウジョウバエ <ref><pubmed>29909982</pubmed></ref><ref><pubmed>29149607</pubmed></ref><ref><pubmed>30703584</pubmed></ref><ref><pubmed>29909983</pubmed></ref>、カタユウレイボヤCiona intestinalis <ref><pubmed>30069052</pubmed></ref><ref><pubmed>30228204</pubmed></ref>、ゼブラフィッシュ<ref><pubmed>31018142</pubmed></ref><ref><pubmed>30929901</pubmed></ref>、アカミミガメTrachemys scripta elegans、トカゲPogona vitticeps, pv<ref><pubmed>29724907</pubmed></ref>、ニワトリ[https://doi.org/10.1101/2020.10.09.333633]、霊長類<ref><pubmed>30730291</pubmed></ref><ref><pubmed>31619793</pubmed></ref>[https://doi.org/10.1101/2020.03.31.016972]）。ただ、遺伝子やトランスクリプトームの研究が進んでいる生物種では比較的容易であるが、遺伝子のアノテーションが十分でない生物種を用いる場合、scRNA-seqのデータ解析は困難を伴う。また種を超えた細胞タイプの相同性の理解には様々な工夫が必要である<ref><pubmed>31552245</pubmed></ref><ref><pubmed>30712875</pubmed></ref>>[https://doi.org/10.1101/2020.03.31.016972]。<br />
<br />
===データベースと統合===<br />
獲得されたscRNA-seqのデータは様々な目的で利用できるので、データベース化し利用できるようにする必要がある。神経系のトランスクリプトーム一般のデータベースが多数公開されており<ref><pubmed>29437890</pubmed></ref>、scRNA-seqのデータも基本的にNCBIのGene Expression Omnibus[https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/]に登録されている。また、オープンサイエンス推進のためにcommon coordinate framework (CCF) やcentral annotation platform (CAP)という概念のもと、特にscRNA-seqを意識したものとして、米国のBRAIN Initiative Cell Census Consortium<ref><pubmed>29096072</pubmed></ref> 、Human Cell Atlas ProjectのHuman Cell Atlas Data Portal [https://data.humancellatlas.org]、そのマウス版であるTabula Muris <ref><pubmed>30283141</pubmed></ref>[https://genome.ucsc.edu/cgi-bin/hgTrackUi?db=mm10&g=tabulaMuris]やSten Linnarssonラボのマウス脳発生データベース[http://mousebrain.org]、アレン脳研究所のAllen Brain Atlas [https://portal.brain-map.org]、ブロード研究所のSingle Cell Portal [https://singlecell.broadinstitute.org/]などのデータベースが稼働している。また、異なった方法や実験で得られたscRNA-seqのデータを体系的に比較することも重要であり、CCA (Canonical correlation analysis)<ref><pubmed>29608179</pubmed></ref>, Seurat 3.0以降に組み込まれたMMN (Mutual Nearest Neighbors)、LIGER<ref><pubmed>31178122</pubmed></ref> 、Harmony<ref><pubmed>31740819</pubmed></ref> 、MetaNeighber<ref><pubmed>29491377</pubmed></ref>、Conos<ref><pubmed>31308548</pubmed></ref>のようなアルゴリズムが開発され、統合サイトもでき始めている（[https://biccn.org]）。<br />
<br />
===空間トランスクリプトミクス===<br />
多数の細胞を扱うscRNA-seqの弱点は、組織から細胞や細胞核を解離する必要があるので、その細胞が存在していた解剖学的あるいは空間的な位置の情報を消去してしまうということである。組織切片におけるタンパク質などの分布は免疫組織化学、mRNAの分布はin situ hybridizationで検出することができるが、数多くのmRNAの分布を情報処理技術と組み合わせ一気に同定する方法がscRNA-seqと同様に開発されてきている（Slide-seq<ref><pubmed>30923225</pubmed></ref>[ https://doi.org/10.1101/2020.03.12.989806]、HDST<ref><pubmed>31501547</pubmed></ref>、Expansion sequencing[http://doi.org/10.1101/2020.05.13.094268]など<ref><pubmed>27365449</pubmed></ref>, <ref><pubmed>31932730</pubmed></ref> <ref><pubmed>30948552</pubmed></ref>）、更に10x Genomics社が市販するVisiumなどがある。現状では、大きな組織の空間トランスクリプトミクスは、空間解像度が細胞レベルにいたっておらず、技術普及の観点からも課題が多い。しかし、そのデータを解析するためのアルゴリズム<ref><pubmed>29553578</pubmed></ref><ref><pubmed>29553579</pubmed></ref><ref><pubmed>32350282</pubmed></ref> [https://doi.org/10.1101/757096][ https://doi.org/10.1101/701680] [https://doi.org/10.1101/431957]。<br />
更にMerFish <ref><pubmed>25858977</pubmed></ref>、corrFISH <ref><pubmed>27271198</pubmed></ref>のように、subcellularレベルで多数のmRNAを検出する方法が開発されてきており（<ref><pubmed>25549890</pubmed></ref> osmFISH<ref><pubmed>30377364</pubmed></ref> 30377364、STARmap (spatially-resolved transcript amplicon readout mapping) <ref><pubmed>29930089</pubmed></ref>、seqFISH+<ref><pubmed>27764670</pubmed></ref>、pciSeq(probabilistic cell typing by in situ sequencing)[ https://doi.org/10.1101/431957]、DSP(Digital Spatial Profiling) <ref><pubmed>32393914</pubmed></ref>）<br />
、scRNA-seqと組み合わせることで、その弱点を補う空間トランスクリプトミクスにも利用され始め<ref><pubmed>30385464</pubmed></ref>[https://doi.org/10.1101/2020.06.04.105700]、今後の発展が期待される。<br />
<br />
<br />
===マルチモーダルなシングルセルオミクス===<br />
同一の細胞からscRNA-seqの情報だけでなく、ゲノム配列、ATAC-seqなどによるエピゲノム解析、少数のタンパク質、あるいはプロテオームなどを、同時に記録するマルチモーダルなオミクスが注目されている<ref><pubmed>31907462</pubmed></ref><ref><pubmed>30696980</pubmed></ref>。2019年には、Nature Methodsの「Methods of the Year」に選ばれており、現状については、その特集号などを参考にされたい。例えば、細胞表面分子に対する抗体にDNAを付加することで、マーカーを発現する細胞のトランスクリプトームを観察するCITE-seq<ref><pubmed>28759029</pubmed></ref>、 REAP-seq<ref><pubmed>28854175</pubmed></ref>は既知の細胞表面マーカーの発現とscRNA-seqが同時に観察できるマルチモーダルなオミクスである。<br />
<br />
マルチモーダルなシングルセルオミクスとして、神経科学分野で注目されるのは、scRNA-seqをパッチクランプによる電気生理学的情報と組み合わせたPatch-seq<ref><pubmed>26689544</pubmed></ref> <ref><pubmed>26689543</pubmed></ref>である。また、ゲノムDNAとscRNA-seqを同時に観察することによって、近年、精神疾患の観点から注目されている発生途中で生じる遺伝子変異を研究するPRDD-seqは今後の展開が注目される[https://doi.org/10.1101/2020.04.19.046904]。最後に、BARseq (barcoded anatomy resolved by sequencing) <ref><pubmed>31626774</pubmed></ref>、CONNECTID[https://doi.org/10.1101/378760<br />
]、Epi-Retro-seq[https://doi.org/10.1101/2020.04.01.019612]のような方法は、コネクトーム（神経細胞の結合性）と遺伝子発現を記録できるオミクスの新たな方向として興味深い。<br />
<br />
<br />
== 関連項目 ==<br />
*[[ゲノムワイド関連解析 ]]<br />
*[[ディファレンシャルディスプレイ ]]<br />
*[[In situハイブリダイゼーション法 ]]<br />
*[[免疫組織化学法]]<br />
*[[エピジェネティクス]]<br />
== 参考文献 ==<br />
<references /></div>
Masahitoyamagata
https://bsd.neuroinf.jp/w/index.php?title=%E3%82%B7%E3%83%B3%E3%82%B0%E3%83%AB%E3%82%BB%E3%83%ABRNA%E3%82%B7%E3%83%BC%E3%82%B1%E3%83%B3%E3%82%B7%E3%83%B3%E3%82%B0&diff=44949
シングルセルRNAシーケンシング
2020-10-26T01:58:11Z
<p>Masahitoyamagata: </p>
<hr />
<div><div align="right"> <br />
<font size="+1">[http://researchmap.jp/yamagatm 山形方人]</font><br><br />
''Harvard University''<br><br />
DOI：<selfdoi /> 原稿受付日：年月日 原稿完成日：年月日<br><br />
担当編集委員：<br><br />
</div><br />
<br />
英：single cell RNA sequencing, scRNA-seq<br />
{{box|text=<br />
シングルセルRNAシーケンシング(single cell RNA sequencing, 以下scRNA-seq)は、[[次世代シーケンシング]] （next generation sequencing、以下NGS）技術を使用して個々の細胞が発現しているmRNA全体、つまり[[トランスクリプトーム]]を質的、量的に網羅的に調べ、細胞ごとの違いを高解像度で検出、分類することで、細胞の分類を行うことができる分子生物学的、コンピュータ生物学的技術である。また、刺激、発生など細胞の状況に応じて、個々の細胞のトランスクリプトームの情報を得ることで、病態や細胞系譜などの解析も可能である。特に多様な神経細胞が存在する神経系では、この方法により、神経細胞や非神経細胞の分類や状態についての知見が深まり、更に新しいマーカーや機能遺伝子の発見などが系統的かつ網羅的に行われるようになった。}}<br />
<br />
==scRNA-seqとその開発史==<br />
===トランスクリプトーム===<br />
トランスクリプトーム（transcriptome）は、細胞中に存在する全ての転写産物（タンパク質をコードするmRNA、タンパク質をコードしない[[ノンコーディングRNA]]、[[マイクロRNA]]など）の総体である<ref><pubmed>19015660</pubmed></ref><ref><pubmed>31341269 </pubmed></ref>。トランスクリプトームは、[[ゲノム]]とは異なり、同一の個体でも、組織ごとに、更には発生段階や細胞外環境や刺激によって変化する。トランスクリプトームは、同質あるいは異質の多数の細胞集団（組織、培養細胞）からRNA抽出後、cDNAに変換し、それを1990年代に出現した[[DNAマイクロアレイ]]のように数多くの既知mRNAを識別する技術によって解析されるようになった。その後、NGSの利用により、希少mRNAやノンコーディングRNAを含めた未知の転写産物の高感度検出が可能になるとともに、[[スプライシング]]で成熟していく過程のmRNAなど、転写産物の種類だけでなく、転写産物の構造的差異（スプライシングバリアント、SNPs、変異など）の解析もできるようになった。加えて、ヒトやモデル実験生物（[[マウス]]、[[ゼブラフィッシュ]]、[[ショウジョウバエ]]、[[センチュウ]]など）だけでなく、多種多様な生物のトランスクリプトームの把握も可能になった。ここでは、このような多数の細胞集団、つまり個体や特定の組織全体ではなく、細胞1つの持つトランスクリプトームを解析する方法（scRNA-seq）とそのscRNA-seqデータを利用することで得られる情報について概説する。<br />
<br />
===scRNA-seqとその開発史===<br />
1つの細胞の持つ生体物質を解明し、定量しようとする試みは古くからあった。1960年代になると、フローサイトメトリーを利用した[[蛍光活性化セルソーティング]]（Fluorescence-activated cell sorting, FACS）が発明され、標識抗体などのプローブと組み合わせることで、多数の細胞集団の中で１つの細胞が持っている分子の種類や量についての断片的な研究が可能になり、この方法は現在でも汎用されている<ref><pubmed>22271369</pubmed></ref>。その後、[[免疫組織化学]]や[[in situ hybridization]]nなどにより、タンパク質やmRNAの種類や量が観察できるようになり、組織中に存在するそれぞれの細胞の同定などに活用されてきている。最近では、それぞれの細胞が持つ抗原分子を、異なった金属イオンで標識した抗体とフローサイトメトリーを組み合わせた方法で検出する[[マスサイトメトリー]]（CyTOFなど）も開発されてきている<ref><pubmed>27153492</pubmed></ref>。<br />
<br />
1つの細胞内にある全RNA（ribosomal RNAを含む）は細胞種にもよるが1-50pgである。そのうち、mRNAの占める割合は1-5%程度である<ref><pubmed>15239941</pubmed></ref>。この微量のmRNAをcDNAに変換してから大幅に増幅できる方法が発明されたことで、1つの細胞が発現するmRNAを高感度で検出できるようになった<ref><pubmed>1557406</pubmed></ref><ref><pubmed>7541630</pubmed></ref> 。例えば、1991年、Linda BuckとRichard Axelは、[[嗅覚受容体]]が[[Gタンパク質]]であると仮定し、個々の嗅覚細胞で特異的に観察されるGタンパク質mRNAを比較することで、嗅覚受容体の同定に成功した<ref><pubmed>1840504</pubmed></ref>。1995年になると、Catherine DulacとRichard Axelは、異なる[[鋤鼻神経細胞で特異的]]に発現する遺伝子を１つの細胞から作製したcDNAライブラリーを比較するディファレンシャル・スクリーニングを行うことで、[[フェロモン受容体]]を同定した<ref><pubmed>7585937</pubmed></ref>。同じ手法で異なる種類の神経細胞で発現している遺伝子も同定され<ref><pubmed>9778248</pubmed></ref><ref><pubmed>12230981</pubmed></ref>、１つの細胞の持つトランスクリプトームを比較するアプローチが神経細胞で特徴的に発現している遺伝子の同定に効果的なことを示した。<br />
<br />
一方で多くの種類のmRNAを１細胞レベルで一挙に観察するトランスクリプトームのための技術にはブレークスルーが待たれた。1つの問題は多種類のcDNAを簡便に識別することを可能にする方法の開発であった。これを可能にしたのが、[[PCR]]などのcDNA増幅法の改良とマイクロアレイの利用であった<ref><pubmed>12736331</pubmed></ref><ref><pubmed>16547197</pubmed></ref>。しかしながら、細胞ごとに高価なマイクロアレイを使用することは、多数の細胞のトランスクリプトームの観察には限界があった。2009年になると、これらの問題を解決できる可能性として、NGSを利用するscRNA-seqプロトコールがAzim Suraniのグループによって報告された<ref><pubmed>19349980</pubmed></ref>。しかしながら、この報告でもわずか8個の細胞の解析に留まっており、1つの細胞ごとに処理を行うという操作が必要で、多数の細胞についてのトランスクリプームを一挙に理解することはできなかった。また、塩基配列の違うcDNAごとにPCR効率に差がある結果生じる増幅バイアス、また3’末端側が選択的に補足されることなどの課題を残した。<br />
<br />
===scRNA-seqの現状===<br />
• その後、5’末端側も含めた完全長cDNAを増幅するscRNA-seqのプロトコールが考案された。特に、SMART-seq（Switch mechanism at the 5' End of RNA Templates）<ref><pubmed>22820318</pubmed></ref>およびその改良されたプロトコールであるSMART-seq2<ref><pubmed>24056875</pubmed></ref> <ref><pubmed>24385147</pubmed></ref>の使用例が多い（既に、SMART-seq3という改良プロトコールもある<ref><pubmed>32518404</pubmed></ref>が、以下SMART-seqと呼ぶ）。また、類似法としてSTRT（single-cell tagged reverse transcription）<ref><pubmed>21543516</pubmed></ref>がある。更に、MARS-seq（Massively parallel single-cell RNA-seq）<ref><pubmed>24531970 </pubmed></ref>、CEL-seq（Cell Expression by Linear amplification and Sequencing）<ref><pubmed>22939981</pubmed></ref>、CEL-seq2<ref><pubmed> 27121950 </pubmed></ref>では、[[T7 RNAポリメラーゼ]]による[[in vitro転写]]を用いることにより、PCRで顕著な増幅バイアスを減少させようとしている。<br />
増幅バイアス除去のアプローチとして特に重要なのは、2011年に発表された分子識別子（unique molecular identifiers: UMI）を持つcDNAを増幅させ、NGS後の情報処理を用いる方法である<ref><pubmed>22101854</pubmed></ref>。この方法では逆転写反応の際、ランダムなUMIをcDNA末端に付加した後、増幅反応、NGSを行い、cDNA配列とUMI配列の両方を読む。同一のUMIを持っていれば、逆転写時に同一のcDNA由来とカウントする。UMIをカウントすることで、増幅前のmRNAのコピー数を知ることができる<ref><pubmed>21543516</pubmed></ref><ref><pubmed>24363023</pubmed></ref><ref><pubmed>28192419</pubmed></ref> <ref><pubmed>29474909</pubmed></ref><ref><pubmed> 28818938 </pubmed></ref><ref><pubmed>29545511</pubmed></ref>。2013年には、このような１細胞のシーケンシング技術が、Nature Methods誌のMethod of the Year に選ばれた[https://www.nature.com/collections/mysbdwgfll]。<br />
<br />
これらの方法のうち、SMART-seqは、マイクロピペットによる捕獲、セルソーター、[[レーザー捕獲]]などを用いるマルチウェル法、あるいは半導体集積回路製作技術で作った流体集積回路を利用するFluidigm C1の装置[https://jp.fluidigm.com]と組み合わせることで利用される機会が多い<ref><pubmed>30405621</pubmed></ref>[https://doi.org/10.1101/742304]。このSMART-seqプロトコールの特徴は、全長トランスクリプトームを得ることができることであり、mRNAのスプライシングバリアントなどのアイソフォーム、アリルごとの発現情報が得られるSNPs、変異の検出にも利用できる。また、それぞれ細胞ごとの反応を独立した場所で行うため、別の細胞の反応と混じる可能性がない。更に小さなウェルを用いるSeq-Wellも同様である<ref><pubmed>28192419</pubmed></ref>[。これらの点が、次に説明するDropletを使用して3’末端のみを標的にしたscRNA-seqに比べた場合の長所であるが、その高コスト（1細胞あたり数十ドル）と処理可能な細胞数の少なさが短所である。<br />
<br />
===Droplet使用の3’エンドリード法===<br />
しかしながら、もっとも重要なscRNA-seqの方法論についての進歩は、2015年、Harvard Medical Schoolの独立した２つのグループが、inDrops<ref><pubmed>26000487</pubmed></ref>そしてDrop-seq<ref><pubmed>26000488 </pubmed></ref>という類似した2つの高スループットな方法を開発したことであろう（inDropsはT7RNAポリメラーゼ、Drop-seqはPCRで増幅）。これらの方法では、[[マイクロ流体力学]] (Microfluidics) 、 UMI（上述）と細胞ごとのCell Barcodeという2種類のDNAバーコーディング、そしてNGSと情報解析を利用している。そして、多く細胞のサンプル調製の自動化と容易さから、1つの細胞あたりに要するコストを大幅に低下させることに成功した（Drop-seqは発表時で、１細胞あたり約5セント）。つまり、細胞1つずつをマイクロ流体力学によるエマルジョン技術を利用した装置に流入させ、その１細胞を1つのDroplet（油中水滴）に自動的に閉じ込める。そのDroplet中には、DropletごとにCell barcode/UMIとしてユニークなDNAバーコードを持つゲルビーズ(Gel Beads in Emulsion, GEMs)が入っており、それを足場に3’末端のみを標的にしたcDNA合成反応を実施することで、同じ細胞に含まれていたmRNAが同じCell barcodeを持つcDNAとして合成され、そのmRNA/cDNAが由来した細胞を識別できるということを利用している（図１）。なお、DropSeqはコストが低いが、細胞の取得率と検出感度が低い弱点がある。inDropsはDropSeqより細胞取得率が高く、パラメータを調整することにより、低レベルで発現される遺伝子の検出にも有利であるとされる<ref><pubmed>30472192</pubmed></ref>。<br />
[http://www.youtube.com/watch?v=fHq9ewdYEWM]<br />
DropSeqのセットアップはDolomite Bio ([https://www.dolomite-bio.com])、inDropは1 Cellbio社から販売されている[https://1cell-bio.com]。しかし、特に重要なのは10x Genomics社が同様の原理を用いた「Chromium」と命名された機器と試薬のシステムを市販することで、多くの研究者に利用できることになったことである[https://www.10xgenomics.com/jp/]。Svenssonらによる最近のデータベース[https://doi.org/10.1101/742304], [http://www.nxn.se/single-cell-studies/gui]では、scRNA-seqを用いた論文で用いられた方法について調査しているが、この数年、10x Genomics社Chromiumを用いた論文が飛躍的に増加し、scRNA-seqの方法として一般的になりつつあることがわかる（現在、10x Genomics社とBioRad社の間で関連特許をめぐる係争がある。）。このシステムは市販であるので導入が容易であり、DropSeqやinDropsに比べ多くの転写産物の高感度検出が可能であるが、ランニングコストは高い<ref><pubmed>30472192</pubmed></ref>。なお、3’エンドリード法だけでなく、N末端側に位置する抗体の可変領域などの検出には5’エンドリード法が利用されることがある。<br />
[[ファイル:ScRNAseqFig1.jpg|サムネイル|250px|'''図1．Droplet使用の3’エンドリード法 '''<br>組織から解離させた細胞それぞれを、マイクロ流体力学を利用した装置で、バーコードプライマーが結合したゲルビーズとともにオイルドロップレットに封じ込める（本文参照）]]<br />
<br />
==scRNA-seqの実際==<br />
ここでは主流になっている10x Genomics社のChromiumを用いた方法とSMART-seqなどを用いた方法に共通する方法の実際について俯瞰する。scRNA-seqの利用には、4つのステップがある（図２）<ref><pubmed>30089861</pubmed></ref>。１）個体や組織を採集し、そこから細胞あるいは細胞核を個別にすること。２）ChromiumやSMART-seqなどによる個々の細胞からのライブラリーの作製とNGS。３）前処理（preprocessing、得られた配列の整理）。４）ダウンストリーム解析（生物学的な情報を得るコンピューター生物学）。これらのうち、２）の段階については、上に記述したように市販の機器や試薬を利用する機会が多くなっているので、そのためのマニュアル等が参考になるはずである。<br />
[[ファイル:ScRNAseqFig2b.jpg|サムネイル|250px|'''図２．scRNA-seqの実際のステップ '''<br>細胞の単離、ライブラリ作製とNGS、データの前処理から次元圧縮、ダウンストリーム解析。図の一部は2016 DBCLS TogoTV、あるいはR-studio/Seuratを用いて10x Genomics社のPBMCデータ（[https://support.10xgenomics.com/single-cell-gene-expression/datasets]から執筆者が作製。]]<br />
<br />
===組織からの細胞、細胞核の分離===<br />
血液細胞のように浮遊した細胞ではない場合、物理的あるいは酵素処理などによって解離することで、生組織から状態の良いバラバラになった細胞を調製する必要がある。神経系組織の酵素処理には、パパインを用いる方法が広く用いられている。ここで、しばしば問題となるのが、酵素処理のため短時間加温することで、発現量が変化する遺伝子が存在することである<ref><pubmed>27090946</pubmed></ref>。例えば、脳の[[ミクログリア]]の解析には、低温下で組織をホモゲナイズするなどの工夫が必要であった<ref><pubmed>30471926</pubmed></ref>。また、このような現象を抑制するために、酵素処理時に転写阻害剤である[[アクチノマイシン]]で処理したり<ref><pubmed>29024657</pubmed></ref>、ヒマラヤ氷河から得られた細菌Bacillus licheniformisから得られた低温プロテアーゼを用いる方法も報告されている<ref><pubmed>28851704</pubmed></ref>。また、細胞解離後に、メタノールで固定しscRNA-seqに使用することも可能である<ref><pubmed>28526029</pubmed></ref>。<br />
<br />
単離した細胞は、そのまま10x GenomicsのChromiumのプラットフォームに導入することができるが、抗体や蛍光タンパク質レポーターなどを用いたFACS、[[パニング]]、MACS(磁気ビーズカラム)などによる特定のマーカーを細胞表面などに発現する細胞の選択的濃縮や除去を行う場合もある。更に、抗体に抗体表示バーコードDNAをカップリングさせるCITE-seq(Cellular Indexing of Transcriptomes and Epitopes by Sequencing) については、下記のマルチモーダルなオミクスの項目で述べる。<br />
<br />
なお、ヒト組織や希少生物などから生細胞を得ることは困難なことが多い。この場合、scRNA-seqの変法として、凍結した組織から、各細胞由来の核を調製し、核内のmRNAを分析するsnRNA-seq (single-nucleus RNA-seq)が利用されている。ただ、snRNA-seqでは、FACSなどによる特定細胞集団の同定が困難であることが多く、細胞質を持つ生細胞を利用した場合より検出できる遺伝子数が少なく同等な結果が必ずしも得られない<ref><pubmed>24248345</pubmed></ref><ref><pubmed>26890679</pubmed></ref> <ref><pubmed>27471252</pubmed></ref><ref><pubmed>28846088</pubmed></ref><<ref><pubmed>29220646</pubmed></ref><ref><pubmed>28846088</pubmed></ref><ref><pubmed>30586455</pubmed></ref><ref><pubmed>28729663</pubmed></ref><ref><pubmed>31728515</pubmed></ref><ref><pubmed>32341560</pubmed></ref> <ref><pubmed>32518403</pubmed></ref>。一方で、snRNA-seqでは、組織をそのまま凍結することから開始するので、上述したscRNA-seqの内在的な問題である酵素処理や加温などを避けることができる。更に、大きな細胞はマイクロ流体力学の流路で詰まりやすいなど、細胞の大きさに伴うバイアスを減らすことができるといったメリットもある。こうしたプロトコールの一部は、protocols.ioのHuman Cell Atlasのグループ[https://www.protocols.io/groups/hca]で公開されている。<br />
<br />
更に、RNAを分析するscRNA-seqではないが、遺伝子発現との関係が想定される[[オープンクロマチン]]領域を[[トランスポゾン]]を用いることで個々の細胞レベルで選択的に検出するsingle cell ATAC-seq (Assay for Transposase-Accessible Chromatin)やsnATAC-seq <ref><pubmed>26083756</pubmed></ref>, <ref><pubmed>29434377</pubmed></ref><ref><pubmed>25953818</pubmed></ref>, single cell THS-seq (transposome hypersensitive-site) <ref><pubmed>29227469</pubmed></ref>、や[[DNAメチル化]]領域を観察するsnmC-seqのような方法も利用されている<ref><pubmed>28798132</pubmed></ref><ref><pubmed>30237449</pubmed></ref>。<br />
<br />
<br />
===scRNA-seqデータの前処理===<br />
10x Genomics社のChromium、Illumina社のNGSを利用した場合、Cell Ranger(Linux上で作動)を用いて、各生物種ごとのレファレンス配列リスト（[https://www.ncbi.nlm.nih.gov/grc]）やEggNOG ([http://eggnogdb.embl.de])などを利用し、細胞とトランスクリプトームの対応マトリックスを作製する。その後のデータの処理についても、10x Genomics社がソフトウェアLoupeを提供している。しかしながら、その後のダウンストリーム解析を考慮して、[[R言語]], [[Python]], MATLABなどのデータ解析のための汎用プログラミング言語やコードで扱えるオブジェクトに変換するのが通常である。ここでは、scRNA-seqデータ解析のために最もよく利用されているR言語を用いたパッケージ「Seurat」<ref><pubmed> 29608179 </pubmed></ref> <ref><pubmed> 31178118 </pubmed></ref>を中心に紹介したい。また、その一部はUniversity of WashingtonのCole Trapnell研究室で開発したMonocle3でも可能である（[https://cole-trapnell-lab.github.io/monocle3/]）。Pythonを利用したものでは、ドイツ・ミュンヘンInstitute of Computational Biologyの Fabian Theisらが開発しているScanpyが有名である<ref><pubmed> 29409532</pubmed></ref>。<br />
<br />
New York UniversityのRahul Satija研究室が開発しているSeuratは、scRNA-seqデータ解析のために広く利用されているRパッケージであり、2020年秋現在、その最新バージョンはSeurat4のβバージョンが公開されている。論文の正式発表前から、サポート情報提供やコード修正なども頻繁に行っており、Satija研究室のウェッブサイト（ [http://satijalab.org/Seurat]）、Github([https://github.com/satijalab/Seurat])、更にTwitterアカウント（@satijalab）などで最新情報を得ることできる。<br />
<br />
最初に行うのは、scRNA-seqデータの品質管理である。ここでは、質の低い細胞のデータ（転写産物の種類が少なく、ミトコンドリア由来の転写産物が多い）を取り除く。また、複数の試料を組み合わせる場合には、バッチごとの違いについて検討する<ref><pubmed>29608177</pubmed></ref>。現実には、実験ごとのバッチの違いによる影響がscRNA-seqの最も大きい問題であり、実験のデザインを工夫する必要がある。また、Dropletを使用するscRNA-seqでしばしば問題になるのが、Dropletに２つ以上の細胞が封じ込められ、それらが同一のCell barcodeを持ってしまうアーティファクトである。通常Doubletと呼ばれるこの問題はダウンストリーム解析を混乱させるので、細胞単離の段階から注意する必要があるが、細胞集団に特徴的なマーカー遺伝子が知られていればscRNA-seqデータ取得後にも、データ処理で検討することは可能である。この問題を解決する新たなアプローチも試みられている<ref><pubmed>30954476</pubmed></ref> <ref><pubmed>31836005</pubmed></ref><ref><pubmed>31856883</pubmed></ref> [https://doi.org/10.1101/2019.12.17.879304][https://doi.org/10.1101/699637]。<br />
<br />
このようなノーマライゼーションの過程を経て、scRNA-seqのデータ解析において、最初に行うのが、[[次元圧縮]] (dimensionality reduction)である<ref><pubmed>30617341</pubmed></ref><ref><pubmed>31780648</pubmed></ref>。PCA (Principal component analysis, 主成分分析)、UMAP（Uniform Manifold Approximation and Projection, 均一マニフォールド近似と投影）、Diffusion maps, t-SNE(t-distributed Stochastic Neighbor Embedding , t分布型確率的近傍埋込み)などの手法が用いられる。 特に、t-SNE[http://www.jmlr.org/papers/v9/vandermaaten08a.html]とUMAPは、高次元データを低次元の点の集合として可視化することで、それぞれの細胞の持つトランスクリプトームの類似度についての直観的な表示が可能でありしばしば用いられる（図３）。次に、[[Louvainアルゴリズム]]などでクラスタリング（コミュニティ分割）を行いグラフ上に表示できる（図３の色分け）。こうして、違ったタイプの細胞の集合が別のクラスターとして表示される。一般にUMAPの方がクラスタリングが明確になる傾向があるので、最近はUMAPを利用することが多くなってきている<br />
[[ファイル:ScRNAseqFig3.jpg|サムネイル|250px|'''図３．tSNEとUMAPによる同じデータの可視化'''<br>ニワトリ網膜の視細胞のデータを用いて作製[A]。]]<br />
<br />
==ダウンストリーム解析==<br />
===細胞クラスターの解釈とマーカー遺伝子候補の発見===<br />
scRNA-seqデータから得られる生物学的知見には、内在的に存在する細胞の種類、外部刺激や環境で変化した細胞の状態、そして種類や変化により特徴的に発現するマーカー遺伝子候補の発見がある<ref><pubmed>27824854</pubmed></ref><ref><pubmed>32033589</pubmed></ref><br />
。クラスタリングにより、異なった細胞集団の存在が認識されると、それぞれのクラスターに特徴的に発現している遺伝子を具体的に探索し、細胞集団の持つバイオマーカーによって、そのクラスターの同定が可能になる。例えば、既に神経細胞とグリア細胞に特異的に発現する典型的マーカーはよく知られており、それぞれのクラスターの識別は容易である。更に、神経細胞のタイプを区別できるマーカーや、外部刺激によって遺伝子発現が変化した神経細胞の状態は、In situ hybridizationや免疫組織化学などにより確認できる。このようなクラスターごとに発現が異なる遺伝子（差次的発現遺伝子）を見つけるためには（Differential expression analysis, DE analysis）、SeuratのFindMarkersコマンド中でも利用可能である専用コード（MAST <ref><pubmed>26653891</pubmed></ref>、DESeq2 <ref><pubmed>25516281</pubmed></ref>など）を用いることができる。scRNA-seqの解析に必要なコードは、scRNA-tools [https://www.scrna-tools.org], Awesome single cell [https://github.com/seandavi/awesome-single-cell], Bioconductor[https://www.bioconductor.org]で紹介されており、ほとんどがダウンロード可能である。また、最新の情報については、bioRxivなどのプレプリントサーバで公開されていることが多く、scRNA-seqのデータ（下記参考）とともに、オープンサイエンス実践の好例となっている。細胞ごとの差次的発現遺伝子の可視化には、ドットプロット（dot plot）、ヴァイオリンプロット（violin plot）、リッジプロット（Ridge plot, joy plot）、次元圧縮の可視化図に重ねる布置プロット（feature plot）などが頻繁に用いられる（図４）。<br />
[[ファイル:ScRNAseqFig4.jpg|サムネイル|250px|'''図３．scRNA-seqデータの可視化の例 '''<br>A. ドットプロット。B.ヴァイオリンプロット。C. 次元圧縮と重ねた布置プロット。ニワトリ網膜の視細胞のデータを用いて作製[A]。]]<br />
<br />
===偽時系列解析、遺伝子制御ネットワーク、パスウェイ解析===<br />
実験的なノイズとは別に生物学的に意味のある遺伝子発現の変動には、位置情報、[[細胞周期]]、[[概日リズム]]、発現変動が大きい破裂型プロモーターの作動などの理由で変動が見られるものもある<ref><pubmed> 31217225 </pubmed></ref><ref><pubmed> 26000846</pubmed></ref>。特に、刺激・薬剤処理やさまざまな病態の進行や治療に伴う細胞の変化、発生途上の細胞系譜や細胞分化といった細胞の遷移状態の解析（[[偽時系列解析]]Pseudo-time analysis ）には、scRNA-seqデータを用いることが効果的である<ref><pubmed>29576429</pubmed></ref><ref><pubmed>28813177</pubmed></ref><ref><pubmed>29565398</pubmed></ref>。これらの分析のためには[[軌道推定]]（Trajectory inference）の解析手法が用いられる。しばしば用いられるMonocle3 <ref><pubmed>30787437</pubmed></ref>など、多くのコードを収集しているGithubのサイトがある [https://github.com/dynverse/dynmethods][https://github.com/agitter/single-cell-pseudotime]。RNA velocityといった転写産物のスプライシングの状態から細胞の分化状態を推定する方法もある<ref><pubmed>30089906</pubmed></ref>。しかし、これらの方法は、あくまで発生途上の[[細胞系譜]]や細胞分化の推定に過ぎない。細胞系譜を更に確実に観察しつつ、scRNA-seqを行うことで、細胞タイプの系統関係を調べる方法として、CRISPR-Cas9を用いた[[ゲノム編集]]による記録法を導入したscGESTALT<ref><pubmed>29608178</pubmed></ref>、ScarTrace<ref><pubmed>29590089</pubmed></ref> 、LINNAEUS<ref><pubmed>29644996</pubmed></ref>がある。<br />
<br />
• また細胞分化や変動に伴う特徴的な遺伝子発現をscRNA-seqで観察することは、遺伝子制御ネットワーク（例、SCENIC<ref><pubmed>28991892</pubmed></ref>, [https://github.com/aertslab/SCENIC]）や[[代謝経路]]や[[シグナル伝達系]]のための[[パスウェイ解析]](例、Metascape<ref><pubmed>30944313</pubmed></ref>, [http://metascape.org])を理解するシステム生物学的な研究として有用である。更に、scRNA-seqで得られた結果をもとに、細胞間相互作用の理解を深めるのを目的とするCellPhoneDB<ref><pubmed>32103204</pubmed></ref>[https：//github.com/Teichlab/cellphonedb]、NicheNet<ref><pubmed>3181926</pubmed></ref>, SVCA<ref><pubmed>31577949</pubmed></ref>がある。特に、Perturb-seq<ref><pubmed>27984732</pubmed></ref> やその変法<ref><pubmed> 32231336</pubmed></ref>は、CRISPRライブラリーによるゲノム編集を施した細胞をscRNA-seqで解析することで、ゲノム編集で破壊された遺伝子の機能や遺伝子間の相互作用の理解を可能にしている後述するマルチモーダルなscRNA-seqの１つであり、注目されている。<br />
==scRNA-seqの神経科学研究への適用==<br />
===神経系細胞ビッグデータとしてのscRNA-seq===<br />
様々な神経・精神疾患について理解しその診断や治療に役立てるためには、神経細胞、[[グリア細胞]]を中心にした神経系にある細胞の種類や状態を識別し、それぞれの細胞における分子的な変化を観察することが重要である <ref><pubmed>28775344</pubmed></ref><ref><pubmed>29738987</pubmed></ref>。本本項目で解説してきたscRNA-seqの技術は、神経系に見られるそれぞれの細胞のトランスクリプトームについて[[ビッグデータ]]を提供することで、この細胞の種類や状態の識別に新たな根拠を与えつつある。近年、中枢神経系の[[アストロサイト]]、[[オリゴデンドロサイト]]、ミクログリアといったグリア細胞も均一ではなく、内在的な多様性や外部因子による状態の変動が報告されてきている。神経細胞は、著しく多様であり、この多様性が神経系を特徴づけており、その多彩で複雑な機能の発現に必須である。従来の神経科学では、神経細胞の多様性は、それぞれの神経細胞の解剖学的な位置、発現している分子、電気生理学、結合性、形態、神経伝達物質、神経伝達物質受容体とシグナル伝達によって識別されてきている。こうした神経細胞の多様性を便宜的に記述するのに、タイプ（type）、クラス（class）、サブクラス（subclass）、サブタイプ（subtype） というような用語が用いられてきた。しかし、ここでは混乱を防ぐため、Masland（2004）<ref><pubmed>15242626</pubmed></ref>が提唱し、広く受けいれられている「クラス」と「タイプ」という単語を用いることとする。タイプは、これ以上分類することができないとされる階層であり、共通性を持つタイプの集団がクラスである。例えば、大脳皮質の錐体細胞、網膜神経節細胞といった大雑把な区分はクラスである。大脳皮質の錐体細胞というクラスは、層や領野によって異なるタイプ、網膜神経節細胞には視覚情報に対して応答が異なるタイプが存在する。scRNA-seqは、「タイプ」の理解に新たな視点を提供している。<br />
<br />
===神経系へのscRNA-seqの適用===<br />
• [[大脳皮質]]には、[[錐体細胞]]や[[非錐体細胞]]などの神経細胞や様々なグリア細胞などが見られ、古くから神経細胞タイプの識別が行われてきた。初期のscRNA-seq技術でも、マウス皮質の小規模な細胞数を分類した研究で、これまで知られていた主要な細胞タイプとは違うタイプが見つかりその有効性が示された<ref><pubmed>25700174</pubmed></ref>。その後のDroplet使用の3’エンドリード法を利用した多数の細胞数の解析で、更に多数の神経細胞のタイプが見つかっている<ref><pubmed>32839617</pubmed></ref><ref><pubmed>28846088</pubmed></ref><ref><pubmed>30096299</pubmed></ref><ref><pubmed>30096314</pubmed></ref><ref><pubmed>30382198</pubmed></ref><ref><pubmed>29320739</pubmed></ref><ref><pubmed>28846088</pubmed></ref>[https://doi.org/10.1101/2020.03.14.991018][https://doi.org/10.1101/2020.06.04.105700]。特に、GABA作動性介在神経細胞タイプの多様性とその発生<ref><pubmed>28942923</pubmed></ref><ref><pubmed>28134272</pubmed></ref><ref><pubmed>29472441</pubmed></ref><ref><pubmed>29513653</pubmed></ref>についての情報は重要であろう。また、初期の発生過程<ref><pubmed>26940868</pubmed></ref><ref><pubmed>30485812</pubmed></ref><pubmed>31073041</pubmed></ref><ref><pubmed>30635555</pubmed></ref><ref><pubmed>30625322</pubmed></ref>、老化<ref><pubmed>31551601</pubmed></ref><の理解が、scRNA-Seq技術を利用することで進んでいる。更に、[[神経活動]]によって変化するトランスクリプトームの変化も細胞ごとに調査され興味深い<ref><pubmed>29230054</pubmed></ref> 。 ヒトを含めた霊長類の大脳についても発達段階を含めてscRNA-seqが適用されてきている<ref><pubmed>26060301</pubmed></ref><ref><pubmed>27339989</pubmed></ref><ref><pubmed>29539641</pubmed></ref><ref><pubmed>29217575</pubmed></ref><ref><pubmed>28846088</pubmed></ref><ref><pubmed>29227469</pubmed></ref><ref><pubmed>31303374</pubmed></ref><ref><pubmed>29867213</pubmed></ref><ref><pubmed>31435019</pubmed></ref><ref><pubmed>32424074</pubmed></ref> [https://doi.org/10.1101/709501[https://doi.org/10.1101/2020.03.31.016972][https://doi.org/10.1101/2020.04.23.056390]。ヒトや霊長類に特徴的とされる[[島]]のvon Economo神経細胞（紡錘細胞）のような希少な神経細胞のscRNA-seqにも成功している<ref><pubmed>32127543</pubmed></ref>。<br />
<br />
[[海馬]]<ref><pubmed>29241552</pubmed></ref><ref><pubmed>29912866</pubmed></ref><ref><pubmed>29335606</pubmed></ref><ref><pubmed>31942070</pubmed></ref>では、これまでの研究で記載されてきた神経細胞のタイプの存在が確認され、更に新規のタイプが見つかった。中枢神経系では、その他、[[外側膝状体]]<ref><pubmed>29343640</pubmed></ref>、[[大脳基底核]](足底核)<ref><pubmed>28384468</pubmed></ref> 、[[視床下部]]<ref><pubmed>28166221</pubmed></ref><ref><pubmed>28355573</pubmed></ref> <ref><pubmed>27991900</pubmed></ref><ref><pubmed>30385464</pubmed></ref> <ref><pubmed>31249056</pubmed></ref><ref><pubmed>30858605</pubmed></ref>、[[線条体]]<ref><pubmed>27425622</pubmed></ref><ref><pubmed>30134177</pubmed></ref><ref><pubmed>31875543</pubmed></ref>、[[中脳]]<ref><pubmed>27716510</pubmed></ref><ref><pubmed>29499164</pubmed></ref> <ref><pubmed>30718509</pubmed></ref> 、[[手綱]]<ref><pubmed>29576475</pubmed></ref>、発生中の[[間脳]]<ref><pubmed>30872278</pubmed></ref> 、さらに[[小脳]]<ref><pubmed>30220501</pubmed></ref><ref><pubmed>30735127</pubmed></ref><ref><pubmed>30690467</pubmed></ref>などの結果が得られている。マウスの小脳においては、分子層にこれまでの星状細胞、バスケット細胞というカテゴリーとは違ったギャップジャンクションに特徴を持つ２種類の神経細胞があることが示唆されている[https://doi.org/10.1101/2020.03.04.976407]。<br />
<br />
脳の外部では、[[運動神経]][ https://doi.org/10.1101/2020.03.16.992958]、[[感覚神経]]<ref><pubmed>25420068</pubmed></ref><ref><pubmed>26691752</pubmed></ref>、[[らせん神経節]]<ref><pubmed>30078709</pubmed></ref><ref><pubmed>30209249</pubmed></ref> 、[[臭覚神経]]<ref><pubmed>26541607</pubmed></ref> <ref><pubmed>32059767</pubmed></ref>、[[腸神経系]] <ref><pubmed>29483303</pubmed></ref>[https://doi.org/10.1101/2020.03.02.955757] 、[[網膜]]<ref><pubmed>27565351</pubmed></ref><ref><pubmed>29909983</pubmed></ref><ref><pubmed>30018341</pubmed></ref><ref><pubmed>31260032</pubmed></ref><ref><pubmed>31128945</pubmed></ref><ref><pubmed>30712875</pubmed></ref><ref><pubmed>30548510</pubmed></ref><ref><pubmed>31075224</pubmed></ref><ref><pubmed>31399471</pubmed></ref><ref><pubmed>31848347</pubmed></ref><ref><pubmed>31673015</pubmed></ref><ref><pubmed>31653841</pubmed></ref><ref><pubmed>31784286</pubmed></ref>[https://doi.org/10.1101/2020.02.26.966093][ https://doi.org/10.1101/779694][https://www.biorxiv.org/content/10.1101/617555][A]でのscRNA-seqデータがある。また[[iPS細胞]]や[[ES細胞]]由来の神経組織[[オルガノイド]]に含まれる神経細胞タイプを知る上でも利用されている<ref><pubmed>28094016</pubmed></ref><ref><pubmed>28279351</pubmed></ref><ref><pubmed>31168097</pubmed></ref><ref><pubmed>31996853</pubmed></ref><ref><pubmed>31968264</pubmed></ref><ref><pubmed><ref><pubmed>32221280</pubmed></ref></pubmed></ref>。<br />
<br />
===神経細胞以外の細胞===<br />
[[上衣細胞]]<ref><pubmed>29727663</pubmed></ref>は、[[神経幹細胞]]としての役割が示唆されてきたが、scRNA-seqによる解析ではその可能性が支持されなかった。グリア細胞では、[[ラジアルグリア]]<ref><pubmed>26406371</pubmed></ref><ref><pubmed>25734491</pubmed></ref><ref><pubmed>29281841</pubmed></ref><ref><pubmed>29217575</pubmed></ref><ref><pubmed>29539641</pubmed></ref>[A]、アストロサイト<ref><pubmed>32139688</pubmed></ref><ref><pubmed>32203496</pubmed></ref>[ https://doi.org/10.1101/2020.04.27.064881]に多様性があることが示唆されてきている。また、オリゴデンドロサイト<ref><pubmed>27284195</pubmed></ref><ref><pubmed>30078729</pubmed></ref><ref><pubmed>30257220</pubmed></ref><ref><pubmed>30747918</pubmed></ref><ref><pubmed>31958186</pubmed></ref>[https://doi.org/10.1101/2020.03.06.981373] [A]については、これまで細胞生物学的に研究されてきた分化の過程がscRNA-seqにより検出されている。ミクログリアは、神経系の発達、老化、損傷などに伴うトランスクリプトームの変化がscRNA-seqにより詳細に明らかになった<ref><pubmed>27338705</pubmed></ref><ref><pubmed>29020624</pubmed></ref><ref><pubmed>30206190</pubmed></ref><ref><pubmed>30471926</pubmed></ref><ref><pubmed>31209379</pubmed></ref><br />
<ref><pubmed>31835035</pubmed></ref>。また、[[CNS境界関連マクロファージ]](BAM) <ref><pubmed>31061494</pubmed></ref>や[[脳血管系]]<ref><pubmed>29443965</pubmed></ref>のscRNA-seqも実施されている。<br />
<br />
===疾患===<br />
scRNA-seqは、疾患の理解にも有用である。筋萎縮性側索硬化症<ref><pubmed>30948552</pubmed></ref>、多発性硬化症<ref><pubmed>30747918</pubmed></ref><ref><pubmed>30420755</pubmed></ref><ref><pubmed>32313246</pubmed></ref> <br />
、アルツハイマー病やそのモデル動物<ref><pubmed>31042697</pubmed></ref><ref><pubmed>31399126</pubmed></ref><ref><pubmed>29020624</pubmed></ref><br />
[https://doi.org/10.1101/628347]<ref><pubmed>28602351</pubmed></ref><ref><pubmed>32341542</pubmed></ref>、統合失調症<ref><pubmed>29785013</pubmed></ref><ref><pubmed>32203495</pubmed></ref>、自閉症やレット症候群<ref><pubmed>31097668</pubmed></ref><ref><pubmed>30455458</pubmed></ref>、シャルコー・マリー・トゥース病<ref><pubmed>29888333</pubmed></ref>、ダウン症[https://www.biorxiv.org/content/10.1101/2020.01.01.892398v1]、パーキンソン病<ref><pubmed>30503143</pubmed></ref> <ref><pubmed>32826893</pubmed></ref>、がん<ref><pubmed>31327527</pubmed></ref><ref><pubmed>28360267</pubmed></ref>などに適用されている。<br />
<br />
<br />
==scRNA-seqの展望==<br />
===神経系の多様性と進化===<br />
NGSを用いることで、どんな生物種にも適用可能なscRNA-seqは、既に多様な生物の神経系の細胞の理解、更には種間の相同性や差異の研究に利用されており、神経系の進化を細胞レベルで考察するのに有用であろう（例、センチュウ<ref><pubmed> 28818938 </pubmed></ref>、ショウジョウバエ <ref><pubmed>29909982</pubmed></ref><ref><pubmed>29149607</pubmed></ref><ref><pubmed>30703584</pubmed></ref><ref><pubmed>29909983</pubmed></ref>、カタユウレイボヤCiona intestinalis <ref><pubmed>30069052</pubmed></ref><ref><pubmed>30228204</pubmed></ref>、ゼブラフィッシュ<ref><pubmed>31018142</pubmed></ref><ref><pubmed>30929901</pubmed></ref>、アカミミガメTrachemys scripta elegans、トカゲPogona vitticeps, pv<ref><pubmed>29724907</pubmed></ref>、ニワトリ[A]、霊長類<ref><pubmed>30730291</pubmed></ref><ref><pubmed>31619793</pubmed></ref>[https://doi.org/10.1101/2020.03.31.016972]）。ただ、遺伝子やトランスクリプトームの研究が進んでいる生物種では比較的容易であるが、遺伝子のアノテーションが十分でない生物種を用いる場合、scRNA-seqのデータ解析は困難を伴うので、NCBIのTaxonomy[https://www.ncbi.nlm.nih.gov/taxonomy]やEggNOG [http://eggnogdb.embl.de] <ref><pubmed>30418610</pubmed></ref>などを利用する。また種を超えた細胞タイプの相同性の理解には様々な工夫が必要である<ref><pubmed>31552245</pubmed></ref><ref><pubmed>30712875</pubmed></ref><br />
<br />
===データベースと統合===<br />
獲得されたscRNA-seqのデータは様々な目的で利用できるので、データベース化し利用できるようにする必要がある。神経系のトランスクリプトーム一般のデータベースが多数公開されており<ref><pubmed>29437890</pubmed></ref>、scRNA-seqのデータも基本的にNCBIのGene Expression Omnibus[https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/]に登録されている。また、オープンサイエンス推進のためにcommon coordinate framework (CCF) やcentral annotation platform (CAP)という概念のもと、特にscRNA-seqを意識したものとして、米国のBRAIN Initiative Cell Census Consortium<ref><pubmed>29096072</pubmed></ref> 、Human Cell Atlas ProjectのHuman Cell Atlas Data Portal [https://data.humancellatlas.org]、アレン脳研究所のAllen Brain Atlas [https://portal.brain-map.org]、ブロード研究所のSingle Cell Portal [https://singlecell.broadinstitute.org/]などのデータベースが稼働している。また、異なった方法や実験で得られたscRNA-seqのデータを体系的に比較することも重要であり、Seurat 3.0以降に組み込まれたMMN (Mutual Nearest Neighbors)、LIGER<ref><pubmed>31178122</pubmed></ref> 、Harmony<ref><pubmed>31740819</pubmed></ref> 、MetaNeighber<ref><pubmed>29491377</pubmed></ref>のようなアルゴリズムが開発されている。<br />
<br />
===空間トランスクリプトミクス===<br />
多数の細胞を扱うscRNA-seqの弱点は、組織から細胞や細胞核を解離する必要があるので、その細胞が存在していた解剖学的あるいは空間的な位置の情報を消去してしまうということである。組織切片におけるタンパク質などの分布は免疫組織化学、mRNAの分布はin situ hybridizationで検出することができるが、数多くのmRNAの分布を情報処理技術と組み合わせ一気に同定する方法がscRNA-seqと同様に開発されてきている。Slide-seq<ref><pubmed>30923225</pubmed></ref>[ https://doi.org/10.1101/2020.03.12.989806]、osmFISH<ref><pubmed>30377364</pubmed></ref>、STARmap (spatially-resolved transcript amplicon readout mapping), <ref><pubmed>29930089</pubmed></ref>、seqFISH <ref><pubmed>27764670</pubmed></ref>、pciSeq(probabilistic cell typing by in situ sequencing)、DSP(Digital Spatial Profiling) <ref><pubmed>32393914</pubmed></ref>、Expansion sequencing[http://doi.org/10.1101/2020.05.13.094268]<br />
、更に10x Genomics社が市販するVisiumなどがある。現状では、大きな組織の空間トランスクリプトミクスは、空間解像度が細胞レベルにいたっておらず、技術普及の観点からも課題が多い。しかし、そのデータを解析するためのアルゴリズム<ref><pubmed>29553578</pubmed></ref><ref><pubmed>29553579</pubmed></ref><ref><pubmed>32350282</pubmed></ref> [https://doi.org/10.1101/757096][ https://doi.org/10.1101/701680] [https://doi.org/10.1101/431957]や、更にMerFish <ref><pubmed>25858977</pubmed></ref>、corrFISH <ref><pubmed>27271198</pubmed></ref>のように、subcellularレベルで多数のmRNAを検出する方法が開発されてきており<ref><pubmed>25549890</pubmed></ref>、scRNA-seqと組み合わせることで、その弱点を補う空間トランスクリプトミクスにも利用され始め<ref><pubmed>30385464</pubmed></ref>[https://doi.org/10.1101/2020.06.04.105700]、今後の発展が期待される。<br />
<br />
===マルチモーダルなシングルセルオミクス===<br />
同一の細胞からscRNA-seqの情報だけでなく、ゲノム配列、ATAC-seqなどによるエピゲノム解析、少数のタンパク質、あるいはプロテオームなどを、同時に記録するマルチモーダルなオミクスが注目されている<ref><pubmed>31907462</pubmed></ref><ref><pubmed>30696980</pubmed></ref>。2019年には、Nature Methodsの「Methods of the Year」に選ばれており、現状については、その特集号などを参考にされたい。例えば、細胞表面分子に対する抗体にDNAを付加することで、マーカーを発現する細胞のトランスクリプトームを観察するCITE-seq<ref><pubmed>28759029</pubmed></ref>、 REAP-seq<ref><pubmed>28854175</pubmed></ref>は既知の細胞表面マーカーの発現とscRNA-seqが同時に観察できるマルチモーダルなオミクスである。<br />
<br />
マルチモーダルなシングルセルオミクスとして、神経科学分野で注目されるのは、scRNA-seqをパッチクランプによる電気生理学的情報と組み合わせたPatch-seq<ref><pubmed>26689544</pubmed></ref> <ref><pubmed>26689543</pubmed></ref>である。また、ゲノムDNAとscRNA-seqを同時に観察することによって、近年、精神疾患の観点から注目されている発生途中で生じる遺伝子変異を研究するPRDD-seqは今後の展開が注目される[https://doi.org/10.1101/2020.04.19.046904]。最後に、BARseq (barcoded anatomy resolved by sequencing) <ref><pubmed>31626774</pubmed></ref>、CONNECTID[https://doi.org/10.1101/378760<br />
]、Epi-Retro-seq[https://doi.org/10.1101/2020.04.01.019612]のような方法は、コネクトーム（神経細胞の結合性）と遺伝子発現を記録できるオミクスの新たな方向として興味深い。<br />
<br />
<br />
== 関連項目 ==<br />
*[[ゲノムワイド関連解析 ]]<br />
*[[ディファレンシャルディスプレイ ]]<br />
*[[In situハイブリダイゼーション法 ]]<br />
*[[免疫組織化学法]]<br />
*[[エピジェネティクス]]<br />
== 参考文献 ==<br />
<references /></div>
Masahitoyamagata
https://bsd.neuroinf.jp/w/index.php?title=%E3%82%B7%E3%83%8A%E3%83%97%E3%82%B9%E5%BD%A2%E6%88%90&diff=44937
シナプス形成
2020-10-22T20:08:32Z
<p>Masahitoyamagata: </p>
<hr />
<div><div align="right"> <br />
<font size="+1">[http://researchmap.jp/yamagatm 山形方人]</font><br><br />
''Harvard University''<br><br />
DOI：<selfdoi /> 原稿受付日：年月日 原稿完成日：年月日<br><br />
担当編集委員：<br><br />
</div><br />
<br />
英：synapse formation, synaptogenesis<br />
{{box|text=<br />
神経細胞とその相手の細胞（神経細胞、筋肉など）は、シナプスという特殊化した細胞接着構造で結合している。シナプス形成とは、神経回路形成において、機能するシナプスができあがるまでの過程である。化学シナプスの形成には、1) シナプス前部（通常は軸索）が、シナプス後部（神経細胞の樹状突起、筋肉など）となる適切な標的細胞の適切な細胞上の適切な位置に結合すること（シナプス特異性）と、2) シナプス前部と後部がシナプス間隙を介して同じ場所に配向して、シナプス前部にシナプス小胞や分泌装置の蓄積、シナプス後部に神経伝達物質受容体の集合やシナプス後肥厚が生じるということ（シナプス分化）がある。シナプス形成は、シナプス前部とシナプス後部の間の相互作用によって制御されており、このような細胞間相互作用を担うシナプス接着分子、細胞外マトリックス分子、更に分泌性因子が同定されている（シナプスオーガナイザー）。また、グリア細胞など神経細胞以外のプレーヤーの関与も重要である。神経系の発達期や臨界期においては、化学シナプス形成は過剰に行われ、神経活動などの影響により、シナプス刈り込みが行われ再編成される。また、発達中のシナプス形成とも共通する成熟した神経系でのシナプス新生や構造変化は、学習と記憶にも重要な役割をし、シナプス形成の異常は、自閉症、精神疾患、認知症などの原因になると考えられている。}}<br />
<br />
==はじめに==<br />
神経細胞は、[[シナプス]]で適切に結合、情報伝達し、情報処理ユニットとして機能している。シナプス形成は、神経細胞の間で適切な場所で生じるシナプスの構造構築から機能発現までの過程であるが、正常の発生だけでなく、再生や可塑性でも見られ、正常発生でのシナプス形成と基本的には共通するものであると考えられる。しかし、シナプス形成といった場合、発生における化学シナプスの構造構築について議論されることが多いので、本項目もそれを中心に扱う。また、化学シナプスの形成とは本質的に構造の異なる[[電気シナプス]]（ギャップジャンクション）の形成については、化学シナプス形成との関係性もあると考えられる<ref><pubmed>23237660</pubmed></ref><ref><pubmed>28170151</pubmed></ref><ref><pubmed>32883654</pubmed></ref>が、本項目では扱わない。<br />
<br />
==シナプス形成の３ステップ==<br />
===ステップ1：シナプス特異性===<br />
軸索は[[軸索ガイダンス]]により、標的細胞近辺に到達する。軸索は特定の標的細胞と特異的にシナプス結合することで、情報を処理できる機能的回路を作る（cellular specificity）。また、シナプスはシナプス後細胞上の特定の部位に形成される（subcellular specificity）<ref><pubmed>19575668</pubmed></ref><ref><pubmed>26656254</pubmed></ref><ref name=ref1><pubmed>32359437</pubmed></ref>。この初期のステップについては、「[[標的認識]]」の項を参考にされたい。神経伝達物質や標的細胞が持つ受容体などのシナプスの神経化学的形質は、遺伝子にプログラムされて発生していく神経系の細胞に内在的なものと大方考えられているが、シナプス形成後の誘導により変換するケースもあるかもしれない<ref><pubmed>10202548</pubmed></ref>。<br />
<br />
===ステップ2：シナプス分化===<br />
次に、標的細胞と接触する軸索の一部分は[[シナプス小胞]]や[[アクティブゾーン]]を伴う[[シナプス前終末]]へと分化し（presynaptic differentiation）、軸索と接触した標的細胞では局所的に[[神経伝達物質受容体]]や細胞内足場が集積しシナプス後部へと分化する（postsynaptic differentiation）。シナプス前部とシナプス後部の特殊化は、軸索と標的細胞の間の相互作用で制御される。この細胞間相互作用についての多くの原理的知見は、運動神経細胞からの軸索が骨格筋線維上で作る巨大で単純なシナプスである[[神経筋接合部]]（neuromuscular junction, NMJ)についての20世紀に行われた研究から得られてきた<ref name=ref2><pubmed>10202544</pubmed></ref>。21世紀になって、小さく多様な中枢神経系でのシナプス形成や無脊椎動物モデル動物のシナプス形成についての分子的な理解が進んでいる<ref name=ref3><pubmed>30359597</pubmed></ref>。本項目では、特にこのステップについて、原理的な観点から概説する。<br />
<br />
===ステップ3：シナプス再編成===<br />
シナプス形成後は、シナプスの成熟や神経回路の再編成が観察される。発達期においては、シナプス形成は過剰に行われ、神経活動などの影響により過剰なシナプスは除去される<ref><pubmed>10719884</pubmed></ref><ref><pubmed>26436703</pubmed></ref><ref><pubmed>29716431</pubmed></ref><ref><pubmed>31372212</pubmed></ref>。シナプスの除去（synapse elimination）は、[[神経細胞死]]と同様に、神経回路を再編する重要な過程であるが、これについては「[[シナプス刈り込み]]」の項を参考されたい。シナプス形成は、個体発生の過程だけでなく、成体におけるシナプスの新生や構造変化は、学習と記憶にも重要な役割をし、シナプス形成の異常は、[[自閉症]]、[[精神疾患]]、[[認知症]]などの原因になると考えられている<ref><pubmed>22258914</pubmed></ref><ref><pubmed>22540979</pubmed></ref>。。<br />
<br />
==神経筋接合部におけるシナプス形成==<br />
脊髄動物の神経筋接合部は、脊髄にある運動神経細胞から伸長した軸索終末（シナプス前終末）、筋線維、[[シュワン細胞]]の３つの細胞要素からなり、それぞれ神経筋接合部で特徴的に分化している（図1A)。シナプス形成は、運動神経の軸索が、軸索ガイダンスを経て、発生中の筋線維に接近して開始される。[[成長円錐]]が神経終末に変化し始めると、神経終末と反対側の筋表面の一部が特殊化し始める。発生が進むと、[[シナプス間隙]]（synaptic cleft）を介したシナプス前部とシナプス後部の構造的な特徴が明確になり、最終的に筋線維表面のわずか1000分の1の面積を占める成熟した神経筋接合部となる（図１A）。このように、シナプス前部は、シナプス後部と同じ場所で配向し、シナプス前部では、シナプス小胞、アクティブゾーンなど神経伝達物質（アセチルコリン）の分泌装置や[[電位依存性カルシウムチャネル]]などが集積する。一方、シナプス後部では、効率的なシナプス伝達のために、神経伝達物質受容体（アセチルコリンレセプター）とシグナル伝達装置や足場構造が集合する<ref name=ref2><pubmed>10202544</pubmed></ref><ref><pubmed>25493308</pubmed></ref><ref name=ref10><pubmed>29415504</pubmed></ref><ref><pubmed>29195055</pubmed></ref>。<br />
[[ファイル:Fig1-SF.jpg|サムネイル|300px|'''図1 神経筋接合部と中枢シナプスのシナプス形成'''<br><br />
A. 脊椎動物の神経筋接合部。運動神経細胞から伸長した軸索末端が多核の筋線維に接触することで、情報交換が始まる。シナプス前部ではシナプス小胞が集積し、シナプス後部では神経伝達物質受容体であるニコチン性アセチルコリンレセプターが集まり始める。成熟した神経筋接合部ではシナプス前部にはシナプス小胞、アクティブゾーンが形成される。シナプス間隙には、シナプス領域で特化したシナプス基底膜が存在し、そこには、アセチルコリンエステラーゼに加え、アグリンやβ2ラミニンなどのシナプスオーガナイザー活性を持つ分子も局在する。シナプス後部には、アセチルコリンレセプターが集積し、Rapsynなどの足場分子やMuSK, Lrp4などのシグナル分子も集まる。シナプスの直下では、核も特殊化しており、アセチルコリンレセプター遺伝子を強く発現している（本文参考）。Sanes & Lichtman (1999) <ref name=ref2><pubmed>10202544</pubmed></ref>などを参考にした。<br><br />
B. 中枢シナプス形成。Vaughn (1989) <ref name=ref4><pubmed>2655146</pubmed></ref>の形態学的モデルをもとに、神経筋接合部のシナプス形成と対比させた。ここでも、シナプス前部と後部の情報交換により、シナプス分化が開始される。中枢シナプスのシナプス間隙には神経筋接合部とは異なり、基底膜は存在せず、前部と後部の直接的な接着が相互作用の中心であり、シナプス小胞や神経伝達物質受容体が、前部と後部にそれぞれ集積する。興奮性シナプスでは顕著なシナプス後肥厚が形成される。]]<br />
<br />
===シナプスオーガナイザー===<br />
運動神経細胞と筋線維は、それぞれ独立してシナプス前部とシナプス後部に対応するシナプス構成要素を合成し、自立的に集合させることが可能である。つまり、運動軸索では、筋線維がない状態でもシナプス小胞が見られ、軸索中に保持することができる。一方、筋線維は神経伝達物質受容体であるアセチルコリンレセプターを合成し、神経がない状態でも、細胞表面上に多数のアセチルコリンレセプターからなる巨大集合構造を作ることができる（クラスタリング, clustering）。したがって、シナプス形成を制御する細胞間相互作用は、シナプス小胞の形成や受容体クラスタリングそのものの誘発因子というより、むしろそれらの位置を決め配向させる指令因子（オーガナイザー, organizer）としての役割が大きい。また、軸索中のシナプス小胞の集積は、ポリリジン被覆ビーズなどとの接触でも容易に引き起こされることから、オーガナイザーとしての役割もAll or nothingといった絶対的なものではなく促進的なものである<ref><pubmed>7127105</pubmed></ref>。しかし、以下に記述するように、シナプス後部やシナプス前部の分化が、それぞれの接触によって誘発、促進される可能性があることを示す証拠もある。これらの証拠のいくつかは、神経筋接合部の再生を利用することで得られた。<br />
<br />
===シナプス後部の分化===<br />
シナプス後部の分化に積極的に関わる分子として想定されたのがアグリン（agrin）である<ref><pubmed>1966767</pubmed></ref>。筋線維は、[[細胞外マトリックス]]である[[基底膜]]（basement membrane, basal lamina）に包まれている。基底膜の成分は、通常、IV型コラーゲン、ヘパラン硫酸プロテオグリカン（パールカンperlecan）、[[ラミニン]]（laminin）などであるが<ref><pubmed>12556454</pubmed></ref>、神経筋接合部の基底膜（シナプス基底膜 synaptic basement membrane）には、シナプス形成に関わる重要な因子であるヘパラン硫酸プロテオグリカンのアグリン（agrin）が存在する。損傷した筋組織の基底膜を再生する筋肉に接触させると、シナプス後部の特徴を誘導することができる。つまり、基底膜にはアセチルコリンレセプターのクラスタリングに関わる因子が存在することが想定されアグリンは生化学的に精製された（図２A）。選択的スプライシングによる特殊エクソン由来配列を含むために、強力な受容体クラスタリング能を持つアグリンは運動神経細胞側で発現し、運動神経を通じて末梢に運搬され、神経筋接合部の基底膜に保持される。アグリン欠損マウスでは、神経筋接合部が乱れており、神経筋接合部におけるアセチルコリンレセプタークラスターの数、大きさ、密度が減少している<ref><pubmed>8653788</pubmed></ref>。 このことから、アグリンはシナプス後部の分化に関わる神経由来の因子であると考えられる。アグリンは、筋特異的チロシンキナーゼ（MuSK）やLRP4を含むいくつかの受容体に結合して、アダプタータンパク質（Dok7）や細胞骨格タンパク質（Rapsyn）とともに、アセチルコリンレセプターのクラスタリングにつながる一連の情報伝達系に影響を与える<ref><pubmed>20215342</pubmed></ref><ref name=ref10><pubmed>29415504</pubmed></ref><ref><pubmed>8653786</pubmed></ref><ref><pubmed>8653787</pubmed></ref><ref><pubmed>16794080</pubmed></ref><ref><pubmed>7675108</pubmed></ref>。<br />
[[ファイル:Fig2-SF.jpg|サムネイル|250px|'''図２ シナプスオーガナイザー'''<br><br />
A. 培養下の筋線維に、アグリンを加えると、アセチルコリンレセプターがクラスタリングする。アグリン欠損マウスでは、神経筋接合部におけるアセチルコリンレセプタークラスターの数、大きさ、密度が減少する<ref><pubmed>8653788</pubmed></ref>。<br><br />
B. 培養細胞(293細胞など）に、ニューロリギン（通常、シナプス後部の神経細胞で発現）を強制発現させ、その上で神経細胞を培養し神経突起を伸長させると、シナプス小胞の蓄積が観察される<ref name=ref6><pubmed>10892652</pubmed></ref>。また、ニューレキシン（通常、シナプス前部の神経細胞で発現）を強制発現させると、その上では神経突起にシナプス後肥厚やある種の神経伝達物質受容体が集積する<ref name=ref5><pubmed>15620359</pubmed></ref>。これらの活性から、これらの分子がシナプス前部や後部の分化と配向に関わるシナプスオーガナイザーであると推定された。]]<br />
<br />
===シナプス前部の分化===<br />
シナプス前部の分化に関わる分子として同定されたものには、神経筋接合部特異的ラミニンのアイソフォームがある。再生神経の軸索が筋線維に到達すると、基底膜に最初に接触する。この際、筋線維を死滅させ、基底膜を抜け殻のように残したままでも、再生神経は正確に元の神経筋接合部の基底膜上でシナプス前部の分化を起こした<ref><pubmed>307554</pubmed></ref>。つまり、神経筋接合部のシナプス基底膜には、シナプス前部の分化を指示する因子があると想定され、その後、そのような分子が同定されている。最もよく研究されているのは、細胞外マトリックス分子ラミニンのアイソフォームである。ラミニンはすべての基底膜の構成分子であり、ラミニンは、α鎖、β鎖、γ鎖のヘテロ3量体であり、少なくとも5本のα鎖、4本のβ鎖、3本のγ鎖のファミリーからなっている。筋線維は複数のラミニンアイソフォームを合成し基底膜に取り込む。シナプス外の通常の筋基底膜にはβ1鎖を含むラミニンが存在するが、神経筋接合部のシナプス間隙の基底膜にはβ2鎖を持つアイソフォームが見られる(ラミニンの系統的命名法ではlaminin-121と呼ばれる)<ref><pubmed>2922051</pubmed></ref>。in vitroでは、β2ラミニンに運動神経の軸索が接触すると伸長を停止し、シナプス小胞を蓄積し、神経伝達物質を放出するようになる。β2ラミニンを欠く変異マウスでは、シナプス前終末およびシュワン細胞の発達に異常が生じる<ref><pubmed>7885444</pubmed></ref>。<br />
<br />
===シナプス核===<br />
中枢シナプスと違う神経筋接合部の際立った特徴は、筋線維が多数の細胞が融合した[[多核細胞]]（syncytial muscle; multinucleated muscle）であり、神経筋接合部の直下にはシナプス核（synaptic nucleus)と呼ばれる特殊化した細胞核が存在することである<ref><pubmed>11498047</pubmed></ref>（図1A）。シナプス核ではアセチルコリンレセプター遺伝子の転写が強く、シナプスから離れた核では転写が低く、アセチルコリンレセプターmRNAを局在化させ、神経筋接合部の近辺でアセチルコリンレセプターが集まる要因にもなっている。これは、神経が、アセチルコリンを使って、アセチルコリンレセプター遺伝子のシナプス外での発現を抑制すると同時に、軸索から放出されるニューレギュリン（neuregulin, ARIA = Acetylcholine Receptor Inducing Activityとも呼ばれた）が、アセチルコリンレセプター遺伝子の転写活性化につながるシグナリング分子となっている<ref><pubmed>9056721</pubmed></ref>。また、発生途中では、アセチルコリンレセプターの組成も変化する。幼若期に特有なδサブユニット遺伝子からε遺伝子への発現の変換がおこる<ref><pubmed>2423878</pubmed></ref>。生体で見られる発生初期のアセチルコリンレセプターのクラスターは単純なプラーク型であるが、最終的には複雑なプレッツェル型になり、神経筋接合部のひだも形成され、シナプス前終末もそれに対応して成熟する<ref><pubmed>15034266</pubmed></ref>。<br />
<br />
==中枢神経系のシナプス形成==<br />
中枢神経系のシナプスの形成も神経筋接合部のシナプス形成と類似した点が多い。中枢シナプスにおけるシナプス前部とシナプス後部の間の相互作用は、基本的に予め合成されたシナプス構成要素の位置を制御し合うことで、お互いの分化を制御しシナプスを形成すると考えられる<ref name=ref4><pubmed>2655146</pubmed></ref><ref><pubmed>14556707</pubmed></ref><ref><pubmed>17417940</pubmed></ref><ref><pubmed>27462810</pubmed></ref><ref><pubmed>29096080</pubmed></ref><ref name=ref3><pubmed>30359597</pubmed></ref>。そこでは、神経筋接合部のシナプス核のように転写レベルで局所的にシナプス構成要素の生合成を制御することはないが、シナプス近辺での局所的なmRNA翻訳や分解の制御はありうる<ref><pubmed>30861464</pubmed></ref>。その結果、中枢シナプスでも、神経筋接合部と同じように、神経伝達物質の受容体がシナプス後膜に集中し<ref name=ref9><pubmed>22046028</pubmed></ref>、神経伝達物質の違いはあるもののシナプス前部におけるシナプス小胞の分子的な成り立ちも基本的には同じであるように見える<ref name=ref8><pubmed>22794257</pubmed></ref>（図1B）。しかし、中枢シナプスの後部は、神経伝達物質受容体の分子種も異なり、その足場となる分子種も神経筋接合部とは大きく異なっている。特に、神経筋接合部では基底膜という細胞外マトリックスであったシナプス間隙（約50nm）の様相は中枢シナプスでは全く異なっており典型的な細胞外マトリックスは存在しない。中枢シナプスでは、約20nmのシナプス間隙で直接接触するシナプス前膜とシナプス後膜の間に存在する細胞間接着がその相互作用の中心であると考えられている<ref><pubmed>14519398</pubmed></ref><ref><pubmed>22278667</pubmed></ref><ref><pubmed>3492943</pubmed></ref><ref><pubmed>20832286</pubmed></ref><ref name=ref3><pubmed>30359597</pubmed></ref><ref name=ref1><pubmed>32359437</pubmed></ref>（図１B)。<br />
<br />
===中枢シナプス形成のオーガナイザー===<br />
シナプス前部とシナプス後部をつなぐ細胞接着分子は多数ある（[[シナプス接着因子]]の項参考）。それらを代表するものの1つは、シナプス後部の膜に存在するタンパク質であるニューロリギン（neuroligin）である。それに対応するシナプス前膜上の主要なリガンドはニューレキシン（neurexin）である。細胞表面のニューロリギンが、軸索上にシナプス小胞を集積させる能力は、ニューロリギンを強制発現する非神経細胞の上で、神経細胞を培養するin vitroアッセイ系を用いることによって初めて明らかになった<ref name=ref6><pubmed>10892652</pubmed></ref>（図2B)。しかし、''in vitro''アッセイ系で見られるニューロリギンなどのシナプス接着分子の作用には、非神経細胞上にデフォールトで発現しているカドヘリンのような別の接着分子の存在が前提になるようである<ref><pubmed>29760652</pubmed></ref>。また、RIM、RIM-BP、liprin、Munc13、ELKSを含むいくつかのタンパク質ファミリーが、シナプス前部の重要な足場分子として同定されており<ref name=ref8><pubmed>22794257</pubmed></ref>、シナプス前膜のLAR-RPTPs（受容体型膜貫通チロシンホスファターゼ）を通じてアクティブゾーンの形成に預かる<ref><pubmed>23916315</pubmed></ref>。<br />
<br />
一方、シナプス後部の樹状突起内の一部の神経伝達物質受容体や足場分子は、ニューロリギンのリガンドであるニューレキシンを発現させた非神経細胞と接触する部位で凝集する<ref name=ref5><pubmed>15620359</pubmed></ref>（図2B）。このような神経伝達物質受容体とそのシグナル伝達タンパク質の一部は、アクチン細胞骨格との直接的および間接的な相互作用を介して固定されている。特に、興奮性シナプスで顕著な[[シナプス後肥厚]]（postsynaptic density)においては、複数のPDZドメインを持った[[PSD95]]などの細胞内タンパク質が、PDZドメイン結合モチーフを持つニューロリギンなどの膜貫通型接着分子、神経伝達物質受容体、イオンチャネルと複数結合することで、シナプス後部の構成要素をつなぐ足場分子として機能し、ShankやHomerなどの他の足場分子とともに、シナプス構造の構築に関与すると考えられる<ref name=ref9><pubmed>22046028</pubmed></ref><ref><pubmed>28577431</pubmed></ref><ref><pubmed>28179641</pubmed></ref>。一方、抑制性シナプスのシナプス後部では、ゲフィリン（gephyrin）が重要な足場分子として機能する<ref><pubmed>24552784</pubmed></ref><ref><pubmed>28460365</pubmed></ref>。<br />
<br />
4種類あるニューロリギンのうち、ニューロリギン1はグルタミン酸作動性シナプス、ニューロリギン2はGABA作動性シナプス、ニューロリギン3はグルタミン酸とGABA作動性シナプスの両者、そしてニューロリギン4はグリシン作動性シナプスに局在している<ref><pubmed>26209464</pubmed></ref><ref><pubmed>15540461</pubmed></ref><ref><pubmed>17897391</pubmed></ref><ref><pubmed>21282647</pubmed></ref>。培養系の実験では、ニューロリギン1,3,4はグルタミン酸レセプターのクラスタリングを引き起こすが、ニューロリギン２はグルタミン酸レセプターとGABA<sub>A</sub>レセプターのクラスタリングを引き起こす<ref name=ref5><pubmed>15620359</pubmed></ref>。<br />
<br />
しかしながら、ニューレキシンやニューロリギンの遺伝子欠失動物では、予想に反して、シナプスの大きさや数にほとんど影響が見られない<ref><pubmed>12827191</pubmed></ref><ref><pubmed>16982420</pubmed></ref><ref><pubmed>28472659</pubmed></ref>ことから、これらの分子の存在が中枢シナプス形成にどの程度の意味を持っているのかは、実は明らかではない。ニューレキシンやニューロリギンの他にも、シナプス接着分子はシナプス分化の誘発能を持つものやニューレキシンに結合するものも含めて多数報告されてきており<ref><pubmed>29100073</pubmed></ref><ref name=ref3><pubmed>30359597</pubmed></ref><ref name=ref1><pubmed>32359437</pubmed></ref>、冗長性、補償性の高い相互作用システムの一部分である可能性が高い（[[シナプス接着因子]]の項参考）。また、同様な証拠から、シナプスオーガナイザーとして知られているFGFファミリーやWntファミリーといった分泌性の因子なども、この冗長な分子ネットワークの一部であると考えられる<ref><pubmed>20646052</pubmed></ref><ref><pubmed>24105999</pubmed></ref><ref><pubmed>29166241</pubmed></ref>。線虫やショウジョウバエでは、変異体スクリーニングなどから、シナプス形成に関わるとされる遺伝子が多く同定されている<ref><pubmed>31037336</pubmed></ref><ref><pubmed>30986749</pubmed></ref><ref><pubmed>32741370</pubmed></ref>。このことからも、哺乳類の中枢シナプスに関わる分子機構も実際には更に複雑であることが予想される。<br />
<br />
中枢神経系の神経細胞の周りには、シナプス部位を囲むようにペリニューロナルネット（perineuronal nets）と呼ばれるプロテオグリカンやヒアルロナンなどを構成要素とする細胞外マトリックスが存在しており、臨界期などでのシナプス形成の制御にも関わっていると考えられている<ref><pubmed>27911749</pubmed></ref><ref><pubmed>31263252</pubmed></ref>。<br />
<br />
==シナプス形成におけるグリア細胞の役割==<br />
これまでシナプス前部とシナプス後部の接点のみに焦点を当ててきたが、シナプス形成には第3の細胞要素であるグリア細胞も関与している<ref><pubmed>30309945</pubmed></ref><ref name=ref3><pubmed>30359597</pubmed></ref><ref><pubmed>30347385</pubmed></ref>。シュワン細胞は神経筋接合部のグリア細胞であり、[[アストロサイト]]は中枢シナプスのグリア細胞である。シュワン細胞がシナプス形成や維持に与える影響については、シュワン細胞を除去した動物での神経筋接合部の異常から考察されている<ref><pubmed>27656017</pubmed></ref>。<br />
<br />
グリア細胞の細胞表面にある分子と外部に分泌される分子の両方がシナプス形成に必要である。巨大な細胞外マトリックス分子であるトロンボスポンジン(thrombospondin) <ref><pubmed>15707899</pubmed></ref>、脂質であるコレステロール<ref><pubmed>12648780</pubmed></ref>、ヘヴィン（hevin) <ref><pubmed>21788491</pubmed></ref>などである。アストロサイトから分泌されるヘヴィンは、通常は相互作用しない細胞接着分子であるニューレキシンとニューロリギンの一部のアイソフォームを架橋することにより、シナプス形成を促進する<ref><pubmed>26771491</pubmed></ref>。アストロサイト上のグリピカン（glypican)は、シナプス前終末からAMPAレセプタークラスタリング因子ペントラキシン1(pentraxin1)の放出を誘発する<ref><pubmed>29024665</pubmed></ref><ref><pubmed>27986928</pubmed></ref>。また、シナプス形成に拮抗するSPARCなどのシナプスの負の調節因子も知られている<ref><pubmed>21788491</pubmed></ref>。また[[ミクログリア]]は、シナプス刈り込みに関与することで、神経回路の再編に関与する<ref><pubmed>31283900</pubmed></ref>。<br />
<br />
== 関連項目 ==<br />
*[[標的認識]]<br />
*[[成長円錐]]<br />
*[[神経筋接合部]]<br />
*[[シナプス刈り込み]]<br />
*[[シナプス接着因子]]<br />
*[[細胞外マトリックス]]<br />
*[[基底膜]]<br />
*[[シナプス前終末]]<br />
*[[シナプス後肥厚]]<br />
== 参考文献 ==<br />
<references /></div>
Masahitoyamagata
https://bsd.neuroinf.jp/w/index.php?title=%E3%82%B7%E3%83%8A%E3%83%97%E3%82%B9%E5%BD%A2%E6%88%90&diff=44936
シナプス形成
2020-10-22T19:48:50Z
<p>Masahitoyamagata: </p>
<hr />
<div><div align="right"> <br />
<font size="+1">[http://researchmap.jp/yamagatm 山形方人]</font><br><br />
''Harvard University''<br><br />
DOI：<selfdoi /> 原稿受付日：年月日 原稿完成日：年月日<br><br />
担当編集委員：<br><br />
</div><br />
<br />
英：synapse formation, synaptogenesis<br />
{{box|text=<br />
神経細胞とその相手の細胞（神経細胞、筋肉など）は、シナプスという特殊化した細胞接着構造で結合している。シナプス形成とは、神経回路形成において、機能するシナプスができあがるまでの過程である。化学シナプスの形成には、1) シナプス前部（通常は軸索）が、シナプス後部（神経細胞の樹状突起、筋肉など）となる適切な標的細胞の適切な細胞上の適切な位置に結合すること（シナプス特異性）と、2) シナプス前部と後部がシナプス間隙を介して同じ場所に配向して、シナプス前部にシナプス小胞や分泌装置の蓄積、シナプス後部に神経伝達物質受容体の集合やシナプス後肥厚が生じるということ（シナプス分化）がある。シナプス形成は、シナプス前部とシナプス後部の間の相互作用によって制御されており、このような細胞間相互作用を担うシナプス接着分子、細胞外マトリックス分子、更に分泌性因子が同定されている（シナプスオーガナイザー）。また、グリア細胞など神経細胞以外のプレーヤーの関与も重要である。神経系の発達期や臨界期においては、化学シナプス形成は過剰に行われ、神経活動などの影響により、シナプス刈り込みが行われ再編成される。また、発達中のシナプス形成とも共通する成熟した神経系でのシナプス新生や構造変化は、学習と記憶にも重要な役割をし、シナプス形成の異常は、自閉症、精神疾患、認知症などの原因になると考えられている。}}<br />
<br />
==はじめに==<br />
神経細胞は、[[シナプス]]で適切に結合、情報伝達し、情報処理ユニットとして機能している。シナプス形成は、神経細胞の間で適切な場所で生じるシナプスの構造構築から機能発現までの過程であるが、正常の発生だけでなく、再生や可塑性でも見られ、正常発生でのシナプス形成と基本的には共通するものであると考えられる。しかし、シナプス形成といった場合、発生における化学シナプスの構造構築について議論されることが多いので、本項目もそれを中心に扱う。また、化学シナプスの形成とは本質的に構造の異なる[[電気シナプス]]（ギャップジャンクション）の形成については、化学シナプス形成との関係性もあると考えられる<ref><pubmed>23237660</pubmed></ref><ref><pubmed>28170151</pubmed></ref><ref><pubmed>32883654</pubmed></ref>が、本項目では扱わない。<br />
<br />
==シナプス形成の３ステップ==<br />
===ステップ1：シナプス特異性===<br />
軸索は[[軸索ガイダンス]]により、標的細胞近辺に到達する。軸索は特定の標的細胞と特異的にシナプス結合することで、情報を処理できる機能的回路を作る（cellular specificity）。また、シナプスはシナプス後細胞上の特定の部位に形成される（subcellular specificity）<ref><pubmed>19575668</pubmed></ref><ref><pubmed>26656254</pubmed></ref><ref name=ref1><pubmed>32359437</pubmed></ref>。この初期のステップについては、「[[標的認識]]」の項を参考にされたい。神経伝達物質や標的細胞が持つ受容体などのシナプスの神経化学的形質は、遺伝子にプログラムされて発生していく神経系の細胞に内在的なものと大方考えられているが、シナプス形成後の誘導により変換するケースもあるかもしれない<ref><pubmed>10202548</pubmed></ref>。<br />
<br />
===ステップ2：シナプス分化===<br />
次に、標的細胞と接触する軸索の一部分は[[シナプス小胞]]や[[アクティブゾーン]]を伴う[[シナプス前終末]]へと分化し（presynaptic differentiation）、軸索と接触した標的細胞では局所的に[[神経伝達物質受容体]]や細胞内足場が集積しシナプス後部へと分化する（postsynaptic differentiation）。シナプス前部とシナプス後部の特殊化は、軸索と標的細胞の間の相互作用で制御される。この細胞間相互作用についての多くの原理的知見は、運動神経細胞からの軸索が骨格筋線維上で作る巨大で単純なシナプスである[[神経筋接合部]]（neuromuscular junction, NMJ)についての20世紀に行われた研究から得られてきた<ref name=ref2><pubmed>10202544</pubmed></ref>。21世紀になって、小さく多様な中枢神経系でのシナプス形成や無脊椎動物モデル動物のシナプス形成についての分子的な理解が進んでいる<ref name=ref3><pubmed>30359597</pubmed></ref>。本項目では、特にこのステップについて、原理的な観点から概説する。<br />
<br />
===ステップ3：シナプス再編成===<br />
シナプス形成後は、シナプスの成熟や神経回路の再編成が観察される。発達期においては、シナプス形成は過剰に行われ、神経活動などの影響により過剰なシナプスは除去される<ref><pubmed>10719884</pubmed></ref><ref><pubmed>26436703</pubmed></ref><ref><pubmed>29716431</pubmed></ref><ref><pubmed>31372212</pubmed></ref>。シナプスの除去（synapse elimination）は、[[神経細胞死]]と同様に、神経回路を再編する重要な過程であるが、これについては「[[シナプス刈り込み]]」の項を参考されたい。シナプス形成は、個体発生の過程だけでなく、成体におけるシナプスの新生や構造変化は、学習と記憶にも重要な役割をし、シナプス形成の異常は、[[自閉症]]、[[精神疾患]]、[[認知症]]などの原因になると考えられている<ref><pubmed>22258914</pubmed></ref><ref><pubmed>22540979</pubmed></ref>。。<br />
<br />
==神経筋接合部におけるシナプス形成==<br />
脊髄動物の神経筋接合部は、脊髄にある運動神経細胞から伸長した軸索終末（シナプス前終末）、筋線維、[[シュワン細胞]]の３つの細胞要素からなり、それぞれ神経筋接合部で特徴的に分化している（図1A)。シナプス形成は、運動神経の軸索が、軸索ガイダンスを経て、発生中の筋線維に接近して開始される。[[成長円錐]]が神経終末に変化し始めると、神経終末と反対側の筋表面の一部が特殊化し始める。発生が進むと、[[シナプス間隙]]（synaptic cleft）を介したシナプス前部とシナプス後部の構造的な特徴が明確になり、最終的に筋線維表面のわずか1000分の1の面積を占める成熟した神経筋接合部となる（図１A）。このように、シナプス前部は、シナプス後部と同じ場所で配向し、シナプス前部では、シナプス小胞、アクティブゾーンなど神経伝達物質（アセチルコリン）の分泌装置や[[電位依存性カルシウムチャネル]]などが集積する。一方、シナプス後部では、効率的なシナプス伝達のために、神経伝達物質受容体（アセチルコリンレセプター）とシグナル伝達装置や足場構造が集合する<ref name=ref2><pubmed>10202544</pubmed></ref><ref><pubmed>25493308</pubmed></ref><ref name=ref10><pubmed>29415504</pubmed></ref><ref><pubmed>29195055</pubmed></ref>。<br />
[[ファイル:Fig1-SF.jpg|サムネイル|300px|'''図1 神経筋接合部と中枢シナプスのシナプス形成'''<br><br />
A. 脊椎動物の神経筋接合部。運動神経細胞から伸長した軸索末端が多核の筋線維に接触することで、情報交換が始まる。シナプス前部ではシナプス小胞が集積し、シナプス後部では神経伝達物質受容体であるニコチン性アセチルコリンレセプターが集まり始める。成熟した神経筋接合部ではシナプス前部にはシナプス小胞、アクティブゾーンが形成される。シナプス間隙には、シナプス領域で特化したシナプス基底膜が存在し、そこには、アセチルコリンエステラーゼに加え、アグリンやβ2ラミニンなどのシナプスオーガナイザー活性を持つ分子も局在する。シナプス後部には、アセチルコリンレセプターが集積し、Rapsynなどの足場分子やMuSK, Lrp4などのシグナル分子も集まる。シナプスの直下では、核も特殊化しており、アセチルコリンレセプター遺伝子を強く発現している（本文参考）。Sanes & Lichtman (1999) <ref name=ref2><pubmed>10202544</pubmed></ref>などを参考にした。<br><br />
B. 中枢シナプス形成。Vaughn (1989) <ref name=ref4><pubmed>2655146</pubmed></ref>の形態学的モデルをもとに、神経筋接合部のシナプス形成と対比させた。ここでも、シナプス前部と後部の情報交換により、シナプス分化が開始される。中枢シナプスのシナプス間隙には神経筋接合部とは異なり、基底膜は存在せず、前部と後部の直接的な接着が相互作用の中心であり、シナプス小胞や神経伝達物質受容体が、前部と後部にそれぞれ集積する。興奮性シナプスでは顕著なシナプス後肥厚が形成される。]]<br />
<br />
===シナプスオーガナイザー===<br />
運動神経細胞と筋線維は、それぞれ独立してシナプス前部とシナプス後部に対応するシナプス構成要素を合成し、自立的に集合させることが可能である。つまり、運動軸索では、筋線維がない状態でもシナプス小胞が見られ、軸索中に保持することができる。一方、筋線維は神経伝達物質受容体であるアセチルコリンレセプターを合成し、神経がない状態でも、細胞表面上に多数のアセチルコリンレセプターからなる巨大集合構造を作ることができる（クラスタリング, clustering）。したがって、シナプス形成を制御する細胞間相互作用は、シナプス小胞の形成や受容体クラスタリングそのものの誘発因子というより、むしろそれらの位置を決め配向させる指令因子（オーガナイザー, organizer）としての役割が大きい。また、軸索中のシナプス小胞の集積は、ポリリジン被覆ビーズなどとの接触でも容易に引き起こされることから、オーガナイザーとしての役割もAll or nothingといった絶対的なものではなく促進的なものである<ref><pubmed>7127105</pubmed></ref>。しかし、以下に記述するように、シナプス後部やシナプス前部の分化が、それぞれの接触によって誘発、促進される可能性があることを示す証拠もある。これらの証拠のいくつかは、神経筋接合部の再生を利用することで得られた。<br />
<br />
===シナプス後部の分化===<br />
シナプス後部の分化に積極的に関わる分子として想定されたのがアグリン（agrin）である<ref><pubmed>1966767</pubmed></ref>。筋線維は、[[細胞外マトリックス]]である[[基底膜]]（basement membrane, basal lamina）に包まれている。基底膜の成分は、通常、IV型コラーゲン、ヘパラン硫酸プロテオグリカン（パールカンperlecan）、[[ラミニン]]（laminin）などであるが<ref><pubmed>12556454</pubmed></ref>、神経筋接合部の基底膜（シナプス基底膜 synaptic basement membrane）には、シナプス形成に関わる重要な因子であるヘパラン硫酸プロテオグリカンのアグリン（agrin）が存在する。損傷した筋組織の基底膜を再生する筋肉に接触させると、シナプス後部の特徴を誘導することができる。つまり、基底膜にはアセチルコリンレセプターのクラスタリングに関わる因子が存在することが想定されアグリンは生化学的に精製された（図２A）。選択的スプライシングによる特殊エクソン由来配列を含むために、強力な受容体クラスタリング能を持つアグリンは運動神経細胞側で発現し、運動神経を通じて末梢に運搬され、神経筋接合部の基底膜に保持される。アグリン欠損マウスでは、神経筋接合部が乱れており、神経筋接合部におけるアセチルコリンレセプタークラスターの数、大きさ、密度が減少している<ref><pubmed>8653788</pubmed></ref>。 このことから、アグリンはシナプス後部の分化に関わる神経由来の因子であると考えられる。アグリンは、筋特異的チロシンキナーゼ（MuSK）やLRP4を含むいくつかの受容体に結合して、アダプタータンパク質（Dok7）や細胞骨格タンパク質（Rapsyn）とともに、アセチルコリンレセプターのクラスタリングにつながる一連の情報伝達系に影響を与える<ref><pubmed>20215342</pubmed></ref><ref name=ref10><pubmed>29415504</pubmed></ref><ref><pubmed>8653786</pubmed></ref><ref><pubmed>8653787</pubmed></ref><ref><pubmed>16794080</pubmed></ref><ref><pubmed>7675108</pubmed></ref>。<br />
[[ファイル:Fig2-SF.jpg|サムネイル|250px|'''図２ シナプスオーガナイザー'''<br><br />
A. 培養下の筋線維に、アグリンを加えると、アセチルコリンレセプターがクラスタリングする。アグリン欠損マウスでは、神経筋接合部におけるアセチルコリンレセプタークラスターの数、大きさ、密度が減少する<ref><pubmed>8653788</pubmed></ref>。<br><br />
B. 培養細胞(293細胞など）に、ニューロリギン（通常、シナプス後部の神経細胞で発現）を強制発現させ、その上で神経細胞を培養し神経突起を伸長させると、シナプス小胞の蓄積が観察される<ref name=ref6><pubmed>10892652</pubmed></ref>。また、ニューレキシン（通常、シナプス前部の神経細胞で発現）を強制発現させると、その上では神経突起にシナプス後肥厚やある種の神経伝達物質受容体が集積する<ref name=ref5><pubmed>15620359</pubmed></ref>。これらの活性から、これらの分子がシナプス前部や後部の分化と配向に関わるシナプスオーガナイザーであると推定された。]]<br />
<br />
===シナプス前部の分化===<br />
シナプス前部の分化に関わる分子として同定されたものには、神経筋接合部特異的ラミニンのアイソフォームがある。再生神経の軸索が筋線維に到達すると、基底膜に最初に接触する。この際、筋線維を死滅させ、基底膜を抜け殻のように残したままでも、再生神経は正確に元の神経筋接合部の基底膜上でシナプス前部の分化を起こした<ref><pubmed>307554</pubmed></ref>。つまり、神経筋接合部のシナプス基底膜には、シナプス前部の分化を指示する因子があると想定され、その後、そのような分子が同定されている。最もよく研究されているのは、細胞外マトリックス分子ラミニンのアイソフォームである。ラミニンはすべての基底膜の構成分子であり、ラミニンは、α鎖、β鎖、γ鎖のヘテロ3量体であり、少なくとも5本のα鎖、4本のβ鎖、3本のγ鎖のファミリーからなっている。筋線維は複数のラミニンアイソフォームを合成し基底膜に取り込む。シナプス外の通常の筋基底膜にはβ1鎖を含むラミニンが存在するが、神経筋接合部のシナプス間隙の基底膜にはβ2鎖を持つアイソフォームが見られる(ラミニンの系統的命名法ではlaminin-121と呼ばれる)<ref><pubmed>2922051</pubmed></ref>。in vitroでは、β2ラミニンに運動神経の軸索が接触すると伸長を停止し、シナプス小胞を蓄積し、神経伝達物質を放出するようになる。β2ラミニンを欠く変異マウスでは、シナプス前終末およびシュワン細胞の発達に異常が生じる<ref><pubmed>7885444</pubmed></ref>。<br />
<br />
===シナプス核===<br />
中枢シナプスと違う神経筋接合部の際立った特徴は、筋線維が多数の細胞が融合した[[多核細胞]]（syncytial muscle; multinucleated muscle）であり、神経筋接合部の直下にはシナプス核（synaptic nucleus)と呼ばれる特殊化した細胞核が存在することである<ref><pubmed>11498047</pubmed></ref>（図1A）。シナプス核ではアセチルコリンレセプター遺伝子の転写が強く、シナプスから離れた核では転写が低く、アセチルコリンレセプターmRNAを局在化させ、神経筋接合部の近辺でアセチルコリンレセプターが集まる要因にもなっている。これは、神経が、アセチルコリンを使って、アセチルコリンレセプター遺伝子のシナプス外での発現を抑制すると同時に、軸索から放出されるニューレギュリン（neuregulin, ARIA = Acetylcholine Receptor Inducing Activityとも呼ばれた）が、アセチルコリンレセプター遺伝子の転写活性化につながるシグナリング分子となっている<ref><pubmed>9056721</pubmed></ref>。また、発生途中では、アセチルコリンレセプターの組成も変化する。幼若期に特有なδサブユニット遺伝子からε遺伝子への発現の変換がおこる<ref><pubmed>2423878</pubmed></ref>。生体で見られる発生初期のアセチルコリンレセプターのクラスターは単純なプラーク型であるが、最終的には複雑なプレッツェル型になり、神経筋接合部のひだも形成され、シナプス前終末もそれに対応して成熟する<ref><pubmed>15034266</pubmed></ref>。<br />
<br />
==中枢神経系のシナプス形成==<br />
中枢神経系のシナプスの形成も神経筋接合部のシナプス形成と類似した点が多い。中枢シナプスにおけるシナプス前部とシナプス後部の間の相互作用は、基本的に予め合成されたシナプス構成要素の位置を制御し合うことで、お互いの分化を制御しシナプスを形成すると考えられる<ref name=ref4><pubmed>2655146</pubmed></ref><ref><pubmed>14556707</pubmed></ref><ref><pubmed>17417940</pubmed></ref><ref><pubmed>27462810</pubmed></ref><ref><pubmed>29096080</pubmed></ref><ref name=ref3><pubmed>30359597</pubmed></ref>。そこでは、神経筋接合部のシナプス核のように転写レベルで局所的にシナプス構成要素の生合成を制御することはないが、シナプス近辺での局所的なmRNA翻訳や分解の制御はありうる<ref><pubmed>30861464</pubmed></ref>。その結果、中枢シナプスでも、神経筋接合部と同じように、神経伝達物質の受容体がシナプス後膜に集中し<ref name=ref9><pubmed>22046028</pubmed></ref>、神経伝達物質の違いはあるもののシナプス前部におけるシナプス小胞の分子的な成り立ちも基本的には同じであるように見える<ref name=ref8><pubmed>22794257</pubmed></ref>（図1B）。しかし、中枢シナプスの後部は、神経伝達物質受容体の分子種も異なり、その足場となる分子種も神経筋接合部とは大きく異なっている。特に、神経筋接合部では基底膜という細胞外マトリックスであったシナプス間隙（約50nm）の様相は中枢シナプスでは全く異なっており典型的な細胞外マトリックスは存在しない。中枢シナプスでは、約20nmのシナプス間隙で直接接触するシナプス前膜とシナプス後膜の間に存在する細胞間接着がその相互作用の中心であると考えられている<ref><pubmed>14519398</pubmed></ref><ref><pubmed>22278667</pubmed></ref><ref><pubmed>3492943</pubmed></ref><ref><pubmed>20832286</pubmed></ref><ref name=ref3><pubmed>30359597</pubmed></ref><ref name=ref1><pubmed>32359437</pubmed></ref>（図１B)。<br />
<br />
===中枢シナプス形成のオーガナイザー===<br />
シナプス前部とシナプス後部をつなぐ細胞接着分子は多数ある（[[シナプス接着因子]]の項参考）。それらを代表するものの1つは、シナプス後部の膜に存在するタンパク質であるニューロリギン（neuroligin）である。それに対応するシナプス前膜上の主要なリガンドはニューレキシン（neurexin）である。細胞表面のニューロリギンが、軸索上にシナプス小胞を集積させる能力は、ニューロリギンを強制発現する非神経細胞の上で、神経細胞を培養するin vitroアッセイ系を用いることによって初めて明らかになった<ref name=ref6><pubmed>10892652</pubmed></ref>（図2B)。しかし、''in vitro''アッセイ系で見られるニューロリギンなどのシナプス接着分子の作用には、非神経細胞上にデフォールトで発現しているカドヘリンのような別の接着分子の存在が前提になるようである<ref><pubmed>29760652</pubmed></ref>。また、RIM、RIM-BP、liprin、Munc13、ELKSを含むいくつかのタンパク質ファミリーが、シナプス前部の重要な足場分子として同定されており<ref name=ref8><pubmed>22794257</pubmed></ref>、シナプス前膜のLAR-RPTPs（受容体型膜貫通チロシンホスファターゼ）を通じてアクティブゾーンを形成に預かる<ref><pubmed>23916315</pubmed></ref>。<br />
<br />
一方、シナプス後部の樹状突起内の一部の神経伝達物質受容体や足場分子は、ニューロリギンのリガンドであるニューレキシンを発現させた非神経細胞と接触する部位で凝集する<ref name=ref5><pubmed>15620359</pubmed></ref>（図2B）。このような神経伝達物質受容体とそのシグナル伝達タンパク質の一部は、アクチン細胞骨格との直接的および間接的な相互作用を介して固定されている。特に、興奮性シナプスで顕著な[[シナプス後肥厚]]（postsynaptic density)においては、複数のPDZドメインを持った[[PSD95]]などの細胞内タンパク質が、PDZドメイン結合モチーフを持つニューロリギンなどの膜貫通型接着分子、神経伝達物質受容体、イオンチャネルと複数結合することで、シナプス後部の構成要素をつなぐ足場分子として機能し、ShankやHomerなどの他の足場分子とともに、シナプス構造の構築に関与すると考えられる<ref name=ref9><pubmed>22046028</pubmed></ref><ref><pubmed>28577431</pubmed></ref><ref><pubmed>28179641</pubmed></ref>。一方、抑制性シナプスのシナプス後部では、ゲフィリン（gephyrin）が重要な足場分子として機能する<ref><pubmed>24552784</pubmed></ref><ref><pubmed>28460365</pubmed></ref>。<br />
<br />
4種類あるニューロリギンのうち、ニューロリギン1はグルタミン酸作動性シナプス、ニューロリギン2はGABA作動性シナプス、ニューロリギン3はグルタミン酸とGABA作動性シナプスの両者、そしてニューロリギン4はグリシン作動性シナプスに局在している<ref><pubmed>26209464</pubmed></ref><ref><pubmed>15540461</pubmed></ref><ref><pubmed>17897391</pubmed></ref><ref><pubmed>21282647</pubmed></ref>。培養系の実験では、ニューロリギン1,3,4はグルタミン酸レセプターのクラスタリングを引き起こすが、ニューロリギン２はグルタミン酸レセプターとGABA<sub>A</sub>レセプターのクラスタリングを引き起こす<ref name=ref5><pubmed>15620359</pubmed></ref>。<br />
<br />
しかしながら、ニューレキシンやニューロリギンの遺伝子欠失動物では、予想に反して、シナプスの大きさや数にほとんど影響が見られない<ref><pubmed>12827191</pubmed></ref><ref><pubmed>16982420</pubmed></ref><ref><pubmed>28472659</pubmed></ref>ことから、これらの分子の存在が中枢シナプス形成にどの程度の意味を持っているのかは、実は明らかではない。ニューレキシンやニューロリギンの他にも、シナプス接着分子はシナプス分化の誘発能を持つものやニューレキシンに結合するものも含めて多数報告されてきており<ref><pubmed>29100073</pubmed></ref><ref name=ref3><pubmed>30359597</pubmed></ref><ref name=ref1><pubmed>32359437</pubmed></ref>、冗長性、補償性の高い相互作用システムの一部分である可能性が高い（[[シナプス接着因子]]の項参考）。また、同様な証拠から、シナプスオーガナイザーとして知られているFGFファミリーやWntファミリーといった分泌性の因子なども、この冗長な分子ネットワークの一部であると考えられる<ref><pubmed>20646052</pubmed></ref><ref><pubmed>24105999</pubmed></ref><ref><pubmed>29166241</pubmed></ref>。線虫やショウジョウバエでは、変異体スクリーニングなどから、シナプス形成に関わるとされる遺伝子が多く同定されている<ref><pubmed>31037336</pubmed></ref><ref><pubmed>30986749</pubmed></ref><ref><pubmed>32741370</pubmed></ref>。このことからも、哺乳類の中枢シナプスに関わる分子機構も実際には更に複雑であることが予想される。<br />
<br />
中枢神経系の神経細胞の周りには、シナプス部位を囲むようにペリニューロナルネット（perineuronal nets）と呼ばれるプロテオグリカンやヒアルロナンなどを構成要素とする細胞外マトリックスが存在しており、臨界期などでのシナプス形成の制御にも関わっていると考えられている<ref><pubmed>27911749</pubmed></ref><ref><pubmed>31263252</pubmed></ref>。<br />
<br />
==シナプス形成におけるグリア細胞の役割==<br />
これまでシナプス前部とシナプス後部の接点のみに焦点を当ててきたが、シナプス形成には第3の細胞要素であるグリア細胞も関与している<ref><pubmed>30309945</pubmed></ref><ref name=ref3><pubmed>30359597</pubmed></ref><ref><pubmed>30347385</pubmed></ref>。シュワン細胞は神経筋接合部のグリア細胞であり、[[アストロサイト]]は中枢シナプスのグリア細胞である。シュワン細胞がシナプス形成や維持に与える影響については、シュワン細胞を除去した動物での神経筋接合部の異常から考察されている<ref><pubmed>27656017</pubmed></ref>。<br />
<br />
グリア細胞の細胞表面にある分子と外部に分泌される分子の両方がシナプス形成に必要である。巨大な細胞外マトリックス分子であるトロンボスポンジン(thrombospondin) <ref><pubmed>15707899</pubmed></ref>、脂質であるコレステロール<ref><pubmed>12648780</pubmed></ref>、ヘヴィン（hevin) <ref><pubmed>21788491</pubmed></ref>などである。アストロサイトから分泌されるヘヴィンは、通常は相互作用しない細胞接着分子であるニューレキシンとニューロリギンの一部のアイソフォームを架橋することにより、シナプス形成を促進する<ref><pubmed>26771491</pubmed></ref>。アストロサイト上のグリピカン（glypican)は、シナプス前終末からAMPAレセプタークラスタリング因子ペントラキシン1(pentraxin1)の放出を誘発する<ref><pubmed>29024665</pubmed></ref><ref><pubmed>27986928</pubmed></ref>。また、シナプス形成に拮抗するSPARCなどのシナプスの負の調節因子も知られている<ref><pubmed>21788491</pubmed></ref>。また[[ミクログリア]]は、シナプス刈り込みに関与することで、神経回路の再編に関与する<ref><pubmed>31283900</pubmed></ref>。<br />
<br />
== 関連項目 ==<br />
*[[標的認識]]<br />
*[[成長円錐]]<br />
*[[神経筋接合部]]<br />
*[[シナプス刈り込み]]<br />
*[[シナプス接着因子]]<br />
*[[細胞外マトリックス]]<br />
*[[基底膜]]<br />
*[[シナプス前終末]]<br />
*[[シナプス後肥厚]]<br />
== 参考文献 ==<br />
<references /></div>
Masahitoyamagata
https://bsd.neuroinf.jp/w/index.php?title=%E3%82%B7%E3%83%8A%E3%83%97%E3%82%B9%E5%BD%A2%E6%88%90&diff=44935
シナプス形成
2020-10-22T01:49:41Z
<p>Masahitoyamagata: </p>
<hr />
<div><div align="right"> <br />
<font size="+1">[http://researchmap.jp/yamagatm 山形方人]</font><br><br />
''Harvard University''<br><br />
DOI：<selfdoi /> 原稿受付日：年月日 原稿完成日：年月日<br><br />
担当編集委員：<br><br />
</div><br />
<br />
英：synapse formation, synaptogenesis<br />
{{box|text=<br />
神経細胞とその相手の細胞（神経細胞、筋肉など）は、シナプスという特殊化した細胞接着構造で結合している。シナプス形成とは、神経回路形成において、機能するシナプスができあがるまでの過程である。化学シナプスの形成には、シナプス前部（通常は軸索）が、シナプス後部（神経細胞の樹状突起、筋肉など）となる標的細胞の適切な細胞上の適切な位置に結合すること（シナプス特異性）と、シナプス前部と後部がシナプス間隙を介して同じ場所に配向して、シナプス前部にシナプス小胞や分泌装置の蓄積、シナプス後部に神経伝達物質受容体の集合やシナプス後肥厚が生じるということ（シナプス分化）がある。シナプス形成は、シナプス前部とシナプス後部の間の相互作用によって制御されており、このような細胞間相互作用を担うシナプス接着分子、細胞外マトリックス分子、更に分泌性因子が同定されている。また、グリア細胞など神経細胞以外のプレーヤーの関与も重要である。神経系の発達期や臨界期においては、化学シナプス形成は過剰に行われ、神経活動などの影響により、シナプス刈り込みにより再編成される。また、発達中のシナプス形成とも共通する成熟した神経系でのシナプス新生や構造変化は、学習と記憶にも重要な役割をし、シナプス形成の異常は、自閉症、精神疾患、認知症などの原因になると考えられている。}}<br />
<br />
==はじめに==<br />
神経細胞は、[[シナプス]]で適切に結合、情報伝達し、情報処理ユニットとして機能している。シナプス形成は、神経細胞の間で適切な場所で生じるシナプスの構造構築から機能発現までの過程であるが、正常の発生だけでなく、再生や可塑性でも見られ、正常発生でのシナプス形成と基本的には共通するものであると考えられる。しかし、シナプス形成といった場合、発生における化学シナプスの構造構築について議論されることが多いので、本項目もそれを中心に扱う。また、化学シナプスの形成とは本質的に構造の異なる[[電気シナプス]]（ギャップジャンクション）の形成については、化学シナプス形成との関係性もあると考えられる<ref><pubmed>23237660</pubmed></ref><ref><pubmed>28170151 </pubmed></ref><ref><pubmed>32883654</pubmed></ref>が、本項目では扱わない。<br />
<br />
==シナプス形成の３ステップ==<br />
===ステップ1：シナプス特異性===<br />
軸索は[[軸索ガイダンス]]により、標的細胞近辺に到達する。軸索は特定の標的細胞と特異的にシナプス結合することで、情報を処理できる機能的回路を作る（celluar specificity）。また、シナプスはシナプス後細胞上の特定の部位に形成される（subcellular specificity）<ref><pubmed>19575668</pubmed></ref><ref><pubmed>26656254</pubmed></ref>。この初期のステップについては、「[[標的認識]]」の項を参考にされたい。神経伝達物質や標的細胞が持つ受容体などのシナプスの神経化学的形質は、遺伝子にプログラムされて発生していく神経系の細胞に内在的なものと大方考えられているが、シナプス形成後の誘導により変換するケースもあるかもしれない<ref><pubmed>10202548</pubmed></ref>。<br />
<br />
===ステップ2：シナプス分化===<br />
次に、標的細胞と接触する軸索の一部分は[[シナプス小胞]]や[[アクティブゾーン]]を伴う[[シナプス前終末]]へと分化し（presynaptic differentiation）、軸索と接触した標的細胞では局所的に[[神経伝達物質受容体]]や細胞内足場が集積しシナプス後部へと分化する（postsynaptic differentiation）。シナプス前部とシナプス後部の特殊化は、軸索と標的細胞の間の相互作用で制御される。この細胞間相互作用についての多くの原理的知見は、運動神経細胞からの軸索が骨格筋線維上で作る巨大で単純なシナプスである[[神経筋接合部]]（neuromuscular junction, NMJ)についての20世紀に行われた研究から得られてきた<ref><pubmed>10202544</pubmed></ref>。21世紀になって、小さく多様な中枢神経系でのシナプス形成や無脊椎動物モデル動物のシナプス形成についての分子的な理解が進んでいる<ref><pubmed>30359597</pubmed></ref>。本項目では、特にこのステップについて、原理的な観点から概説する。<br />
<br />
===ステップ3：シナプス再編成===<br />
シナプス形成後は、シナプスの成熟や神経回路の再編成が観察される。発達期においては、シナプス形成は過剰に行われ、神経活動などの影響により過剰なシナプスは除去される<ref><pubmed>10719884</pubmed></ref><ref><pubmed>26436703</pubmed></ref><ref><pubmed>29716431</pubmed></ref><ref><pubmed>31372212</pubmed></ref>。シナプスの除去（synapse elimination）は、[[神経細胞死]]と同様に、神経回路を再編する重要な過程であるが、これについては「[[シナプス刈り込み]]」の項を参考されたい。シナプス形成は、個体発生の過程だけでなく、成体におけるシナプスの新生や構造変化は、学習と記憶にも重要な役割をし、シナプス形成の異常は、[[自閉症]]、[[精神疾患]]、[[認知症]]などの原因になると考えられている<ref><pubmed>22258914</pubmed></ref><ref><pubmed>22540979</pubmed></ref>。。<br />
<br />
==神経筋接合部におけるシナプス形成==<br />
脊髄動物の神経筋接合部は、脊髄にある運動神経細胞から伸長した軸索終末（シナプス前終末）、筋線維、[[シュワン細胞]]の３つの細胞要素からなり、それぞれ神経筋接合部で特徴的に分化している（図1A)。シナプス形成は、運動神経の軸索が、軸索ガイダンスを経て、発生中の筋線維に接近して開始される。[[成長円錐]]が神経終末に変化し始めると、神経終末と反対側の筋表面の一部が特殊化し始める。発生が進むと、[[シナプス間隙]]（synaptic cleft）を介したシナプス前部とシナプス後部の構造的な特徴が明確になり、最終的に筋線維表面のわずか1000分の1の面積を占める成熟した神経筋接合部となる（図１A）。このように、シナプス前部は、シナプス後部と同じ場所で配向し、シナプス前部では、シナプス小胞、アクティブゾーンなど神経伝達物質（アセチルコリン）の分泌装置や[[電位依存性カルシウムチャネル]]などが集積する。一方、シナプス後部では、効率的なシナプス伝達のために、神経伝達物質受容体（アセチルコリンレセプター）とシグナル伝達装置や足場構造が集合する<ref><pubmed>10202544</pubmed></ref><ref><pubmed>25493308</pubmed></ref><ref><pubmed>29415504</pubmed></ref><ref><pubmed>29195055</pubmed></ref>。<br />
[[ファイル:Fig1-SF.jpg|サムネイル|250px|'''図1 神経筋接合部と中枢シナプスのシナプス形成<br />
A. 脊椎動物の神経筋接合部。運動神経細胞から伸長した軸索末端が多核の筋線維に接触することで、情報交換が始まる。シナプス前部ではシナプス小胞が集積し、シナプス後部では神経伝達物質受容体であるニコチン性アセチルコリンレセプターが集まり始める。成熟した神経筋接合部ではシナプス前部にはシナプス小胞、アクティブゾーンが形成される。シナプス間隙には、シナプス領域で特化したシナプス基底膜が存在し、そこには、アセチルコリンエステラーゼに加え、アグリンやβ2ラミニンなどのシナプスオーガナイザー活性を持つ分子も局在する。シナプス後部には、アセチルコリンレセプターが集積し、Rapsynなどの足場分子やMuSK, Lrp4などのシグナル分子も集まる。シナプスの直下では、核も特殊化しており、アセチルコリンレセプター遺伝子を強く発現している（本文参考）。Sanes & Lichtman (1999) <ref><pubmed>10202544</pubmed></ref>などを参考にした。<br />
B. 中枢シナプス形成。Vaughn (1989) <ref><pubmed>2655146</pubmed></ref>の形態学的モデルをもとに、神経筋接合部のシナプス形成と対比させた。ここでも、シナプス前部と後部の情報交換により、シナプス分化が開始される。中枢シナプスのシナプス間隙には神経筋接合部とは異なり、基底膜は存在せず、前部と後部の直接的な接着が相互作用の中心であり、シナプス小胞や神経伝達物質受容体が、前部と後部にそれぞれ集積する。興奮性シナプスでは顕著なシナプス後肥厚が形成される。]]<br />
<br />
===シナプスオーガナイザー===<br />
運動神経細胞と筋線維は、それぞれ独立してシナプス前部とシナプス後部に対応するシナプス構成要素を合成し、自立的に集合させることが可能である。つまり、運動軸索では、筋線維がない状態でもシナプス小胞が見られ、軸索中に保持することができる。一方、筋線維は神経伝達物質受容体であるアセチルコリンレセプターを合成し、神経がない状態でも、細胞表面上に多数のアセチルコリンレセプターからなる巨大集合構造を作ることができる（クラスタリング, clustering）。したがって、シナプス形成を制御する細胞間相互作用は、シナプス小胞の形成や受容体クラスタリングそのものの誘発因子というより、むしろそれらの位置を決め配向させる指令因子（オーガナイザー, organizer）としての役割が大きい。また、軸索中のシナプス小胞の集積は、ポリリジン被覆ビーズなどとの接触でも容易に引き起こされることから、オーガナイザーとしての役割もAll or nothingといった絶対的なものではなく促進的なものである<ref><pubmed>7127105</pubmed></ref>。しかし、以下に記述するように、シナプス後部やシナプス前部の分化が、それぞれの接触によって誘発、促進される可能性があることを示す証拠もある。これらの証拠のいくつかは、神経筋接合部の再生を利用することで得られた。<br />
<br />
===シナプス後部の分化===<br />
シナプス後部の分化に積極的に関わる分子として想定されたのがアグリン（agrin）である<ref><pubmed>1966767</pubmed></ref>。シナプス前部筋線維は、[[細胞外マトリックス]]である[[基底膜]]（basement membrane, basal lamina）に包まれている。基底膜の成分は、通常、IV型コラーゲン、ヘパラン硫酸プロテオグリカン（パールカンperlecan）、[[ラミニン]]（laminin）などであるが<ref><pubmed>12556454</pubmed></ref>、神経筋接合部の基底膜（シナプス基底膜 synaptic basement membrane）には、シナプス形成に関わる重要な因子であるヘパラン硫酸プロテオグリカンのアグリン（agrin）が存在する。損傷した筋組織の基底膜を再生する筋肉に接触させると、シナプス後部の特徴を誘導することができる。つまり、基底膜にはアセチルコリンレセプターのクラスタリングに関わる因子が存在することが想定されアグリンは生化学的に精製された（図２A）。オールターナティブスプライシングによる特殊エクソン由来配列を含むために、強力な受容体クラスタリング能を持つアグリンは運動神経細胞側で発現し、運動神経を通じて末梢に運搬され、神経筋接合部の基底膜に保持される。アグリン欠損マウスでは、神経筋接合部が乱れており、神経筋接合部におけるアセチルコリンレセプタークラスターの数、大きさ、密度が減少している<ref><pubmed>8653788</pubmed></ref>。 このことから、アグリンはシナプス後部の分化に関わる神経由来の因子であると考えられる。アグリンは、筋特異的チロシンキナーゼ（MuSK）やLRP4を含むいくつかの受容体に結合して、アダプタータンパク質（Dok7）や細胞骨格タンパク質（Rapsyn）とともに、アセチルコリンレセプターのクラスタリングにつながる一連の情報伝達系に影響を与える<ref><pubmed>20215342</pubmed></ref><ref><pubmed>29415504</pubmed></ref><ref><pubmed>8653786</pubmed></ref><ref><pubmed>8653787</pubmed></ref><ref><pubmed>16794080</pubmed></ref><ref><pubmed>7675108</pubmed></ref>。<br />
[[ファイル:Fig2-SF.jpg|サムネイル|250px|'''図２ シナプスオーガナイザー<br />
A. 培養化の筋線維に、アグリンを加えると、アセチルコリンレセプターがクラスタリングする。アグリン欠損マウスでは、神経筋接合部におけるアセチルコリンレセプタークラスターの数、大きさ、密度が減少する<ref><pubmed>8653788</pubmed></ref>。<br />
B. 培養細胞(293細胞など）に、ニューロリギン（通常、シナプス後部の神経細胞で発現）を強制発現させ、その上で神経細胞を培養し神経突起を伸長させると、シナプス小胞の蓄積が観察される<ref><pubmed>10892652</pubmed></ref>。また、ニューレキシン（通常、シナプス前部の神経細胞で発現）を強制発現させると、その上では神経突起にシナプス後肥厚やある種の神経伝達物質受容体が集積する<ref><pubmed>15620359</pubmed></ref>。これらの活性から、これらの分子がシナプス前部や後部の分化と配向に関わるシナプスオーガナイザーであると推定された。]]<br />
<br />
===シナプス前部の分化===<br />
シナプス前部の分化に関わる分子として同定されたものには、神経筋接合部特異的ラミニンのアイソフォームがある。再生神経の軸索が筋線維に到達すると、基底膜に最初に接触する。この際、筋線維を死滅させ、基底膜を抜け殻のように残したままでも、再生神経は正確に元の神経筋接合部の基底膜上でシナプス前部の分化を起こした<ref><pubmed>307554</pubmed></ref>。つまり、神経筋接合部のシナプス基底膜には、シナプス前部の分化を指示する因子があると想定され、その後、そのような分子が同定されている。最もよく研究されているのは、細胞外マトリックス分子ラミニンのアイソフォームである。ラミニンはすべての基底膜の構成分子であり、ラミニンは、α鎖、β鎖、γ鎖のヘテロ3量体であり、少なくとも5本のα鎖、4本のβ鎖、3本のγ鎖のファミリーからなっている。筋線維は複数のラミニンアイソフォームを合成し基底膜に取り込む。シナプス外の通常の筋基底膜にはβ1鎖を含むラミニンが存在するが、神経筋接合部のシナプス間隙の基底膜にはβ2鎖を持つアイソフォームが見られる<ref><pubmed>2922051</pubmed></ref>。in vitroでは、β2ラミニンに運動神経の軸索が接触すると伸長を停止し、シナプス小胞を蓄積し、神経伝達物質を放出するようになる。β2ラミニンを欠く変異マウスでは、シナプス前終末およびシュワン細胞の発達に異常が生じる<ref><pubmed>7885444</pubmed></ref>。<br />
<br />
===シナプス核===<br />
中枢シナプスと違う神経筋接合部の際立った特徴は、筋線維が多数の細胞が融合した[[多核細胞]]（syncytial muscle; multinucleated muscle）であり、神経筋接合部の直下にはシナプス核（synaptic nucleus)と呼ばれる特殊化した細胞核が存在することである<ref><pubmed>11498047</pubmed></ref>（図1A）。シナプス核ではアセチルコリンレセプター遺伝子の転写が強く、シナプスから離れた核では転写が低く、アセチルコリンレセプターmRNAを局在化させ、神経筋接合部の近辺でアセチルコリンレセプターが集まる要因にもなっている。これは、神経が、アセチルコリンを使って、アセチルコリンレセプター遺伝子のシナプス外での発現を抑制すると同時に、軸索から放出されるニューレギュリン（neuregulin, ARIA = Acetylcholine Receptor Inducing Activityとも呼ばれた）が、アセチルコリンレセプター遺伝子の転写活性化につながるシグナリング分子となっている<ref><pubmed>9056721</pubmed></ref>。また、発生途中では、アセチルコリンレセプターの組成も変化する。幼若期に特有なδサブユニット遺伝子からε遺伝子への発現の変換がおこる<ref><pubmed>2423878</pubmed></ref>。生体で見られる発生初期のアセチルコリンレセプターのクラスターは単純なプラーク型であるが、最終的には複雑なプレッツェル型になり、神経筋接合部のひだも形成され、シナプス前終末もそれに対応して成熟する<ref><pubmed>15034266</pubmed></ref>。<br />
<br />
==中枢神経系のシナプス形成==<br />
中枢神経系のシナプスの形成も神経筋接合部のシナプス形成と類似した点が多い。中枢シナプスにおけるシナプス前部とシナプス後部の間の相互作用は、基本的に予め合成されたシナプス構成要素の位置を制御し合うことで、お互いの分化を制御しシナプスを形成すると考えられる<ref><pubmed>2655146</pubmed></ref><ref><pubmed>14556707</pubmed></ref><ref><pubmed>17417940</pubmed></ref><ref><pubmed>27462810</pubmed></ref><ref><pubmed>29096080</pubmed></ref><ref><pubmed>30359597</pubmed></ref>。そこでは、神経筋接合部のシナプス核のように転写レベルで局所的にシナプス構成要素の生合成を制御することはないが、シナプス近辺での局所的なmRNA翻訳や分解の制御はありうる<ref><pubmed>30861464</pubmed></ref>。その結果、中枢シナプスでも、神経筋接合部と同じように、神経伝達物質の受容体がシナプス後膜に集中し<ref><pubmed>22046028</pubmed></ref>、神経伝達物質の違いはあるもののシナプス前部におけるシナプス小胞の分子的な成り立ちも基本的には同じであるように見える<ref><pubmed>22794257</pubmed></ref>（図1B）。しかし、中枢シナプスの後部は、神経伝達物質受容体の分子種も異なり、その足場となる分子種も神経筋接合部とは大きく異なっている。特に、神経筋接合部では基底膜という細胞外マトリックスであったシナプス間隙（約50nm）の様相は中枢シナプスでは全く異なっており典型的な細胞外マトリックスは存在しない。中枢シナプスでは、約20nmのシナプス間隙で直接接触するシナプス前膜とシナプス後膜の間に存在する細胞間接着がその相互作用の中心であると考えられている<ref><pubmed>14519398</pubmed></ref><ref><pubmed>22278667</pubmed></ref><ref><pubmed>3492943</pubmed></ref><ref><pubmed>20832286</pubmed></ref><ref><pubmed>30359597</pubmed></ref><ref><pubmed>32359437</pubmed></ref>（図１B)。<br />
<br />
===中枢シナプス形成のオーガナイザー===<br />
シナプス前部とシナプス後部をつなぐ細胞接着分子は多数ある（[[シナプス接着因子]]の項参考）。それらを代表するものの1つは、シナプス後部の膜に存在するタンパク質であるニューロリギン（neuroligin）である。それに対応するシナプス前膜上の主要なリガンドはニューレキシン（neurexin）である。細胞表面のニューロリギンが、軸索上にシナプス小胞を集積させる能力は、ニューロリギンを強制発現する非神経細胞の上で、神経細胞を培養するin vitroアッセイ系を用いることによって初めて明らかになった<ref><pubmed>10892652</pubmed></ref>（図2B)。しかし、in vitroアッセイ系で見られるニューロリギンなどのシナプス接着分子の作用には、非神経細胞上にデフォールトで発現しているカドヘリンのような別の接着分子の存在が前提になるようである<ref><pubmed>29760652</pubmed></ref>。また、RIM、RIM-BP、liprin、Munc13、ELKSを含むいくつかのタンパク質ファミリーが、シナプス前部の重要な足場分子として同定されており<ref><pubmed>22794257</pubmed></ref>、シナプス前膜のLAR-RPTPs（受容体型膜貫通チロシンホスファターゼ）を通じてアクティブゾーンを形成に預かる<ref><pubmed>23916315</pubmed></ref>。<br />
<br />
一方、シナプス後部の樹状突起内の一部の神経伝達物質受容体や足場分子は、ニューロリギンのリガンドであるニューレキシンを発現させた非神経細胞と接触する部位で凝集する<ref><pubmed>15620359</pubmed></ref>（図2B）。このような神経伝達物質受容体とそのシグナル伝達タンパク質の一部は、アクチン細胞骨格との直接的および間接的な相互作用を介して固定されている。特に、興奮性シナプスで顕著な[[シナプス後肥厚]]（postsynaptic density)においては、複数のPDZドメインを持った[[PSD95]]などの細胞内タンパク質が、PDZドメイン結合モチーフを持つニューロリギンなどの膜貫通型接着分子、神経伝達物質受容体、イオンチャネルと複数結合することで、シナプス後部の構成要素をつなぐ足場分子として機能し、ShankやHomerなどの他の足場分子とともに、シナプス構造の構築に関与すると考えられる<ref><pubmed>22046028</pubmed></ref><ref><pubmed>28577431</pubmed></ref><ref><pubmed>28179641</pubmed></ref>。一方、抑制性シナプスのシナプス後部では、ゲフィリン（gephyrin）が重要な足場分子として機能する<ref><pubmed>24552784</pubmed></ref><ref><pubmed>28460365</pubmed></ref>。<br />
<br />
4種類あるニューロリギンのうち、ニューロリギン1はグルタミン酸作動性シナプス、ニューロリギン2はGABA作動性シナプス、ニューロリギン3はグルタミン酸とGABA作動性シナプスの両者、そしてニューロリギン4はグリシン作動性シナプスに局在している<ref><pubmed>26209464</pubmed></ref><ref><pubmed>15540461</pubmed></ref><ref><pubmed>17897391</pubmed></ref><ref><pubmed>21282647</pubmed></ref>。培養系の実験では、ニューロリギン1,3,4はグルタミン酸レセプターのクラスタリングを引き起こすが、ニューロリギン２はグルタミン酸レセプターとGABAAレセプターのクラスタリングを引き起こす<ref><pubmed>15620359</pubmed></ref>。<br />
<br />
しかしながら、ニューレキシンやニューロリギンの遺伝子欠失動物では、予想に反して、シナプスの大きさや数にほとんど影響が見られない<ref><pubmed>12827191</pubmed></ref><ref><pubmed>16982420</pubmed></ref><ref><pubmed>28472659</pubmed></ref>ことから、これらの分子の存在が中枢シナプス形成にどの程度の意味を持っているのかは、実は明らかではない。ニューレキシンやニューロリギンの他にも、シナプス接着分子はシナプス分化の誘発能を持つものやニューレキシンに結合するものも含めて多数報告されてきており<ref><pubmed>29100073</pubmed></ref><ref><pubmed>30359597</pubmed></ref><ref><pubmed>32359437</pubmed></ref>、冗長性、補償性の高い相互作用システムの一部分である可能性が高い（[[シナプス接着因子]]の項参考）。また、同様な証拠から、シナプスオーガナイザーとして知られているFGFファミリーやWntファミリーといった分泌性の因子なども、この冗長な分子ネットワークの一部であると考えられる<ref><pubmed>20646052</pubmed></ref><ref><pubmed>24105999</pubmed></ref><ref><pubmed>29166241</pubmed></ref>。センチュウやショウジョウバエでは、変異体スクリーニングなどから、シナプス形成に関わるとされる遺伝子が多く同定されている<ref><pubmed>31037336</pubmed></ref><ref><pubmed>30986749</pubmed></ref><ref><pubmed>32741370</pubmed></ref>。このことからも、哺乳類の中枢シナプスに関わる分子機構も実際には更に複雑であることが予想される。<br />
<br />
中枢神経系の神経細胞の周りには、シナプス部位を囲むようにペリニューロナルネット（perineuronal nets）と呼ばれるプロテオグリカンやヒアルロナンなどを構成要素とする細胞外マトリックスが存在しており、臨界期などでのシナプス形成の制御にも関わっていると考えられている<ref><pubmed>27911749</pubmed></ref><ref><pubmed>31263252</pubmed></ref>。<br />
<br />
==シナプス形成におけるグリア細胞の役割==<br />
これまでシナプス前部とシナプス後部の接点のみに焦点を当ててきたが、シナプス形成には第3の細胞要素であるグリア細胞も関与している<ref><pubmed>30309945</pubmed></ref><ref><pubmed>30359597</pubmed></ref><ref><pubmed>30347385</pubmed></ref>。シュワン細胞は神経筋接合部のグリア細胞であり、[[アストロサイト]]は中枢シナプスのグリア細胞である。シュワン細胞がシナプス形成や維持に与える影響については、シュワン細胞を除去した動物での神経筋接合部の異常から考察されている<ref><pubmed>27656017</pubmed></ref>。<br />
<br />
グリア細胞の細胞表面にある分子と外部に分泌される分子の両方がシナプス形成に必要である。巨大な細胞外マトリックス分子であるトロンボスポンジン(thrombospondin) <ref><pubmed>15707899</pubmed></ref>、脂質であるコレステロール<ref><pubmed>12648780</pubmed></ref>、ヘヴィン（hevin) <ref><pubmed>21788491</pubmed></ref>などである。アストロサイトから分泌されるヘヴィンは、通常は相互作用しない細胞接着分子であるニューレキシンとニューロリギンの一部のアイソフォームを架橋することにより、シナプス形成を促進する<ref><pubmed>26771491</pubmed></ref>。アストロサイト上のグリピカン（glypican)は、シナプス前終末からAMPAレセプタークラスタリング因子ペントラキシン1(pentraxin1)の放出を誘発する<ref><pubmed>29024665</pubmed></ref><ref><pubmed>27986928</pubmed></ref>。また、シナプス形成に拮抗するSPARCなどのシナプスの負の調節因子も知られている<ref><pubmed>21788491</pubmed></ref>。また[[ミクログリア]]は、シナプス刈り込みに関与することで、神経回路の再編に関与する<ref><pubmed>31283900</pubmed></ref>。<br />
<br />
== 関連項目 ==<br />
*[[標的認識]]<br />
*[[成長円錐]]<br />
*[[神経筋接合部]]<br />
*[[シナプス刈り込み]]<br />
*[[シナプス接着因子]]<br />
*[[細胞外マトリックス]]<br />
*[[基底膜]]<br />
*[[シナプス前終末]]<br />
*[[シナプス後肥厚]]<br />
== 参考文献 ==<br />
<references /></div>
Masahitoyamagata
https://bsd.neuroinf.jp/w/index.php?title=%E3%82%B7%E3%83%8A%E3%83%97%E3%82%B9%E5%BD%A2%E6%88%90&diff=44934
シナプス形成
2020-10-22T01:06:23Z
<p>Masahitoyamagata: /* シナプス形成の３ステップについての概観 */</p>
<hr />
<div><div align="right"> <br />
<font size="+1">[http://researchmap.jp/yamagatm 山形方人]</font><br><br />
''Harvard University''<br><br />
DOI：<selfdoi /> 原稿受付日：年月日 原稿完成日：年月日<br><br />
担当編集委員：<br><br />
</div><br />
<br />
英：synapse formation, synaptogenesis<br />
{{box|text=<br />
神経細胞とその相手の細胞（神経細胞、筋肉など）は、シナプスという特殊化した細胞接着構造で結合している。シナプス形成とは、神経回路形成において、機能するシナプスができあがるまでの過程である。化学シナプスの形成には、シナプス前部（通常は軸索）が、シナプス後部（神経細胞の樹状突起、筋肉など）となる標的細胞の適切な細胞上の適切な位置に結合すること（シナプス特異性）と、シナプス前部と後部がシナプス間隙を介して同じ場所に配向して、シナプス前部にシナプス小胞や分泌装置の蓄積、シナプス後部に神経伝達物質受容体の集合やシナプス重厚部が生じるということ（シナプス分化）がある。シナプス形成は、シナプス前部とシナプス後部の間の相互作用によって制御されており、このような細胞間相互作用を担うシナプス接着分子、細胞外マトリックス分子、更に分泌性因子が同定されている。また、グリア細胞など神経細胞以外のプレーヤーの関与も重要である。神経系の発達期や臨界期においては、化学シナプス形成は過剰に行われ、神経活動などの影響により、シナプス刈り込みにより再編成される。また、発達中のシナプス形成とも共通する成熟した神経系でのシナプス新生や構造変化は、学習と記憶にも重要な役割をし、シナプス形成の異常は、自閉症、精神疾患、認知症などの原因になると考えられている。}}<br />
<br />
==はじめに==<br />
神経細胞は、[[シナプス]]で適切に結合、情報伝達し、情報処理ユニットとして機能している。シナプス形成は、神経細胞の間で適切な場所で生じるシナプスの構造構築から機能発現までの過程であるが、正常の発生だけでなく、再生や可塑性でも見られ、正常発生でのシナプス形成と基本的には共通するものであると考えられる。しかし、シナプス形成といった場合、発生における化学シナプスの構造構築について議論されることが多いので、本項目もそれを中心に扱う。また、化学シナプスの形成とは本質的に構造の異なる[[電気シナプス]]（ギャップジャンクション）の形成については、化学シナプス形成との関係性もあると考えられる<ref><pubmed>23237660</pubmed></ref><ref><pubmed>28170151 </pubmed></ref><ref><pubmed>32883654</pubmed></ref>が、本項目では扱わない。<br />
<br />
==シナプス形成の３ステップ==<br />
===ステップ1：シナプス特異性===<br />
軸索は[[軸索ガイダンス]]により、標的細胞近辺に到達する。軸索は特定の標的細胞と特異的にシナプス結合することで、情報を処理できる機能的回路を作る（celluar specificity）。また、シナプスはシナプス後細胞上の特定の部位に形成される（subcellular specificity）<ref><pubmed>19575668</pubmed></ref><ref><pubmed>26656254</pubmed></ref>。この初期のステップについては、「[[標的認識]]」の項を参考にされたい。神経伝達物質や標的細胞が持つ受容体などのシナプスの神経化学的形質は、遺伝子にプログラムされて発生していく神経系の細胞に内在的なものと大方考えられているが、シナプス形成後の誘導により変換するケースもあるかもしれない<ref><pubmed>10202548</pubmed></ref>。<br />
<br />
===ステップ2：シナプス分化===<br />
次に、標的細胞と接触する軸索の一部分は[[シナプス小胞]]や[[アクティブゾーン]]を伴う[[シナプス前終末]]へと分化し（presynaptic differentiation）、軸索と接触した標的細胞では局所的に[[神経伝達物質受容体]]や細胞内足場が集積しシナプス後部へと分化する（postsynaptic differentiation）。シナプス前部とシナプス後部の特殊化は、軸索と標的細胞の間の相互作用で制御される。この細胞間相互作用についての多くの原理的知見は、運動神経細胞からの軸索が骨格筋線維上で作る巨大で単純なシナプスである[[神経筋接合部]]（neuromuscular junction, NMJ)についての20世紀に行われた研究から得られてきた<ref><pubmed>10202544</pubmed></ref>。21世紀になって、小さく多様な中枢神経系でのシナプス形成や無脊椎動物モデル動物のシナプス形成についての分子的な理解が進んでいる<ref><pubmed>30359597</pubmed></ref>。本項目では、特にこのステップについて、原理的な観点から概説する。<br />
<br />
===ステップ3：シナプス再編成===<br />
シナプス形成後は、シナプスの成熟や神経回路の再編成が観察される。発達期においては、シナプス形成は過剰に行われ、神経活動などの影響により過剰なシナプスは除去される<ref><pubmed>10719884</pubmed></ref><ref><pubmed>26436703</pubmed></ref><ref><pubmed>29716431</pubmed></ref><ref><pubmed>31372212</pubmed></ref>。シナプスの除去（synapse elimination）は、[[神経細胞死]]と同様に、神経回路を再編する重要な過程であるが、これについては「[[シナプス刈り込み]]」の項を参考されたい。シナプス形成は、個体発生の過程だけでなく、成体におけるシナプスの新生や構造変化は、学習と記憶にも重要な役割をし、シナプス形成の異常は、[[自閉症]]、[[精神疾患]]、[[認知症]]などの原因になると考えられている<ref><pubmed>22258914</pubmed></ref><ref><pubmed>22540979</pubmed></ref>。。<br />
<br />
==神経筋接合部におけるシナプス形成==<br />
脊髄動物の神経筋接合部は、脊髄にある運動神経細胞から伸長した軸索終末（シナプス前終末）、筋線維、[[シュワン細胞]]の３つの細胞要素からなり、それぞれ神経筋接合部で特徴的に分化している（図1A)。シナプス形成は、運動神経の軸索が、軸索ガイダンスを経て、発生中の筋線維に接近して開始される。[[成長円錐]]が神経終末に変化し始めると、神経終末と反対側の筋表面の一部が特殊化し始める。発生が進むと、[[シナプス間隙]]（synaptic cleft）を介したシナプス前部とシナプス後部の構造的な特徴が明確になり、最終的に筋線維表面のわずか1000分の1の面積を占める成熟した神経筋接合部となる（図１A）。このように、シナプス前部は、シナプス後部と同じ場所で配向し、シナプス前部では、シナプス小胞、アクティブゾーンなど神経伝達物質（アセチルコリン）の分泌装置や[[電位依存性カルシウムチャネル]]などが集積する。一方、シナプス後部では、効率的なシナプス伝達のために、神経伝達物質受容体（アセチルコリンレセプター）とシグナル伝達装置や足場構造が集合する<ref><pubmed>10202544</pubmed></ref><ref><pubmed>25493308</pubmed></ref><ref><pubmed>29415504</pubmed></ref><ref><pubmed>29195055</pubmed></ref>。<br />
[[ファイル:Fig1-SF.jpg|サムネイル|250px|'''図1 神経筋接合部と中枢シナプスのシナプス形成<br />
A. 脊椎動物の神経筋接合部。運動神経細胞から伸長した軸索末端が多核の筋線維に接触することで、情報交換が始まる。シナプス前部ではシナプス小胞が集積し、シナプス後部では神経伝達物質受容体であるニコチン性アセチルコリンレセプターが集まり始める。成熟した神経筋接合部ではシナプス前部にはシナプス小胞、アクティブゾーンが形成される。シナプス間隙には、シナプス領域で特化したシナプス基底膜が存在し、そこには、アセチルコリンエステラーゼに加え、アグリンやβ2ラミニンなどのシナプスオーガナイザー活性を持つ分子も局在する。シナプス後部には、アセチルコリンレセプターが集積し、Rapsynなどの足場分子やMuSK, Lrp4などのシグナル分子も集まる。シナプスの直下では、核も特殊化しており、アセチルコリンレセプター遺伝子を強く発現している（本文参考）。Sanes & Lichtman (1999) <ref><pubmed>10202544</pubmed></ref>などを参考にした。<br />
B. 中枢シナプス形成。Vaughn (1989) <ref><pubmed>2655146</pubmed></ref>の形態学的モデルをもとに、神経筋接合部のシナプス形成と対比させた。ここでも、シナプス前部と後部の情報交換により、シナプス分化が開始される。中枢シナプスのシナプス間隙には神経筋接合部とは異なり、基底膜は存在せず、前部と後部の直接的な接着が相互作用の中心であり、シナプス小胞や神経伝達物質受容体が、前部と後部にそれぞれ集積する。興奮性シナプスでは顕著なシナプス後肥厚が形成される。]]<br />
<br />
===シナプスオーガナイザー===<br />
運動神経細胞と筋線維は、それぞれ独立してシナプス前部とシナプス後部に対応するシナプス構成要素を合成し、自立的に集合させることが可能である。つまり、運動軸索では、筋線維がない状態でもシナプス小胞が見られ、軸索中に保持することができる。一方、筋線維は神経伝達物質受容体であるアセチルコリンレセプターを合成し、神経がない状態でも、細胞表面上に多数のアセチルコリンレセプターからなる巨大集合構造を作ることができる（クラスタリング, clustering）。したがって、シナプス形成を制御する細胞間相互作用は、シナプス小胞の形成や受容体クラスタリングそのものの誘発因子というより、むしろそれらの位置を決め配向させる指令因子（オーガナイザー, organizer）としての役割が大きい。また、軸索中のシナプス小胞の集積は、ポリリジン被覆ビーズなどとの接触でも容易に引き起こされることから、オーガナイザーとしての役割もAll or nothingといった絶対的なものではなく促進的なものである<ref><pubmed>7127105</pubmed></ref>。しかし、以下に記述するように、シナプス後部やシナプス前部の分化が、それぞれの接触によって誘発、促進される可能性があることを示す証拠もある。これらの証拠のいくつかは、神経筋接合部の再生を利用することで得られた。<br />
<br />
===シナプス後部の分化===<br />
シナプス後部の分化に積極的に関わる分子として想定されたのがアグリン（agrin）である<ref><pubmed>1966767</pubmed></ref>。シナプス前部筋線維は、[[細胞外マトリックス]]である[[基底膜]]（basement membrane, basal lamina）に包まれている。基底膜の成分は、通常、IV型コラーゲン、ヘパラン硫酸プロテオグリカン（パールカンperlecan）、[[ラミニン]]（laminin）などであるが<ref><pubmed>12556454</pubmed></ref>、神経筋接合部の基底膜（シナプス基底膜 synaptic basement membrane）には、シナプス形成に関わる重要な因子であるヘパラン硫酸プロテオグリカンのアグリン（agrin）が存在する。損傷した筋組織の基底膜を再生する筋肉に接触させると、シナプス後部の特徴を誘導することができる。つまり、基底膜にはアセチルコリンレセプターのクラスタリングに関わる因子が存在することが想定されアグリンは生化学的に精製された（図２A）。オールターナティブスプライシングによる特殊エクソン由来配列を含むために、強力な受容体クラスタリング能を持つアグリンは運動神経細胞側で発現し、運動神経を通じて末梢に運搬され、神経筋接合部の基底膜に保持される。アグリン欠損マウスでは、神経筋接合部が乱れており、神経筋接合部におけるアセチルコリンレセプタークラスターの数、大きさ、密度が減少している<ref><pubmed>8653788</pubmed></ref>。 このことから、アグリンはシナプス後部の分化に関わる神経由来の因子であると考えられる。アグリンは、筋特異的チロシンキナーゼ（MuSK）やLRP4を含むいくつかの受容体に結合して、アダプタータンパク質（Dok7）や細胞骨格タンパク質（Rapsyn）とともに、アセチルコリンレセプターのクラスタリングにつながる一連の情報伝達系に影響を与える<ref><pubmed>20215342</pubmed></ref><ref><pubmed>29415504</pubmed></ref><ref><pubmed>8653786</pubmed></ref><ref><pubmed>8653787</pubmed></ref><ref><pubmed>16794080</pubmed></ref><ref><pubmed>7675108</pubmed></ref>。<br />
[[ファイル:Fig2-SF.jpg|サムネイル|250px|'''図２ シナプスオーガナイザー<br />
A. 培養化の筋線維に、アグリンを加えると、アセチルコリンレセプターがクラスタリングする。アグリン欠損マウスでは、神経筋接合部におけるアセチルコリンレセプタークラスターの数、大きさ、密度が減少する<ref><pubmed>8653788</pubmed></ref>。<br />
B. 培養細胞(293細胞など）に、ニューロリギン（通常、シナプス後部の神経細胞で発現）を強制発現させ、その上で神経細胞を培養し神経突起を伸長させると、シナプス小胞の蓄積が観察される<ref><pubmed>10892652</pubmed></ref>。また、ニューレキシン（通常、シナプス前部の神経細胞で発現）を強制発現させると、その上では神経突起にシナプス後肥厚やある種の神経伝達物質受容体が集積する<ref><pubmed>15620359</pubmed></ref>。これらの活性から、これらの分子がシナプス前部や後部の分化と配向に関わるシナプスオーガナイザーであると推定された。]]<br />
<br />
===シナプス前部の分化===<br />
シナプス前部の分化に関わる分子として同定されたものには、神経筋接合部特異的ラミニンのアイソフォームがある。再生神経の軸索が筋線維に到達すると、基底膜に最初に接触する。この際、筋線維を死滅させ、基底膜を抜け殻のように残したままでも、再生神経は正確に元の神経筋接合部の基底膜上でシナプス前部の分化を起こした<ref><pubmed>307554</pubmed></ref>。つまり、神経筋接合部のシナプス基底膜には、シナプス前部の分化を指示する因子があると想定され、その後、そのような分子が同定されている。最もよく研究されているのは、細胞外マトリックス分子ラミニンのアイソフォームである。ラミニンはすべての基底膜の構成分子であり、ラミニンは、α鎖、β鎖、γ鎖のヘテロ3量体であり、少なくとも5本のα鎖、4本のβ鎖、3本のγ鎖のファミリーからなっている。筋線維は複数のラミニンアイソフォームを合成し基底膜に取り込む。シナプス外の通常の筋基底膜にはβ1鎖を含むラミニンが存在するが、神経筋接合部のシナプス間隙の基底膜にはβ2鎖を持つアイソフォームが見られる<ref><pubmed>2922051</pubmed></ref>。in vitroでは、β2ラミニンに運動神経の軸索が接触すると伸長を停止し、シナプス小胞を蓄積し、神経伝達物質を放出するようになる。β2ラミニンを欠く変異マウスでは、シナプス前終末およびシュワン細胞の発達に異常が生じる<ref><pubmed>7885444</pubmed></ref>。<br />
<br />
===シナプス核===<br />
中枢シナプスと違う神経筋接合部の際立った特徴は、筋線維が多数の細胞が融合した[[多核細胞]]（syncytial muscle; multinucleated muscle）であり、神経筋接合部の直下にはシナプス核（synaptic nucleus)と呼ばれる特殊化した細胞核が存在することである<ref><pubmed>11498047</pubmed></ref>（図1A）。シナプス核ではアセチルコリンレセプター遺伝子の転写が強く、シナプスから離れた核では転写が低く、アセチルコリンレセプターmRNAを局在化させ、神経筋接合部の近辺でアセチルコリンレセプターが集まる要因にもなっている。これは、神経が、アセチルコリンを使って、アセチルコリンレセプター遺伝子のシナプス外での発現を抑制すると同時に、軸索から放出されるニューレギュリン（neuregulin, ARIA = Acetylcholine Receptor Inducing Activityとも呼ばれた）が、アセチルコリンレセプター遺伝子の転写活性化につながるシグナリング分子となっている<ref><pubmed>9056721</pubmed></ref>。また、発生途中では、アセチルコリンレセプターの組成も変化する。幼若期に特有なδサブユニット遺伝子からε遺伝子への発現の変換がおこる<ref><pubmed>2423878</pubmed></ref>。生体で見られる発生初期のアセチルコリンレセプターのクラスターは単純なプラーク型であるが、最終的には複雑なプレッツェル型になり、神経筋接合部のひだも形成され、シナプス前終末もそれに対応して成熟する<ref><pubmed>15034266</pubmed></ref>。<br />
<br />
==中枢神経系のシナプス形成==<br />
中枢神経系のシナプスの形成も神経筋接合部のシナプス形成と類似した点が多い。中枢シナプスにおけるシナプス前部とシナプス後部の間の相互作用は、基本的に予め合成されたシナプス構成要素の位置を制御し合うことで、お互いの分化を制御しシナプスを形成すると考えられる<ref><pubmed>2655146</pubmed></ref><ref><pubmed>14556707</pubmed></ref><ref><pubmed>17417940</pubmed></ref><ref><pubmed>27462810</pubmed></ref><ref><pubmed>29096080</pubmed></ref><ref><pubmed>30359597</pubmed></ref>。そこでは、神経筋接合部のシナプス核のように転写レベルで局所的にシナプス構成要素の生合成を制御することはないが、シナプス近辺での局所的なmRNA翻訳や分解の制御はありうる<ref><pubmed>30861464</pubmed></ref>。その結果、中枢シナプスでも、神経筋接合部と同じように、神経伝達物質の受容体がシナプス後膜に集中し<ref><pubmed>22046028</pubmed></ref>、神経伝達物質の違いはあるもののシナプス前部におけるシナプス小胞の分子的な成り立ちも基本的には同じであるように見える<ref><pubmed>22794257</pubmed></ref>（図1B）。しかし、中枢シナプスの後部は、神経伝達物質受容体の分子種も異なり、その足場となる分子種も神経筋接合部とは大きく異なっている。特に、神経筋接合部では基底膜という細胞外マトリックスであったシナプス間隙（約50nm）の様相は中枢シナプスでは全く異なっており典型的な細胞外マトリックスは存在しない。中枢シナプスでは、約20nmのシナプス間隙で直接接触するシナプス前膜とシナプス後膜の間に存在する細胞間接着がその相互作用の中心であると考えられている<ref><pubmed>14519398</pubmed></ref><ref><pubmed>22278667</pubmed></ref><ref><pubmed>3492943</pubmed></ref><ref><pubmed>20832286</pubmed></ref><ref><pubmed>30359597</pubmed></ref><ref><pubmed>32359437</pubmed></ref>（図１B)。<br />
<br />
===中枢シナプス形成のオーガナイザー===<br />
シナプス前部とシナプス後部をつなぐ細胞接着分子は多数ある（[[シナプス接着因子]]の項参考）。それらを代表するものの1つは、シナプス後部の膜に存在するタンパク質であるニューロリギン（neuroligin）である。それに対応するシナプス前膜上の主要なリガンドはニューレキシン（neurexin）である。細胞表面のニューロリギンが、軸索上にシナプス小胞を集積させる能力は、ニューロリギンを強制発現する非神経細胞の上で、神経細胞を培養するin vitroアッセイ系を用いることによって初めて明らかになった<ref><pubmed>10892652</pubmed></ref>（図2B)。しかし、in vitroアッセイ系で見られるニューロリギンなどのシナプス接着分子の作用には、非神経細胞上にデフォールトで発現しているカドヘリンのような別の接着分子の存在が前提になるようである<ref><pubmed>29760652</pubmed></ref>。また、RIM、RIM-BP、liprin、Munc13、ELKSを含むいくつかのタンパク質ファミリーが、シナプス前部の重要な足場分子として同定されており<ref><pubmed>22794257</pubmed></ref>、シナプス前膜のLAR-RPTPs（受容体型膜貫通チロシンホスファターゼ）を通じてアクティブゾーンを形成に預かる<ref><pubmed>23916315</pubmed></ref>。<br />
<br />
一方、シナプス後部の樹状突起内の一部の神経伝達物質受容体や足場分子は、ニューロリギンのリガンドであるニューレキシンを発現させた非神経細胞と接触する部位で凝集する<ref><pubmed>15620359</pubmed></ref>（図2B）。このような神経伝達物質受容体とそのシグナル伝達タンパク質の一部は、アクチン細胞骨格との直接的および間接的な相互作用を介して固定されている。特に、興奮性シナプスで顕著な[[シナプス後肥厚]]（postsynaptic density)においては、複数のPDZドメインを持った[[PSD95]]などの細胞内タンパク質が、PDZドメイン結合モチーフを持つニューロリギンなどの膜貫通型接着分子、神経伝達物質受容体、イオンチャネルと複数結合することで、シナプス後部の構成要素をつなぐ足場分子として機能し、ShankやHomerなどの他の足場分子とともに、シナプス構造の構築に関与すると考えられる<ref><pubmed>22046028</pubmed></ref><ref><pubmed>28577431</pubmed></ref><ref><pubmed>28179641</pubmed></ref>。一方、抑制性シナプスのシナプス後部では、ゲフィリン（gephyrin）が重要な足場分子として機能する<ref><pubmed>24552784</pubmed></ref><ref><pubmed>28460365</pubmed></ref>。<br />
<br />
4種類あるニューロリギンのうち、ニューロリギン1はグルタミン酸作動性シナプス、ニューロリギン2はGABA作動性シナプス、ニューロリギン3はグルタミン酸とGABA作動性シナプスの両者、そしてニューロリギン4はグリシン作動性シナプスに局在している<ref><pubmed>26209464</pubmed></ref><ref><pubmed>15540461</pubmed></ref><ref><pubmed>17897391</pubmed></ref><ref><pubmed>21282647</pubmed></ref>。培養系の実験では、ニューロリギン1,3,4はグルタミン酸レセプターのクラスタリングを引き起こすが、ニューロリギン２はグルタミン酸レセプターとGABAAレセプターのクラスタリングを引き起こす<ref><pubmed>15620359</pubmed></ref>。<br />
<br />
しかしながら、ニューレキシンやニューロリギンの遺伝子欠失動物では、予想に反して、シナプスの大きさや数にほとんど影響が見られない<ref><pubmed>12827191</pubmed></ref><ref><pubmed>16982420</pubmed></ref><ref><pubmed>28472659</pubmed></ref>ことから、これらの分子の存在が中枢シナプス形成にどの程度の意味を持っているのかは、実は明らかではない。ニューレキシンやニューロリギンの他にも、シナプス接着分子はシナプス分化の誘発能を持つものやニューレキシンに結合するものも含めて多数報告されてきており<ref><pubmed>29100073</pubmed></ref><ref><pubmed>30359597</pubmed></ref><ref><pubmed>32359437</pubmed></ref>、冗長性、補償性の高い相互作用システムの一部分である可能性が高い（[[シナプス接着因子]]の項参考）。また、同様な証拠から、シナプスオーガナイザーとして知られているFGFファミリーやWntファミリーといった分泌性の因子なども、この冗長な分子ネットワークの一部であると考えられる<ref><pubmed>20646052</pubmed></ref><ref><pubmed>24105999</pubmed></ref><ref><pubmed>29166241</pubmed></ref>。センチュウやショウジョウバエでは、変異体スクリーニングなどから、シナプス形成に関わるとされる遺伝子が多く同定されている<ref><pubmed>31037336</pubmed></ref><ref><pubmed>30986749</pubmed></ref><ref><pubmed>32741370</pubmed></ref>。このことからも、哺乳類の中枢シナプスに関わる分子機構も実際には更に複雑であることが予想される。<br />
<br />
中枢神経系の神経細胞の周りには、シナプス部位を囲むようにペリニューロナルネット（perineuronal nets）と呼ばれるプロテオグリカンやヒアルロナンなどを構成要素とする細胞外マトリックスが存在しており、臨界期などでのシナプス形成の制御にも関わっていると考えられている<ref><pubmed>27911749</pubmed></ref><ref><pubmed>31263252</pubmed></ref>。<br />
<br />
==シナプス形成におけるグリア細胞の役割==<br />
これまでシナプス前部とシナプス後部の接点のみに焦点を当ててきたが、シナプス形成には第3の細胞要素であるグリア細胞も関与している<ref><pubmed>30309945</pubmed></ref><ref><pubmed>30359597</pubmed></ref><ref><pubmed>30347385</pubmed></ref>。シュワン細胞は神経筋接合部のグリア細胞であり、[[アストロサイト]]は中枢シナプスのグリア細胞である。シュワン細胞がシナプス形成や維持に与える影響については、シュワン細胞を除去した動物での神経筋接合部の異常から考察されている<ref><pubmed>27656017</pubmed></ref>。<br />
<br />
グリア細胞の細胞表面にある分子と外部に分泌される分子の両方がシナプス形成に必要である。巨大な細胞外マトリックス分子であるトロンボスポンジン(thrombospondin) <ref><pubmed>15707899</pubmed></ref>、脂質であるコレステロール<ref><pubmed>12648780</pubmed></ref>、ヘヴィン（hevin) <ref><pubmed>21788491</pubmed></ref>などである。アストロサイトから分泌されるヘヴィンは、通常は相互作用しない細胞接着分子であるニューレキシンとニューロリギンの一部のアイソフォームを架橋することにより、シナプス形成を促進する<ref><pubmed>26771491</pubmed></ref>。アストロサイト上のグリピカン（glypican)は、シナプス前終末からAMPAレセプタークラスタリング因子ペントラキシン1(pentraxin1)の放出を誘発する<ref><pubmed>29024665</pubmed></ref><ref><pubmed>27986928</pubmed></ref>。また、シナプス形成に拮抗するSPARCなどのシナプスの負の調節因子も知られている<ref><pubmed>21788491</pubmed></ref>。また[[ミクログリア]]は、シナプス刈り込みに関与することで、神経回路の再編に関与する<ref><pubmed>31283900</pubmed></ref>。<br />
<br />
== 関連項目 ==<br />
*[[標的認識]]<br />
*[[成長円錐]]<br />
*[[神経筋接合部]]<br />
*[[シナプス刈り込み]]<br />
*[[シナプス接着因子]]<br />
*[[細胞外マトリックス]]<br />
*[[基底膜]]<br />
*[[シナプス前終末]]<br />
*[[シナプス後肥厚]]<br />
== 参考文献 ==<br />
<references /></div>
Masahitoyamagata
https://bsd.neuroinf.jp/w/index.php?title=%E3%82%B7%E3%83%8A%E3%83%97%E3%82%B9%E5%BD%A2%E6%88%90&diff=44933
シナプス形成
2020-10-22T01:05:56Z
<p>Masahitoyamagata: /* シナプス形成におけるグリア細胞の役割 */</p>
<hr />
<div><div align="right"> <br />
<font size="+1">[http://researchmap.jp/yamagatm 山形方人]</font><br><br />
''Harvard University''<br><br />
DOI：<selfdoi /> 原稿受付日：年月日 原稿完成日：年月日<br><br />
担当編集委員：<br><br />
</div><br />
<br />
英：synapse formation, synaptogenesis<br />
{{box|text=<br />
神経細胞とその相手の細胞（神経細胞、筋肉など）は、シナプスという特殊化した細胞接着構造で結合している。シナプス形成とは、神経回路形成において、機能するシナプスができあがるまでの過程である。化学シナプスの形成には、シナプス前部（通常は軸索）が、シナプス後部（神経細胞の樹状突起、筋肉など）となる標的細胞の適切な細胞上の適切な位置に結合すること（シナプス特異性）と、シナプス前部と後部がシナプス間隙を介して同じ場所に配向して、シナプス前部にシナプス小胞や分泌装置の蓄積、シナプス後部に神経伝達物質受容体の集合やシナプス重厚部が生じるということ（シナプス分化）がある。シナプス形成は、シナプス前部とシナプス後部の間の相互作用によって制御されており、このような細胞間相互作用を担うシナプス接着分子、細胞外マトリックス分子、更に分泌性因子が同定されている。また、グリア細胞など神経細胞以外のプレーヤーの関与も重要である。神経系の発達期や臨界期においては、化学シナプス形成は過剰に行われ、神経活動などの影響により、シナプス刈り込みにより再編成される。また、発達中のシナプス形成とも共通する成熟した神経系でのシナプス新生や構造変化は、学習と記憶にも重要な役割をし、シナプス形成の異常は、自閉症、精神疾患、認知症などの原因になると考えられている。}}<br />
<br />
==はじめに==<br />
神経細胞は、[[シナプス]]で適切に結合、情報伝達し、情報処理ユニットとして機能している。シナプス形成は、神経細胞の間で適切な場所で生じるシナプスの構造構築から機能発現までの過程であるが、正常の発生だけでなく、再生や可塑性でも見られ、正常発生でのシナプス形成と基本的には共通するものであると考えられる。しかし、シナプス形成といった場合、発生における化学シナプスの構造構築について議論されることが多いので、本項目もそれを中心に扱う。また、化学シナプスの形成とは本質的に構造の異なる[[電気シナプス]]（ギャップジャンクション）の形成については、化学シナプス形成との関係性もあると考えられる<ref><pubmed>23237660</pubmed></ref><ref><pubmed>28170151 </pubmed></ref><ref><pubmed>32883654</pubmed></ref>が、本項目では扱わない。<br />
<br />
==シナプス形成の３ステップについての概観==<br />
===ステップ1：シナプス特異性===<br />
軸索は[[軸索ガイダンス]]により、標的細胞近辺に到達する。軸索は特定の標的細胞と特異的にシナプス結合することで、情報を処理できる機能的回路を作る（celluar specificity）。また、シナプスはシナプス後細胞上の特定の部位に形成される（subcellular specificity）<ref><pubmed>19575668</pubmed></ref><ref><pubmed>26656254</pubmed></ref>。この初期のステップについては、「[[標的認識]]」の項を参考にされたい。神経伝達物質や標的細胞が持つ受容体などのシナプスの神経化学的形質は、遺伝子にプログラムされて発生していく神経系の細胞に内在的なものと大方考えられているが、シナプス形成後の誘導により変換するケースもあるかもしれない<ref><pubmed>10202548</pubmed></ref>。<br />
<br />
===ステップ2：シナプス分化===<br />
次に、標的細胞と接触する軸索の一部分は[[シナプス小胞]]や[[アクティブゾーン]]を伴う[[シナプス前終末]]へと分化し（presynaptic differentiation）、軸索と接触した標的細胞では局所的に[[神経伝達物質受容体]]や細胞内足場が集積しシナプス後部へと分化する（postsynaptic differentiation）。シナプス前部とシナプス後部の特殊化は、軸索と標的細胞の間の相互作用で制御される。この細胞間相互作用についての多くの原理的知見は、運動神経細胞からの軸索が骨格筋線維上で作る巨大で単純なシナプスである[[神経筋接合部]]（neuromuscular junction, NMJ)についての20世紀に行われた研究から得られてきた<ref><pubmed>10202544</pubmed></ref>。21世紀になって、小さく多様な中枢神経系でのシナプス形成や無脊椎動物モデル動物のシナプス形成についての分子的な理解が進んでいる<ref><pubmed>30359597</pubmed></ref>。本項目では、特にこのステップについて、原理的な観点から概説する。<br />
<br />
===ステップ3：シナプス再編成===<br />
シナプス形成後は、シナプスの成熟や神経回路の再編成が観察される。発達期においては、シナプス形成は過剰に行われ、神経活動などの影響により過剰なシナプスは除去される<ref><pubmed>10719884</pubmed></ref><ref><pubmed>26436703</pubmed></ref><ref><pubmed>29716431</pubmed></ref><ref><pubmed>31372212</pubmed></ref>。シナプスの除去（synapse elimination）は、[[神経細胞死]]と同様に、神経回路を再編する重要な過程であるが、これについては「[[シナプス刈り込み]]」の項を参考されたい。シナプス形成は、個体発生の過程だけでなく、成体におけるシナプスの新生や構造変化は、学習と記憶にも重要な役割をし、シナプス形成の異常は、[[自閉症]]、[[精神疾患]]、[[認知症]]などの原因になると考えられている<ref><pubmed>22258914</pubmed></ref><ref><pubmed>22540979</pubmed></ref>。。<br />
<br />
==神経筋接合部におけるシナプス形成==<br />
脊髄動物の神経筋接合部は、脊髄にある運動神経細胞から伸長した軸索終末（シナプス前終末）、筋線維、[[シュワン細胞]]の３つの細胞要素からなり、それぞれ神経筋接合部で特徴的に分化している（図1A)。シナプス形成は、運動神経の軸索が、軸索ガイダンスを経て、発生中の筋線維に接近して開始される。[[成長円錐]]が神経終末に変化し始めると、神経終末と反対側の筋表面の一部が特殊化し始める。発生が進むと、[[シナプス間隙]]（synaptic cleft）を介したシナプス前部とシナプス後部の構造的な特徴が明確になり、最終的に筋線維表面のわずか1000分の1の面積を占める成熟した神経筋接合部となる（図１A）。このように、シナプス前部は、シナプス後部と同じ場所で配向し、シナプス前部では、シナプス小胞、アクティブゾーンなど神経伝達物質（アセチルコリン）の分泌装置や[[電位依存性カルシウムチャネル]]などが集積する。一方、シナプス後部では、効率的なシナプス伝達のために、神経伝達物質受容体（アセチルコリンレセプター）とシグナル伝達装置や足場構造が集合する<ref><pubmed>10202544</pubmed></ref><ref><pubmed>25493308</pubmed></ref><ref><pubmed>29415504</pubmed></ref><ref><pubmed>29195055</pubmed></ref>。<br />
[[ファイル:Fig1-SF.jpg|サムネイル|250px|'''図1 神経筋接合部と中枢シナプスのシナプス形成<br />
A. 脊椎動物の神経筋接合部。運動神経細胞から伸長した軸索末端が多核の筋線維に接触することで、情報交換が始まる。シナプス前部ではシナプス小胞が集積し、シナプス後部では神経伝達物質受容体であるニコチン性アセチルコリンレセプターが集まり始める。成熟した神経筋接合部ではシナプス前部にはシナプス小胞、アクティブゾーンが形成される。シナプス間隙には、シナプス領域で特化したシナプス基底膜が存在し、そこには、アセチルコリンエステラーゼに加え、アグリンやβ2ラミニンなどのシナプスオーガナイザー活性を持つ分子も局在する。シナプス後部には、アセチルコリンレセプターが集積し、Rapsynなどの足場分子やMuSK, Lrp4などのシグナル分子も集まる。シナプスの直下では、核も特殊化しており、アセチルコリンレセプター遺伝子を強く発現している（本文参考）。Sanes & Lichtman (1999) <ref><pubmed>10202544</pubmed></ref>などを参考にした。<br />
B. 中枢シナプス形成。Vaughn (1989) <ref><pubmed>2655146</pubmed></ref>の形態学的モデルをもとに、神経筋接合部のシナプス形成と対比させた。ここでも、シナプス前部と後部の情報交換により、シナプス分化が開始される。中枢シナプスのシナプス間隙には神経筋接合部とは異なり、基底膜は存在せず、前部と後部の直接的な接着が相互作用の中心であり、シナプス小胞や神経伝達物質受容体が、前部と後部にそれぞれ集積する。興奮性シナプスでは顕著なシナプス後肥厚が形成される。]]<br />
<br />
===シナプスオーガナイザー===<br />
運動神経細胞と筋線維は、それぞれ独立してシナプス前部とシナプス後部に対応するシナプス構成要素を合成し、自立的に集合させることが可能である。つまり、運動軸索では、筋線維がない状態でもシナプス小胞が見られ、軸索中に保持することができる。一方、筋線維は神経伝達物質受容体であるアセチルコリンレセプターを合成し、神経がない状態でも、細胞表面上に多数のアセチルコリンレセプターからなる巨大集合構造を作ることができる（クラスタリング, clustering）。したがって、シナプス形成を制御する細胞間相互作用は、シナプス小胞の形成や受容体クラスタリングそのものの誘発因子というより、むしろそれらの位置を決め配向させる指令因子（オーガナイザー, organizer）としての役割が大きい。また、軸索中のシナプス小胞の集積は、ポリリジン被覆ビーズなどとの接触でも容易に引き起こされることから、オーガナイザーとしての役割もAll or nothingといった絶対的なものではなく促進的なものである<ref><pubmed>7127105</pubmed></ref>。しかし、以下に記述するように、シナプス後部やシナプス前部の分化が、それぞれの接触によって誘発、促進される可能性があることを示す証拠もある。これらの証拠のいくつかは、神経筋接合部の再生を利用することで得られた。<br />
<br />
===シナプス後部の分化===<br />
シナプス後部の分化に積極的に関わる分子として想定されたのがアグリン（agrin）である<ref><pubmed>1966767</pubmed></ref>。シナプス前部筋線維は、[[細胞外マトリックス]]である[[基底膜]]（basement membrane, basal lamina）に包まれている。基底膜の成分は、通常、IV型コラーゲン、ヘパラン硫酸プロテオグリカン（パールカンperlecan）、[[ラミニン]]（laminin）などであるが<ref><pubmed>12556454</pubmed></ref>、神経筋接合部の基底膜（シナプス基底膜 synaptic basement membrane）には、シナプス形成に関わる重要な因子であるヘパラン硫酸プロテオグリカンのアグリン（agrin）が存在する。損傷した筋組織の基底膜を再生する筋肉に接触させると、シナプス後部の特徴を誘導することができる。つまり、基底膜にはアセチルコリンレセプターのクラスタリングに関わる因子が存在することが想定されアグリンは生化学的に精製された（図２A）。オールターナティブスプライシングによる特殊エクソン由来配列を含むために、強力な受容体クラスタリング能を持つアグリンは運動神経細胞側で発現し、運動神経を通じて末梢に運搬され、神経筋接合部の基底膜に保持される。アグリン欠損マウスでは、神経筋接合部が乱れており、神経筋接合部におけるアセチルコリンレセプタークラスターの数、大きさ、密度が減少している<ref><pubmed>8653788</pubmed></ref>。 このことから、アグリンはシナプス後部の分化に関わる神経由来の因子であると考えられる。アグリンは、筋特異的チロシンキナーゼ（MuSK）やLRP4を含むいくつかの受容体に結合して、アダプタータンパク質（Dok7）や細胞骨格タンパク質（Rapsyn）とともに、アセチルコリンレセプターのクラスタリングにつながる一連の情報伝達系に影響を与える<ref><pubmed>20215342</pubmed></ref><ref><pubmed>29415504</pubmed></ref><ref><pubmed>8653786</pubmed></ref><ref><pubmed>8653787</pubmed></ref><ref><pubmed>16794080</pubmed></ref><ref><pubmed>7675108</pubmed></ref>。<br />
[[ファイル:Fig2-SF.jpg|サムネイル|250px|'''図２ シナプスオーガナイザー<br />
A. 培養化の筋線維に、アグリンを加えると、アセチルコリンレセプターがクラスタリングする。アグリン欠損マウスでは、神経筋接合部におけるアセチルコリンレセプタークラスターの数、大きさ、密度が減少する<ref><pubmed>8653788</pubmed></ref>。<br />
B. 培養細胞(293細胞など）に、ニューロリギン（通常、シナプス後部の神経細胞で発現）を強制発現させ、その上で神経細胞を培養し神経突起を伸長させると、シナプス小胞の蓄積が観察される<ref><pubmed>10892652</pubmed></ref>。また、ニューレキシン（通常、シナプス前部の神経細胞で発現）を強制発現させると、その上では神経突起にシナプス後肥厚やある種の神経伝達物質受容体が集積する<ref><pubmed>15620359</pubmed></ref>。これらの活性から、これらの分子がシナプス前部や後部の分化と配向に関わるシナプスオーガナイザーであると推定された。]]<br />
<br />
===シナプス前部の分化===<br />
シナプス前部の分化に関わる分子として同定されたものには、神経筋接合部特異的ラミニンのアイソフォームがある。再生神経の軸索が筋線維に到達すると、基底膜に最初に接触する。この際、筋線維を死滅させ、基底膜を抜け殻のように残したままでも、再生神経は正確に元の神経筋接合部の基底膜上でシナプス前部の分化を起こした<ref><pubmed>307554</pubmed></ref>。つまり、神経筋接合部のシナプス基底膜には、シナプス前部の分化を指示する因子があると想定され、その後、そのような分子が同定されている。最もよく研究されているのは、細胞外マトリックス分子ラミニンのアイソフォームである。ラミニンはすべての基底膜の構成分子であり、ラミニンは、α鎖、β鎖、γ鎖のヘテロ3量体であり、少なくとも5本のα鎖、4本のβ鎖、3本のγ鎖のファミリーからなっている。筋線維は複数のラミニンアイソフォームを合成し基底膜に取り込む。シナプス外の通常の筋基底膜にはβ1鎖を含むラミニンが存在するが、神経筋接合部のシナプス間隙の基底膜にはβ2鎖を持つアイソフォームが見られる<ref><pubmed>2922051</pubmed></ref>。in vitroでは、β2ラミニンに運動神経の軸索が接触すると伸長を停止し、シナプス小胞を蓄積し、神経伝達物質を放出するようになる。β2ラミニンを欠く変異マウスでは、シナプス前終末およびシュワン細胞の発達に異常が生じる<ref><pubmed>7885444</pubmed></ref>。<br />
<br />
===シナプス核===<br />
中枢シナプスと違う神経筋接合部の際立った特徴は、筋線維が多数の細胞が融合した[[多核細胞]]（syncytial muscle; multinucleated muscle）であり、神経筋接合部の直下にはシナプス核（synaptic nucleus)と呼ばれる特殊化した細胞核が存在することである<ref><pubmed>11498047</pubmed></ref>（図1A）。シナプス核ではアセチルコリンレセプター遺伝子の転写が強く、シナプスから離れた核では転写が低く、アセチルコリンレセプターmRNAを局在化させ、神経筋接合部の近辺でアセチルコリンレセプターが集まる要因にもなっている。これは、神経が、アセチルコリンを使って、アセチルコリンレセプター遺伝子のシナプス外での発現を抑制すると同時に、軸索から放出されるニューレギュリン（neuregulin, ARIA = Acetylcholine Receptor Inducing Activityとも呼ばれた）が、アセチルコリンレセプター遺伝子の転写活性化につながるシグナリング分子となっている<ref><pubmed>9056721</pubmed></ref>。また、発生途中では、アセチルコリンレセプターの組成も変化する。幼若期に特有なδサブユニット遺伝子からε遺伝子への発現の変換がおこる<ref><pubmed>2423878</pubmed></ref>。生体で見られる発生初期のアセチルコリンレセプターのクラスターは単純なプラーク型であるが、最終的には複雑なプレッツェル型になり、神経筋接合部のひだも形成され、シナプス前終末もそれに対応して成熟する<ref><pubmed>15034266</pubmed></ref>。<br />
<br />
==中枢神経系のシナプス形成==<br />
中枢神経系のシナプスの形成も神経筋接合部のシナプス形成と類似した点が多い。中枢シナプスにおけるシナプス前部とシナプス後部の間の相互作用は、基本的に予め合成されたシナプス構成要素の位置を制御し合うことで、お互いの分化を制御しシナプスを形成すると考えられる<ref><pubmed>2655146</pubmed></ref><ref><pubmed>14556707</pubmed></ref><ref><pubmed>17417940</pubmed></ref><ref><pubmed>27462810</pubmed></ref><ref><pubmed>29096080</pubmed></ref><ref><pubmed>30359597</pubmed></ref>。そこでは、神経筋接合部のシナプス核のように転写レベルで局所的にシナプス構成要素の生合成を制御することはないが、シナプス近辺での局所的なmRNA翻訳や分解の制御はありうる<ref><pubmed>30861464</pubmed></ref>。その結果、中枢シナプスでも、神経筋接合部と同じように、神経伝達物質の受容体がシナプス後膜に集中し<ref><pubmed>22046028</pubmed></ref>、神経伝達物質の違いはあるもののシナプス前部におけるシナプス小胞の分子的な成り立ちも基本的には同じであるように見える<ref><pubmed>22794257</pubmed></ref>（図1B）。しかし、中枢シナプスの後部は、神経伝達物質受容体の分子種も異なり、その足場となる分子種も神経筋接合部とは大きく異なっている。特に、神経筋接合部では基底膜という細胞外マトリックスであったシナプス間隙（約50nm）の様相は中枢シナプスでは全く異なっており典型的な細胞外マトリックスは存在しない。中枢シナプスでは、約20nmのシナプス間隙で直接接触するシナプス前膜とシナプス後膜の間に存在する細胞間接着がその相互作用の中心であると考えられている<ref><pubmed>14519398</pubmed></ref><ref><pubmed>22278667</pubmed></ref><ref><pubmed>3492943</pubmed></ref><ref><pubmed>20832286</pubmed></ref><ref><pubmed>30359597</pubmed></ref><ref><pubmed>32359437</pubmed></ref>（図１B)。<br />
<br />
===中枢シナプス形成のオーガナイザー===<br />
シナプス前部とシナプス後部をつなぐ細胞接着分子は多数ある（[[シナプス接着因子]]の項参考）。それらを代表するものの1つは、シナプス後部の膜に存在するタンパク質であるニューロリギン（neuroligin）である。それに対応するシナプス前膜上の主要なリガンドはニューレキシン（neurexin）である。細胞表面のニューロリギンが、軸索上にシナプス小胞を集積させる能力は、ニューロリギンを強制発現する非神経細胞の上で、神経細胞を培養するin vitroアッセイ系を用いることによって初めて明らかになった<ref><pubmed>10892652</pubmed></ref>（図2B)。しかし、in vitroアッセイ系で見られるニューロリギンなどのシナプス接着分子の作用には、非神経細胞上にデフォールトで発現しているカドヘリンのような別の接着分子の存在が前提になるようである<ref><pubmed>29760652</pubmed></ref>。また、RIM、RIM-BP、liprin、Munc13、ELKSを含むいくつかのタンパク質ファミリーが、シナプス前部の重要な足場分子として同定されており<ref><pubmed>22794257</pubmed></ref>、シナプス前膜のLAR-RPTPs（受容体型膜貫通チロシンホスファターゼ）を通じてアクティブゾーンを形成に預かる<ref><pubmed>23916315</pubmed></ref>。<br />
<br />
一方、シナプス後部の樹状突起内の一部の神経伝達物質受容体や足場分子は、ニューロリギンのリガンドであるニューレキシンを発現させた非神経細胞と接触する部位で凝集する<ref><pubmed>15620359</pubmed></ref>（図2B）。このような神経伝達物質受容体とそのシグナル伝達タンパク質の一部は、アクチン細胞骨格との直接的および間接的な相互作用を介して固定されている。特に、興奮性シナプスで顕著な[[シナプス後肥厚]]（postsynaptic density)においては、複数のPDZドメインを持った[[PSD95]]などの細胞内タンパク質が、PDZドメイン結合モチーフを持つニューロリギンなどの膜貫通型接着分子、神経伝達物質受容体、イオンチャネルと複数結合することで、シナプス後部の構成要素をつなぐ足場分子として機能し、ShankやHomerなどの他の足場分子とともに、シナプス構造の構築に関与すると考えられる<ref><pubmed>22046028</pubmed></ref><ref><pubmed>28577431</pubmed></ref><ref><pubmed>28179641</pubmed></ref>。一方、抑制性シナプスのシナプス後部では、ゲフィリン（gephyrin）が重要な足場分子として機能する<ref><pubmed>24552784</pubmed></ref><ref><pubmed>28460365</pubmed></ref>。<br />
<br />
4種類あるニューロリギンのうち、ニューロリギン1はグルタミン酸作動性シナプス、ニューロリギン2はGABA作動性シナプス、ニューロリギン3はグルタミン酸とGABA作動性シナプスの両者、そしてニューロリギン4はグリシン作動性シナプスに局在している<ref><pubmed>26209464</pubmed></ref><ref><pubmed>15540461</pubmed></ref><ref><pubmed>17897391</pubmed></ref><ref><pubmed>21282647</pubmed></ref>。培養系の実験では、ニューロリギン1,3,4はグルタミン酸レセプターのクラスタリングを引き起こすが、ニューロリギン２はグルタミン酸レセプターとGABAAレセプターのクラスタリングを引き起こす<ref><pubmed>15620359</pubmed></ref>。<br />
<br />
しかしながら、ニューレキシンやニューロリギンの遺伝子欠失動物では、予想に反して、シナプスの大きさや数にほとんど影響が見られない<ref><pubmed>12827191</pubmed></ref><ref><pubmed>16982420</pubmed></ref><ref><pubmed>28472659</pubmed></ref>ことから、これらの分子の存在が中枢シナプス形成にどの程度の意味を持っているのかは、実は明らかではない。ニューレキシンやニューロリギンの他にも、シナプス接着分子はシナプス分化の誘発能を持つものやニューレキシンに結合するものも含めて多数報告されてきており<ref><pubmed>29100073</pubmed></ref><ref><pubmed>30359597</pubmed></ref><ref><pubmed>32359437</pubmed></ref>、冗長性、補償性の高い相互作用システムの一部分である可能性が高い（[[シナプス接着因子]]の項参考）。また、同様な証拠から、シナプスオーガナイザーとして知られているFGFファミリーやWntファミリーといった分泌性の因子なども、この冗長な分子ネットワークの一部であると考えられる<ref><pubmed>20646052</pubmed></ref><ref><pubmed>24105999</pubmed></ref><ref><pubmed>29166241</pubmed></ref>。センチュウやショウジョウバエでは、変異体スクリーニングなどから、シナプス形成に関わるとされる遺伝子が多く同定されている<ref><pubmed>31037336</pubmed></ref><ref><pubmed>30986749</pubmed></ref><ref><pubmed>32741370</pubmed></ref>。このことからも、哺乳類の中枢シナプスに関わる分子機構も実際には更に複雑であることが予想される。<br />
<br />
中枢神経系の神経細胞の周りには、シナプス部位を囲むようにペリニューロナルネット（perineuronal nets）と呼ばれるプロテオグリカンやヒアルロナンなどを構成要素とする細胞外マトリックスが存在しており、臨界期などでのシナプス形成の制御にも関わっていると考えられている<ref><pubmed>27911749</pubmed></ref><ref><pubmed>31263252</pubmed></ref>。<br />
<br />
==シナプス形成におけるグリア細胞の役割==<br />
これまでシナプス前部とシナプス後部の接点のみに焦点を当ててきたが、シナプス形成には第3の細胞要素であるグリア細胞も関与している<ref><pubmed>30309945</pubmed></ref><ref><pubmed>30359597</pubmed></ref><ref><pubmed>30347385</pubmed></ref>。シュワン細胞は神経筋接合部のグリア細胞であり、[[アストロサイト]]は中枢シナプスのグリア細胞である。シュワン細胞がシナプス形成や維持に与える影響については、シュワン細胞を除去した動物での神経筋接合部の異常から考察されている<ref><pubmed>27656017</pubmed></ref>。<br />
<br />
グリア細胞の細胞表面にある分子と外部に分泌される分子の両方がシナプス形成に必要である。巨大な細胞外マトリックス分子であるトロンボスポンジン(thrombospondin) <ref><pubmed>15707899</pubmed></ref>、脂質であるコレステロール<ref><pubmed>12648780</pubmed></ref>、ヘヴィン（hevin) <ref><pubmed>21788491</pubmed></ref>などである。アストロサイトから分泌されるヘヴィンは、通常は相互作用しない細胞接着分子であるニューレキシンとニューロリギンの一部のアイソフォームを架橋することにより、シナプス形成を促進する<ref><pubmed>26771491</pubmed></ref>。アストロサイト上のグリピカン（glypican)は、シナプス前終末からAMPAレセプタークラスタリング因子ペントラキシン1(pentraxin1)の放出を誘発する<ref><pubmed>29024665</pubmed></ref><ref><pubmed>27986928</pubmed></ref>。また、シナプス形成に拮抗するSPARCなどのシナプスの負の調節因子も知られている<ref><pubmed>21788491</pubmed></ref>。また[[ミクログリア]]は、シナプス刈り込みに関与することで、神経回路の再編に関与する<ref><pubmed>31283900</pubmed></ref>。<br />
<br />
== 関連項目 ==<br />
*[[標的認識]]<br />
*[[成長円錐]]<br />
*[[神経筋接合部]]<br />
*[[シナプス刈り込み]]<br />
*[[シナプス接着因子]]<br />
*[[細胞外マトリックス]]<br />
*[[基底膜]]<br />
*[[シナプス前終末]]<br />
*[[シナプス後肥厚]]<br />
== 参考文献 ==<br />
<references /></div>
Masahitoyamagata
https://bsd.neuroinf.jp/w/index.php?title=%E3%82%B7%E3%83%8A%E3%83%97%E3%82%B9%E5%BD%A2%E6%88%90&diff=44932
シナプス形成
2020-10-22T01:05:05Z
<p>Masahitoyamagata: /* 中枢神経系のシナプス形成 */</p>
<hr />
<div><div align="right"> <br />
<font size="+1">[http://researchmap.jp/yamagatm 山形方人]</font><br><br />
''Harvard University''<br><br />
DOI：<selfdoi /> 原稿受付日：年月日 原稿完成日：年月日<br><br />
担当編集委員：<br><br />
</div><br />
<br />
英：synapse formation, synaptogenesis<br />
{{box|text=<br />
神経細胞とその相手の細胞（神経細胞、筋肉など）は、シナプスという特殊化した細胞接着構造で結合している。シナプス形成とは、神経回路形成において、機能するシナプスができあがるまでの過程である。化学シナプスの形成には、シナプス前部（通常は軸索）が、シナプス後部（神経細胞の樹状突起、筋肉など）となる標的細胞の適切な細胞上の適切な位置に結合すること（シナプス特異性）と、シナプス前部と後部がシナプス間隙を介して同じ場所に配向して、シナプス前部にシナプス小胞や分泌装置の蓄積、シナプス後部に神経伝達物質受容体の集合やシナプス重厚部が生じるということ（シナプス分化）がある。シナプス形成は、シナプス前部とシナプス後部の間の相互作用によって制御されており、このような細胞間相互作用を担うシナプス接着分子、細胞外マトリックス分子、更に分泌性因子が同定されている。また、グリア細胞など神経細胞以外のプレーヤーの関与も重要である。神経系の発達期や臨界期においては、化学シナプス形成は過剰に行われ、神経活動などの影響により、シナプス刈り込みにより再編成される。また、発達中のシナプス形成とも共通する成熟した神経系でのシナプス新生や構造変化は、学習と記憶にも重要な役割をし、シナプス形成の異常は、自閉症、精神疾患、認知症などの原因になると考えられている。}}<br />
<br />
==はじめに==<br />
神経細胞は、[[シナプス]]で適切に結合、情報伝達し、情報処理ユニットとして機能している。シナプス形成は、神経細胞の間で適切な場所で生じるシナプスの構造構築から機能発現までの過程であるが、正常の発生だけでなく、再生や可塑性でも見られ、正常発生でのシナプス形成と基本的には共通するものであると考えられる。しかし、シナプス形成といった場合、発生における化学シナプスの構造構築について議論されることが多いので、本項目もそれを中心に扱う。また、化学シナプスの形成とは本質的に構造の異なる[[電気シナプス]]（ギャップジャンクション）の形成については、化学シナプス形成との関係性もあると考えられる<ref><pubmed>23237660</pubmed></ref><ref><pubmed>28170151 </pubmed></ref><ref><pubmed>32883654</pubmed></ref>が、本項目では扱わない。<br />
<br />
==シナプス形成の３ステップについての概観==<br />
===ステップ1：シナプス特異性===<br />
軸索は[[軸索ガイダンス]]により、標的細胞近辺に到達する。軸索は特定の標的細胞と特異的にシナプス結合することで、情報を処理できる機能的回路を作る（celluar specificity）。また、シナプスはシナプス後細胞上の特定の部位に形成される（subcellular specificity）<ref><pubmed>19575668</pubmed></ref><ref><pubmed>26656254</pubmed></ref>。この初期のステップについては、「[[標的認識]]」の項を参考にされたい。神経伝達物質や標的細胞が持つ受容体などのシナプスの神経化学的形質は、遺伝子にプログラムされて発生していく神経系の細胞に内在的なものと大方考えられているが、シナプス形成後の誘導により変換するケースもあるかもしれない<ref><pubmed>10202548</pubmed></ref>。<br />
<br />
===ステップ2：シナプス分化===<br />
次に、標的細胞と接触する軸索の一部分は[[シナプス小胞]]や[[アクティブゾーン]]を伴う[[シナプス前終末]]へと分化し（presynaptic differentiation）、軸索と接触した標的細胞では局所的に[[神経伝達物質受容体]]や細胞内足場が集積しシナプス後部へと分化する（postsynaptic differentiation）。シナプス前部とシナプス後部の特殊化は、軸索と標的細胞の間の相互作用で制御される。この細胞間相互作用についての多くの原理的知見は、運動神経細胞からの軸索が骨格筋線維上で作る巨大で単純なシナプスである[[神経筋接合部]]（neuromuscular junction, NMJ)についての20世紀に行われた研究から得られてきた<ref><pubmed>10202544</pubmed></ref>。21世紀になって、小さく多様な中枢神経系でのシナプス形成や無脊椎動物モデル動物のシナプス形成についての分子的な理解が進んでいる<ref><pubmed>30359597</pubmed></ref>。本項目では、特にこのステップについて、原理的な観点から概説する。<br />
<br />
===ステップ3：シナプス再編成===<br />
シナプス形成後は、シナプスの成熟や神経回路の再編成が観察される。発達期においては、シナプス形成は過剰に行われ、神経活動などの影響により過剰なシナプスは除去される<ref><pubmed>10719884</pubmed></ref><ref><pubmed>26436703</pubmed></ref><ref><pubmed>29716431</pubmed></ref><ref><pubmed>31372212</pubmed></ref>。シナプスの除去（synapse elimination）は、[[神経細胞死]]と同様に、神経回路を再編する重要な過程であるが、これについては「[[シナプス刈り込み]]」の項を参考されたい。シナプス形成は、個体発生の過程だけでなく、成体におけるシナプスの新生や構造変化は、学習と記憶にも重要な役割をし、シナプス形成の異常は、[[自閉症]]、[[精神疾患]]、[[認知症]]などの原因になると考えられている<ref><pubmed>22258914</pubmed></ref><ref><pubmed>22540979</pubmed></ref>。。<br />
<br />
==神経筋接合部におけるシナプス形成==<br />
脊髄動物の神経筋接合部は、脊髄にある運動神経細胞から伸長した軸索終末（シナプス前終末）、筋線維、[[シュワン細胞]]の３つの細胞要素からなり、それぞれ神経筋接合部で特徴的に分化している（図1A)。シナプス形成は、運動神経の軸索が、軸索ガイダンスを経て、発生中の筋線維に接近して開始される。[[成長円錐]]が神経終末に変化し始めると、神経終末と反対側の筋表面の一部が特殊化し始める。発生が進むと、[[シナプス間隙]]（synaptic cleft）を介したシナプス前部とシナプス後部の構造的な特徴が明確になり、最終的に筋線維表面のわずか1000分の1の面積を占める成熟した神経筋接合部となる（図１A）。このように、シナプス前部は、シナプス後部と同じ場所で配向し、シナプス前部では、シナプス小胞、アクティブゾーンなど神経伝達物質（アセチルコリン）の分泌装置や[[電位依存性カルシウムチャネル]]などが集積する。一方、シナプス後部では、効率的なシナプス伝達のために、神経伝達物質受容体（アセチルコリンレセプター）とシグナル伝達装置や足場構造が集合する<ref><pubmed>10202544</pubmed></ref><ref><pubmed>25493308</pubmed></ref><ref><pubmed>29415504</pubmed></ref><ref><pubmed>29195055</pubmed></ref>。<br />
[[ファイル:Fig1-SF.jpg|サムネイル|250px|'''図1 神経筋接合部と中枢シナプスのシナプス形成<br />
A. 脊椎動物の神経筋接合部。運動神経細胞から伸長した軸索末端が多核の筋線維に接触することで、情報交換が始まる。シナプス前部ではシナプス小胞が集積し、シナプス後部では神経伝達物質受容体であるニコチン性アセチルコリンレセプターが集まり始める。成熟した神経筋接合部ではシナプス前部にはシナプス小胞、アクティブゾーンが形成される。シナプス間隙には、シナプス領域で特化したシナプス基底膜が存在し、そこには、アセチルコリンエステラーゼに加え、アグリンやβ2ラミニンなどのシナプスオーガナイザー活性を持つ分子も局在する。シナプス後部には、アセチルコリンレセプターが集積し、Rapsynなどの足場分子やMuSK, Lrp4などのシグナル分子も集まる。シナプスの直下では、核も特殊化しており、アセチルコリンレセプター遺伝子を強く発現している（本文参考）。Sanes & Lichtman (1999) <ref><pubmed>10202544</pubmed></ref>などを参考にした。<br />
B. 中枢シナプス形成。Vaughn (1989) <ref><pubmed>2655146</pubmed></ref>の形態学的モデルをもとに、神経筋接合部のシナプス形成と対比させた。ここでも、シナプス前部と後部の情報交換により、シナプス分化が開始される。中枢シナプスのシナプス間隙には神経筋接合部とは異なり、基底膜は存在せず、前部と後部の直接的な接着が相互作用の中心であり、シナプス小胞や神経伝達物質受容体が、前部と後部にそれぞれ集積する。興奮性シナプスでは顕著なシナプス後肥厚が形成される。]]<br />
<br />
===シナプスオーガナイザー===<br />
運動神経細胞と筋線維は、それぞれ独立してシナプス前部とシナプス後部に対応するシナプス構成要素を合成し、自立的に集合させることが可能である。つまり、運動軸索では、筋線維がない状態でもシナプス小胞が見られ、軸索中に保持することができる。一方、筋線維は神経伝達物質受容体であるアセチルコリンレセプターを合成し、神経がない状態でも、細胞表面上に多数のアセチルコリンレセプターからなる巨大集合構造を作ることができる（クラスタリング, clustering）。したがって、シナプス形成を制御する細胞間相互作用は、シナプス小胞の形成や受容体クラスタリングそのものの誘発因子というより、むしろそれらの位置を決め配向させる指令因子（オーガナイザー, organizer）としての役割が大きい。また、軸索中のシナプス小胞の集積は、ポリリジン被覆ビーズなどとの接触でも容易に引き起こされることから、オーガナイザーとしての役割もAll or nothingといった絶対的なものではなく促進的なものである<ref><pubmed>7127105</pubmed></ref>。しかし、以下に記述するように、シナプス後部やシナプス前部の分化が、それぞれの接触によって誘発、促進される可能性があることを示す証拠もある。これらの証拠のいくつかは、神経筋接合部の再生を利用することで得られた。<br />
<br />
===シナプス後部の分化===<br />
シナプス後部の分化に積極的に関わる分子として想定されたのがアグリン（agrin）である<ref><pubmed>1966767</pubmed></ref>。シナプス前部筋線維は、[[細胞外マトリックス]]である[[基底膜]]（basement membrane, basal lamina）に包まれている。基底膜の成分は、通常、IV型コラーゲン、ヘパラン硫酸プロテオグリカン（パールカンperlecan）、[[ラミニン]]（laminin）などであるが<ref><pubmed>12556454</pubmed></ref>、神経筋接合部の基底膜（シナプス基底膜 synaptic basement membrane）には、シナプス形成に関わる重要な因子であるヘパラン硫酸プロテオグリカンのアグリン（agrin）が存在する。損傷した筋組織の基底膜を再生する筋肉に接触させると、シナプス後部の特徴を誘導することができる。つまり、基底膜にはアセチルコリンレセプターのクラスタリングに関わる因子が存在することが想定されアグリンは生化学的に精製された（図２A）。オールターナティブスプライシングによる特殊エクソン由来配列を含むために、強力な受容体クラスタリング能を持つアグリンは運動神経細胞側で発現し、運動神経を通じて末梢に運搬され、神経筋接合部の基底膜に保持される。アグリン欠損マウスでは、神経筋接合部が乱れており、神経筋接合部におけるアセチルコリンレセプタークラスターの数、大きさ、密度が減少している<ref><pubmed>8653788</pubmed></ref>。 このことから、アグリンはシナプス後部の分化に関わる神経由来の因子であると考えられる。アグリンは、筋特異的チロシンキナーゼ（MuSK）やLRP4を含むいくつかの受容体に結合して、アダプタータンパク質（Dok7）や細胞骨格タンパク質（Rapsyn）とともに、アセチルコリンレセプターのクラスタリングにつながる一連の情報伝達系に影響を与える<ref><pubmed>20215342</pubmed></ref><ref><pubmed>29415504</pubmed></ref><ref><pubmed>8653786</pubmed></ref><ref><pubmed>8653787</pubmed></ref><ref><pubmed>16794080</pubmed></ref><ref><pubmed>7675108</pubmed></ref>。<br />
[[ファイル:Fig2-SF.jpg|サムネイル|250px|'''図２ シナプスオーガナイザー<br />
A. 培養化の筋線維に、アグリンを加えると、アセチルコリンレセプターがクラスタリングする。アグリン欠損マウスでは、神経筋接合部におけるアセチルコリンレセプタークラスターの数、大きさ、密度が減少する<ref><pubmed>8653788</pubmed></ref>。<br />
B. 培養細胞(293細胞など）に、ニューロリギン（通常、シナプス後部の神経細胞で発現）を強制発現させ、その上で神経細胞を培養し神経突起を伸長させると、シナプス小胞の蓄積が観察される<ref><pubmed>10892652</pubmed></ref>。また、ニューレキシン（通常、シナプス前部の神経細胞で発現）を強制発現させると、その上では神経突起にシナプス後肥厚やある種の神経伝達物質受容体が集積する<ref><pubmed>15620359</pubmed></ref>。これらの活性から、これらの分子がシナプス前部や後部の分化と配向に関わるシナプスオーガナイザーであると推定された。]]<br />
<br />
===シナプス前部の分化===<br />
シナプス前部の分化に関わる分子として同定されたものには、神経筋接合部特異的ラミニンのアイソフォームがある。再生神経の軸索が筋線維に到達すると、基底膜に最初に接触する。この際、筋線維を死滅させ、基底膜を抜け殻のように残したままでも、再生神経は正確に元の神経筋接合部の基底膜上でシナプス前部の分化を起こした<ref><pubmed>307554</pubmed></ref>。つまり、神経筋接合部のシナプス基底膜には、シナプス前部の分化を指示する因子があると想定され、その後、そのような分子が同定されている。最もよく研究されているのは、細胞外マトリックス分子ラミニンのアイソフォームである。ラミニンはすべての基底膜の構成分子であり、ラミニンは、α鎖、β鎖、γ鎖のヘテロ3量体であり、少なくとも5本のα鎖、4本のβ鎖、3本のγ鎖のファミリーからなっている。筋線維は複数のラミニンアイソフォームを合成し基底膜に取り込む。シナプス外の通常の筋基底膜にはβ1鎖を含むラミニンが存在するが、神経筋接合部のシナプス間隙の基底膜にはβ2鎖を持つアイソフォームが見られる<ref><pubmed>2922051</pubmed></ref>。in vitroでは、β2ラミニンに運動神経の軸索が接触すると伸長を停止し、シナプス小胞を蓄積し、神経伝達物質を放出するようになる。β2ラミニンを欠く変異マウスでは、シナプス前終末およびシュワン細胞の発達に異常が生じる<ref><pubmed>7885444</pubmed></ref>。<br />
<br />
===シナプス核===<br />
中枢シナプスと違う神経筋接合部の際立った特徴は、筋線維が多数の細胞が融合した[[多核細胞]]（syncytial muscle; multinucleated muscle）であり、神経筋接合部の直下にはシナプス核（synaptic nucleus)と呼ばれる特殊化した細胞核が存在することである<ref><pubmed>11498047</pubmed></ref>（図1A）。シナプス核ではアセチルコリンレセプター遺伝子の転写が強く、シナプスから離れた核では転写が低く、アセチルコリンレセプターmRNAを局在化させ、神経筋接合部の近辺でアセチルコリンレセプターが集まる要因にもなっている。これは、神経が、アセチルコリンを使って、アセチルコリンレセプター遺伝子のシナプス外での発現を抑制すると同時に、軸索から放出されるニューレギュリン（neuregulin, ARIA = Acetylcholine Receptor Inducing Activityとも呼ばれた）が、アセチルコリンレセプター遺伝子の転写活性化につながるシグナリング分子となっている<ref><pubmed>9056721</pubmed></ref>。また、発生途中では、アセチルコリンレセプターの組成も変化する。幼若期に特有なδサブユニット遺伝子からε遺伝子への発現の変換がおこる<ref><pubmed>2423878</pubmed></ref>。生体で見られる発生初期のアセチルコリンレセプターのクラスターは単純なプラーク型であるが、最終的には複雑なプレッツェル型になり、神経筋接合部のひだも形成され、シナプス前終末もそれに対応して成熟する<ref><pubmed>15034266</pubmed></ref>。<br />
<br />
==中枢神経系のシナプス形成==<br />
中枢神経系のシナプスの形成も神経筋接合部のシナプス形成と類似した点が多い。中枢シナプスにおけるシナプス前部とシナプス後部の間の相互作用は、基本的に予め合成されたシナプス構成要素の位置を制御し合うことで、お互いの分化を制御しシナプスを形成すると考えられる<ref><pubmed>2655146</pubmed></ref><ref><pubmed>14556707</pubmed></ref><ref><pubmed>17417940</pubmed></ref><ref><pubmed>27462810</pubmed></ref><ref><pubmed>29096080</pubmed></ref><ref><pubmed>30359597</pubmed></ref>。そこでは、神経筋接合部のシナプス核のように転写レベルで局所的にシナプス構成要素の生合成を制御することはないが、シナプス近辺での局所的なmRNA翻訳や分解の制御はありうる<ref><pubmed>30861464</pubmed></ref>。その結果、中枢シナプスでも、神経筋接合部と同じように、神経伝達物質の受容体がシナプス後膜に集中し<ref><pubmed>22046028</pubmed></ref>、神経伝達物質の違いはあるもののシナプス前部におけるシナプス小胞の分子的な成り立ちも基本的には同じであるように見える<ref><pubmed>22794257</pubmed></ref>（図1B）。しかし、中枢シナプスの後部は、神経伝達物質受容体の分子種も異なり、その足場となる分子種も神経筋接合部とは大きく異なっている。特に、神経筋接合部では基底膜という細胞外マトリックスであったシナプス間隙（約50nm）の様相は中枢シナプスでは全く異なっており典型的な細胞外マトリックスは存在しない。中枢シナプスでは、約20nmのシナプス間隙で直接接触するシナプス前膜とシナプス後膜の間に存在する細胞間接着がその相互作用の中心であると考えられている<ref><pubmed>14519398</pubmed></ref><ref><pubmed>22278667</pubmed></ref><ref><pubmed>3492943</pubmed></ref><ref><pubmed>20832286</pubmed></ref><ref><pubmed>30359597</pubmed></ref><ref><pubmed>32359437</pubmed></ref>（図１B)。<br />
<br />
===中枢シナプス形成のオーガナイザー===<br />
シナプス前部とシナプス後部をつなぐ細胞接着分子は多数ある（[[シナプス接着因子]]の項参考）。それらを代表するものの1つは、シナプス後部の膜に存在するタンパク質であるニューロリギン（neuroligin）である。それに対応するシナプス前膜上の主要なリガンドはニューレキシン（neurexin）である。細胞表面のニューロリギンが、軸索上にシナプス小胞を集積させる能力は、ニューロリギンを強制発現する非神経細胞の上で、神経細胞を培養するin vitroアッセイ系を用いることによって初めて明らかになった<ref><pubmed>10892652</pubmed></ref>（図2B)。しかし、in vitroアッセイ系で見られるニューロリギンなどのシナプス接着分子の作用には、非神経細胞上にデフォールトで発現しているカドヘリンのような別の接着分子の存在が前提になるようである<ref><pubmed>29760652</pubmed></ref>。また、RIM、RIM-BP、liprin、Munc13、ELKSを含むいくつかのタンパク質ファミリーが、シナプス前部の重要な足場分子として同定されており<ref><pubmed>22794257</pubmed></ref>、シナプス前膜のLAR-RPTPs（受容体型膜貫通チロシンホスファターゼ）を通じてアクティブゾーンを形成に預かる<ref><pubmed>23916315</pubmed></ref>。<br />
<br />
一方、シナプス後部の樹状突起内の一部の神経伝達物質受容体や足場分子は、ニューロリギンのリガンドであるニューレキシンを発現させた非神経細胞と接触する部位で凝集する<ref><pubmed>15620359</pubmed></ref>（図2B）。このような神経伝達物質受容体とそのシグナル伝達タンパク質の一部は、アクチン細胞骨格との直接的および間接的な相互作用を介して固定されている。特に、興奮性シナプスで顕著な[[シナプス後肥厚]]（postsynaptic density)においては、複数のPDZドメインを持った[[PSD95]]などの細胞内タンパク質が、PDZドメイン結合モチーフを持つニューロリギンなどの膜貫通型接着分子、神経伝達物質受容体、イオンチャネルと複数結合することで、シナプス後部の構成要素をつなぐ足場分子として機能し、ShankやHomerなどの他の足場分子とともに、シナプス構造の構築に関与すると考えられる<ref><pubmed>22046028</pubmed></ref><ref><pubmed>28577431</pubmed></ref><ref><pubmed>28179641</pubmed></ref>。一方、抑制性シナプスのシナプス後部では、ゲフィリン（gephyrin）が重要な足場分子として機能する<ref><pubmed>24552784</pubmed></ref><ref><pubmed>28460365</pubmed></ref>。<br />
<br />
4種類あるニューロリギンのうち、ニューロリギン1はグルタミン酸作動性シナプス、ニューロリギン2はGABA作動性シナプス、ニューロリギン3はグルタミン酸とGABA作動性シナプスの両者、そしてニューロリギン4はグリシン作動性シナプスに局在している<ref><pubmed>26209464</pubmed></ref><ref><pubmed>15540461</pubmed></ref><ref><pubmed>17897391</pubmed></ref><ref><pubmed>21282647</pubmed></ref>。培養系の実験では、ニューロリギン1,3,4はグルタミン酸レセプターのクラスタリングを引き起こすが、ニューロリギン２はグルタミン酸レセプターとGABAAレセプターのクラスタリングを引き起こす<ref><pubmed>15620359</pubmed></ref>。<br />
<br />
しかしながら、ニューレキシンやニューロリギンの遺伝子欠失動物では、予想に反して、シナプスの大きさや数にほとんど影響が見られない<ref><pubmed>12827191</pubmed></ref><ref><pubmed>16982420</pubmed></ref><ref><pubmed>28472659</pubmed></ref>ことから、これらの分子の存在が中枢シナプス形成にどの程度の意味を持っているのかは、実は明らかではない。ニューレキシンやニューロリギンの他にも、シナプス接着分子はシナプス分化の誘発能を持つものやニューレキシンに結合するものも含めて多数報告されてきており<ref><pubmed>29100073</pubmed></ref><ref><pubmed>30359597</pubmed></ref><ref><pubmed>32359437</pubmed></ref>、冗長性、補償性の高い相互作用システムの一部分である可能性が高い（[[シナプス接着因子]]の項参考）。また、同様な証拠から、シナプスオーガナイザーとして知られているFGFファミリーやWntファミリーといった分泌性の因子なども、この冗長な分子ネットワークの一部であると考えられる<ref><pubmed>20646052</pubmed></ref><ref><pubmed>24105999</pubmed></ref><ref><pubmed>29166241</pubmed></ref>。センチュウやショウジョウバエでは、変異体スクリーニングなどから、シナプス形成に関わるとされる遺伝子が多く同定されている<ref><pubmed>31037336</pubmed></ref><ref><pubmed>30986749</pubmed></ref><ref><pubmed>32741370</pubmed></ref>。このことからも、哺乳類の中枢シナプスに関わる分子機構も実際には更に複雑であることが予想される。<br />
<br />
中枢神経系の神経細胞の周りには、シナプス部位を囲むようにペリニューロナルネット（perineuronal nets）と呼ばれるプロテオグリカンやヒアルロナンなどを構成要素とする細胞外マトリックスが存在しており、臨界期などでのシナプス形成の制御にも関わっていると考えられている<ref><pubmed>27911749</pubmed></ref><ref><pubmed>31263252</pubmed></ref>。<br />
<br />
==シナプス形成におけるグリア細胞の役割==<br />
これまでシナプス前部とシナプス後部の接点のみに焦点を当ててきたが、シナプス形成には第3の細胞要素であるグリア細胞も関与している<ref><pubmed>30309945</pubmed></ref><ref><pubmed>30347385</pubmed></ref>。シュワン細胞は神経筋接合部のグリア細胞であり、[[アストロサイト]]は中枢シナプスのグリア細胞である。シュワン細胞がシナプス形成や維持に与える影響については、シュワン細胞を除去した動物での神経筋接合部の異常から考察されている<ref><pubmed>27656017</pubmed></ref>。<br />
<br />
グリア細胞の細胞表面にある分子と外部に分泌される分子の両方がシナプス形成に必要である。巨大な細胞外マトリックス分子であるトロンボスポンジン(thrombospondin) <ref><pubmed>15707899</pubmed></ref>、脂質であるコレステロール<ref><pubmed>12648780</pubmed></ref>、ヘヴィン（hevin) <ref><pubmed>21788491</pubmed></ref>などである。アストロサイトから分泌されるヘヴィンは、通常は相互作用しない細胞接着分子であるニューレキシンとニューロリギンの一部のアイソフォームを架橋することにより、シナプス形成を促進する<ref><pubmed>26771491</pubmed></ref>。アストロサイト上のグリピカン（glypican)は、シナプス前終末からAMPAレセプタークラスタリング因子ペントラキシン1(pentraxin1)の放出を誘発する<ref><pubmed>29024665</pubmed></ref><ref><pubmed>27986928</pubmed></ref>。また、シナプス形成に拮抗するSPARCなどのシナプスの負の調節因子も知られている<ref><pubmed>21788491</pubmed></ref>。また[[ミクログリア]]は、シナプス刈り込みに関与することで、神経回路の再編に関与する<ref><pubmed>31283900</pubmed></ref>。<br />
<br />
== 関連項目 ==<br />
*[[標的認識]]<br />
*[[成長円錐]]<br />
*[[神経筋接合部]]<br />
*[[シナプス刈り込み]]<br />
*[[シナプス接着因子]]<br />
*[[細胞外マトリックス]]<br />
*[[基底膜]]<br />
*[[シナプス前終末]]<br />
*[[シナプス後肥厚]]<br />
== 参考文献 ==<br />
<references /></div>
Masahitoyamagata
https://bsd.neuroinf.jp/w/index.php?title=%E3%82%B7%E3%83%8A%E3%83%97%E3%82%B9%E5%BD%A2%E6%88%90&diff=44931
シナプス形成
2020-10-22T00:47:53Z
<p>Masahitoyamagata: /* 中枢シナプス形成のオーガナイザー */</p>
<hr />
<div><div align="right"> <br />
<font size="+1">[http://researchmap.jp/yamagatm 山形方人]</font><br><br />
''Harvard University''<br><br />
DOI：<selfdoi /> 原稿受付日：年月日 原稿完成日：年月日<br><br />
担当編集委員：<br><br />
</div><br />
<br />
英：synapse formation, synaptogenesis<br />
{{box|text=<br />
神経細胞とその相手の細胞（神経細胞、筋肉など）は、シナプスという特殊化した細胞接着構造で結合している。シナプス形成とは、神経回路形成において、機能するシナプスができあがるまでの過程である。化学シナプスの形成には、シナプス前部（通常は軸索）が、シナプス後部（神経細胞の樹状突起、筋肉など）となる標的細胞の適切な細胞上の適切な位置に結合すること（シナプス特異性）と、シナプス前部と後部がシナプス間隙を介して同じ場所に配向して、シナプス前部にシナプス小胞や分泌装置の蓄積、シナプス後部に神経伝達物質受容体の集合やシナプス重厚部が生じるということ（シナプス分化）がある。シナプス形成は、シナプス前部とシナプス後部の間の相互作用によって制御されており、このような細胞間相互作用を担うシナプス接着分子、細胞外マトリックス分子、更に分泌性因子が同定されている。また、グリア細胞など神経細胞以外のプレーヤーの関与も重要である。神経系の発達期や臨界期においては、化学シナプス形成は過剰に行われ、神経活動などの影響により、シナプス刈り込みにより再編成される。また、発達中のシナプス形成とも共通する成熟した神経系でのシナプス新生や構造変化は、学習と記憶にも重要な役割をし、シナプス形成の異常は、自閉症、精神疾患、認知症などの原因になると考えられている。}}<br />
<br />
==はじめに==<br />
神経細胞は、[[シナプス]]で適切に結合、情報伝達し、情報処理ユニットとして機能している。シナプス形成は、神経細胞の間で適切な場所で生じるシナプスの構造構築から機能発現までの過程であるが、正常の発生だけでなく、再生や可塑性でも見られ、正常発生でのシナプス形成と基本的には共通するものであると考えられる。しかし、シナプス形成といった場合、発生における化学シナプスの構造構築について議論されることが多いので、本項目もそれを中心に扱う。また、化学シナプスの形成とは本質的に構造の異なる[[電気シナプス]]（ギャップジャンクション）の形成については、化学シナプス形成との関係性もあると考えられる<ref><pubmed>23237660</pubmed></ref><ref><pubmed>28170151 </pubmed></ref><ref><pubmed>32883654</pubmed></ref>が、本項目では扱わない。<br />
<br />
==シナプス形成の３ステップについての概観==<br />
===ステップ1：シナプス特異性===<br />
軸索は[[軸索ガイダンス]]により、標的細胞近辺に到達する。軸索は特定の標的細胞と特異的にシナプス結合することで、情報を処理できる機能的回路を作る（celluar specificity）。また、シナプスはシナプス後細胞上の特定の部位に形成される（subcellular specificity）<ref><pubmed>19575668</pubmed></ref><ref><pubmed>26656254</pubmed></ref>。この初期のステップについては、「[[標的認識]]」の項を参考にされたい。神経伝達物質や標的細胞が持つ受容体などのシナプスの神経化学的形質は、遺伝子にプログラムされて発生していく神経系の細胞に内在的なものと大方考えられているが、シナプス形成後の誘導により変換するケースもあるかもしれない<ref><pubmed>10202548</pubmed></ref>。<br />
<br />
===ステップ2：シナプス分化===<br />
次に、標的細胞と接触する軸索の一部分は[[シナプス小胞]]や[[アクティブゾーン]]を伴う[[シナプス前終末]]へと分化し（presynaptic differentiation）、軸索と接触した標的細胞では局所的に[[神経伝達物質受容体]]や細胞内足場が集積しシナプス後部へと分化する（postsynaptic differentiation）。シナプス前部とシナプス後部の特殊化は、軸索と標的細胞の間の相互作用で制御される。この細胞間相互作用についての多くの原理的知見は、運動神経細胞からの軸索が骨格筋線維上で作る巨大で単純なシナプスである[[神経筋接合部]]（neuromuscular junction, NMJ)についての20世紀に行われた研究から得られてきた<ref><pubmed>10202544</pubmed></ref>。21世紀になって、小さく多様な中枢神経系でのシナプス形成や無脊椎動物モデル動物のシナプス形成についての分子的な理解が進んでいる<ref><pubmed>30359597</pubmed></ref>。本項目では、特にこのステップについて、原理的な観点から概説する。<br />
<br />
===ステップ3：シナプス再編成===<br />
シナプス形成後は、シナプスの成熟や神経回路の再編成が観察される。発達期においては、シナプス形成は過剰に行われ、神経活動などの影響により過剰なシナプスは除去される<ref><pubmed>10719884</pubmed></ref><ref><pubmed>26436703</pubmed></ref><ref><pubmed>29716431</pubmed></ref><ref><pubmed>31372212</pubmed></ref>。シナプスの除去（synapse elimination）は、[[神経細胞死]]と同様に、神経回路を再編する重要な過程であるが、これについては「[[シナプス刈り込み]]」の項を参考されたい。シナプス形成は、個体発生の過程だけでなく、成体におけるシナプスの新生や構造変化は、学習と記憶にも重要な役割をし、シナプス形成の異常は、[[自閉症]]、[[精神疾患]]、[[認知症]]などの原因になると考えられている<ref><pubmed>22258914</pubmed></ref><ref><pubmed>22540979</pubmed></ref>。。<br />
<br />
==神経筋接合部におけるシナプス形成==<br />
脊髄動物の神経筋接合部は、脊髄にある運動神経細胞から伸長した軸索終末（シナプス前終末）、筋線維、[[シュワン細胞]]の３つの細胞要素からなり、それぞれ神経筋接合部で特徴的に分化している（図1A)。シナプス形成は、運動神経の軸索が、軸索ガイダンスを経て、発生中の筋線維に接近して開始される。[[成長円錐]]が神経終末に変化し始めると、神経終末と反対側の筋表面の一部が特殊化し始める。発生が進むと、[[シナプス間隙]]（synaptic cleft）を介したシナプス前部とシナプス後部の構造的な特徴が明確になり、最終的に筋線維表面のわずか1000分の1の面積を占める成熟した神経筋接合部となる（図１A）。このように、シナプス前部は、シナプス後部と同じ場所で配向し、シナプス前部では、シナプス小胞、アクティブゾーンなど神経伝達物質（アセチルコリン）の分泌装置や[[電位依存性カルシウムチャネル]]などが集積する。一方、シナプス後部では、効率的なシナプス伝達のために、神経伝達物質受容体（アセチルコリンレセプター）とシグナル伝達装置や足場構造が集合する<ref><pubmed>10202544</pubmed></ref><ref><pubmed>25493308</pubmed></ref><ref><pubmed>29415504</pubmed></ref><ref><pubmed>29195055</pubmed></ref>。<br />
[[ファイル:Fig1-SF.jpg|サムネイル|250px|'''図1 神経筋接合部と中枢シナプスのシナプス形成<br />
A. 脊椎動物の神経筋接合部。運動神経細胞から伸長した軸索末端が多核の筋線維に接触することで、情報交換が始まる。シナプス前部ではシナプス小胞が集積し、シナプス後部では神経伝達物質受容体であるニコチン性アセチルコリンレセプターが集まり始める。成熟した神経筋接合部ではシナプス前部にはシナプス小胞、アクティブゾーンが形成される。シナプス間隙には、シナプス領域で特化したシナプス基底膜が存在し、そこには、アセチルコリンエステラーゼに加え、アグリンやβ2ラミニンなどのシナプスオーガナイザー活性を持つ分子も局在する。シナプス後部には、アセチルコリンレセプターが集積し、Rapsynなどの足場分子やMuSK, Lrp4などのシグナル分子も集まる。シナプスの直下では、核も特殊化しており、アセチルコリンレセプター遺伝子を強く発現している（本文参考）。Sanes & Lichtman (1999) <ref><pubmed>10202544</pubmed></ref>などを参考にした。<br />
B. 中枢シナプス形成。Vaughn (1989) <ref><pubmed>2655146</pubmed></ref>の形態学的モデルをもとに、神経筋接合部のシナプス形成と対比させた。ここでも、シナプス前部と後部の情報交換により、シナプス分化が開始される。中枢シナプスのシナプス間隙には神経筋接合部とは異なり、基底膜は存在せず、前部と後部の直接的な接着が相互作用の中心であり、シナプス小胞や神経伝達物質受容体が、前部と後部にそれぞれ集積する。興奮性シナプスでは顕著なシナプス後肥厚が形成される。]]<br />
<br />
===シナプスオーガナイザー===<br />
運動神経細胞と筋線維は、それぞれ独立してシナプス前部とシナプス後部に対応するシナプス構成要素を合成し、自立的に集合させることが可能である。つまり、運動軸索では、筋線維がない状態でもシナプス小胞が見られ、軸索中に保持することができる。一方、筋線維は神経伝達物質受容体であるアセチルコリンレセプターを合成し、神経がない状態でも、細胞表面上に多数のアセチルコリンレセプターからなる巨大集合構造を作ることができる（クラスタリング, clustering）。したがって、シナプス形成を制御する細胞間相互作用は、シナプス小胞の形成や受容体クラスタリングそのものの誘発因子というより、むしろそれらの位置を決め配向させる指令因子（オーガナイザー, organizer）としての役割が大きい。また、軸索中のシナプス小胞の集積は、ポリリジン被覆ビーズなどとの接触でも容易に引き起こされることから、オーガナイザーとしての役割もAll or nothingといった絶対的なものではなく促進的なものである<ref><pubmed>7127105</pubmed></ref>。しかし、以下に記述するように、シナプス後部やシナプス前部の分化が、それぞれの接触によって誘発、促進される可能性があることを示す証拠もある。これらの証拠のいくつかは、神経筋接合部の再生を利用することで得られた。<br />
<br />
===シナプス後部の分化===<br />
シナプス後部の分化に積極的に関わる分子として想定されたのがアグリン（agrin）である<ref><pubmed>1966767</pubmed></ref>。シナプス前部筋線維は、[[細胞外マトリックス]]である[[基底膜]]（basement membrane, basal lamina）に包まれている。基底膜の成分は、通常、IV型コラーゲン、ヘパラン硫酸プロテオグリカン（パールカンperlecan）、[[ラミニン]]（laminin）などであるが<ref><pubmed>12556454</pubmed></ref>、神経筋接合部の基底膜（シナプス基底膜 synaptic basement membrane）には、シナプス形成に関わる重要な因子であるヘパラン硫酸プロテオグリカンのアグリン（agrin）が存在する。損傷した筋組織の基底膜を再生する筋肉に接触させると、シナプス後部の特徴を誘導することができる。つまり、基底膜にはアセチルコリンレセプターのクラスタリングに関わる因子が存在することが想定されアグリンは生化学的に精製された（図２A）。オールターナティブスプライシングによる特殊エクソン由来配列を含むために、強力な受容体クラスタリング能を持つアグリンは運動神経細胞側で発現し、運動神経を通じて末梢に運搬され、神経筋接合部の基底膜に保持される。アグリン欠損マウスでは、神経筋接合部が乱れており、神経筋接合部におけるアセチルコリンレセプタークラスターの数、大きさ、密度が減少している<ref><pubmed>8653788</pubmed></ref>。 このことから、アグリンはシナプス後部の分化に関わる神経由来の因子であると考えられる。アグリンは、筋特異的チロシンキナーゼ（MuSK）やLRP4を含むいくつかの受容体に結合して、アダプタータンパク質（Dok7）や細胞骨格タンパク質（Rapsyn）とともに、アセチルコリンレセプターのクラスタリングにつながる一連の情報伝達系に影響を与える<ref><pubmed>20215342</pubmed></ref><ref><pubmed>29415504</pubmed></ref><ref><pubmed>8653786</pubmed></ref><ref><pubmed>8653787</pubmed></ref><ref><pubmed>16794080</pubmed></ref><ref><pubmed>7675108</pubmed></ref>。<br />
[[ファイル:Fig2-SF.jpg|サムネイル|250px|'''図２ シナプスオーガナイザー<br />
A. 培養化の筋線維に、アグリンを加えると、アセチルコリンレセプターがクラスタリングする。アグリン欠損マウスでは、神経筋接合部におけるアセチルコリンレセプタークラスターの数、大きさ、密度が減少する<ref><pubmed>8653788</pubmed></ref>。<br />
B. 培養細胞(293細胞など）に、ニューロリギン（通常、シナプス後部の神経細胞で発現）を強制発現させ、その上で神経細胞を培養し神経突起を伸長させると、シナプス小胞の蓄積が観察される<ref><pubmed>10892652</pubmed></ref>。また、ニューレキシン（通常、シナプス前部の神経細胞で発現）を強制発現させると、その上では神経突起にシナプス後肥厚やある種の神経伝達物質受容体が集積する<ref><pubmed>15620359</pubmed></ref>。これらの活性から、これらの分子がシナプス前部や後部の分化と配向に関わるシナプスオーガナイザーであると推定された。]]<br />
<br />
===シナプス前部の分化===<br />
シナプス前部の分化に関わる分子として同定されたものには、神経筋接合部特異的ラミニンのアイソフォームがある。再生神経の軸索が筋線維に到達すると、基底膜に最初に接触する。この際、筋線維を死滅させ、基底膜を抜け殻のように残したままでも、再生神経は正確に元の神経筋接合部の基底膜上でシナプス前部の分化を起こした<ref><pubmed>307554</pubmed></ref>。つまり、神経筋接合部のシナプス基底膜には、シナプス前部の分化を指示する因子があると想定され、その後、そのような分子が同定されている。最もよく研究されているのは、細胞外マトリックス分子ラミニンのアイソフォームである。ラミニンはすべての基底膜の構成分子であり、ラミニンは、α鎖、β鎖、γ鎖のヘテロ3量体であり、少なくとも5本のα鎖、4本のβ鎖、3本のγ鎖のファミリーからなっている。筋線維は複数のラミニンアイソフォームを合成し基底膜に取り込む。シナプス外の通常の筋基底膜にはβ1鎖を含むラミニンが存在するが、神経筋接合部のシナプス間隙の基底膜にはβ2鎖を持つアイソフォームが見られる<ref><pubmed>2922051</pubmed></ref>。in vitroでは、β2ラミニンに運動神経の軸索が接触すると伸長を停止し、シナプス小胞を蓄積し、神経伝達物質を放出するようになる。β2ラミニンを欠く変異マウスでは、シナプス前終末およびシュワン細胞の発達に異常が生じる<ref><pubmed>7885444</pubmed></ref>。<br />
<br />
===シナプス核===<br />
中枢シナプスと違う神経筋接合部の際立った特徴は、筋線維が多数の細胞が融合した[[多核細胞]]（syncytial muscle; multinucleated muscle）であり、神経筋接合部の直下にはシナプス核（synaptic nucleus)と呼ばれる特殊化した細胞核が存在することである<ref><pubmed>11498047</pubmed></ref>（図1A）。シナプス核ではアセチルコリンレセプター遺伝子の転写が強く、シナプスから離れた核では転写が低く、アセチルコリンレセプターmRNAを局在化させ、神経筋接合部の近辺でアセチルコリンレセプターが集まる要因にもなっている。これは、神経が、アセチルコリンを使って、アセチルコリンレセプター遺伝子のシナプス外での発現を抑制すると同時に、軸索から放出されるニューレギュリン（neuregulin, ARIA = Acetylcholine Receptor Inducing Activityとも呼ばれた）が、アセチルコリンレセプター遺伝子の転写活性化につながるシグナリング分子となっている<ref><pubmed>9056721</pubmed></ref>。また、発生途中では、アセチルコリンレセプターの組成も変化する。幼若期に特有なδサブユニット遺伝子からε遺伝子への発現の変換がおこる<ref><pubmed>2423878</pubmed></ref>。生体で見られる発生初期のアセチルコリンレセプターのクラスターは単純なプラーク型であるが、最終的には複雑なプレッツェル型になり、神経筋接合部のひだも形成され、シナプス前終末もそれに対応して成熟する<ref><pubmed>15034266</pubmed></ref>。<br />
<br />
==中枢神経系のシナプス形成==<br />
中枢神経系のシナプスの形成も神経筋接合部のシナプス形成と類似した点が多い。中枢シナプスにおけるシナプス前部とシナプス後部の間の相互作用は、基本的に予め合成されたシナプス構成要素の位置を制御し合うことで、お互いの分化を制御しシナプスを形成すると考えられる<ref><pubmed>2655146</pubmed></ref><ref><pubmed>14556707</pubmed></ref><ref><pubmed>17417940</pubmed></ref><ref><pubmed>27462810</pubmed></ref><ref><pubmed>29096080</pubmed></ref><ref><pubmed>30359597</pubmed></ref>。そこでは、神経筋接合部のシナプス核のように転写レベルで局所的にシナプス構成要素の生合成を制御することはないが、シナプス近辺での局所的なmRNA翻訳や分解の制御はありうる<ref><pubmed>30861464</pubmed></ref>。その結果、中枢シナプスでも、神経筋接合部と同じように、神経伝達物質の受容体がシナプス後膜に集中し<ref><pubmed>22046028</pubmed></ref>、神経伝達物質の違いはあるもののシナプス前部におけるシナプス小胞の分子的な成り立ちも基本的には同じであるように見える<ref><pubmed>22794257</pubmed></ref>（図1B）。しかし、中枢シナプスの後部は、神経伝達物質受容体の分子種も異なり、その足場となる分子種も神経筋接合部とは大きく異なっている。特に、神経筋接合部では基底膜という細胞外マトリックスであったシナプス間隙（約50nm）の様相は中枢シナプスでは全く異なっており典型的な細胞外マトリックスは存在しない。中枢シナプスでは、約20nmのシナプス間隙で直接接触するシナプス前膜とシナプス後膜の間に存在する細胞間接着がその相互作用の中心であると考えられている<ref><pubmed>14519398</pubmed></ref><ref><pubmed>22278667</pubmed></ref><ref><pubmed>20832286</pubmed></ref><ref><pubmed>30359597</pubmed></ref><ref><pubmed>32359437</pubmed></ref>（図１B)。<br />
<br />
===中枢シナプス形成のオーガナイザー===<br />
シナプス前部とシナプス後部をつなぐ細胞接着分子は多数ある（[[シナプス接着因子]]の項参考）。それらを代表するものの1つは、シナプス後部の膜に存在するタンパク質であるニューロリギン（neuroligin）である。それに対応するシナプス前膜上の主要なリガンドはニューレキシン（neurexin）である。細胞表面のニューロリギンが、軸索上にシナプス小胞を集積させる能力は、ニューロリギンを強制発現する非神経細胞の上で、神経細胞を培養するin vitroアッセイ系を用いることによって初めて明らかになった<ref><pubmed>10892652</pubmed></ref>（図2B)。しかし、in vitroアッセイ系で見られるニューロリギンなどのシナプス接着分子の作用には、非神経細胞上にデフォールトで発現しているカドヘリンのような別の接着分子の存在が前提になるようである<ref><pubmed>29760652</pubmed></ref>。また、RIM、RIM-BP、liprin、Munc13、ELKSを含むいくつかのタンパク質ファミリーが、シナプス前部の重要な足場分子として同定されており<ref><pubmed>22794257</pubmed></ref>、シナプス前部表面のLAR-RPTPs（受容体型膜貫通チロシンホスファターゼ）を通じてアクティブゾーンを形成に預かる<ref><pubmed>23916315</pubmed></ref>。<br />
<br />
一方、シナプス後部の樹状突起内の一部の神経伝達物質受容体や足場分子は、ニューロリギンのリガンドであるニューレキシンを発現させた非神経細胞と接触する部位で凝集する<ref><pubmed>15620359</pubmed></ref>（図2B）。このような神経伝達物質受容体とそのシグナル伝達タンパク質の一部は、アクチン細胞骨格との直接的および間接的な相互作用を介して固定されている。特に、興奮性シナプスで顕著な[[シナプス後肥厚]]（postsynaptic density)においては、複数のPDZドメインを持った[[PSD95]]などの細胞内タンパク質が、PDZドメイン結合モチーフを持つニューロリギンなどの膜貫通型接着分子、神経伝達物質受容体、イオンチャネルと複数結合することで、シナプス後部の構成要素をつなぐ足場分子として機能し、ShankやHomerなどの他の足場分子とともに、シナプス構造の構築に関与すると考えられる<ref><pubmed>22046028</pubmed></ref><ref><pubmed>28577431</pubmed></ref><ref><pubmed>28179641</pubmed></ref>。一方、抑制性シナプスのシナプス後部では、ゲフィリン（gephyrin）が重要な足場分子として機能する<ref><pubmed>24552784</pubmed></ref><ref><pubmed>28460365</pubmed></ref>。<br />
<br />
4種類あるニューロリギンのうち、ニューロリギン1はグルタミン酸作動性シナプス、ニューロリギン2はGABA作動性シナプス、ニューロリギン3はグルタミン酸とGABA作動性シナプスの両者、そしてニューロリギン4はグリシン作動性シナプスに局在している<ref><pubmed>26209464</pubmed></ref><ref><pubmed>15540461</pubmed></ref><ref><pubmed>17897391</pubmed></ref><ref><pubmed>21282647</pubmed></ref>。培養系の実験では、ニューロリギン1,3,4はグルタミン酸レセプターのクラスタリングを引き起こすが、ニューロリギン２はグルタミン酸レセプターとGABAAレセプターのクラスタリングを引き起こす<ref><pubmed>15620359</pubmed></ref>。<br />
<br />
しかしながら、ニューレキシンやニューロリギンの遺伝子欠失動物では、予想に反して、シナプスの大きさや数にほとんど影響が見られない<ref><pubmed>12827191</pubmed></ref><ref><pubmed>16982420</pubmed></ref><ref><pubmed>28472659</pubmed></ref>ことから、これらの分子の存在が中枢シナプス形成にどの程度の意味を持っているのかは、実は明らかではない。ニューレキシンやニューロリギンの他にも、シナプス接着分子はシナプス分化の誘発能を持つものやニューレキシンに結合するものも含めて多数報告されてきており<ref><pubmed>29100073</pubmed></ref><ref><pubmed>30359597</pubmed></ref><ref><pubmed>32359437</pubmed></ref>、冗長性、補償性の高い相互作用システムの一部分である可能性が高い（[[シナプス接着因子]]の項参考）。また、同様な証拠から、シナプスオーガナイザーとして知られているFGFファミリーやWntファミリーといった分泌性の因子なども、この冗長な分子ネットワークの一部であると考えられる<ref><pubmed>20646052</pubmed></ref><ref><pubmed>24105999</pubmed></ref><ref><pubmed>29166241</pubmed></ref>。センチュウやショウジョウバエでは、変異体スクリーニングなどから、シナプス形成に関わるとされる遺伝子が多く同定されている<ref><pubmed>31037336</pubmed></ref><ref><pubmed>30986749</pubmed></ref><ref><pubmed>32741370</pubmed></ref>。このことからも、哺乳類の中枢シナプスに関わる分子機構も実際には更に複雑であることが予想される。<br />
<br />
中枢神経系の神経細胞の周りには、シナプス部位を囲むようにペリニューロナルネット（perineuronal nets）と呼ばれるプロテオグリカンやヒアルロナンなどを構成要素とする細胞外マトリックスが存在しており、臨界期などでのシナプス形成の制御にも関わっていると考えられている<ref><pubmed>27911749</pubmed></ref><ref><pubmed>31263252</pubmed></ref>。<br />
<br />
==シナプス形成におけるグリア細胞の役割==<br />
これまでシナプス前部とシナプス後部の接点のみに焦点を当ててきたが、シナプス形成には第3の細胞要素であるグリア細胞も関与している<ref><pubmed>30309945</pubmed></ref><ref><pubmed>30347385</pubmed></ref>。シュワン細胞は神経筋接合部のグリア細胞であり、[[アストロサイト]]は中枢シナプスのグリア細胞である。シュワン細胞がシナプス形成や維持に与える影響については、シュワン細胞を除去した動物での神経筋接合部の異常から考察されている<ref><pubmed>27656017</pubmed></ref>。<br />
<br />
グリア細胞の細胞表面にある分子と外部に分泌される分子の両方がシナプス形成に必要である。巨大な細胞外マトリックス分子であるトロンボスポンジン(thrombospondin) <ref><pubmed>15707899</pubmed></ref>、脂質であるコレステロール<ref><pubmed>12648780</pubmed></ref>、ヘヴィン（hevin) <ref><pubmed>21788491</pubmed></ref>などである。アストロサイトから分泌されるヘヴィンは、通常は相互作用しない細胞接着分子であるニューレキシンとニューロリギンの一部のアイソフォームを架橋することにより、シナプス形成を促進する<ref><pubmed>26771491</pubmed></ref>。アストロサイト上のグリピカン（glypican)は、シナプス前終末からAMPAレセプタークラスタリング因子ペントラキシン1(pentraxin1)の放出を誘発する<ref><pubmed>29024665</pubmed></ref><ref><pubmed>27986928</pubmed></ref>。また、シナプス形成に拮抗するSPARCなどのシナプスの負の調節因子も知られている<ref><pubmed>21788491</pubmed></ref>。また[[ミクログリア]]は、シナプス刈り込みに関与することで、神経回路の再編に関与する<ref><pubmed>31283900</pubmed></ref>。<br />
<br />
== 関連項目 ==<br />
*[[標的認識]]<br />
*[[成長円錐]]<br />
*[[神経筋接合部]]<br />
*[[シナプス刈り込み]]<br />
*[[シナプス接着因子]]<br />
*[[細胞外マトリックス]]<br />
*[[基底膜]]<br />
*[[シナプス前終末]]<br />
*[[シナプス後肥厚]]<br />
== 参考文献 ==<br />
<references /></div>
Masahitoyamagata
https://bsd.neuroinf.jp/w/index.php?title=%E3%82%B7%E3%83%8A%E3%83%97%E3%82%B9%E5%BD%A2%E6%88%90&diff=44930
シナプス形成
2020-10-22T00:07:04Z
<p>Masahitoyamagata: /* シナプス核 */</p>
<hr />
<div><div align="right"> <br />
<font size="+1">[http://researchmap.jp/yamagatm 山形方人]</font><br><br />
''Harvard University''<br><br />
DOI：<selfdoi /> 原稿受付日：年月日 原稿完成日：年月日<br><br />
担当編集委員：<br><br />
</div><br />
<br />
英：synapse formation, synaptogenesis<br />
{{box|text=<br />
神経細胞とその相手の細胞（神経細胞、筋肉など）は、シナプスという特殊化した細胞接着構造で結合している。シナプス形成とは、神経回路形成において、機能するシナプスができあがるまでの過程である。化学シナプスの形成には、シナプス前部（通常は軸索）が、シナプス後部（神経細胞の樹状突起、筋肉など）となる標的細胞の適切な細胞上の適切な位置に結合すること（シナプス特異性）と、シナプス前部と後部がシナプス間隙を介して同じ場所に配向して、シナプス前部にシナプス小胞や分泌装置の蓄積、シナプス後部に神経伝達物質受容体の集合やシナプス重厚部が生じるということ（シナプス分化）がある。シナプス形成は、シナプス前部とシナプス後部の間の相互作用によって制御されており、このような細胞間相互作用を担うシナプス接着分子、細胞外マトリックス分子、更に分泌性因子が同定されている。また、グリア細胞など神経細胞以外のプレーヤーの関与も重要である。神経系の発達期や臨界期においては、化学シナプス形成は過剰に行われ、神経活動などの影響により、シナプス刈り込みにより再編成される。また、発達中のシナプス形成とも共通する成熟した神経系でのシナプス新生や構造変化は、学習と記憶にも重要な役割をし、シナプス形成の異常は、自閉症、精神疾患、認知症などの原因になると考えられている。}}<br />
<br />
==はじめに==<br />
神経細胞は、[[シナプス]]で適切に結合、情報伝達し、情報処理ユニットとして機能している。シナプス形成は、神経細胞の間で適切な場所で生じるシナプスの構造構築から機能発現までの過程であるが、正常の発生だけでなく、再生や可塑性でも見られ、正常発生でのシナプス形成と基本的には共通するものであると考えられる。しかし、シナプス形成といった場合、発生における化学シナプスの構造構築について議論されることが多いので、本項目もそれを中心に扱う。また、化学シナプスの形成とは本質的に構造の異なる[[電気シナプス]]（ギャップジャンクション）の形成については、化学シナプス形成との関係性もあると考えられる<ref><pubmed>23237660</pubmed></ref><ref><pubmed>28170151 </pubmed></ref><ref><pubmed>32883654</pubmed></ref>が、本項目では扱わない。<br />
<br />
==シナプス形成の３ステップについての概観==<br />
===ステップ1：シナプス特異性===<br />
軸索は[[軸索ガイダンス]]により、標的細胞近辺に到達する。軸索は特定の標的細胞と特異的にシナプス結合することで、情報を処理できる機能的回路を作る（celluar specificity）。また、シナプスはシナプス後細胞上の特定の部位に形成される（subcellular specificity）<ref><pubmed>19575668</pubmed></ref><ref><pubmed>26656254</pubmed></ref>。この初期のステップについては、「[[標的認識]]」の項を参考にされたい。神経伝達物質や標的細胞が持つ受容体などのシナプスの神経化学的形質は、遺伝子にプログラムされて発生していく神経系の細胞に内在的なものと大方考えられているが、シナプス形成後の誘導により変換するケースもあるかもしれない<ref><pubmed>10202548</pubmed></ref>。<br />
<br />
===ステップ2：シナプス分化===<br />
次に、標的細胞と接触する軸索の一部分は[[シナプス小胞]]や[[アクティブゾーン]]を伴う[[シナプス前終末]]へと分化し（presynaptic differentiation）、軸索と接触した標的細胞では局所的に[[神経伝達物質受容体]]や細胞内足場が集積しシナプス後部へと分化する（postsynaptic differentiation）。シナプス前部とシナプス後部の特殊化は、軸索と標的細胞の間の相互作用で制御される。この細胞間相互作用についての多くの原理的知見は、運動神経細胞からの軸索が骨格筋線維上で作る巨大で単純なシナプスである[[神経筋接合部]]（neuromuscular junction, NMJ)についての20世紀に行われた研究から得られてきた<ref><pubmed>10202544</pubmed></ref>。21世紀になって、小さく多様な中枢神経系でのシナプス形成や無脊椎動物モデル動物のシナプス形成についての分子的な理解が進んでいる<ref><pubmed>30359597</pubmed></ref>。本項目では、特にこのステップについて、原理的な観点から概説する。<br />
<br />
===ステップ3：シナプス再編成===<br />
シナプス形成後は、シナプスの成熟や神経回路の再編成が観察される。発達期においては、シナプス形成は過剰に行われ、神経活動などの影響により過剰なシナプスは除去される<ref><pubmed>10719884</pubmed></ref><ref><pubmed>26436703</pubmed></ref><ref><pubmed>29716431</pubmed></ref><ref><pubmed>31372212</pubmed></ref>。シナプスの除去（synapse elimination）は、[[神経細胞死]]と同様に、神経回路を再編する重要な過程であるが、これについては「[[シナプス刈り込み]]」の項を参考されたい。シナプス形成は、個体発生の過程だけでなく、成体におけるシナプスの新生や構造変化は、学習と記憶にも重要な役割をし、シナプス形成の異常は、[[自閉症]]、[[精神疾患]]、[[認知症]]などの原因になると考えられている<ref><pubmed>22258914</pubmed></ref><ref><pubmed>22540979</pubmed></ref>。。<br />
<br />
==神経筋接合部におけるシナプス形成==<br />
脊髄動物の神経筋接合部は、脊髄にある運動神経細胞から伸長した軸索終末（シナプス前終末）、筋線維、[[シュワン細胞]]の３つの細胞要素からなり、それぞれ神経筋接合部で特徴的に分化している（図1A)。シナプス形成は、運動神経の軸索が、軸索ガイダンスを経て、発生中の筋線維に接近して開始される。[[成長円錐]]が神経終末に変化し始めると、神経終末と反対側の筋表面の一部が特殊化し始める。発生が進むと、[[シナプス間隙]]（synaptic cleft）を介したシナプス前部とシナプス後部の構造的な特徴が明確になり、最終的に筋線維表面のわずか1000分の1の面積を占める成熟した神経筋接合部となる（図１A）。このように、シナプス前部は、シナプス後部と同じ場所で配向し、シナプス前部では、シナプス小胞、アクティブゾーンなど神経伝達物質（アセチルコリン）の分泌装置や[[電位依存性カルシウムチャネル]]などが集積する。一方、シナプス後部では、効率的なシナプス伝達のために、神経伝達物質受容体（アセチルコリンレセプター）とシグナル伝達装置や足場構造が集合する<ref><pubmed>10202544</pubmed></ref><ref><pubmed>25493308</pubmed></ref><ref><pubmed>29415504</pubmed></ref><ref><pubmed>29195055</pubmed></ref>。<br />
[[ファイル:Fig1-SF.jpg|サムネイル|250px|'''図1 神経筋接合部と中枢シナプスのシナプス形成<br />
A. 脊椎動物の神経筋接合部。運動神経細胞から伸長した軸索末端が多核の筋線維に接触することで、情報交換が始まる。シナプス前部ではシナプス小胞が集積し、シナプス後部では神経伝達物質受容体であるニコチン性アセチルコリンレセプターが集まり始める。成熟した神経筋接合部ではシナプス前部にはシナプス小胞、アクティブゾーンが形成される。シナプス間隙には、シナプス領域で特化したシナプス基底膜が存在し、そこには、アセチルコリンエステラーゼに加え、アグリンやβ2ラミニンなどのシナプスオーガナイザー活性を持つ分子も局在する。シナプス後部には、アセチルコリンレセプターが集積し、Rapsynなどの足場分子やMuSK, Lrp4などのシグナル分子も集まる。シナプスの直下では、核も特殊化しており、アセチルコリンレセプター遺伝子を強く発現している（本文参考）。Sanes & Lichtman (1999) <ref><pubmed>10202544</pubmed></ref>などを参考にした。<br />
B. 中枢シナプス形成。Vaughn (1989) <ref><pubmed>2655146</pubmed></ref>の形態学的モデルをもとに、神経筋接合部のシナプス形成と対比させた。ここでも、シナプス前部と後部の情報交換により、シナプス分化が開始される。中枢シナプスのシナプス間隙には神経筋接合部とは異なり、基底膜は存在せず、前部と後部の直接的な接着が相互作用の中心であり、シナプス小胞や神経伝達物質受容体が、前部と後部にそれぞれ集積する。興奮性シナプスでは顕著なシナプス後肥厚が形成される。]]<br />
<br />
===シナプスオーガナイザー===<br />
運動神経細胞と筋線維は、それぞれ独立してシナプス前部とシナプス後部に対応するシナプス構成要素を合成し、自立的に集合させることが可能である。つまり、運動軸索では、筋線維がない状態でもシナプス小胞が見られ、軸索中に保持することができる。一方、筋線維は神経伝達物質受容体であるアセチルコリンレセプターを合成し、神経がない状態でも、細胞表面上に多数のアセチルコリンレセプターからなる巨大集合構造を作ることができる（クラスタリング, clustering）。したがって、シナプス形成を制御する細胞間相互作用は、シナプス小胞の形成や受容体クラスタリングそのものの誘発因子というより、むしろそれらの位置を決め配向させる指令因子（オーガナイザー, organizer）としての役割が大きい。また、軸索中のシナプス小胞の集積は、ポリリジン被覆ビーズなどとの接触でも容易に引き起こされることから、オーガナイザーとしての役割もAll or nothingといった絶対的なものではなく促進的なものである<ref><pubmed>7127105</pubmed></ref>。しかし、以下に記述するように、シナプス後部やシナプス前部の分化が、それぞれの接触によって誘発、促進される可能性があることを示す証拠もある。これらの証拠のいくつかは、神経筋接合部の再生を利用することで得られた。<br />
<br />
===シナプス後部の分化===<br />
シナプス後部の分化に積極的に関わる分子として想定されたのがアグリン（agrin）である<ref><pubmed>1966767</pubmed></ref>。シナプス前部筋線維は、[[細胞外マトリックス]]である[[基底膜]]（basement membrane, basal lamina）に包まれている。基底膜の成分は、通常、IV型コラーゲン、ヘパラン硫酸プロテオグリカン（パールカンperlecan）、[[ラミニン]]（laminin）などであるが<ref><pubmed>12556454</pubmed></ref>、神経筋接合部の基底膜（シナプス基底膜 synaptic basement membrane）には、シナプス形成に関わる重要な因子であるヘパラン硫酸プロテオグリカンのアグリン（agrin）が存在する。損傷した筋組織の基底膜を再生する筋肉に接触させると、シナプス後部の特徴を誘導することができる。つまり、基底膜にはアセチルコリンレセプターのクラスタリングに関わる因子が存在することが想定されアグリンは生化学的に精製された（図２A）。オールターナティブスプライシングによる特殊エクソン由来配列を含むために、強力な受容体クラスタリング能を持つアグリンは運動神経細胞側で発現し、運動神経を通じて末梢に運搬され、神経筋接合部の基底膜に保持される。アグリン欠損マウスでは、神経筋接合部が乱れており、神経筋接合部におけるアセチルコリンレセプタークラスターの数、大きさ、密度が減少している<ref><pubmed>8653788</pubmed></ref>。 このことから、アグリンはシナプス後部の分化に関わる神経由来の因子であると考えられる。アグリンは、筋特異的チロシンキナーゼ（MuSK）やLRP4を含むいくつかの受容体に結合して、アダプタータンパク質（Dok7）や細胞骨格タンパク質（Rapsyn）とともに、アセチルコリンレセプターのクラスタリングにつながる一連の情報伝達系に影響を与える<ref><pubmed>20215342</pubmed></ref><ref><pubmed>29415504</pubmed></ref><ref><pubmed>8653786</pubmed></ref><ref><pubmed>8653787</pubmed></ref><ref><pubmed>16794080</pubmed></ref><ref><pubmed>7675108</pubmed></ref>。<br />
[[ファイル:Fig2-SF.jpg|サムネイル|250px|'''図２ シナプスオーガナイザー<br />
A. 培養化の筋線維に、アグリンを加えると、アセチルコリンレセプターがクラスタリングする。アグリン欠損マウスでは、神経筋接合部におけるアセチルコリンレセプタークラスターの数、大きさ、密度が減少する<ref><pubmed>8653788</pubmed></ref>。<br />
B. 培養細胞(293細胞など）に、ニューロリギン（通常、シナプス後部の神経細胞で発現）を強制発現させ、その上で神経細胞を培養し神経突起を伸長させると、シナプス小胞の蓄積が観察される<ref><pubmed>10892652</pubmed></ref>。また、ニューレキシン（通常、シナプス前部の神経細胞で発現）を強制発現させると、その上では神経突起にシナプス後肥厚やある種の神経伝達物質受容体が集積する<ref><pubmed>15620359</pubmed></ref>。これらの活性から、これらの分子がシナプス前部や後部の分化と配向に関わるシナプスオーガナイザーであると推定された。]]<br />
<br />
===シナプス前部の分化===<br />
シナプス前部の分化に関わる分子として同定されたものには、神経筋接合部特異的ラミニンのアイソフォームがある。再生神経の軸索が筋線維に到達すると、基底膜に最初に接触する。この際、筋線維を死滅させ、基底膜を抜け殻のように残したままでも、再生神経は正確に元の神経筋接合部の基底膜上でシナプス前部の分化を起こした<ref><pubmed>307554</pubmed></ref>。つまり、神経筋接合部のシナプス基底膜には、シナプス前部の分化を指示する因子があると想定され、その後、そのような分子が同定されている。最もよく研究されているのは、細胞外マトリックス分子ラミニンのアイソフォームである。ラミニンはすべての基底膜の構成分子であり、ラミニンは、α鎖、β鎖、γ鎖のヘテロ3量体であり、少なくとも5本のα鎖、4本のβ鎖、3本のγ鎖のファミリーからなっている。筋線維は複数のラミニンアイソフォームを合成し基底膜に取り込む。シナプス外の通常の筋基底膜にはβ1鎖を含むラミニンが存在するが、神経筋接合部のシナプス間隙の基底膜にはβ2鎖を持つアイソフォームが見られる<ref><pubmed>2922051</pubmed></ref>。in vitroでは、β2ラミニンに運動神経の軸索が接触すると伸長を停止し、シナプス小胞を蓄積し、神経伝達物質を放出するようになる。β2ラミニンを欠く変異マウスでは、シナプス前終末およびシュワン細胞の発達に異常が生じる<ref><pubmed>7885444</pubmed></ref>。<br />
<br />
===シナプス核===<br />
中枢シナプスと違う神経筋接合部の際立った特徴は、筋線維が多数の細胞が融合した[[多核細胞]]（syncytial muscle; multinucleated muscle）であり、神経筋接合部の直下にはシナプス核（synaptic nucleus)と呼ばれる特殊化した細胞核が存在することである<ref><pubmed>11498047</pubmed></ref>（図1A）。シナプス核ではアセチルコリンレセプター遺伝子の転写が強く、シナプスから離れた核では転写が低く、アセチルコリンレセプターmRNAを局在化させ、神経筋接合部の近辺でアセチルコリンレセプターが集まる要因にもなっている。これは、神経が、アセチルコリンを使って、アセチルコリンレセプター遺伝子のシナプス外での発現を抑制すると同時に、軸索から放出されるニューレギュリン（neuregulin, ARIA = Acetylcholine Receptor Inducing Activityとも呼ばれた）が、アセチルコリンレセプター遺伝子の転写活性化につながるシグナリング分子となっている<ref><pubmed>9056721</pubmed></ref>。また、発生途中では、アセチルコリンレセプターの組成も変化する。幼若期に特有なδサブユニット遺伝子からε遺伝子への発現の変換がおこる<ref><pubmed>2423878</pubmed></ref>。生体で見られる発生初期のアセチルコリンレセプターのクラスターは単純なプラーク型であるが、最終的には複雑なプレッツェル型になり、神経筋接合部のひだも形成され、シナプス前終末もそれに対応して成熟する<ref><pubmed>15034266</pubmed></ref>。<br />
<br />
==中枢神経系のシナプス形成==<br />
中枢神経系のシナプスの形成も神経筋接合部のシナプス形成と類似した点が多い。中枢シナプスにおけるシナプス前部とシナプス後部の間の相互作用は、基本的に予め合成されたシナプス構成要素の位置を制御し合うことで、お互いの分化を制御しシナプスを形成すると考えられる<ref><pubmed>2655146</pubmed></ref><ref><pubmed>14556707</pubmed></ref><ref><pubmed>17417940</pubmed></ref><ref><pubmed>27462810</pubmed></ref><ref><pubmed>29096080</pubmed></ref><ref><pubmed>30359597</pubmed></ref>。そこでは、神経筋接合部のシナプス核のように転写レベルで局所的にシナプス構成要素の生合成を制御することはないが、シナプス近辺での局所的なmRNA翻訳や分解の制御はありうる<ref><pubmed>30861464</pubmed></ref>。その結果、中枢シナプスでも、神経筋接合部と同じように、神経伝達物質の受容体がシナプス後膜に集中し<ref><pubmed>22046028</pubmed></ref>、神経伝達物質の違いはあるもののシナプス前部におけるシナプス小胞の分子的な成り立ちも基本的には同じであるように見える<ref><pubmed>22794257</pubmed></ref>（図1B）。しかし、中枢シナプスの後部は、神経伝達物質受容体の分子種も異なり、その足場となる分子種も神経筋接合部とは大きく異なっている。特に、神経筋接合部では基底膜という細胞外マトリックスであったシナプス間隙（約50nm）の様相は中枢シナプスでは全く異なっており典型的な細胞外マトリックスは存在しない。中枢シナプスでは、約20nmのシナプス間隙で直接接触するシナプス前膜とシナプス後膜の間に存在する細胞間接着がその相互作用の中心であると考えられている<ref><pubmed>14519398</pubmed></ref><ref><pubmed>22278667</pubmed></ref><ref><pubmed>20832286</pubmed></ref><ref><pubmed>30359597</pubmed></ref><ref><pubmed>32359437</pubmed></ref>（図１B)。<br />
<br />
===中枢シナプス形成のオーガナイザー===<br />
シナプス前部とシナプス後部をつなぐ細胞接着分子は多数ある（[[シナプス接着因子]]の項参考）。それらを代表するものの1つは、シナプス後部の膜に存在するタンパク質であるニューロリギン（neuroligin）である。それに対応するシナプス前膜上の主要なリガンドはニューレキシン（neurexin）である。細胞表面のニューロリギンが、軸索上にシナプス小胞を集積させる能力は、ニューロリギンを強制発現する非神経細胞の上で、神経細胞を培養するin vitroアッセイ系を用いることによって初めて明らかになった<ref><pubmed>10892652</pubmed></ref>（図2B)。しかし、in vitroアッセイ系で見られるニューロリギンなどのシナプス接着分子の作用には、非神経細胞上にデフォールトで発現しているカドヘリンのような別の接着分子の存在が前提になるようである<ref><pubmed>29760652</pubmed></ref>。また、RIM、RIM-BP、liprin、Munc13、ELKSを含むいくつかのタンパク質ファミリーが、シナプス前部の重要な足場分子として同定されており<ref><pubmed>22794257</pubmed></ref>、シナプス前部表面のLAR-RPTPs（受容体型膜貫通チロシンホスファターゼ）を通じてアクティブゾーンを形成に預かる<ref><pubmed>23916315</pubmed></ref>。<br />
<br />
一方、シナプス後部の樹状突起内の一部の神経伝達物質受容体や足場分子は、ニューロリギンのリガンドであるニューレキシンを発現させた非神経細胞と接触する部位で凝集する<ref><pubmed>15620359</pubmed></ref>（図2B）。このような神経伝達物質受容体とそのシグナル伝達タンパク質の一部は、アクチン細胞骨格との直接的および間接的な相互作用を介して固定されている。特に、興奮性シナプスで顕著な[[シナプス後肥厚]]（postsynaptic density)においては、複数のPDZドメインを持った[[PSD95]]などの細胞内タンパク質が、PDZドメイン結合モチーフを持つニューロリギンなどの膜貫通型接着分子、神経伝達物質受容体、イオンチャネルと複数結合することで、シナプス後部の構成要素をつなぐ足場分子として機能し、ShankやHomerなどの他の足場分子とともに、シナプス構造の構築に関与すると考えられる<ref><pubmed>22046028</pubmed></ref><ref><pubmed>28577431</pubmed></ref><ref><pubmed>28179641</pubmed></ref>。一方、抑制性シナプスのシナプス後部では、ゲフィリン（gephyrin）が重要な足場分子として機能する<ref><pubmed>24552784</pubmed></ref><ref><pubmed>28460365</pubmed></ref>。<br />
<br />
4種類あるニューロリギンのうち、ニューロリギン1はグルタミン酸作動性シナプス、ニューロリギン2はGABA作動性シナプス、ニューロリギン3はグルタミン酸とGABA作動性シナプスの両者、そしてニューロリギン4はグリシン作動性シナプスに局在している<ref><pubmed>26209464</pubmed></ref><ref><pubmed>15540461</pubmed></ref><ref><pubmed>17897391</pubmed></ref><ref><pubmed>21282647</pubmed></ref>。培養系の実験では、ニューロリギン1,3,4はグルタミン酸レセプターのクラスタリングを引き起こすが、ニューロリギン２はグルタミン酸レセプターとGABAAレセプターのクラスタリングを引き起こす<ref><pubmed>15620359</pubmed></ref>。<br />
<br />
しかしながら、ニューレキシンやニューロリギンの遺伝子欠失動物では、予想に反して、シナプスの大きさや数にほとんど影響が見られない<ref><pubmed>12827191</pubmed></ref><ref><pubmed>16982420</pubmed></ref><ref><pubmed>28472659</pubmed></ref>ことから、これらの分子の存在が中枢シナプス形成にどの程度の意味を持っているのかは、実は明らかではない。ニューレキシンやニューロリギンの他にも、シナプス接着分子はシナプス分化の誘発能を持つものやニューレキシンに結合するものも含めて多数報告されてきており<ref><pubmed>29100073</pubmed></ref><ref><pubmed>30359597</pubmed></ref><ref><pubmed>32359437</pubmed></ref>、冗長性、補完性の高い相互作用システムの一部分である可能性が高い（[[シナプス接着因子]]の項参考）。また、同様な証拠から、シナプスオーガナイザーとして知られているFGFファミリーやWntファミリーといった分泌性の因子なども、この冗長な分子ネットワークの一部であると考えられる<ref><pubmed>20646052</pubmed></ref><ref><pubmed>24105999</pubmed></ref><ref><pubmed>29166241</pubmed></ref>。センチュウやショウジョウバエでは、変異体スクリーニングなどから、シナプス形成に関わるとされる遺伝子が多く同定されている<ref><pubmed>31037336</pubmed></ref><ref><pubmed>30986749</pubmed></ref><ref><pubmed>32741370</pubmed></ref>。このことからも、哺乳類の中枢シナプスに関わる分子機構も実際には更に複雑であることが予想される。<br />
<br />
中枢神経系の神経細胞の周りには、シナプス部位を囲むようにペリニューロナルネット（perineuronal nets）と呼ばれるプロテオグリカンやヒアルロナンなどを構成要素とする細胞外マトリックスが存在しており、臨界期などでのシナプス形成の制御にも関わっていると考えられている<ref><pubmed>27911749</pubmed></ref><ref><pubmed>31263252</pubmed></ref>。<br />
<br />
==シナプス形成におけるグリア細胞の役割==<br />
これまでシナプス前部とシナプス後部の接点のみに焦点を当ててきたが、シナプス形成には第3の細胞要素であるグリア細胞も関与している<ref><pubmed>30309945</pubmed></ref><ref><pubmed>30347385</pubmed></ref>。シュワン細胞は神経筋接合部のグリア細胞であり、[[アストロサイト]]は中枢シナプスのグリア細胞である。シュワン細胞がシナプス形成や維持に与える影響については、シュワン細胞を除去した動物での神経筋接合部の異常から考察されている<ref><pubmed>27656017</pubmed></ref>。<br />
<br />
グリア細胞の細胞表面にある分子と外部に分泌される分子の両方がシナプス形成に必要である。巨大な細胞外マトリックス分子であるトロンボスポンジン(thrombospondin) <ref><pubmed>15707899</pubmed></ref>、脂質であるコレステロール<ref><pubmed>12648780</pubmed></ref>、ヘヴィン（hevin) <ref><pubmed>21788491</pubmed></ref>などである。アストロサイトから分泌されるヘヴィンは、通常は相互作用しない細胞接着分子であるニューレキシンとニューロリギンの一部のアイソフォームを架橋することにより、シナプス形成を促進する<ref><pubmed>26771491</pubmed></ref>。アストロサイト上のグリピカン（glypican)は、シナプス前終末からAMPAレセプタークラスタリング因子ペントラキシン1(pentraxin1)の放出を誘発する<ref><pubmed>29024665</pubmed></ref><ref><pubmed>27986928</pubmed></ref>。また、シナプス形成に拮抗するSPARCなどのシナプスの負の調節因子も知られている<ref><pubmed>21788491</pubmed></ref>。また[[ミクログリア]]は、シナプス刈り込みに関与することで、神経回路の再編に関与する<ref><pubmed>31283900</pubmed></ref>。<br />
<br />
== 関連項目 ==<br />
*[[標的認識]]<br />
*[[成長円錐]]<br />
*[[神経筋接合部]]<br />
*[[シナプス刈り込み]]<br />
*[[シナプス接着因子]]<br />
*[[細胞外マトリックス]]<br />
*[[基底膜]]<br />
*[[シナプス前終末]]<br />
*[[シナプス後肥厚]]<br />
== 参考文献 ==<br />
<references /></div>
Masahitoyamagata
https://bsd.neuroinf.jp/w/index.php?title=%E3%82%B7%E3%83%8A%E3%83%97%E3%82%B9%E5%BD%A2%E6%88%90&diff=44929
シナプス形成
2020-10-22T00:04:24Z
<p>Masahitoyamagata: /* 中枢神経系のシナプス形成 */</p>
<hr />
<div><div align="right"> <br />
<font size="+1">[http://researchmap.jp/yamagatm 山形方人]</font><br><br />
''Harvard University''<br><br />
DOI：<selfdoi /> 原稿受付日：年月日 原稿完成日：年月日<br><br />
担当編集委員：<br><br />
</div><br />
<br />
英：synapse formation, synaptogenesis<br />
{{box|text=<br />
神経細胞とその相手の細胞（神経細胞、筋肉など）は、シナプスという特殊化した細胞接着構造で結合している。シナプス形成とは、神経回路形成において、機能するシナプスができあがるまでの過程である。化学シナプスの形成には、シナプス前部（通常は軸索）が、シナプス後部（神経細胞の樹状突起、筋肉など）となる標的細胞の適切な細胞上の適切な位置に結合すること（シナプス特異性）と、シナプス前部と後部がシナプス間隙を介して同じ場所に配向して、シナプス前部にシナプス小胞や分泌装置の蓄積、シナプス後部に神経伝達物質受容体の集合やシナプス重厚部が生じるということ（シナプス分化）がある。シナプス形成は、シナプス前部とシナプス後部の間の相互作用によって制御されており、このような細胞間相互作用を担うシナプス接着分子、細胞外マトリックス分子、更に分泌性因子が同定されている。また、グリア細胞など神経細胞以外のプレーヤーの関与も重要である。神経系の発達期や臨界期においては、化学シナプス形成は過剰に行われ、神経活動などの影響により、シナプス刈り込みにより再編成される。また、発達中のシナプス形成とも共通する成熟した神経系でのシナプス新生や構造変化は、学習と記憶にも重要な役割をし、シナプス形成の異常は、自閉症、精神疾患、認知症などの原因になると考えられている。}}<br />
<br />
==はじめに==<br />
神経細胞は、[[シナプス]]で適切に結合、情報伝達し、情報処理ユニットとして機能している。シナプス形成は、神経細胞の間で適切な場所で生じるシナプスの構造構築から機能発現までの過程であるが、正常の発生だけでなく、再生や可塑性でも見られ、正常発生でのシナプス形成と基本的には共通するものであると考えられる。しかし、シナプス形成といった場合、発生における化学シナプスの構造構築について議論されることが多いので、本項目もそれを中心に扱う。また、化学シナプスの形成とは本質的に構造の異なる[[電気シナプス]]（ギャップジャンクション）の形成については、化学シナプス形成との関係性もあると考えられる<ref><pubmed>23237660</pubmed></ref><ref><pubmed>28170151 </pubmed></ref><ref><pubmed>32883654</pubmed></ref>が、本項目では扱わない。<br />
<br />
==シナプス形成の３ステップについての概観==<br />
===ステップ1：シナプス特異性===<br />
軸索は[[軸索ガイダンス]]により、標的細胞近辺に到達する。軸索は特定の標的細胞と特異的にシナプス結合することで、情報を処理できる機能的回路を作る（celluar specificity）。また、シナプスはシナプス後細胞上の特定の部位に形成される（subcellular specificity）<ref><pubmed>19575668</pubmed></ref><ref><pubmed>26656254</pubmed></ref>。この初期のステップについては、「[[標的認識]]」の項を参考にされたい。神経伝達物質や標的細胞が持つ受容体などのシナプスの神経化学的形質は、遺伝子にプログラムされて発生していく神経系の細胞に内在的なものと大方考えられているが、シナプス形成後の誘導により変換するケースもあるかもしれない<ref><pubmed>10202548</pubmed></ref>。<br />
<br />
===ステップ2：シナプス分化===<br />
次に、標的細胞と接触する軸索の一部分は[[シナプス小胞]]や[[アクティブゾーン]]を伴う[[シナプス前終末]]へと分化し（presynaptic differentiation）、軸索と接触した標的細胞では局所的に[[神経伝達物質受容体]]や細胞内足場が集積しシナプス後部へと分化する（postsynaptic differentiation）。シナプス前部とシナプス後部の特殊化は、軸索と標的細胞の間の相互作用で制御される。この細胞間相互作用についての多くの原理的知見は、運動神経細胞からの軸索が骨格筋線維上で作る巨大で単純なシナプスである[[神経筋接合部]]（neuromuscular junction, NMJ)についての20世紀に行われた研究から得られてきた<ref><pubmed>10202544</pubmed></ref>。21世紀になって、小さく多様な中枢神経系でのシナプス形成や無脊椎動物モデル動物のシナプス形成についての分子的な理解が進んでいる<ref><pubmed>30359597</pubmed></ref>。本項目では、特にこのステップについて、原理的な観点から概説する。<br />
<br />
===ステップ3：シナプス再編成===<br />
シナプス形成後は、シナプスの成熟や神経回路の再編成が観察される。発達期においては、シナプス形成は過剰に行われ、神経活動などの影響により過剰なシナプスは除去される<ref><pubmed>10719884</pubmed></ref><ref><pubmed>26436703</pubmed></ref><ref><pubmed>29716431</pubmed></ref><ref><pubmed>31372212</pubmed></ref>。シナプスの除去（synapse elimination）は、[[神経細胞死]]と同様に、神経回路を再編する重要な過程であるが、これについては「[[シナプス刈り込み]]」の項を参考されたい。シナプス形成は、個体発生の過程だけでなく、成体におけるシナプスの新生や構造変化は、学習と記憶にも重要な役割をし、シナプス形成の異常は、[[自閉症]]、[[精神疾患]]、[[認知症]]などの原因になると考えられている<ref><pubmed>22258914</pubmed></ref><ref><pubmed>22540979</pubmed></ref>。。<br />
<br />
==神経筋接合部におけるシナプス形成==<br />
脊髄動物の神経筋接合部は、脊髄にある運動神経細胞から伸長した軸索終末（シナプス前終末）、筋線維、[[シュワン細胞]]の３つの細胞要素からなり、それぞれ神経筋接合部で特徴的に分化している（図1A)。シナプス形成は、運動神経の軸索が、軸索ガイダンスを経て、発生中の筋線維に接近して開始される。[[成長円錐]]が神経終末に変化し始めると、神経終末と反対側の筋表面の一部が特殊化し始める。発生が進むと、[[シナプス間隙]]（synaptic cleft）を介したシナプス前部とシナプス後部の構造的な特徴が明確になり、最終的に筋線維表面のわずか1000分の1の面積を占める成熟した神経筋接合部となる（図１A）。このように、シナプス前部は、シナプス後部と同じ場所で配向し、シナプス前部では、シナプス小胞、アクティブゾーンなど神経伝達物質（アセチルコリン）の分泌装置や[[電位依存性カルシウムチャネル]]などが集積する。一方、シナプス後部では、効率的なシナプス伝達のために、神経伝達物質受容体（アセチルコリンレセプター）とシグナル伝達装置や足場構造が集合する<ref><pubmed>10202544</pubmed></ref><ref><pubmed>25493308</pubmed></ref><ref><pubmed>29415504</pubmed></ref><ref><pubmed>29195055</pubmed></ref>。<br />
[[ファイル:Fig1-SF.jpg|サムネイル|250px|'''図1 神経筋接合部と中枢シナプスのシナプス形成<br />
A. 脊椎動物の神経筋接合部。運動神経細胞から伸長した軸索末端が多核の筋線維に接触することで、情報交換が始まる。シナプス前部ではシナプス小胞が集積し、シナプス後部では神経伝達物質受容体であるニコチン性アセチルコリンレセプターが集まり始める。成熟した神経筋接合部ではシナプス前部にはシナプス小胞、アクティブゾーンが形成される。シナプス間隙には、シナプス領域で特化したシナプス基底膜が存在し、そこには、アセチルコリンエステラーゼに加え、アグリンやβ2ラミニンなどのシナプスオーガナイザー活性を持つ分子も局在する。シナプス後部には、アセチルコリンレセプターが集積し、Rapsynなどの足場分子やMuSK, Lrp4などのシグナル分子も集まる。シナプスの直下では、核も特殊化しており、アセチルコリンレセプター遺伝子を強く発現している（本文参考）。Sanes & Lichtman (1999) <ref><pubmed>10202544</pubmed></ref>などを参考にした。<br />
B. 中枢シナプス形成。Vaughn (1989) <ref><pubmed>2655146</pubmed></ref>の形態学的モデルをもとに、神経筋接合部のシナプス形成と対比させた。ここでも、シナプス前部と後部の情報交換により、シナプス分化が開始される。中枢シナプスのシナプス間隙には神経筋接合部とは異なり、基底膜は存在せず、前部と後部の直接的な接着が相互作用の中心であり、シナプス小胞や神経伝達物質受容体が、前部と後部にそれぞれ集積する。興奮性シナプスでは顕著なシナプス後肥厚が形成される。]]<br />
<br />
===シナプスオーガナイザー===<br />
運動神経細胞と筋線維は、それぞれ独立してシナプス前部とシナプス後部に対応するシナプス構成要素を合成し、自立的に集合させることが可能である。つまり、運動軸索では、筋線維がない状態でもシナプス小胞が見られ、軸索中に保持することができる。一方、筋線維は神経伝達物質受容体であるアセチルコリンレセプターを合成し、神経がない状態でも、細胞表面上に多数のアセチルコリンレセプターからなる巨大集合構造を作ることができる（クラスタリング, clustering）。したがって、シナプス形成を制御する細胞間相互作用は、シナプス小胞の形成や受容体クラスタリングそのものの誘発因子というより、むしろそれらの位置を決め配向させる指令因子（オーガナイザー, organizer）としての役割が大きい。また、軸索中のシナプス小胞の集積は、ポリリジン被覆ビーズなどとの接触でも容易に引き起こされることから、オーガナイザーとしての役割もAll or nothingといった絶対的なものではなく促進的なものである<ref><pubmed>7127105</pubmed></ref>。しかし、以下に記述するように、シナプス後部やシナプス前部の分化が、それぞれの接触によって誘発、促進される可能性があることを示す証拠もある。これらの証拠のいくつかは、神経筋接合部の再生を利用することで得られた。<br />
<br />
===シナプス後部の分化===<br />
シナプス後部の分化に積極的に関わる分子として想定されたのがアグリン（agrin）である<ref><pubmed>1966767</pubmed></ref>。シナプス前部筋線維は、[[細胞外マトリックス]]である[[基底膜]]（basement membrane, basal lamina）に包まれている。基底膜の成分は、通常、IV型コラーゲン、ヘパラン硫酸プロテオグリカン（パールカンperlecan）、[[ラミニン]]（laminin）などであるが<ref><pubmed>12556454</pubmed></ref>、神経筋接合部の基底膜（シナプス基底膜 synaptic basement membrane）には、シナプス形成に関わる重要な因子であるヘパラン硫酸プロテオグリカンのアグリン（agrin）が存在する。損傷した筋組織の基底膜を再生する筋肉に接触させると、シナプス後部の特徴を誘導することができる。つまり、基底膜にはアセチルコリンレセプターのクラスタリングに関わる因子が存在することが想定されアグリンは生化学的に精製された（図２A）。オールターナティブスプライシングによる特殊エクソン由来配列を含むために、強力な受容体クラスタリング能を持つアグリンは運動神経細胞側で発現し、運動神経を通じて末梢に運搬され、神経筋接合部の基底膜に保持される。アグリン欠損マウスでは、神経筋接合部が乱れており、神経筋接合部におけるアセチルコリンレセプタークラスターの数、大きさ、密度が減少している<ref><pubmed>8653788</pubmed></ref>。 このことから、アグリンはシナプス後部の分化に関わる神経由来の因子であると考えられる。アグリンは、筋特異的チロシンキナーゼ（MuSK）やLRP4を含むいくつかの受容体に結合して、アダプタータンパク質（Dok7）や細胞骨格タンパク質（Rapsyn）とともに、アセチルコリンレセプターのクラスタリングにつながる一連の情報伝達系に影響を与える<ref><pubmed>20215342</pubmed></ref><ref><pubmed>29415504</pubmed></ref><ref><pubmed>8653786</pubmed></ref><ref><pubmed>8653787</pubmed></ref><ref><pubmed>16794080</pubmed></ref><ref><pubmed>7675108</pubmed></ref>。<br />
[[ファイル:Fig2-SF.jpg|サムネイル|250px|'''図２ シナプスオーガナイザー<br />
A. 培養化の筋線維に、アグリンを加えると、アセチルコリンレセプターがクラスタリングする。アグリン欠損マウスでは、神経筋接合部におけるアセチルコリンレセプタークラスターの数、大きさ、密度が減少する<ref><pubmed>8653788</pubmed></ref>。<br />
B. 培養細胞(293細胞など）に、ニューロリギン（通常、シナプス後部の神経細胞で発現）を強制発現させ、その上で神経細胞を培養し神経突起を伸長させると、シナプス小胞の蓄積が観察される<ref><pubmed>10892652</pubmed></ref>。また、ニューレキシン（通常、シナプス前部の神経細胞で発現）を強制発現させると、その上では神経突起にシナプス後肥厚やある種の神経伝達物質受容体が集積する<ref><pubmed>15620359</pubmed></ref>。これらの活性から、これらの分子がシナプス前部や後部の分化と配向に関わるシナプスオーガナイザーであると推定された。]]<br />
<br />
===シナプス前部の分化===<br />
シナプス前部の分化に関わる分子として同定されたものには、神経筋接合部特異的ラミニンのアイソフォームがある。再生神経の軸索が筋線維に到達すると、基底膜に最初に接触する。この際、筋線維を死滅させ、基底膜を抜け殻のように残したままでも、再生神経は正確に元の神経筋接合部の基底膜上でシナプス前部の分化を起こした<ref><pubmed>307554</pubmed></ref>。つまり、神経筋接合部のシナプス基底膜には、シナプス前部の分化を指示する因子があると想定され、その後、そのような分子が同定されている。最もよく研究されているのは、細胞外マトリックス分子ラミニンのアイソフォームである。ラミニンはすべての基底膜の構成分子であり、ラミニンは、α鎖、β鎖、γ鎖のヘテロ3量体であり、少なくとも5本のα鎖、4本のβ鎖、3本のγ鎖のファミリーからなっている。筋線維は複数のラミニンアイソフォームを合成し基底膜に取り込む。シナプス外の通常の筋基底膜にはβ1鎖を含むラミニンが存在するが、神経筋接合部のシナプス間隙の基底膜にはβ2鎖を持つアイソフォームが見られる<ref><pubmed>2922051</pubmed></ref>。in vitroでは、β2ラミニンに運動神経の軸索が接触すると伸長を停止し、シナプス小胞を蓄積し、神経伝達物質を放出するようになる。β2ラミニンを欠く変異マウスでは、シナプス前終末およびシュワン細胞の発達に異常が生じる<ref><pubmed>7885444</pubmed></ref>。<br />
<br />
===シナプス核===<br />
中枢シナプスと違う神経筋接合部の際立った特徴は、筋線維は多数の細胞が融合した[[多核細胞]]（syncytial muscle; multinucleated muscle）となっており、神経筋接合部の直下にはシナプス核（synaptic nucleus)と呼ばれる特化した細胞核が存在することである<ref><pubmed>11498047</pubmed></ref>（図1A）。シナプス核ではアセチルコリンレセプター遺伝子の転写が強く、シナプスから離れた核では転写が低く、アセチルコリンレセプターmRNAを局在化させ、神経筋接合部の近辺でアセチルコリンレセプターが集まる要因にもなっている。これは、神経が、アセチルコリンを使って、アセチルコリンレセプター遺伝子のシナプス外での発現を抑制すると同時に、軸索から放出されるニューレギュリン（neuregulin, ARIA = Acetylcholine Receptor Inducing Activityとも呼ばれた）が、アセチルコリンレセプター遺伝子の転写活性化につながるシグナリング分子となっている<ref><pubmed>9056721</pubmed></ref>。また、発生途中では、アセチルコリンレセプターの組成も変化する。幼若期に特有なδサブユニット遺伝子からε遺伝子への発現の変換がおこる<ref><pubmed>2423878</pubmed></ref>。生体で見られる発生初期のアセチルコリンレセプターのクラスターは単純なプラーク型であるが、最終的には複雑なプレッツェル型になり、神経筋接合部のひだも形成され、シナプス前終末もそれに対応して成熟する<ref><pubmed>15034266</pubmed></ref>。<br />
<br />
==中枢神経系のシナプス形成==<br />
中枢神経系のシナプスの形成も神経筋接合部のシナプス形成と類似した点が多い。中枢シナプスにおけるシナプス前部とシナプス後部の間の相互作用は、基本的に予め合成されたシナプス構成要素の位置を制御し合うことで、お互いの分化を制御しシナプスを形成すると考えられる<ref><pubmed>2655146</pubmed></ref><ref><pubmed>14556707</pubmed></ref><ref><pubmed>17417940</pubmed></ref><ref><pubmed>27462810</pubmed></ref><ref><pubmed>29096080</pubmed></ref><ref><pubmed>30359597</pubmed></ref>。そこでは、神経筋接合部のシナプス核のように転写レベルで局所的にシナプス構成要素の生合成を制御することはないが、シナプス近辺での局所的なmRNA翻訳や分解の制御はありうる<ref><pubmed>30861464</pubmed></ref>。その結果、中枢シナプスでも、神経筋接合部と同じように、神経伝達物質の受容体がシナプス後膜に集中し<ref><pubmed>22046028</pubmed></ref>、神経伝達物質の違いはあるもののシナプス前部におけるシナプス小胞の分子的な成り立ちも基本的には同じであるように見える<ref><pubmed>22794257</pubmed></ref>（図1B）。しかし、中枢シナプスの後部は、神経伝達物質受容体の分子種も異なり、その足場となる分子種も神経筋接合部とは大きく異なっている。特に、神経筋接合部では基底膜という細胞外マトリックスであったシナプス間隙（約50nm）の様相は中枢シナプスでは全く異なっており典型的な細胞外マトリックスは存在しない。中枢シナプスでは、約20nmのシナプス間隙で直接接触するシナプス前膜とシナプス後膜の間に存在する細胞間接着がその相互作用の中心であると考えられている<ref><pubmed>14519398</pubmed></ref><ref><pubmed>22278667</pubmed></ref><ref><pubmed>20832286</pubmed></ref><ref><pubmed>30359597</pubmed></ref><ref><pubmed>32359437</pubmed></ref>（図１B)。<br />
<br />
===中枢シナプス形成のオーガナイザー===<br />
シナプス前部とシナプス後部をつなぐ細胞接着分子は多数ある（[[シナプス接着因子]]の項参考）。それらを代表するものの1つは、シナプス後部の膜に存在するタンパク質であるニューロリギン（neuroligin）である。それに対応するシナプス前膜上の主要なリガンドはニューレキシン（neurexin）である。細胞表面のニューロリギンが、軸索上にシナプス小胞を集積させる能力は、ニューロリギンを強制発現する非神経細胞の上で、神経細胞を培養するin vitroアッセイ系を用いることによって初めて明らかになった<ref><pubmed>10892652</pubmed></ref>（図2B)。しかし、in vitroアッセイ系で見られるニューロリギンなどのシナプス接着分子の作用には、非神経細胞上にデフォールトで発現しているカドヘリンのような別の接着分子の存在が前提になるようである<ref><pubmed>29760652</pubmed></ref>。また、RIM、RIM-BP、liprin、Munc13、ELKSを含むいくつかのタンパク質ファミリーが、シナプス前部の重要な足場分子として同定されており<ref><pubmed>22794257</pubmed></ref>、シナプス前部表面のLAR-RPTPs（受容体型膜貫通チロシンホスファターゼ）を通じてアクティブゾーンを形成に預かる<ref><pubmed>23916315</pubmed></ref>。<br />
<br />
一方、シナプス後部の樹状突起内の一部の神経伝達物質受容体や足場分子は、ニューロリギンのリガンドであるニューレキシンを発現させた非神経細胞と接触する部位で凝集する<ref><pubmed>15620359</pubmed></ref>（図2B）。このような神経伝達物質受容体とそのシグナル伝達タンパク質の一部は、アクチン細胞骨格との直接的および間接的な相互作用を介して固定されている。特に、興奮性シナプスで顕著な[[シナプス後肥厚]]（postsynaptic density)においては、複数のPDZドメインを持った[[PSD95]]などの細胞内タンパク質が、PDZドメイン結合モチーフを持つニューロリギンなどの膜貫通型接着分子、神経伝達物質受容体、イオンチャネルと複数結合することで、シナプス後部の構成要素をつなぐ足場分子として機能し、ShankやHomerなどの他の足場分子とともに、シナプス構造の構築に関与すると考えられる<ref><pubmed>22046028</pubmed></ref><ref><pubmed>28577431</pubmed></ref><ref><pubmed>28179641</pubmed></ref>。一方、抑制性シナプスのシナプス後部では、ゲフィリン（gephyrin）が重要な足場分子として機能する<ref><pubmed>24552784</pubmed></ref><ref><pubmed>28460365</pubmed></ref>。<br />
<br />
4種類あるニューロリギンのうち、ニューロリギン1はグルタミン酸作動性シナプス、ニューロリギン2はGABA作動性シナプス、ニューロリギン3はグルタミン酸とGABA作動性シナプスの両者、そしてニューロリギン4はグリシン作動性シナプスに局在している<ref><pubmed>26209464</pubmed></ref><ref><pubmed>15540461</pubmed></ref><ref><pubmed>17897391</pubmed></ref><ref><pubmed>21282647</pubmed></ref>。培養系の実験では、ニューロリギン1,3,4はグルタミン酸レセプターのクラスタリングを引き起こすが、ニューロリギン２はグルタミン酸レセプターとGABAAレセプターのクラスタリングを引き起こす<ref><pubmed>15620359</pubmed></ref>。<br />
<br />
しかしながら、ニューレキシンやニューロリギンの遺伝子欠失動物では、予想に反して、シナプスの大きさや数にほとんど影響が見られない<ref><pubmed>12827191</pubmed></ref><ref><pubmed>16982420</pubmed></ref><ref><pubmed>28472659</pubmed></ref>ことから、これらの分子の存在が中枢シナプス形成にどの程度の意味を持っているのかは、実は明らかではない。ニューレキシンやニューロリギンの他にも、シナプス接着分子はシナプス分化の誘発能を持つものやニューレキシンに結合するものも含めて多数報告されてきており<ref><pubmed>29100073</pubmed></ref><ref><pubmed>30359597</pubmed></ref><ref><pubmed>32359437</pubmed></ref>、冗長性、補完性の高い相互作用システムの一部分である可能性が高い（[[シナプス接着因子]]の項参考）。また、同様な証拠から、シナプスオーガナイザーとして知られているFGFファミリーやWntファミリーといった分泌性の因子なども、この冗長な分子ネットワークの一部であると考えられる<ref><pubmed>20646052</pubmed></ref><ref><pubmed>24105999</pubmed></ref><ref><pubmed>29166241</pubmed></ref>。センチュウやショウジョウバエでは、変異体スクリーニングなどから、シナプス形成に関わるとされる遺伝子が多く同定されている<ref><pubmed>31037336</pubmed></ref><ref><pubmed>30986749</pubmed></ref><ref><pubmed>32741370</pubmed></ref>。このことからも、哺乳類の中枢シナプスに関わる分子機構も実際には更に複雑であることが予想される。<br />
<br />
中枢神経系の神経細胞の周りには、シナプス部位を囲むようにペリニューロナルネット（perineuronal nets）と呼ばれるプロテオグリカンやヒアルロナンなどを構成要素とする細胞外マトリックスが存在しており、臨界期などでのシナプス形成の制御にも関わっていると考えられている<ref><pubmed>27911749</pubmed></ref><ref><pubmed>31263252</pubmed></ref>。<br />
<br />
==シナプス形成におけるグリア細胞の役割==<br />
これまでシナプス前部とシナプス後部の接点のみに焦点を当ててきたが、シナプス形成には第3の細胞要素であるグリア細胞も関与している<ref><pubmed>30309945</pubmed></ref><ref><pubmed>30347385</pubmed></ref>。シュワン細胞は神経筋接合部のグリア細胞であり、[[アストロサイト]]は中枢シナプスのグリア細胞である。シュワン細胞がシナプス形成や維持に与える影響については、シュワン細胞を除去した動物での神経筋接合部の異常から考察されている<ref><pubmed>27656017</pubmed></ref>。<br />
<br />
グリア細胞の細胞表面にある分子と外部に分泌される分子の両方がシナプス形成に必要である。巨大な細胞外マトリックス分子であるトロンボスポンジン(thrombospondin) <ref><pubmed>15707899</pubmed></ref>、脂質であるコレステロール<ref><pubmed>12648780</pubmed></ref>、ヘヴィン（hevin) <ref><pubmed>21788491</pubmed></ref>などである。アストロサイトから分泌されるヘヴィンは、通常は相互作用しない細胞接着分子であるニューレキシンとニューロリギンの一部のアイソフォームを架橋することにより、シナプス形成を促進する<ref><pubmed>26771491</pubmed></ref>。アストロサイト上のグリピカン（glypican)は、シナプス前終末からAMPAレセプタークラスタリング因子ペントラキシン1(pentraxin1)の放出を誘発する<ref><pubmed>29024665</pubmed></ref><ref><pubmed>27986928</pubmed></ref>。また、シナプス形成に拮抗するSPARCなどのシナプスの負の調節因子も知られている<ref><pubmed>21788491</pubmed></ref>。また[[ミクログリア]]は、シナプス刈り込みに関与することで、神経回路の再編に関与する<ref><pubmed>31283900</pubmed></ref>。<br />
<br />
== 関連項目 ==<br />
*[[標的認識]]<br />
*[[成長円錐]]<br />
*[[神経筋接合部]]<br />
*[[シナプス刈り込み]]<br />
*[[シナプス接着因子]]<br />
*[[細胞外マトリックス]]<br />
*[[基底膜]]<br />
*[[シナプス前終末]]<br />
*[[シナプス後肥厚]]<br />
== 参考文献 ==<br />
<references /></div>
Masahitoyamagata
https://bsd.neuroinf.jp/w/index.php?title=%E3%82%B7%E3%83%8A%E3%83%97%E3%82%B9%E5%BD%A2%E6%88%90&diff=44928
シナプス形成
2020-10-21T23:56:58Z
<p>Masahitoyamagata: /* シナプス形成におけるグリア細胞の役割 */</p>
<hr />
<div><div align="right"> <br />
<font size="+1">[http://researchmap.jp/yamagatm 山形方人]</font><br><br />
''Harvard University''<br><br />
DOI：<selfdoi /> 原稿受付日：年月日 原稿完成日：年月日<br><br />
担当編集委員：<br><br />
</div><br />
<br />
英：synapse formation, synaptogenesis<br />
{{box|text=<br />
神経細胞とその相手の細胞（神経細胞、筋肉など）は、シナプスという特殊化した細胞接着構造で結合している。シナプス形成とは、神経回路形成において、機能するシナプスができあがるまでの過程である。化学シナプスの形成には、シナプス前部（通常は軸索）が、シナプス後部（神経細胞の樹状突起、筋肉など）となる標的細胞の適切な細胞上の適切な位置に結合すること（シナプス特異性）と、シナプス前部と後部がシナプス間隙を介して同じ場所に配向して、シナプス前部にシナプス小胞や分泌装置の蓄積、シナプス後部に神経伝達物質受容体の集合やシナプス重厚部が生じるということ（シナプス分化）がある。シナプス形成は、シナプス前部とシナプス後部の間の相互作用によって制御されており、このような細胞間相互作用を担うシナプス接着分子、細胞外マトリックス分子、更に分泌性因子が同定されている。また、グリア細胞など神経細胞以外のプレーヤーの関与も重要である。神経系の発達期や臨界期においては、化学シナプス形成は過剰に行われ、神経活動などの影響により、シナプス刈り込みにより再編成される。また、発達中のシナプス形成とも共通する成熟した神経系でのシナプス新生や構造変化は、学習と記憶にも重要な役割をし、シナプス形成の異常は、自閉症、精神疾患、認知症などの原因になると考えられている。}}<br />
<br />
==はじめに==<br />
神経細胞は、[[シナプス]]で適切に結合、情報伝達し、情報処理ユニットとして機能している。シナプス形成は、神経細胞の間で適切な場所で生じるシナプスの構造構築から機能発現までの過程であるが、正常の発生だけでなく、再生や可塑性でも見られ、正常発生でのシナプス形成と基本的には共通するものであると考えられる。しかし、シナプス形成といった場合、発生における化学シナプスの構造構築について議論されることが多いので、本項目もそれを中心に扱う。また、化学シナプスの形成とは本質的に構造の異なる[[電気シナプス]]（ギャップジャンクション）の形成については、化学シナプス形成との関係性もあると考えられる<ref><pubmed>23237660</pubmed></ref><ref><pubmed>28170151 </pubmed></ref><ref><pubmed>32883654</pubmed></ref>が、本項目では扱わない。<br />
<br />
==シナプス形成の３ステップについての概観==<br />
===ステップ1：シナプス特異性===<br />
軸索は[[軸索ガイダンス]]により、標的細胞近辺に到達する。軸索は特定の標的細胞と特異的にシナプス結合することで、情報を処理できる機能的回路を作る（celluar specificity）。また、シナプスはシナプス後細胞上の特定の部位に形成される（subcellular specificity）<ref><pubmed>19575668</pubmed></ref><ref><pubmed>26656254</pubmed></ref>。この初期のステップについては、「[[標的認識]]」の項を参考にされたい。神経伝達物質や標的細胞が持つ受容体などのシナプスの神経化学的形質は、遺伝子にプログラムされて発生していく神経系の細胞に内在的なものと大方考えられているが、シナプス形成後の誘導により変換するケースもあるかもしれない<ref><pubmed>10202548</pubmed></ref>。<br />
<br />
===ステップ2：シナプス分化===<br />
次に、標的細胞と接触する軸索の一部分は[[シナプス小胞]]や[[アクティブゾーン]]を伴う[[シナプス前終末]]へと分化し（presynaptic differentiation）、軸索と接触した標的細胞では局所的に[[神経伝達物質受容体]]や細胞内足場が集積しシナプス後部へと分化する（postsynaptic differentiation）。シナプス前部とシナプス後部の特殊化は、軸索と標的細胞の間の相互作用で制御される。この細胞間相互作用についての多くの原理的知見は、運動神経細胞からの軸索が骨格筋線維上で作る巨大で単純なシナプスである[[神経筋接合部]]（neuromuscular junction, NMJ)についての20世紀に行われた研究から得られてきた<ref><pubmed>10202544</pubmed></ref>。21世紀になって、小さく多様な中枢神経系でのシナプス形成や無脊椎動物モデル動物のシナプス形成についての分子的な理解が進んでいる<ref><pubmed>30359597</pubmed></ref>。本項目では、特にこのステップについて、原理的な観点から概説する。<br />
<br />
===ステップ3：シナプス再編成===<br />
シナプス形成後は、シナプスの成熟や神経回路の再編成が観察される。発達期においては、シナプス形成は過剰に行われ、神経活動などの影響により過剰なシナプスは除去される<ref><pubmed>10719884</pubmed></ref><ref><pubmed>26436703</pubmed></ref><ref><pubmed>29716431</pubmed></ref><ref><pubmed>31372212</pubmed></ref>。シナプスの除去（synapse elimination）は、[[神経細胞死]]と同様に、神経回路を再編する重要な過程であるが、これについては「[[シナプス刈り込み]]」の項を参考されたい。シナプス形成は、個体発生の過程だけでなく、成体におけるシナプスの新生や構造変化は、学習と記憶にも重要な役割をし、シナプス形成の異常は、[[自閉症]]、[[精神疾患]]、[[認知症]]などの原因になると考えられている<ref><pubmed>22258914</pubmed></ref><ref><pubmed>22540979</pubmed></ref>。。<br />
<br />
==神経筋接合部におけるシナプス形成==<br />
脊髄動物の神経筋接合部は、脊髄にある運動神経細胞から伸長した軸索終末（シナプス前終末）、筋線維、[[シュワン細胞]]の３つの細胞要素からなり、それぞれ神経筋接合部で特徴的に分化している（図1A)。シナプス形成は、運動神経の軸索が、軸索ガイダンスを経て、発生中の筋線維に接近して開始される。[[成長円錐]]が神経終末に変化し始めると、神経終末と反対側の筋表面の一部が特殊化し始める。発生が進むと、[[シナプス間隙]]（synaptic cleft）を介したシナプス前部とシナプス後部の構造的な特徴が明確になり、最終的に筋線維表面のわずか1000分の1の面積を占める成熟した神経筋接合部となる（図１A）。このように、シナプス前部は、シナプス後部と同じ場所で配向し、シナプス前部では、シナプス小胞、アクティブゾーンなど神経伝達物質（アセチルコリン）の分泌装置や[[電位依存性カルシウムチャネル]]などが集積する。一方、シナプス後部では、効率的なシナプス伝達のために、神経伝達物質受容体（アセチルコリンレセプター）とシグナル伝達装置や足場構造が集合する<ref><pubmed>10202544</pubmed></ref><ref><pubmed>25493308</pubmed></ref><ref><pubmed>29415504</pubmed></ref><ref><pubmed>29195055</pubmed></ref>。<br />
[[ファイル:Fig1-SF.jpg|サムネイル|250px|'''図1 神経筋接合部と中枢シナプスのシナプス形成<br />
A. 脊椎動物の神経筋接合部。運動神経細胞から伸長した軸索末端が多核の筋線維に接触することで、情報交換が始まる。シナプス前部ではシナプス小胞が集積し、シナプス後部では神経伝達物質受容体であるニコチン性アセチルコリンレセプターが集まり始める。成熟した神経筋接合部ではシナプス前部にはシナプス小胞、アクティブゾーンが形成される。シナプス間隙には、シナプス領域で特化したシナプス基底膜が存在し、そこには、アセチルコリンエステラーゼに加え、アグリンやβ2ラミニンなどのシナプスオーガナイザー活性を持つ分子も局在する。シナプス後部には、アセチルコリンレセプターが集積し、Rapsynなどの足場分子やMuSK, Lrp4などのシグナル分子も集まる。シナプスの直下では、核も特殊化しており、アセチルコリンレセプター遺伝子を強く発現している（本文参考）。Sanes & Lichtman (1999) <ref><pubmed>10202544</pubmed></ref>などを参考にした。<br />
B. 中枢シナプス形成。Vaughn (1989) <ref><pubmed>2655146</pubmed></ref>の形態学的モデルをもとに、神経筋接合部のシナプス形成と対比させた。ここでも、シナプス前部と後部の情報交換により、シナプス分化が開始される。中枢シナプスのシナプス間隙には神経筋接合部とは異なり、基底膜は存在せず、前部と後部の直接的な接着が相互作用の中心であり、シナプス小胞や神経伝達物質受容体が、前部と後部にそれぞれ集積する。興奮性シナプスでは顕著なシナプス後肥厚が形成される。]]<br />
<br />
===シナプスオーガナイザー===<br />
運動神経細胞と筋線維は、それぞれ独立してシナプス前部とシナプス後部に対応するシナプス構成要素を合成し、自立的に集合させることが可能である。つまり、運動軸索では、筋線維がない状態でもシナプス小胞が見られ、軸索中に保持することができる。一方、筋線維は神経伝達物質受容体であるアセチルコリンレセプターを合成し、神経がない状態でも、細胞表面上に多数のアセチルコリンレセプターからなる巨大集合構造を作ることができる（クラスタリング, clustering）。したがって、シナプス形成を制御する細胞間相互作用は、シナプス小胞の形成や受容体クラスタリングそのものの誘発因子というより、むしろそれらの位置を決め配向させる指令因子（オーガナイザー, organizer）としての役割が大きい。また、軸索中のシナプス小胞の集積は、ポリリジン被覆ビーズなどとの接触でも容易に引き起こされることから、オーガナイザーとしての役割もAll or nothingといった絶対的なものではなく促進的なものである<ref><pubmed>7127105</pubmed></ref>。しかし、以下に記述するように、シナプス後部やシナプス前部の分化が、それぞれの接触によって誘発、促進される可能性があることを示す証拠もある。これらの証拠のいくつかは、神経筋接合部の再生を利用することで得られた。<br />
<br />
===シナプス後部の分化===<br />
シナプス後部の分化に積極的に関わる分子として想定されたのがアグリン（agrin）である<ref><pubmed>1966767</pubmed></ref>。シナプス前部筋線維は、[[細胞外マトリックス]]である[[基底膜]]（basement membrane, basal lamina）に包まれている。基底膜の成分は、通常、IV型コラーゲン、ヘパラン硫酸プロテオグリカン（パールカンperlecan）、[[ラミニン]]（laminin）などであるが<ref><pubmed>12556454</pubmed></ref>、神経筋接合部の基底膜（シナプス基底膜 synaptic basement membrane）には、シナプス形成に関わる重要な因子であるヘパラン硫酸プロテオグリカンのアグリン（agrin）が存在する。損傷した筋組織の基底膜を再生する筋肉に接触させると、シナプス後部の特徴を誘導することができる。つまり、基底膜にはアセチルコリンレセプターのクラスタリングに関わる因子が存在することが想定されアグリンは生化学的に精製された（図２A）。オールターナティブスプライシングによる特殊エクソン由来配列を含むために、強力な受容体クラスタリング能を持つアグリンは運動神経細胞側で発現し、運動神経を通じて末梢に運搬され、神経筋接合部の基底膜に保持される。アグリン欠損マウスでは、神経筋接合部が乱れており、神経筋接合部におけるアセチルコリンレセプタークラスターの数、大きさ、密度が減少している<ref><pubmed>8653788</pubmed></ref>。 このことから、アグリンはシナプス後部の分化に関わる神経由来の因子であると考えられる。アグリンは、筋特異的チロシンキナーゼ（MuSK）やLRP4を含むいくつかの受容体に結合して、アダプタータンパク質（Dok7）や細胞骨格タンパク質（Rapsyn）とともに、アセチルコリンレセプターのクラスタリングにつながる一連の情報伝達系に影響を与える<ref><pubmed>20215342</pubmed></ref><ref><pubmed>29415504</pubmed></ref><ref><pubmed>8653786</pubmed></ref><ref><pubmed>8653787</pubmed></ref><ref><pubmed>16794080</pubmed></ref><ref><pubmed>7675108</pubmed></ref>。<br />
[[ファイル:Fig2-SF.jpg|サムネイル|250px|'''図２ シナプスオーガナイザー<br />
A. 培養化の筋線維に、アグリンを加えると、アセチルコリンレセプターがクラスタリングする。アグリン欠損マウスでは、神経筋接合部におけるアセチルコリンレセプタークラスターの数、大きさ、密度が減少する<ref><pubmed>8653788</pubmed></ref>。<br />
B. 培養細胞(293細胞など）に、ニューロリギン（通常、シナプス後部の神経細胞で発現）を強制発現させ、その上で神経細胞を培養し神経突起を伸長させると、シナプス小胞の蓄積が観察される<ref><pubmed>10892652</pubmed></ref>。また、ニューレキシン（通常、シナプス前部の神経細胞で発現）を強制発現させると、その上では神経突起にシナプス後肥厚やある種の神経伝達物質受容体が集積する<ref><pubmed>15620359</pubmed></ref>。これらの活性から、これらの分子がシナプス前部や後部の分化と配向に関わるシナプスオーガナイザーであると推定された。]]<br />
<br />
===シナプス前部の分化===<br />
シナプス前部の分化に関わる分子として同定されたものには、神経筋接合部特異的ラミニンのアイソフォームがある。再生神経の軸索が筋線維に到達すると、基底膜に最初に接触する。この際、筋線維を死滅させ、基底膜を抜け殻のように残したままでも、再生神経は正確に元の神経筋接合部の基底膜上でシナプス前部の分化を起こした<ref><pubmed>307554</pubmed></ref>。つまり、神経筋接合部のシナプス基底膜には、シナプス前部の分化を指示する因子があると想定され、その後、そのような分子が同定されている。最もよく研究されているのは、細胞外マトリックス分子ラミニンのアイソフォームである。ラミニンはすべての基底膜の構成分子であり、ラミニンは、α鎖、β鎖、γ鎖のヘテロ3量体であり、少なくとも5本のα鎖、4本のβ鎖、3本のγ鎖のファミリーからなっている。筋線維は複数のラミニンアイソフォームを合成し基底膜に取り込む。シナプス外の通常の筋基底膜にはβ1鎖を含むラミニンが存在するが、神経筋接合部のシナプス間隙の基底膜にはβ2鎖を持つアイソフォームが見られる<ref><pubmed>2922051</pubmed></ref>。in vitroでは、β2ラミニンに運動神経の軸索が接触すると伸長を停止し、シナプス小胞を蓄積し、神経伝達物質を放出するようになる。β2ラミニンを欠く変異マウスでは、シナプス前終末およびシュワン細胞の発達に異常が生じる<ref><pubmed>7885444</pubmed></ref>。<br />
<br />
===シナプス核===<br />
中枢シナプスと違う神経筋接合部の際立った特徴は、筋線維は多数の細胞が融合した[[多核細胞]]（syncytial muscle; multinucleated muscle）となっており、神経筋接合部の直下にはシナプス核（synaptic nucleus)と呼ばれる特化した細胞核が存在することである<ref><pubmed>11498047</pubmed></ref>（図1A）。シナプス核ではアセチルコリンレセプター遺伝子の転写が強く、シナプスから離れた核では転写が低く、アセチルコリンレセプターmRNAを局在化させ、神経筋接合部の近辺でアセチルコリンレセプターが集まる要因にもなっている。これは、神経が、アセチルコリンを使って、アセチルコリンレセプター遺伝子のシナプス外での発現を抑制すると同時に、軸索から放出されるニューレギュリン（neuregulin, ARIA = Acetylcholine Receptor Inducing Activityとも呼ばれた）が、アセチルコリンレセプター遺伝子の転写活性化につながるシグナリング分子となっている<ref><pubmed>9056721</pubmed></ref>。また、発生途中では、アセチルコリンレセプターの組成も変化する。幼若期に特有なδサブユニット遺伝子からε遺伝子への発現の変換がおこる<ref><pubmed>2423878</pubmed></ref>。生体で見られる発生初期のアセチルコリンレセプターのクラスターは単純なプラーク型であるが、最終的には複雑なプレッツェル型になり、神経筋接合部のひだも形成され、シナプス前終末もそれに対応して成熟する<ref><pubmed>15034266</pubmed></ref>。<br />
<br />
==中枢神経系のシナプス形成==<br />
中枢神経系のシナプスの形成も神経筋接合部のシナプス形成と類似した点が多い。シナプス前部とシナプス後部の間の相互作用は、基本的に予め合成されたシナプス構成要素の位置を制御し合うことで、お互いの分化を制御しシナプスを形成すると考えられる<ref><pubmed>2655146</pubmed></ref><ref><pubmed>14556707</pubmed></ref><ref><pubmed>17417940</pubmed></ref><ref><pubmed>27462810</pubmed></ref><ref><pubmed>29096080</pubmed></ref><ref><pubmed>30359597</pubmed></ref>。中枢シナプスでは、神経筋接合部のシナプス核のように転写レベルで局所的に合成を制御することはないが、シナプス近辺での局所的な翻訳や分解の制御はありうる<ref><pubmed>30861464</pubmed></ref>。その結果、中枢シナプスでも、神経筋接合部と同じように、神経伝達物質の受容体がシナプス後膜に集中し<ref><pubmed>22046028</pubmed></ref>、シナプス前部におけるシナプス小胞の分子的な成り立ちや蓄積も基本的には同じであるように見える<ref><pubmed>22794257</pubmed></ref>（図1B）。しかし、中枢シナプスの後部は、神経伝達物質受容体の分子種も異なり、その足場となる分子種も神経筋接合部とは大きく異なっている。特に、神経筋接合部では基底膜という細胞外マトリックスであったシナプス間隙（約50nm）の様相は中枢シナプスでは全く異なっており典型的な細胞外マトリックスは存在しない。中枢シナプスでは、約20nmのシナプス間隙で直接接触するシナプス前膜とシナプス後膜の間に存在する細胞間接着がその相互作用の中心であると考えられている<ref><pubmed>14519398</pubmed></ref><ref><pubmed>22278667</pubmed></ref><ref><pubmed>20832286</pubmed></ref><ref><pubmed>30359597</pubmed></ref><ref><pubmed>32359437</pubmed></ref>（図１B)。<br />
<br />
===中枢シナプス形成のオーガナイザー===<br />
シナプス前部とシナプス後部をつなぐ細胞接着分子は多数ある（[[シナプス接着因子]]の項参考）。それらを代表するものの1つは、シナプス後部の膜に存在するタンパク質であるニューロリギン（neuroligin）である。それに対応するシナプス前膜上の主要なリガンドはニューレキシン（neurexin）である。細胞表面のニューロリギンが、軸索上にシナプス小胞を集積させる能力は、ニューロリギンを強制発現する非神経細胞の上で、神経細胞を培養するin vitroアッセイ系を用いることによって初めて明らかになった<ref><pubmed>10892652</pubmed></ref>（図2B)。しかし、in vitroアッセイ系で見られるニューロリギンなどのシナプス接着分子の作用には、非神経細胞上にデフォールトで発現しているカドヘリンのような別の接着分子の存在が前提になるようである<ref><pubmed>29760652</pubmed></ref>。また、RIM、RIM-BP、liprin、Munc13、ELKSを含むいくつかのタンパク質ファミリーが、シナプス前部の重要な足場分子として同定されており<ref><pubmed>22794257</pubmed></ref>、シナプス前部表面のLAR-RPTPs（受容体型膜貫通チロシンホスファターゼ）を通じてアクティブゾーンを形成に預かる<ref><pubmed>23916315</pubmed></ref>。<br />
<br />
一方、シナプス後部の樹状突起内の一部の神経伝達物質受容体や足場分子は、ニューロリギンのリガンドであるニューレキシンを発現させた非神経細胞と接触する部位で凝集する<ref><pubmed>15620359</pubmed></ref>（図2B）。このような神経伝達物質受容体とそのシグナル伝達タンパク質の一部は、アクチン細胞骨格との直接的および間接的な相互作用を介して固定されている。特に、興奮性シナプスで顕著な[[シナプス後肥厚]]（postsynaptic density)においては、複数のPDZドメインを持った[[PSD95]]などの細胞内タンパク質が、PDZドメイン結合モチーフを持つニューロリギンなどの膜貫通型接着分子、神経伝達物質受容体、イオンチャネルと複数結合することで、シナプス後部の構成要素をつなぐ足場分子として機能し、ShankやHomerなどの他の足場分子とともに、シナプス構造の構築に関与すると考えられる<ref><pubmed>22046028</pubmed></ref><ref><pubmed>28577431</pubmed></ref><ref><pubmed>28179641</pubmed></ref>。一方、抑制性シナプスのシナプス後部では、ゲフィリン（gephyrin）が重要な足場分子として機能する<ref><pubmed>24552784</pubmed></ref><ref><pubmed>28460365</pubmed></ref>。<br />
<br />
4種類あるニューロリギンのうち、ニューロリギン1はグルタミン酸作動性シナプス、ニューロリギン2はGABA作動性シナプス、ニューロリギン3はグルタミン酸とGABA作動性シナプスの両者、そしてニューロリギン4はグリシン作動性シナプスに局在している<ref><pubmed>26209464</pubmed></ref><ref><pubmed>15540461</pubmed></ref><ref><pubmed>17897391</pubmed></ref><ref><pubmed>21282647</pubmed></ref>。培養系の実験では、ニューロリギン1,3,4はグルタミン酸レセプターのクラスタリングを引き起こすが、ニューロリギン２はグルタミン酸レセプターとGABAAレセプターのクラスタリングを引き起こす<ref><pubmed>15620359</pubmed></ref>。<br />
<br />
しかしながら、ニューレキシンやニューロリギンの遺伝子欠失動物では、予想に反して、シナプスの大きさや数にほとんど影響が見られない<ref><pubmed>12827191</pubmed></ref><ref><pubmed>16982420</pubmed></ref><ref><pubmed>28472659</pubmed></ref>ことから、これらの分子の存在が中枢シナプス形成にどの程度の意味を持っているのかは、実は明らかではない。ニューレキシンやニューロリギンの他にも、シナプス接着分子はシナプス分化の誘発能を持つものやニューレキシンに結合するものも含めて多数報告されてきており<ref><pubmed>29100073</pubmed></ref><ref><pubmed>30359597</pubmed></ref><ref><pubmed>32359437</pubmed></ref>、冗長性、補完性の高い相互作用システムの一部分である可能性が高い（[[シナプス接着因子]]の項参考）。また、同様な証拠から、シナプスオーガナイザーとして知られているFGFファミリーやWntファミリーといった分泌性の因子なども、この冗長な分子ネットワークの一部であると考えられる<ref><pubmed>20646052</pubmed></ref><ref><pubmed>24105999</pubmed></ref><ref><pubmed>29166241</pubmed></ref>。センチュウやショウジョウバエでは、変異体スクリーニングなどから、シナプス形成に関わるとされる遺伝子が多く同定されている<ref><pubmed>31037336</pubmed></ref><ref><pubmed>30986749</pubmed></ref><ref><pubmed>32741370</pubmed></ref>。このことからも、哺乳類の中枢シナプスに関わる分子機構も実際には更に複雑であることが予想される。<br />
<br />
中枢神経系の神経細胞の周りには、シナプス部位を囲むようにペリニューロナルネット（perineuronal nets）と呼ばれるプロテオグリカンやヒアルロナンなどを構成要素とする細胞外マトリックスが存在しており、臨界期などでのシナプス形成の制御にも関わっていると考えられている<ref><pubmed>27911749</pubmed></ref><ref><pubmed>31263252</pubmed></ref>。<br />
<br />
==シナプス形成におけるグリア細胞の役割==<br />
これまでシナプス前部とシナプス後部の接点のみに焦点を当ててきたが、シナプス形成には第3の細胞要素であるグリア細胞も関与している<ref><pubmed>30309945</pubmed></ref><ref><pubmed>30347385</pubmed></ref>。シュワン細胞は神経筋接合部のグリア細胞であり、[[アストロサイト]]は中枢シナプスのグリア細胞である。シュワン細胞がシナプス形成や維持に与える影響については、シュワン細胞を除去した動物での神経筋接合部の異常から考察されている<ref><pubmed>27656017</pubmed></ref>。<br />
<br />
グリア細胞の細胞表面にある分子と外部に分泌される分子の両方がシナプス形成に必要である。巨大な細胞外マトリックス分子であるトロンボスポンジン(thrombospondin) <ref><pubmed>15707899</pubmed></ref>、脂質であるコレステロール<ref><pubmed>12648780</pubmed></ref>、ヘヴィン（hevin) <ref><pubmed>21788491</pubmed></ref>などである。アストロサイトから分泌されるヘヴィンは、通常は相互作用しない細胞接着分子であるニューレキシンとニューロリギンの一部のアイソフォームを架橋することにより、シナプス形成を促進する<ref><pubmed>26771491</pubmed></ref>。アストロサイト上のグリピカン（glypican)は、シナプス前終末からAMPAレセプタークラスタリング因子ペントラキシン1(pentraxin1)の放出を誘発する<ref><pubmed>29024665</pubmed></ref><ref><pubmed>27986928</pubmed></ref>。また、シナプス形成に拮抗するSPARCなどのシナプスの負の調節因子も知られている<ref><pubmed>21788491</pubmed></ref>。また[[ミクログリア]]は、シナプス刈り込みに関与することで、神経回路の再編に関与する<ref><pubmed>31283900</pubmed></ref>。<br />
<br />
== 関連項目 ==<br />
*[[標的認識]]<br />
*[[成長円錐]]<br />
*[[神経筋接合部]]<br />
*[[シナプス刈り込み]]<br />
*[[シナプス接着因子]]<br />
*[[細胞外マトリックス]]<br />
*[[基底膜]]<br />
*[[シナプス前終末]]<br />
*[[シナプス後肥厚]]<br />
== 参考文献 ==<br />
<references /></div>
Masahitoyamagata
https://bsd.neuroinf.jp/w/index.php?title=%E3%82%B7%E3%83%8A%E3%83%97%E3%82%B9%E5%BD%A2%E6%88%90&diff=44927
シナプス形成
2020-10-21T23:54:09Z
<p>Masahitoyamagata: /* ステップ3：シナプス再編成 */</p>
<hr />
<div><div align="right"> <br />
<font size="+1">[http://researchmap.jp/yamagatm 山形方人]</font><br><br />
''Harvard University''<br><br />
DOI：<selfdoi /> 原稿受付日：年月日 原稿完成日：年月日<br><br />
担当編集委員：<br><br />
</div><br />
<br />
英：synapse formation, synaptogenesis<br />
{{box|text=<br />
神経細胞とその相手の細胞（神経細胞、筋肉など）は、シナプスという特殊化した細胞接着構造で結合している。シナプス形成とは、神経回路形成において、機能するシナプスができあがるまでの過程である。化学シナプスの形成には、シナプス前部（通常は軸索）が、シナプス後部（神経細胞の樹状突起、筋肉など）となる標的細胞の適切な細胞上の適切な位置に結合すること（シナプス特異性）と、シナプス前部と後部がシナプス間隙を介して同じ場所に配向して、シナプス前部にシナプス小胞や分泌装置の蓄積、シナプス後部に神経伝達物質受容体の集合やシナプス重厚部が生じるということ（シナプス分化）がある。シナプス形成は、シナプス前部とシナプス後部の間の相互作用によって制御されており、このような細胞間相互作用を担うシナプス接着分子、細胞外マトリックス分子、更に分泌性因子が同定されている。また、グリア細胞など神経細胞以外のプレーヤーの関与も重要である。神経系の発達期や臨界期においては、化学シナプス形成は過剰に行われ、神経活動などの影響により、シナプス刈り込みにより再編成される。また、発達中のシナプス形成とも共通する成熟した神経系でのシナプス新生や構造変化は、学習と記憶にも重要な役割をし、シナプス形成の異常は、自閉症、精神疾患、認知症などの原因になると考えられている。}}<br />
<br />
==はじめに==<br />
神経細胞は、[[シナプス]]で適切に結合、情報伝達し、情報処理ユニットとして機能している。シナプス形成は、神経細胞の間で適切な場所で生じるシナプスの構造構築から機能発現までの過程であるが、正常の発生だけでなく、再生や可塑性でも見られ、正常発生でのシナプス形成と基本的には共通するものであると考えられる。しかし、シナプス形成といった場合、発生における化学シナプスの構造構築について議論されることが多いので、本項目もそれを中心に扱う。また、化学シナプスの形成とは本質的に構造の異なる[[電気シナプス]]（ギャップジャンクション）の形成については、化学シナプス形成との関係性もあると考えられる<ref><pubmed>23237660</pubmed></ref><ref><pubmed>28170151 </pubmed></ref><ref><pubmed>32883654</pubmed></ref>が、本項目では扱わない。<br />
<br />
==シナプス形成の３ステップについての概観==<br />
===ステップ1：シナプス特異性===<br />
軸索は[[軸索ガイダンス]]により、標的細胞近辺に到達する。軸索は特定の標的細胞と特異的にシナプス結合することで、情報を処理できる機能的回路を作る（celluar specificity）。また、シナプスはシナプス後細胞上の特定の部位に形成される（subcellular specificity）<ref><pubmed>19575668</pubmed></ref><ref><pubmed>26656254</pubmed></ref>。この初期のステップについては、「[[標的認識]]」の項を参考にされたい。神経伝達物質や標的細胞が持つ受容体などのシナプスの神経化学的形質は、遺伝子にプログラムされて発生していく神経系の細胞に内在的なものと大方考えられているが、シナプス形成後の誘導により変換するケースもあるかもしれない<ref><pubmed>10202548</pubmed></ref>。<br />
<br />
===ステップ2：シナプス分化===<br />
次に、標的細胞と接触する軸索の一部分は[[シナプス小胞]]や[[アクティブゾーン]]を伴う[[シナプス前終末]]へと分化し（presynaptic differentiation）、軸索と接触した標的細胞では局所的に[[神経伝達物質受容体]]や細胞内足場が集積しシナプス後部へと分化する（postsynaptic differentiation）。シナプス前部とシナプス後部の特殊化は、軸索と標的細胞の間の相互作用で制御される。この細胞間相互作用についての多くの原理的知見は、運動神経細胞からの軸索が骨格筋線維上で作る巨大で単純なシナプスである[[神経筋接合部]]（neuromuscular junction, NMJ)についての20世紀に行われた研究から得られてきた<ref><pubmed>10202544</pubmed></ref>。21世紀になって、小さく多様な中枢神経系でのシナプス形成や無脊椎動物モデル動物のシナプス形成についての分子的な理解が進んでいる<ref><pubmed>30359597</pubmed></ref>。本項目では、特にこのステップについて、原理的な観点から概説する。<br />
<br />
===ステップ3：シナプス再編成===<br />
シナプス形成後は、シナプスの成熟や神経回路の再編成が観察される。発達期においては、シナプス形成は過剰に行われ、神経活動などの影響により過剰なシナプスは除去される<ref><pubmed>10719884</pubmed></ref><ref><pubmed>26436703</pubmed></ref><ref><pubmed>29716431</pubmed></ref><ref><pubmed>31372212</pubmed></ref>。シナプスの除去（synapse elimination）は、[[神経細胞死]]と同様に、神経回路を再編する重要な過程であるが、これについては「[[シナプス刈り込み]]」の項を参考されたい。シナプス形成は、個体発生の過程だけでなく、成体におけるシナプスの新生や構造変化は、学習と記憶にも重要な役割をし、シナプス形成の異常は、[[自閉症]]、[[精神疾患]]、[[認知症]]などの原因になると考えられている<ref><pubmed>22258914</pubmed></ref><ref><pubmed>22540979</pubmed></ref>。。<br />
<br />
==神経筋接合部におけるシナプス形成==<br />
脊髄動物の神経筋接合部は、脊髄にある運動神経細胞から伸長した軸索終末（シナプス前終末）、筋線維、[[シュワン細胞]]の３つの細胞要素からなり、それぞれ神経筋接合部で特徴的に分化している（図1A)。シナプス形成は、運動神経の軸索が、軸索ガイダンスを経て、発生中の筋線維に接近して開始される。[[成長円錐]]が神経終末に変化し始めると、神経終末と反対側の筋表面の一部が特殊化し始める。発生が進むと、[[シナプス間隙]]（synaptic cleft）を介したシナプス前部とシナプス後部の構造的な特徴が明確になり、最終的に筋線維表面のわずか1000分の1の面積を占める成熟した神経筋接合部となる（図１A）。このように、シナプス前部は、シナプス後部と同じ場所で配向し、シナプス前部では、シナプス小胞、アクティブゾーンなど神経伝達物質（アセチルコリン）の分泌装置や[[電位依存性カルシウムチャネル]]などが集積する。一方、シナプス後部では、効率的なシナプス伝達のために、神経伝達物質受容体（アセチルコリンレセプター）とシグナル伝達装置や足場構造が集合する<ref><pubmed>10202544</pubmed></ref><ref><pubmed>25493308</pubmed></ref><ref><pubmed>29415504</pubmed></ref><ref><pubmed>29195055</pubmed></ref>。<br />
[[ファイル:Fig1-SF.jpg|サムネイル|250px|'''図1 神経筋接合部と中枢シナプスのシナプス形成<br />
A. 脊椎動物の神経筋接合部。運動神経細胞から伸長した軸索末端が多核の筋線維に接触することで、情報交換が始まる。シナプス前部ではシナプス小胞が集積し、シナプス後部では神経伝達物質受容体であるニコチン性アセチルコリンレセプターが集まり始める。成熟した神経筋接合部ではシナプス前部にはシナプス小胞、アクティブゾーンが形成される。シナプス間隙には、シナプス領域で特化したシナプス基底膜が存在し、そこには、アセチルコリンエステラーゼに加え、アグリンやβ2ラミニンなどのシナプスオーガナイザー活性を持つ分子も局在する。シナプス後部には、アセチルコリンレセプターが集積し、Rapsynなどの足場分子やMuSK, Lrp4などのシグナル分子も集まる。シナプスの直下では、核も特殊化しており、アセチルコリンレセプター遺伝子を強く発現している（本文参考）。Sanes & Lichtman (1999) <ref><pubmed>10202544</pubmed></ref>などを参考にした。<br />
B. 中枢シナプス形成。Vaughn (1989) <ref><pubmed>2655146</pubmed></ref>の形態学的モデルをもとに、神経筋接合部のシナプス形成と対比させた。ここでも、シナプス前部と後部の情報交換により、シナプス分化が開始される。中枢シナプスのシナプス間隙には神経筋接合部とは異なり、基底膜は存在せず、前部と後部の直接的な接着が相互作用の中心であり、シナプス小胞や神経伝達物質受容体が、前部と後部にそれぞれ集積する。興奮性シナプスでは顕著なシナプス後肥厚が形成される。]]<br />
<br />
===シナプスオーガナイザー===<br />
運動神経細胞と筋線維は、それぞれ独立してシナプス前部とシナプス後部に対応するシナプス構成要素を合成し、自立的に集合させることが可能である。つまり、運動軸索では、筋線維がない状態でもシナプス小胞が見られ、軸索中に保持することができる。一方、筋線維は神経伝達物質受容体であるアセチルコリンレセプターを合成し、神経がない状態でも、細胞表面上に多数のアセチルコリンレセプターからなる巨大集合構造を作ることができる（クラスタリング, clustering）。したがって、シナプス形成を制御する細胞間相互作用は、シナプス小胞の形成や受容体クラスタリングそのものの誘発因子というより、むしろそれらの位置を決め配向させる指令因子（オーガナイザー, organizer）としての役割が大きい。また、軸索中のシナプス小胞の集積は、ポリリジン被覆ビーズなどとの接触でも容易に引き起こされることから、オーガナイザーとしての役割もAll or nothingといった絶対的なものではなく促進的なものである<ref><pubmed>7127105</pubmed></ref>。しかし、以下に記述するように、シナプス後部やシナプス前部の分化が、それぞれの接触によって誘発、促進される可能性があることを示す証拠もある。これらの証拠のいくつかは、神経筋接合部の再生を利用することで得られた。<br />
<br />
===シナプス後部の分化===<br />
シナプス後部の分化に積極的に関わる分子として想定されたのがアグリン（agrin）である<ref><pubmed>1966767</pubmed></ref>。シナプス前部筋線維は、[[細胞外マトリックス]]である[[基底膜]]（basement membrane, basal lamina）に包まれている。基底膜の成分は、通常、IV型コラーゲン、ヘパラン硫酸プロテオグリカン（パールカンperlecan）、[[ラミニン]]（laminin）などであるが<ref><pubmed>12556454</pubmed></ref>、神経筋接合部の基底膜（シナプス基底膜 synaptic basement membrane）には、シナプス形成に関わる重要な因子であるヘパラン硫酸プロテオグリカンのアグリン（agrin）が存在する。損傷した筋組織の基底膜を再生する筋肉に接触させると、シナプス後部の特徴を誘導することができる。つまり、基底膜にはアセチルコリンレセプターのクラスタリングに関わる因子が存在することが想定されアグリンは生化学的に精製された（図２A）。オールターナティブスプライシングによる特殊エクソン由来配列を含むために、強力な受容体クラスタリング能を持つアグリンは運動神経細胞側で発現し、運動神経を通じて末梢に運搬され、神経筋接合部の基底膜に保持される。アグリン欠損マウスでは、神経筋接合部が乱れており、神経筋接合部におけるアセチルコリンレセプタークラスターの数、大きさ、密度が減少している<ref><pubmed>8653788</pubmed></ref>。 このことから、アグリンはシナプス後部の分化に関わる神経由来の因子であると考えられる。アグリンは、筋特異的チロシンキナーゼ（MuSK）やLRP4を含むいくつかの受容体に結合して、アダプタータンパク質（Dok7）や細胞骨格タンパク質（Rapsyn）とともに、アセチルコリンレセプターのクラスタリングにつながる一連の情報伝達系に影響を与える<ref><pubmed>20215342</pubmed></ref><ref><pubmed>29415504</pubmed></ref><ref><pubmed>8653786</pubmed></ref><ref><pubmed>8653787</pubmed></ref><ref><pubmed>16794080</pubmed></ref><ref><pubmed>7675108</pubmed></ref>。<br />
[[ファイル:Fig2-SF.jpg|サムネイル|250px|'''図２ シナプスオーガナイザー<br />
A. 培養化の筋線維に、アグリンを加えると、アセチルコリンレセプターがクラスタリングする。アグリン欠損マウスでは、神経筋接合部におけるアセチルコリンレセプタークラスターの数、大きさ、密度が減少する<ref><pubmed>8653788</pubmed></ref>。<br />
B. 培養細胞(293細胞など）に、ニューロリギン（通常、シナプス後部の神経細胞で発現）を強制発現させ、その上で神経細胞を培養し神経突起を伸長させると、シナプス小胞の蓄積が観察される<ref><pubmed>10892652</pubmed></ref>。また、ニューレキシン（通常、シナプス前部の神経細胞で発現）を強制発現させると、その上では神経突起にシナプス後肥厚やある種の神経伝達物質受容体が集積する<ref><pubmed>15620359</pubmed></ref>。これらの活性から、これらの分子がシナプス前部や後部の分化と配向に関わるシナプスオーガナイザーであると推定された。]]<br />
<br />
===シナプス前部の分化===<br />
シナプス前部の分化に関わる分子として同定されたものには、神経筋接合部特異的ラミニンのアイソフォームがある。再生神経の軸索が筋線維に到達すると、基底膜に最初に接触する。この際、筋線維を死滅させ、基底膜を抜け殻のように残したままでも、再生神経は正確に元の神経筋接合部の基底膜上でシナプス前部の分化を起こした<ref><pubmed>307554</pubmed></ref>。つまり、神経筋接合部のシナプス基底膜には、シナプス前部の分化を指示する因子があると想定され、その後、そのような分子が同定されている。最もよく研究されているのは、細胞外マトリックス分子ラミニンのアイソフォームである。ラミニンはすべての基底膜の構成分子であり、ラミニンは、α鎖、β鎖、γ鎖のヘテロ3量体であり、少なくとも5本のα鎖、4本のβ鎖、3本のγ鎖のファミリーからなっている。筋線維は複数のラミニンアイソフォームを合成し基底膜に取り込む。シナプス外の通常の筋基底膜にはβ1鎖を含むラミニンが存在するが、神経筋接合部のシナプス間隙の基底膜にはβ2鎖を持つアイソフォームが見られる<ref><pubmed>2922051</pubmed></ref>。in vitroでは、β2ラミニンに運動神経の軸索が接触すると伸長を停止し、シナプス小胞を蓄積し、神経伝達物質を放出するようになる。β2ラミニンを欠く変異マウスでは、シナプス前終末およびシュワン細胞の発達に異常が生じる<ref><pubmed>7885444</pubmed></ref>。<br />
<br />
===シナプス核===<br />
中枢シナプスと違う神経筋接合部の際立った特徴は、筋線維は多数の細胞が融合した[[多核細胞]]（syncytial muscle; multinucleated muscle）となっており、神経筋接合部の直下にはシナプス核（synaptic nucleus)と呼ばれる特化した細胞核が存在することである<ref><pubmed>11498047</pubmed></ref>（図1A）。シナプス核ではアセチルコリンレセプター遺伝子の転写が強く、シナプスから離れた核では転写が低く、アセチルコリンレセプターmRNAを局在化させ、神経筋接合部の近辺でアセチルコリンレセプターが集まる要因にもなっている。これは、神経が、アセチルコリンを使って、アセチルコリンレセプター遺伝子のシナプス外での発現を抑制すると同時に、軸索から放出されるニューレギュリン（neuregulin, ARIA = Acetylcholine Receptor Inducing Activityとも呼ばれた）が、アセチルコリンレセプター遺伝子の転写活性化につながるシグナリング分子となっている<ref><pubmed>9056721</pubmed></ref>。また、発生途中では、アセチルコリンレセプターの組成も変化する。幼若期に特有なδサブユニット遺伝子からε遺伝子への発現の変換がおこる<ref><pubmed>2423878</pubmed></ref>。生体で見られる発生初期のアセチルコリンレセプターのクラスターは単純なプラーク型であるが、最終的には複雑なプレッツェル型になり、神経筋接合部のひだも形成され、シナプス前終末もそれに対応して成熟する<ref><pubmed>15034266</pubmed></ref>。<br />
<br />
==中枢神経系のシナプス形成==<br />
中枢神経系のシナプスの形成も神経筋接合部のシナプス形成と類似した点が多い。シナプス前部とシナプス後部の間の相互作用は、基本的に予め合成されたシナプス構成要素の位置を制御し合うことで、お互いの分化を制御しシナプスを形成すると考えられる<ref><pubmed>2655146</pubmed></ref><ref><pubmed>14556707</pubmed></ref><ref><pubmed>17417940</pubmed></ref><ref><pubmed>27462810</pubmed></ref><ref><pubmed>29096080</pubmed></ref><ref><pubmed>30359597</pubmed></ref>。中枢シナプスでは、神経筋接合部のシナプス核のように転写レベルで局所的に合成を制御することはないが、シナプス近辺での局所的な翻訳や分解の制御はありうる<ref><pubmed>30861464</pubmed></ref>。その結果、中枢シナプスでも、神経筋接合部と同じように、神経伝達物質の受容体がシナプス後膜に集中し<ref><pubmed>22046028</pubmed></ref>、シナプス前部におけるシナプス小胞の分子的な成り立ちや蓄積も基本的には同じであるように見える<ref><pubmed>22794257</pubmed></ref>（図1B）。しかし、中枢シナプスの後部は、神経伝達物質受容体の分子種も異なり、その足場となる分子種も神経筋接合部とは大きく異なっている。特に、神経筋接合部では基底膜という細胞外マトリックスであったシナプス間隙（約50nm）の様相は中枢シナプスでは全く異なっており典型的な細胞外マトリックスは存在しない。中枢シナプスでは、約20nmのシナプス間隙で直接接触するシナプス前膜とシナプス後膜の間に存在する細胞間接着がその相互作用の中心であると考えられている<ref><pubmed>14519398</pubmed></ref><ref><pubmed>22278667</pubmed></ref><ref><pubmed>20832286</pubmed></ref><ref><pubmed>30359597</pubmed></ref><ref><pubmed>32359437</pubmed></ref>（図１B)。<br />
<br />
===中枢シナプス形成のオーガナイザー===<br />
シナプス前部とシナプス後部をつなぐ細胞接着分子は多数ある（[[シナプス接着因子]]の項参考）。それらを代表するものの1つは、シナプス後部の膜に存在するタンパク質であるニューロリギン（neuroligin）である。それに対応するシナプス前膜上の主要なリガンドはニューレキシン（neurexin）である。細胞表面のニューロリギンが、軸索上にシナプス小胞を集積させる能力は、ニューロリギンを強制発現する非神経細胞の上で、神経細胞を培養するin vitroアッセイ系を用いることによって初めて明らかになった<ref><pubmed>10892652</pubmed></ref>（図2B)。しかし、in vitroアッセイ系で見られるニューロリギンなどのシナプス接着分子の作用には、非神経細胞上にデフォールトで発現しているカドヘリンのような別の接着分子の存在が前提になるようである<ref><pubmed>29760652</pubmed></ref>。また、RIM、RIM-BP、liprin、Munc13、ELKSを含むいくつかのタンパク質ファミリーが、シナプス前部の重要な足場分子として同定されており<ref><pubmed>22794257</pubmed></ref>、シナプス前部表面のLAR-RPTPs（受容体型膜貫通チロシンホスファターゼ）を通じてアクティブゾーンを形成に預かる<ref><pubmed>23916315</pubmed></ref>。<br />
<br />
一方、シナプス後部の樹状突起内の一部の神経伝達物質受容体や足場分子は、ニューロリギンのリガンドであるニューレキシンを発現させた非神経細胞と接触する部位で凝集する<ref><pubmed>15620359</pubmed></ref>（図2B）。このような神経伝達物質受容体とそのシグナル伝達タンパク質の一部は、アクチン細胞骨格との直接的および間接的な相互作用を介して固定されている。特に、興奮性シナプスで顕著な[[シナプス後肥厚]]（postsynaptic density)においては、複数のPDZドメインを持った[[PSD95]]などの細胞内タンパク質が、PDZドメイン結合モチーフを持つニューロリギンなどの膜貫通型接着分子、神経伝達物質受容体、イオンチャネルと複数結合することで、シナプス後部の構成要素をつなぐ足場分子として機能し、ShankやHomerなどの他の足場分子とともに、シナプス構造の構築に関与すると考えられる<ref><pubmed>22046028</pubmed></ref><ref><pubmed>28577431</pubmed></ref><ref><pubmed>28179641</pubmed></ref>。一方、抑制性シナプスのシナプス後部では、ゲフィリン（gephyrin）が重要な足場分子として機能する<ref><pubmed>24552784</pubmed></ref><ref><pubmed>28460365</pubmed></ref>。<br />
<br />
4種類あるニューロリギンのうち、ニューロリギン1はグルタミン酸作動性シナプス、ニューロリギン2はGABA作動性シナプス、ニューロリギン3はグルタミン酸とGABA作動性シナプスの両者、そしてニューロリギン4はグリシン作動性シナプスに局在している<ref><pubmed>26209464</pubmed></ref><ref><pubmed>15540461</pubmed></ref><ref><pubmed>17897391</pubmed></ref><ref><pubmed>21282647</pubmed></ref>。培養系の実験では、ニューロリギン1,3,4はグルタミン酸レセプターのクラスタリングを引き起こすが、ニューロリギン２はグルタミン酸レセプターとGABAAレセプターのクラスタリングを引き起こす<ref><pubmed>15620359</pubmed></ref>。<br />
<br />
しかしながら、ニューレキシンやニューロリギンの遺伝子欠失動物では、予想に反して、シナプスの大きさや数にほとんど影響が見られない<ref><pubmed>12827191</pubmed></ref><ref><pubmed>16982420</pubmed></ref><ref><pubmed>28472659</pubmed></ref>ことから、これらの分子の存在が中枢シナプス形成にどの程度の意味を持っているのかは、実は明らかではない。ニューレキシンやニューロリギンの他にも、シナプス接着分子はシナプス分化の誘発能を持つものやニューレキシンに結合するものも含めて多数報告されてきており<ref><pubmed>29100073</pubmed></ref><ref><pubmed>30359597</pubmed></ref><ref><pubmed>32359437</pubmed></ref>、冗長性、補完性の高い相互作用システムの一部分である可能性が高い（[[シナプス接着因子]]の項参考）。また、同様な証拠から、シナプスオーガナイザーとして知られているFGFファミリーやWntファミリーといった分泌性の因子なども、この冗長な分子ネットワークの一部であると考えられる<ref><pubmed>20646052</pubmed></ref><ref><pubmed>24105999</pubmed></ref><ref><pubmed>29166241</pubmed></ref>。センチュウやショウジョウバエでは、変異体スクリーニングなどから、シナプス形成に関わるとされる遺伝子が多く同定されている<ref><pubmed>31037336</pubmed></ref><ref><pubmed>30986749</pubmed></ref><ref><pubmed>32741370</pubmed></ref>。このことからも、哺乳類の中枢シナプスに関わる分子機構も実際には更に複雑であることが予想される。<br />
<br />
中枢神経系の神経細胞の周りには、シナプス部位を囲むようにペリニューロナルネット（perineuronal nets）と呼ばれるプロテオグリカンやヒアルロナンなどを構成要素とする細胞外マトリックスが存在しており、臨界期などでのシナプス形成の制御にも関わっていると考えられている<ref><pubmed>27911749</pubmed></ref><ref><pubmed>31263252</pubmed></ref>。<br />
<br />
==シナプス形成におけるグリア細胞の役割==<br />
これまでシナプス前部とシナプス後部の接点のみに焦点を当ててきたが、シナプス形成には第3の細胞要素であるグリア細胞も関与している<ref><pubmed>30309945</pubmed></ref><ref><pubmed>30347385</pubmed></ref>。シュワン細胞は神経筋接合部のグリア細胞であり、[[アストロサイト]]は中枢シナプスのグリア細胞である。シュワン細胞がシナプス形成や維持に与える影響については、シュワン細胞を除去した動物での神経筋接合部の異常から考察されている<ref><pubmed>27656017</pubmed></ref>。<br />
<br />
グリア細胞の細胞表面にある分子と外部に分泌される分子の両方がシナプス形成に必要である。巨大な細胞外マトリックス分子であるトロンボスポンジン(thrombospondin) <ref><pubmed>15707899</pubmed></ref>、脂質であるコレステロール<ref><pubmed>12648780</pubmed></ref>、ヘビン（hevin) <ref><pubmed>21788491</pubmed></ref>などである。アストロサイトから分泌されるヘビンは、通常は相互作用しない細胞接着分子であるニューレキシンとニューロリギンの一部のアイソフォームを架橋することにより、シナプス形成を促進する<ref><pubmed>26771491</pubmed></ref>。アストロサイト上のグリピカン（glypican)は、シナプス前終末からAMPAレセプタークラスタリング因子ペントラキシン1(pentraxin1)の放出を誘発する<ref><pubmed>29024665</pubmed></ref><ref><pubmed>27986928</pubmed></ref>。また、シナプス形成に拮抗するSPARCなどのシナプスの負の調節因子も知られている<ref><pubmed>21788491</pubmed></ref>。また[[ミクログリア]]は、シナプス刈り込みに関与することで、神経回路の再編に関与する<ref><pubmed>31283900</pubmed></ref>。 <br />
== 関連項目 ==<br />
*[[標的認識]]<br />
*[[成長円錐]]<br />
*[[神経筋接合部]]<br />
*[[シナプス刈り込み]]<br />
*[[シナプス接着因子]]<br />
*[[細胞外マトリックス]]<br />
*[[基底膜]]<br />
*[[シナプス前終末]]<br />
*[[シナプス後肥厚]]<br />
== 参考文献 ==<br />
<references /></div>
Masahitoyamagata
https://bsd.neuroinf.jp/w/index.php?title=%E3%82%B7%E3%83%8A%E3%83%97%E3%82%B9%E5%BD%A2%E6%88%90&diff=44926
シナプス形成
2020-10-21T23:51:39Z
<p>Masahitoyamagata: /* 中枢シナプス形成のオーガナイザー */</p>
<hr />
<div><div align="right"> <br />
<font size="+1">[http://researchmap.jp/yamagatm 山形方人]</font><br><br />
''Harvard University''<br><br />
DOI：<selfdoi /> 原稿受付日：年月日 原稿完成日：年月日<br><br />
担当編集委員：<br><br />
</div><br />
<br />
英：synapse formation, synaptogenesis<br />
{{box|text=<br />
神経細胞とその相手の細胞（神経細胞、筋肉など）は、シナプスという特殊化した細胞接着構造で結合している。シナプス形成とは、神経回路形成において、機能するシナプスができあがるまでの過程である。化学シナプスの形成には、シナプス前部（通常は軸索）が、シナプス後部（神経細胞の樹状突起、筋肉など）となる標的細胞の適切な細胞上の適切な位置に結合すること（シナプス特異性）と、シナプス前部と後部がシナプス間隙を介して同じ場所に配向して、シナプス前部にシナプス小胞や分泌装置の蓄積、シナプス後部に神経伝達物質受容体の集合やシナプス重厚部が生じるということ（シナプス分化）がある。シナプス形成は、シナプス前部とシナプス後部の間の相互作用によって制御されており、このような細胞間相互作用を担うシナプス接着分子、細胞外マトリックス分子、更に分泌性因子が同定されている。また、グリア細胞など神経細胞以外のプレーヤーの関与も重要である。神経系の発達期や臨界期においては、化学シナプス形成は過剰に行われ、神経活動などの影響により、シナプス刈り込みにより再編成される。また、発達中のシナプス形成とも共通する成熟した神経系でのシナプス新生や構造変化は、学習と記憶にも重要な役割をし、シナプス形成の異常は、自閉症、精神疾患、認知症などの原因になると考えられている。}}<br />
<br />
==はじめに==<br />
神経細胞は、[[シナプス]]で適切に結合、情報伝達し、情報処理ユニットとして機能している。シナプス形成は、神経細胞の間で適切な場所で生じるシナプスの構造構築から機能発現までの過程であるが、正常の発生だけでなく、再生や可塑性でも見られ、正常発生でのシナプス形成と基本的には共通するものであると考えられる。しかし、シナプス形成といった場合、発生における化学シナプスの構造構築について議論されることが多いので、本項目もそれを中心に扱う。また、化学シナプスの形成とは本質的に構造の異なる[[電気シナプス]]（ギャップジャンクション）の形成については、化学シナプス形成との関係性もあると考えられる<ref><pubmed>23237660</pubmed></ref><ref><pubmed>28170151 </pubmed></ref><ref><pubmed>32883654</pubmed></ref>が、本項目では扱わない。<br />
<br />
==シナプス形成の３ステップについての概観==<br />
===ステップ1：シナプス特異性===<br />
軸索は[[軸索ガイダンス]]により、標的細胞近辺に到達する。軸索は特定の標的細胞と特異的にシナプス結合することで、情報を処理できる機能的回路を作る（celluar specificity）。また、シナプスはシナプス後細胞上の特定の部位に形成される（subcellular specificity）<ref><pubmed>19575668</pubmed></ref><ref><pubmed>26656254</pubmed></ref>。この初期のステップについては、「[[標的認識]]」の項を参考にされたい。神経伝達物質や標的細胞が持つ受容体などのシナプスの神経化学的形質は、遺伝子にプログラムされて発生していく神経系の細胞に内在的なものと大方考えられているが、シナプス形成後の誘導により変換するケースもあるかもしれない<ref><pubmed>10202548</pubmed></ref>。<br />
<br />
===ステップ2：シナプス分化===<br />
次に、標的細胞と接触する軸索の一部分は[[シナプス小胞]]や[[アクティブゾーン]]を伴う[[シナプス前終末]]へと分化し（presynaptic differentiation）、軸索と接触した標的細胞では局所的に[[神経伝達物質受容体]]や細胞内足場が集積しシナプス後部へと分化する（postsynaptic differentiation）。シナプス前部とシナプス後部の特殊化は、軸索と標的細胞の間の相互作用で制御される。この細胞間相互作用についての多くの原理的知見は、運動神経細胞からの軸索が骨格筋線維上で作る巨大で単純なシナプスである[[神経筋接合部]]（neuromuscular junction, NMJ)についての20世紀に行われた研究から得られてきた<ref><pubmed>10202544</pubmed></ref>。21世紀になって、小さく多様な中枢神経系でのシナプス形成や無脊椎動物モデル動物のシナプス形成についての分子的な理解が進んでいる<ref><pubmed>30359597</pubmed></ref>。本項目では、特にこのステップについて、原理的な観点から概説する。<br />
<br />
===ステップ3：シナプス再編成===<br />
シナプス形成後は、シナプスの成熟や神経回路の再編成が観察される。発達期においては、シナプス形成は過剰に行われ、神経活動などの影響により過剰なシナプスは除去さ<ref><pubmed>10719884</pubmed></ref><ref><pubmed>26436703</pubmed></ref><ref><pubmed>29716431</pubmed></ref><ref><pubmed>31372212</pubmed></ref>。シナプスの除去（synapse elimination）は、[[神経細胞死]]と同様に、神経回路を再編する重要な過程であるが、これについては「[[シナプス刈り込み]]」の項を参考されたい。シナプス形成は、個体発生の過程だけでなく、成体におけるシナプスの新生や構造変化は、学習と記憶にも重要な役割をし、シナプス形成の異常は、[[自閉症]]、[[精神疾患]]、[[認知症]]などの原因になると考えられている<ref><pubmed>22258914</pubmed></ref><ref><pubmed>22540979</pubmed></ref>。。<br />
<br />
==神経筋接合部におけるシナプス形成==<br />
脊髄動物の神経筋接合部は、脊髄にある運動神経細胞から伸長した軸索終末（シナプス前終末）、筋線維、[[シュワン細胞]]の３つの細胞要素からなり、それぞれ神経筋接合部で特徴的に分化している（図1A)。シナプス形成は、運動神経の軸索が、軸索ガイダンスを経て、発生中の筋線維に接近して開始される。[[成長円錐]]が神経終末に変化し始めると、神経終末と反対側の筋表面の一部が特殊化し始める。発生が進むと、[[シナプス間隙]]（synaptic cleft）を介したシナプス前部とシナプス後部の構造的な特徴が明確になり、最終的に筋線維表面のわずか1000分の1の面積を占める成熟した神経筋接合部となる（図１A）。このように、シナプス前部は、シナプス後部と同じ場所で配向し、シナプス前部では、シナプス小胞、アクティブゾーンなど神経伝達物質（アセチルコリン）の分泌装置や[[電位依存性カルシウムチャネル]]などが集積する。一方、シナプス後部では、効率的なシナプス伝達のために、神経伝達物質受容体（アセチルコリンレセプター）とシグナル伝達装置や足場構造が集合する<ref><pubmed>10202544</pubmed></ref><ref><pubmed>25493308</pubmed></ref><ref><pubmed>29415504</pubmed></ref><ref><pubmed>29195055</pubmed></ref>。<br />
[[ファイル:Fig1-SF.jpg|サムネイル|250px|'''図1 神経筋接合部と中枢シナプスのシナプス形成<br />
A. 脊椎動物の神経筋接合部。運動神経細胞から伸長した軸索末端が多核の筋線維に接触することで、情報交換が始まる。シナプス前部ではシナプス小胞が集積し、シナプス後部では神経伝達物質受容体であるニコチン性アセチルコリンレセプターが集まり始める。成熟した神経筋接合部ではシナプス前部にはシナプス小胞、アクティブゾーンが形成される。シナプス間隙には、シナプス領域で特化したシナプス基底膜が存在し、そこには、アセチルコリンエステラーゼに加え、アグリンやβ2ラミニンなどのシナプスオーガナイザー活性を持つ分子も局在する。シナプス後部には、アセチルコリンレセプターが集積し、Rapsynなどの足場分子やMuSK, Lrp4などのシグナル分子も集まる。シナプスの直下では、核も特殊化しており、アセチルコリンレセプター遺伝子を強く発現している（本文参考）。Sanes & Lichtman (1999) <ref><pubmed>10202544</pubmed></ref>などを参考にした。<br />
B. 中枢シナプス形成。Vaughn (1989) <ref><pubmed>2655146</pubmed></ref>の形態学的モデルをもとに、神経筋接合部のシナプス形成と対比させた。ここでも、シナプス前部と後部の情報交換により、シナプス分化が開始される。中枢シナプスのシナプス間隙には神経筋接合部とは異なり、基底膜は存在せず、前部と後部の直接的な接着が相互作用の中心であり、シナプス小胞や神経伝達物質受容体が、前部と後部にそれぞれ集積する。興奮性シナプスでは顕著なシナプス後肥厚が形成される。]]<br />
<br />
===シナプスオーガナイザー===<br />
運動神経細胞と筋線維は、それぞれ独立してシナプス前部とシナプス後部に対応するシナプス構成要素を合成し、自立的に集合させることが可能である。つまり、運動軸索では、筋線維がない状態でもシナプス小胞が見られ、軸索中に保持することができる。一方、筋線維は神経伝達物質受容体であるアセチルコリンレセプターを合成し、神経がない状態でも、細胞表面上に多数のアセチルコリンレセプターからなる巨大集合構造を作ることができる（クラスタリング, clustering）。したがって、シナプス形成を制御する細胞間相互作用は、シナプス小胞の形成や受容体クラスタリングそのものの誘発因子というより、むしろそれらの位置を決め配向させる指令因子（オーガナイザー, organizer）としての役割が大きい。また、軸索中のシナプス小胞の集積は、ポリリジン被覆ビーズなどとの接触でも容易に引き起こされることから、オーガナイザーとしての役割もAll or nothingといった絶対的なものではなく促進的なものである<ref><pubmed>7127105</pubmed></ref>。しかし、以下に記述するように、シナプス後部やシナプス前部の分化が、それぞれの接触によって誘発、促進される可能性があることを示す証拠もある。これらの証拠のいくつかは、神経筋接合部の再生を利用することで得られた。<br />
<br />
===シナプス後部の分化===<br />
シナプス後部の分化に積極的に関わる分子として想定されたのがアグリン（agrin）である<ref><pubmed>1966767</pubmed></ref>。シナプス前部筋線維は、[[細胞外マトリックス]]である[[基底膜]]（basement membrane, basal lamina）に包まれている。基底膜の成分は、通常、IV型コラーゲン、ヘパラン硫酸プロテオグリカン（パールカンperlecan）、[[ラミニン]]（laminin）などであるが<ref><pubmed>12556454</pubmed></ref>、神経筋接合部の基底膜（シナプス基底膜 synaptic basement membrane）には、シナプス形成に関わる重要な因子であるヘパラン硫酸プロテオグリカンのアグリン（agrin）が存在する。損傷した筋組織の基底膜を再生する筋肉に接触させると、シナプス後部の特徴を誘導することができる。つまり、基底膜にはアセチルコリンレセプターのクラスタリングに関わる因子が存在することが想定されアグリンは生化学的に精製された（図２A）。オールターナティブスプライシングによる特殊エクソン由来配列を含むために、強力な受容体クラスタリング能を持つアグリンは運動神経細胞側で発現し、運動神経を通じて末梢に運搬され、神経筋接合部の基底膜に保持される。アグリン欠損マウスでは、神経筋接合部が乱れており、神経筋接合部におけるアセチルコリンレセプタークラスターの数、大きさ、密度が減少している<ref><pubmed>8653788</pubmed></ref>。 このことから、アグリンはシナプス後部の分化に関わる神経由来の因子であると考えられる。アグリンは、筋特異的チロシンキナーゼ（MuSK）やLRP4を含むいくつかの受容体に結合して、アダプタータンパク質（Dok7）や細胞骨格タンパク質（Rapsyn）とともに、アセチルコリンレセプターのクラスタリングにつながる一連の情報伝達系に影響を与える<ref><pubmed>20215342</pubmed></ref><ref><pubmed>29415504</pubmed></ref><ref><pubmed>8653786</pubmed></ref><ref><pubmed>8653787</pubmed></ref><ref><pubmed>16794080</pubmed></ref><ref><pubmed>7675108</pubmed></ref>。<br />
[[ファイル:Fig2-SF.jpg|サムネイル|250px|'''図２ シナプスオーガナイザー<br />
A. 培養化の筋線維に、アグリンを加えると、アセチルコリンレセプターがクラスタリングする。アグリン欠損マウスでは、神経筋接合部におけるアセチルコリンレセプタークラスターの数、大きさ、密度が減少する<ref><pubmed>8653788</pubmed></ref>。<br />
B. 培養細胞(293細胞など）に、ニューロリギン（通常、シナプス後部の神経細胞で発現）を強制発現させ、その上で神経細胞を培養し神経突起を伸長させると、シナプス小胞の蓄積が観察される<ref><pubmed>10892652</pubmed></ref>。また、ニューレキシン（通常、シナプス前部の神経細胞で発現）を強制発現させると、その上では神経突起にシナプス後肥厚やある種の神経伝達物質受容体が集積する<ref><pubmed>15620359</pubmed></ref>。これらの活性から、これらの分子がシナプス前部や後部の分化と配向に関わるシナプスオーガナイザーであると推定された。]]<br />
<br />
===シナプス前部の分化===<br />
シナプス前部の分化に関わる分子として同定されたものには、神経筋接合部特異的ラミニンのアイソフォームがある。再生神経の軸索が筋線維に到達すると、基底膜に最初に接触する。この際、筋線維を死滅させ、基底膜を抜け殻のように残したままでも、再生神経は正確に元の神経筋接合部の基底膜上でシナプス前部の分化を起こした<ref><pubmed>307554</pubmed></ref>。つまり、神経筋接合部のシナプス基底膜には、シナプス前部の分化を指示する因子があると想定され、その後、そのような分子が同定されている。最もよく研究されているのは、細胞外マトリックス分子ラミニンのアイソフォームである。ラミニンはすべての基底膜の構成分子であり、ラミニンは、α鎖、β鎖、γ鎖のヘテロ3量体であり、少なくとも5本のα鎖、4本のβ鎖、3本のγ鎖のファミリーからなっている。筋線維は複数のラミニンアイソフォームを合成し基底膜に取り込む。シナプス外の通常の筋基底膜にはβ1鎖を含むラミニンが存在するが、神経筋接合部のシナプス間隙の基底膜にはβ2鎖を持つアイソフォームが見られる<ref><pubmed>2922051</pubmed></ref>。in vitroでは、β2ラミニンに運動神経の軸索が接触すると伸長を停止し、シナプス小胞を蓄積し、神経伝達物質を放出するようになる。β2ラミニンを欠く変異マウスでは、シナプス前終末およびシュワン細胞の発達に異常が生じる<ref><pubmed>7885444</pubmed></ref>。<br />
<br />
===シナプス核===<br />
中枢シナプスと違う神経筋接合部の際立った特徴は、筋線維は多数の細胞が融合した[[多核細胞]]（syncytial muscle; multinucleated muscle）となっており、神経筋接合部の直下にはシナプス核（synaptic nucleus)と呼ばれる特化した細胞核が存在することである<ref><pubmed>11498047</pubmed></ref>（図1A）。シナプス核ではアセチルコリンレセプター遺伝子の転写が強く、シナプスから離れた核では転写が低く、アセチルコリンレセプターmRNAを局在化させ、神経筋接合部の近辺でアセチルコリンレセプターが集まる要因にもなっている。これは、神経が、アセチルコリンを使って、アセチルコリンレセプター遺伝子のシナプス外での発現を抑制すると同時に、軸索から放出されるニューレギュリン（neuregulin, ARIA = Acetylcholine Receptor Inducing Activityとも呼ばれた）が、アセチルコリンレセプター遺伝子の転写活性化につながるシグナリング分子となっている<ref><pubmed>9056721</pubmed></ref>。また、発生途中では、アセチルコリンレセプターの組成も変化する。幼若期に特有なδサブユニット遺伝子からε遺伝子への発現の変換がおこる<ref><pubmed>2423878</pubmed></ref>。生体で見られる発生初期のアセチルコリンレセプターのクラスターは単純なプラーク型であるが、最終的には複雑なプレッツェル型になり、神経筋接合部のひだも形成され、シナプス前終末もそれに対応して成熟する<ref><pubmed>15034266</pubmed></ref>。<br />
<br />
==中枢神経系のシナプス形成==<br />
中枢神経系のシナプスの形成も神経筋接合部のシナプス形成と類似した点が多い。シナプス前部とシナプス後部の間の相互作用は、基本的に予め合成されたシナプス構成要素の位置を制御し合うことで、お互いの分化を制御しシナプスを形成すると考えられる<ref><pubmed>2655146</pubmed></ref><ref><pubmed>14556707</pubmed></ref><ref><pubmed>17417940</pubmed></ref><ref><pubmed>27462810</pubmed></ref><ref><pubmed>29096080</pubmed></ref><ref><pubmed>30359597</pubmed></ref>。中枢シナプスでは、神経筋接合部のシナプス核のように転写レベルで局所的に合成を制御することはないが、シナプス近辺での局所的な翻訳や分解の制御はありうる<ref><pubmed>30861464</pubmed></ref>。その結果、中枢シナプスでも、神経筋接合部と同じように、神経伝達物質の受容体がシナプス後膜に集中し<ref><pubmed>22046028</pubmed></ref>、シナプス前部におけるシナプス小胞の分子的な成り立ちや蓄積も基本的には同じであるように見える<ref><pubmed>22794257</pubmed></ref>（図1B）。しかし、中枢シナプスの後部は、神経伝達物質受容体の分子種も異なり、その足場となる分子種も神経筋接合部とは大きく異なっている。特に、神経筋接合部では基底膜という細胞外マトリックスであったシナプス間隙（約50nm）の様相は中枢シナプスでは全く異なっており典型的な細胞外マトリックスは存在しない。中枢シナプスでは、約20nmのシナプス間隙で直接接触するシナプス前膜とシナプス後膜の間に存在する細胞間接着がその相互作用の中心であると考えられている<ref><pubmed>14519398</pubmed></ref><ref><pubmed>22278667</pubmed></ref><ref><pubmed>20832286</pubmed></ref><ref><pubmed>30359597</pubmed></ref><ref><pubmed>32359437</pubmed></ref>（図１B)。<br />
<br />
===中枢シナプス形成のオーガナイザー===<br />
シナプス前部とシナプス後部をつなぐ細胞接着分子は多数ある（[[シナプス接着因子]]の項参考）。それらを代表するものの1つは、シナプス後部の膜に存在するタンパク質であるニューロリギン（neuroligin）である。それに対応するシナプス前膜上の主要なリガンドはニューレキシン（neurexin）である。細胞表面のニューロリギンが、軸索上にシナプス小胞を集積させる能力は、ニューロリギンを強制発現する非神経細胞の上で、神経細胞を培養するin vitroアッセイ系を用いることによって初めて明らかになった<ref><pubmed>10892652</pubmed></ref>（図2B)。しかし、in vitroアッセイ系で見られるニューロリギンなどのシナプス接着分子の作用には、非神経細胞上にデフォールトで発現しているカドヘリンのような別の接着分子の存在が前提になるようである<ref><pubmed>29760652</pubmed></ref>。また、RIM、RIM-BP、liprin、Munc13、ELKSを含むいくつかのタンパク質ファミリーが、シナプス前部の重要な足場分子として同定されており<ref><pubmed>22794257</pubmed></ref>、シナプス前部表面のLAR-RPTPs（受容体型膜貫通チロシンホスファターゼ）を通じてアクティブゾーンを形成に預かる<ref><pubmed>23916315</pubmed></ref>。<br />
<br />
一方、シナプス後部の樹状突起内の一部の神経伝達物質受容体や足場分子は、ニューロリギンのリガンドであるニューレキシンを発現させた非神経細胞と接触する部位で凝集する<ref><pubmed>15620359</pubmed></ref>（図2B）。このような神経伝達物質受容体とそのシグナル伝達タンパク質の一部は、アクチン細胞骨格との直接的および間接的な相互作用を介して固定されている。特に、興奮性シナプスで顕著な[[シナプス後肥厚]]（postsynaptic density)においては、複数のPDZドメインを持った[[PSD95]]などの細胞内タンパク質が、PDZドメイン結合モチーフを持つニューロリギンなどの膜貫通型接着分子、神経伝達物質受容体、イオンチャネルと複数結合することで、シナプス後部の構成要素をつなぐ足場分子として機能し、ShankやHomerなどの他の足場分子とともに、シナプス構造の構築に関与すると考えられる<ref><pubmed>22046028</pubmed></ref><ref><pubmed>28577431</pubmed></ref><ref><pubmed>28179641</pubmed></ref>。一方、抑制性シナプスのシナプス後部では、ゲフィリン（gephyrin）が重要な足場分子として機能する<ref><pubmed>24552784</pubmed></ref><ref><pubmed>28460365</pubmed></ref>。<br />
<br />
4種類あるニューロリギンのうち、ニューロリギン1はグルタミン酸作動性シナプス、ニューロリギン2はGABA作動性シナプス、ニューロリギン3はグルタミン酸とGABA作動性シナプスの両者、そしてニューロリギン4はグリシン作動性シナプスに局在している<ref><pubmed>26209464</pubmed></ref><ref><pubmed>15540461</pubmed></ref><ref><pubmed>17897391</pubmed></ref><ref><pubmed>21282647</pubmed></ref>。培養系の実験では、ニューロリギン1,3,4はグルタミン酸レセプターのクラスタリングを引き起こすが、ニューロリギン２はグルタミン酸レセプターとGABAAレセプターのクラスタリングを引き起こす<ref><pubmed>15620359</pubmed></ref>。<br />
<br />
しかしながら、ニューレキシンやニューロリギンの遺伝子欠失動物では、予想に反して、シナプスの大きさや数にほとんど影響が見られない<ref><pubmed>12827191</pubmed></ref><ref><pubmed>16982420</pubmed></ref><ref><pubmed>28472659</pubmed></ref>ことから、これらの分子の存在が中枢シナプス形成にどの程度の意味を持っているのかは、実は明らかではない。ニューレキシンやニューロリギンの他にも、シナプス接着分子はシナプス分化の誘発能を持つものやニューレキシンに結合するものも含めて多数報告されてきており<ref><pubmed>29100073</pubmed></ref><ref><pubmed>30359597</pubmed></ref><ref><pubmed>32359437</pubmed></ref>、冗長性、補完性の高い相互作用システムの一部分である可能性が高い（[[シナプス接着因子]]の項参考）。また、同様な証拠から、シナプスオーガナイザーとして知られているFGFファミリーやWntファミリーといった分泌性の因子なども、この冗長な分子ネットワークの一部であると考えられる<ref><pubmed>20646052</pubmed></ref><ref><pubmed>24105999</pubmed></ref><ref><pubmed>29166241</pubmed></ref>。センチュウやショウジョウバエでは、変異体スクリーニングなどから、シナプス形成に関わるとされる遺伝子が多く同定されている<ref><pubmed>31037336</pubmed></ref><ref><pubmed>30986749</pubmed></ref><ref><pubmed>32741370</pubmed></ref>。このことからも、哺乳類の中枢シナプスに関わる分子機構も実際には更に複雑であることが予想される。<br />
<br />
中枢神経系の神経細胞の周りには、シナプス部位を囲むようにペリニューロナルネット（perineuronal nets）と呼ばれるプロテオグリカンやヒアルロナンなどを構成要素とする細胞外マトリックスが存在しており、臨界期などでのシナプス形成の制御にも関わっていると考えられている<ref><pubmed>27911749</pubmed></ref><ref><pubmed>31263252</pubmed></ref>。<br />
<br />
==シナプス形成におけるグリア細胞の役割==<br />
これまでシナプス前部とシナプス後部の接点のみに焦点を当ててきたが、シナプス形成には第3の細胞要素であるグリア細胞も関与している<ref><pubmed>30309945</pubmed></ref><ref><pubmed>30347385</pubmed></ref>。シュワン細胞は神経筋接合部のグリア細胞であり、[[アストロサイト]]は中枢シナプスのグリア細胞である。シュワン細胞がシナプス形成や維持に与える影響については、シュワン細胞を除去した動物での神経筋接合部の異常から考察されている<ref><pubmed>27656017</pubmed></ref>。<br />
<br />
グリア細胞の細胞表面にある分子と外部に分泌される分子の両方がシナプス形成に必要である。巨大な細胞外マトリックス分子であるトロンボスポンジン(thrombospondin) <ref><pubmed>15707899</pubmed></ref>、脂質であるコレステロール<ref><pubmed>12648780</pubmed></ref>、ヘビン（hevin) <ref><pubmed>21788491</pubmed></ref>などである。アストロサイトから分泌されるヘビンは、通常は相互作用しない細胞接着分子であるニューレキシンとニューロリギンの一部のアイソフォームを架橋することにより、シナプス形成を促進する<ref><pubmed>26771491</pubmed></ref>。アストロサイト上のグリピカン（glypican)は、シナプス前終末からAMPAレセプタークラスタリング因子ペントラキシン1(pentraxin1)の放出を誘発する<ref><pubmed>29024665</pubmed></ref><ref><pubmed>27986928</pubmed></ref>。また、シナプス形成に拮抗するSPARCなどのシナプスの負の調節因子も知られている<ref><pubmed>21788491</pubmed></ref>。また[[ミクログリア]]は、シナプス刈り込みに関与することで、神経回路の再編に関与する<ref><pubmed>31283900</pubmed></ref>。 <br />
== 関連項目 ==<br />
*[[標的認識]]<br />
*[[成長円錐]]<br />
*[[神経筋接合部]]<br />
*[[シナプス刈り込み]]<br />
*[[シナプス接着因子]]<br />
*[[細胞外マトリックス]]<br />
*[[基底膜]]<br />
*[[シナプス前終末]]<br />
*[[シナプス後肥厚]]<br />
== 参考文献 ==<br />
<references /></div>
Masahitoyamagata
https://bsd.neuroinf.jp/w/index.php?title=%E3%82%B7%E3%83%8A%E3%83%97%E3%82%B9%E5%BD%A2%E6%88%90&diff=44925
シナプス形成
2020-10-21T23:50:38Z
<p>Masahitoyamagata: /* 中枢神経系のシナプス形成 */</p>
<hr />
<div><div align="right"> <br />
<font size="+1">[http://researchmap.jp/yamagatm 山形方人]</font><br><br />
''Harvard University''<br><br />
DOI：<selfdoi /> 原稿受付日：年月日 原稿完成日：年月日<br><br />
担当編集委員：<br><br />
</div><br />
<br />
英：synapse formation, synaptogenesis<br />
{{box|text=<br />
神経細胞とその相手の細胞（神経細胞、筋肉など）は、シナプスという特殊化した細胞接着構造で結合している。シナプス形成とは、神経回路形成において、機能するシナプスができあがるまでの過程である。化学シナプスの形成には、シナプス前部（通常は軸索）が、シナプス後部（神経細胞の樹状突起、筋肉など）となる標的細胞の適切な細胞上の適切な位置に結合すること（シナプス特異性）と、シナプス前部と後部がシナプス間隙を介して同じ場所に配向して、シナプス前部にシナプス小胞や分泌装置の蓄積、シナプス後部に神経伝達物質受容体の集合やシナプス重厚部が生じるということ（シナプス分化）がある。シナプス形成は、シナプス前部とシナプス後部の間の相互作用によって制御されており、このような細胞間相互作用を担うシナプス接着分子、細胞外マトリックス分子、更に分泌性因子が同定されている。また、グリア細胞など神経細胞以外のプレーヤーの関与も重要である。神経系の発達期や臨界期においては、化学シナプス形成は過剰に行われ、神経活動などの影響により、シナプス刈り込みにより再編成される。また、発達中のシナプス形成とも共通する成熟した神経系でのシナプス新生や構造変化は、学習と記憶にも重要な役割をし、シナプス形成の異常は、自閉症、精神疾患、認知症などの原因になると考えられている。}}<br />
<br />
==はじめに==<br />
神経細胞は、[[シナプス]]で適切に結合、情報伝達し、情報処理ユニットとして機能している。シナプス形成は、神経細胞の間で適切な場所で生じるシナプスの構造構築から機能発現までの過程であるが、正常の発生だけでなく、再生や可塑性でも見られ、正常発生でのシナプス形成と基本的には共通するものであると考えられる。しかし、シナプス形成といった場合、発生における化学シナプスの構造構築について議論されることが多いので、本項目もそれを中心に扱う。また、化学シナプスの形成とは本質的に構造の異なる[[電気シナプス]]（ギャップジャンクション）の形成については、化学シナプス形成との関係性もあると考えられる<ref><pubmed>23237660</pubmed></ref><ref><pubmed>28170151 </pubmed></ref><ref><pubmed>32883654</pubmed></ref>が、本項目では扱わない。<br />
<br />
==シナプス形成の３ステップについての概観==<br />
===ステップ1：シナプス特異性===<br />
軸索は[[軸索ガイダンス]]により、標的細胞近辺に到達する。軸索は特定の標的細胞と特異的にシナプス結合することで、情報を処理できる機能的回路を作る（celluar specificity）。また、シナプスはシナプス後細胞上の特定の部位に形成される（subcellular specificity）<ref><pubmed>19575668</pubmed></ref><ref><pubmed>26656254</pubmed></ref>。この初期のステップについては、「[[標的認識]]」の項を参考にされたい。神経伝達物質や標的細胞が持つ受容体などのシナプスの神経化学的形質は、遺伝子にプログラムされて発生していく神経系の細胞に内在的なものと大方考えられているが、シナプス形成後の誘導により変換するケースもあるかもしれない<ref><pubmed>10202548</pubmed></ref>。<br />
<br />
===ステップ2：シナプス分化===<br />
次に、標的細胞と接触する軸索の一部分は[[シナプス小胞]]や[[アクティブゾーン]]を伴う[[シナプス前終末]]へと分化し（presynaptic differentiation）、軸索と接触した標的細胞では局所的に[[神経伝達物質受容体]]や細胞内足場が集積しシナプス後部へと分化する（postsynaptic differentiation）。シナプス前部とシナプス後部の特殊化は、軸索と標的細胞の間の相互作用で制御される。この細胞間相互作用についての多くの原理的知見は、運動神経細胞からの軸索が骨格筋線維上で作る巨大で単純なシナプスである[[神経筋接合部]]（neuromuscular junction, NMJ)についての20世紀に行われた研究から得られてきた<ref><pubmed>10202544</pubmed></ref>。21世紀になって、小さく多様な中枢神経系でのシナプス形成や無脊椎動物モデル動物のシナプス形成についての分子的な理解が進んでいる<ref><pubmed>30359597</pubmed></ref>。本項目では、特にこのステップについて、原理的な観点から概説する。<br />
<br />
===ステップ3：シナプス再編成===<br />
シナプス形成後は、シナプスの成熟や神経回路の再編成が観察される。発達期においては、シナプス形成は過剰に行われ、神経活動などの影響により過剰なシナプスは除去さ<ref><pubmed>10719884</pubmed></ref><ref><pubmed>26436703</pubmed></ref><ref><pubmed>29716431</pubmed></ref><ref><pubmed>31372212</pubmed></ref>。シナプスの除去（synapse elimination）は、[[神経細胞死]]と同様に、神経回路を再編する重要な過程であるが、これについては「[[シナプス刈り込み]]」の項を参考されたい。シナプス形成は、個体発生の過程だけでなく、成体におけるシナプスの新生や構造変化は、学習と記憶にも重要な役割をし、シナプス形成の異常は、[[自閉症]]、[[精神疾患]]、[[認知症]]などの原因になると考えられている<ref><pubmed>22258914</pubmed></ref><ref><pubmed>22540979</pubmed></ref>。。<br />
<br />
==神経筋接合部におけるシナプス形成==<br />
脊髄動物の神経筋接合部は、脊髄にある運動神経細胞から伸長した軸索終末（シナプス前終末）、筋線維、[[シュワン細胞]]の３つの細胞要素からなり、それぞれ神経筋接合部で特徴的に分化している（図1A)。シナプス形成は、運動神経の軸索が、軸索ガイダンスを経て、発生中の筋線維に接近して開始される。[[成長円錐]]が神経終末に変化し始めると、神経終末と反対側の筋表面の一部が特殊化し始める。発生が進むと、[[シナプス間隙]]（synaptic cleft）を介したシナプス前部とシナプス後部の構造的な特徴が明確になり、最終的に筋線維表面のわずか1000分の1の面積を占める成熟した神経筋接合部となる（図１A）。このように、シナプス前部は、シナプス後部と同じ場所で配向し、シナプス前部では、シナプス小胞、アクティブゾーンなど神経伝達物質（アセチルコリン）の分泌装置や[[電位依存性カルシウムチャネル]]などが集積する。一方、シナプス後部では、効率的なシナプス伝達のために、神経伝達物質受容体（アセチルコリンレセプター）とシグナル伝達装置や足場構造が集合する<ref><pubmed>10202544</pubmed></ref><ref><pubmed>25493308</pubmed></ref><ref><pubmed>29415504</pubmed></ref><ref><pubmed>29195055</pubmed></ref>。<br />
[[ファイル:Fig1-SF.jpg|サムネイル|250px|'''図1 神経筋接合部と中枢シナプスのシナプス形成<br />
A. 脊椎動物の神経筋接合部。運動神経細胞から伸長した軸索末端が多核の筋線維に接触することで、情報交換が始まる。シナプス前部ではシナプス小胞が集積し、シナプス後部では神経伝達物質受容体であるニコチン性アセチルコリンレセプターが集まり始める。成熟した神経筋接合部ではシナプス前部にはシナプス小胞、アクティブゾーンが形成される。シナプス間隙には、シナプス領域で特化したシナプス基底膜が存在し、そこには、アセチルコリンエステラーゼに加え、アグリンやβ2ラミニンなどのシナプスオーガナイザー活性を持つ分子も局在する。シナプス後部には、アセチルコリンレセプターが集積し、Rapsynなどの足場分子やMuSK, Lrp4などのシグナル分子も集まる。シナプスの直下では、核も特殊化しており、アセチルコリンレセプター遺伝子を強く発現している（本文参考）。Sanes & Lichtman (1999) <ref><pubmed>10202544</pubmed></ref>などを参考にした。<br />
B. 中枢シナプス形成。Vaughn (1989) <ref><pubmed>2655146</pubmed></ref>の形態学的モデルをもとに、神経筋接合部のシナプス形成と対比させた。ここでも、シナプス前部と後部の情報交換により、シナプス分化が開始される。中枢シナプスのシナプス間隙には神経筋接合部とは異なり、基底膜は存在せず、前部と後部の直接的な接着が相互作用の中心であり、シナプス小胞や神経伝達物質受容体が、前部と後部にそれぞれ集積する。興奮性シナプスでは顕著なシナプス後肥厚が形成される。]]<br />
<br />
===シナプスオーガナイザー===<br />
運動神経細胞と筋線維は、それぞれ独立してシナプス前部とシナプス後部に対応するシナプス構成要素を合成し、自立的に集合させることが可能である。つまり、運動軸索では、筋線維がない状態でもシナプス小胞が見られ、軸索中に保持することができる。一方、筋線維は神経伝達物質受容体であるアセチルコリンレセプターを合成し、神経がない状態でも、細胞表面上に多数のアセチルコリンレセプターからなる巨大集合構造を作ることができる（クラスタリング, clustering）。したがって、シナプス形成を制御する細胞間相互作用は、シナプス小胞の形成や受容体クラスタリングそのものの誘発因子というより、むしろそれらの位置を決め配向させる指令因子（オーガナイザー, organizer）としての役割が大きい。また、軸索中のシナプス小胞の集積は、ポリリジン被覆ビーズなどとの接触でも容易に引き起こされることから、オーガナイザーとしての役割もAll or nothingといった絶対的なものではなく促進的なものである<ref><pubmed>7127105</pubmed></ref>。しかし、以下に記述するように、シナプス後部やシナプス前部の分化が、それぞれの接触によって誘発、促進される可能性があることを示す証拠もある。これらの証拠のいくつかは、神経筋接合部の再生を利用することで得られた。<br />
<br />
===シナプス後部の分化===<br />
シナプス後部の分化に積極的に関わる分子として想定されたのがアグリン（agrin）である<ref><pubmed>1966767</pubmed></ref>。シナプス前部筋線維は、[[細胞外マトリックス]]である[[基底膜]]（basement membrane, basal lamina）に包まれている。基底膜の成分は、通常、IV型コラーゲン、ヘパラン硫酸プロテオグリカン（パールカンperlecan）、[[ラミニン]]（laminin）などであるが<ref><pubmed>12556454</pubmed></ref>、神経筋接合部の基底膜（シナプス基底膜 synaptic basement membrane）には、シナプス形成に関わる重要な因子であるヘパラン硫酸プロテオグリカンのアグリン（agrin）が存在する。損傷した筋組織の基底膜を再生する筋肉に接触させると、シナプス後部の特徴を誘導することができる。つまり、基底膜にはアセチルコリンレセプターのクラスタリングに関わる因子が存在することが想定されアグリンは生化学的に精製された（図２A）。オールターナティブスプライシングによる特殊エクソン由来配列を含むために、強力な受容体クラスタリング能を持つアグリンは運動神経細胞側で発現し、運動神経を通じて末梢に運搬され、神経筋接合部の基底膜に保持される。アグリン欠損マウスでは、神経筋接合部が乱れており、神経筋接合部におけるアセチルコリンレセプタークラスターの数、大きさ、密度が減少している<ref><pubmed>8653788</pubmed></ref>。 このことから、アグリンはシナプス後部の分化に関わる神経由来の因子であると考えられる。アグリンは、筋特異的チロシンキナーゼ（MuSK）やLRP4を含むいくつかの受容体に結合して、アダプタータンパク質（Dok7）や細胞骨格タンパク質（Rapsyn）とともに、アセチルコリンレセプターのクラスタリングにつながる一連の情報伝達系に影響を与える<ref><pubmed>20215342</pubmed></ref><ref><pubmed>29415504</pubmed></ref><ref><pubmed>8653786</pubmed></ref><ref><pubmed>8653787</pubmed></ref><ref><pubmed>16794080</pubmed></ref><ref><pubmed>7675108</pubmed></ref>。<br />
[[ファイル:Fig2-SF.jpg|サムネイル|250px|'''図２ シナプスオーガナイザー<br />
A. 培養化の筋線維に、アグリンを加えると、アセチルコリンレセプターがクラスタリングする。アグリン欠損マウスでは、神経筋接合部におけるアセチルコリンレセプタークラスターの数、大きさ、密度が減少する<ref><pubmed>8653788</pubmed></ref>。<br />
B. 培養細胞(293細胞など）に、ニューロリギン（通常、シナプス後部の神経細胞で発現）を強制発現させ、その上で神経細胞を培養し神経突起を伸長させると、シナプス小胞の蓄積が観察される<ref><pubmed>10892652</pubmed></ref>。また、ニューレキシン（通常、シナプス前部の神経細胞で発現）を強制発現させると、その上では神経突起にシナプス後肥厚やある種の神経伝達物質受容体が集積する<ref><pubmed>15620359</pubmed></ref>。これらの活性から、これらの分子がシナプス前部や後部の分化と配向に関わるシナプスオーガナイザーであると推定された。]]<br />
<br />
===シナプス前部の分化===<br />
シナプス前部の分化に関わる分子として同定されたものには、神経筋接合部特異的ラミニンのアイソフォームがある。再生神経の軸索が筋線維に到達すると、基底膜に最初に接触する。この際、筋線維を死滅させ、基底膜を抜け殻のように残したままでも、再生神経は正確に元の神経筋接合部の基底膜上でシナプス前部の分化を起こした<ref><pubmed>307554</pubmed></ref>。つまり、神経筋接合部のシナプス基底膜には、シナプス前部の分化を指示する因子があると想定され、その後、そのような分子が同定されている。最もよく研究されているのは、細胞外マトリックス分子ラミニンのアイソフォームである。ラミニンはすべての基底膜の構成分子であり、ラミニンは、α鎖、β鎖、γ鎖のヘテロ3量体であり、少なくとも5本のα鎖、4本のβ鎖、3本のγ鎖のファミリーからなっている。筋線維は複数のラミニンアイソフォームを合成し基底膜に取り込む。シナプス外の通常の筋基底膜にはβ1鎖を含むラミニンが存在するが、神経筋接合部のシナプス間隙の基底膜にはβ2鎖を持つアイソフォームが見られる<ref><pubmed>2922051</pubmed></ref>。in vitroでは、β2ラミニンに運動神経の軸索が接触すると伸長を停止し、シナプス小胞を蓄積し、神経伝達物質を放出するようになる。β2ラミニンを欠く変異マウスでは、シナプス前終末およびシュワン細胞の発達に異常が生じる<ref><pubmed>7885444</pubmed></ref>。<br />
<br />
===シナプス核===<br />
中枢シナプスと違う神経筋接合部の際立った特徴は、筋線維は多数の細胞が融合した[[多核細胞]]（syncytial muscle; multinucleated muscle）となっており、神経筋接合部の直下にはシナプス核（synaptic nucleus)と呼ばれる特化した細胞核が存在することである<ref><pubmed>11498047</pubmed></ref>（図1A）。シナプス核ではアセチルコリンレセプター遺伝子の転写が強く、シナプスから離れた核では転写が低く、アセチルコリンレセプターmRNAを局在化させ、神経筋接合部の近辺でアセチルコリンレセプターが集まる要因にもなっている。これは、神経が、アセチルコリンを使って、アセチルコリンレセプター遺伝子のシナプス外での発現を抑制すると同時に、軸索から放出されるニューレギュリン（neuregulin, ARIA = Acetylcholine Receptor Inducing Activityとも呼ばれた）が、アセチルコリンレセプター遺伝子の転写活性化につながるシグナリング分子となっている<ref><pubmed>9056721</pubmed></ref>。また、発生途中では、アセチルコリンレセプターの組成も変化する。幼若期に特有なδサブユニット遺伝子からε遺伝子への発現の変換がおこる<ref><pubmed>2423878</pubmed></ref>。生体で見られる発生初期のアセチルコリンレセプターのクラスターは単純なプラーク型であるが、最終的には複雑なプレッツェル型になり、神経筋接合部のひだも形成され、シナプス前終末もそれに対応して成熟する<ref><pubmed>15034266</pubmed></ref>。<br />
<br />
==中枢神経系のシナプス形成==<br />
中枢神経系のシナプスの形成も神経筋接合部のシナプス形成と類似した点が多い。シナプス前部とシナプス後部の間の相互作用は、基本的に予め合成されたシナプス構成要素の位置を制御し合うことで、お互いの分化を制御しシナプスを形成すると考えられる<ref><pubmed>2655146</pubmed></ref><ref><pubmed>14556707</pubmed></ref><ref><pubmed>17417940</pubmed></ref><ref><pubmed>27462810</pubmed></ref><ref><pubmed>29096080</pubmed></ref><ref><pubmed>30359597</pubmed></ref>。中枢シナプスでは、神経筋接合部のシナプス核のように転写レベルで局所的に合成を制御することはないが、シナプス近辺での局所的な翻訳や分解の制御はありうる<ref><pubmed>30861464</pubmed></ref>。その結果、中枢シナプスでも、神経筋接合部と同じように、神経伝達物質の受容体がシナプス後膜に集中し<ref><pubmed>22046028</pubmed></ref>、シナプス前部におけるシナプス小胞の分子的な成り立ちや蓄積も基本的には同じであるように見える<ref><pubmed>22794257</pubmed></ref>（図1B）。しかし、中枢シナプスの後部は、神経伝達物質受容体の分子種も異なり、その足場となる分子種も神経筋接合部とは大きく異なっている。特に、神経筋接合部では基底膜という細胞外マトリックスであったシナプス間隙（約50nm）の様相は中枢シナプスでは全く異なっており典型的な細胞外マトリックスは存在しない。中枢シナプスでは、約20nmのシナプス間隙で直接接触するシナプス前膜とシナプス後膜の間に存在する細胞間接着がその相互作用の中心であると考えられている<ref><pubmed>14519398</pubmed></ref><ref><pubmed>22278667</pubmed></ref><ref><pubmed>20832286</pubmed></ref><ref><pubmed>30359597</pubmed></ref><ref><pubmed>32359437</pubmed></ref>（図１B)。<br />
<br />
===中枢シナプス形成のオーガナイザー===<br />
シナプス前部とシナプス後部をつなぐ細胞接着分子は多数ある（[[シナプス接着因子]]の項参考）。それらを代表するものの1つは、シナプス後部の膜に存在するタンパク質であるニューロリギン（neuroligin）である。それに対応するシナプス前膜上の主要なリガンドはニューレキシン（neurexin）である。細胞表面のニューロリギンが、軸索上にシナプス小胞を集積させる能力は、ニューロリギンを強制発現する非神経細胞の上で、神経細胞を培養するin vitroアッセイ系を用いることによって初めて明らかになった<ref><pubmed>10892652</pubmed></ref>（図2B)。しかし、in vitroアッセイ系で見られるニューロリギンなどのシナプス接着分子の作用には、非神経細胞上にデフォールトで発現しているカドヘリンのような別の接着分子の存在が前提になるようである<ref><pubmed>29760652</pubmed></ref>。また、RIM、RIM-BP、liprin、Munc13、ELKSを含むいくつかのタンパク質ファミリーが、シナプス前部の重要な足場分子として同定されており<ref><pubmed>22794257</pubmed></ref>、シナプス前部表面のLAR-RPTPs（受容体型膜貫通チロシンホスファターゼ）を通じてアクティブゾーンを形成に預かる<ref><pubmed>23916315</pubmed></ref>。<br />
<br />
一方、シナプス後部の樹状突起内の一部の神経伝達物質受容体や足場分子は、ニューロリギンのリガンドであるニューレキシンを発現させた非神経細胞と接触する部位で凝集する<ref><pubmed>15620359</pubmed></ref>（図2B）。このような神経伝達物質受容体とそのシグナル伝達タンパク質の一部は、アクチン細胞骨格との直接的および間接的な相互作用を介して固定されている。特に、興奮性シナプスで顕著な[[シナプス後肥厚]]（postsynaptic density)においては、複数のPDZドメインを持った[[PSD95]]などの細胞内タンパク質が、PDZドメイン結合モチーフを持つニューロリギンなどの膜貫通型接着分子、神経伝達物質受容体、イオンチャネルと複数結合することで、シナプス後部の構成要素をつなぐ足場分子として機能し、ShankやHomerなどの他の足場分子とともに、シナプス構造の構築に関与すると考えられる<ref><pubmed>22046028</pubmed></ref><ref><pubmed>28577431</pubmed></ref><ref><pubmed>28179641</pubmed></ref>。一方、抑制性シナプスのシナプス後部では、ゲフィリン（gephyrin）が重要な足場分子として機能する<ref><pubmed>24552784</pubmed></ref><ref><pubmed>28460365</pubmed></ref>。<br />
<br />
4種類あるニューロリギンのうち、ニューロリギン1はグルタミン酸作動性シナプス、ニューロリギン2はGABA作動性シナプス、ニューロリギン3はグルタミン酸とGABA作動性シナプスの両者、そしてニューロリギン4はグリシン作動性シナプスに局在している<ref><pubmed>26209464</pubmed></ref><ref><pubmed>15540461</pubmed></ref><ref><pubmed>17897391</pubmed></ref><ref><pubmed>21282647</pubmed></ref>。培養系の実験では、ニューロリギン1,3,4はグルタミン酸レセプターのクラスタリングを引き起こすが、ニューロリギン２はグルタミン酸レセプターとGABAAレセプターのクラスタリングを引き起こす<ref><pubmed>15620359</pubmed></ref>。<br />
<br />
しかしながら、ニューレキシンやニューロリギンの遺伝子欠失動物では、予想に反して、シナプスの大きさや数にほとんど影響が見られない<ref><pubmed>12827191</pubmed></ref><ref><pubmed>16982420</pubmed></ref><ref><pubmed>28472659</pubmed></ref>ことから、これらの分子の存在が中枢シナプス形成にどの程度の意味を持っているのかは、実は明らかではない。ニューレキシンやニューロリギンの他にも、シナプス接着分子はシナプス分化の誘発能を持つものやニューレキシンに結合するものも含めて多数報告されてきており<ref><pubmed>29100073</pubmed></ref><ref><pubmed>30359597</pubmed></ref>ref><pubmed>32359437</pubmed></ref>、冗長性、補完性の高い相互作用システムの一部分である可能性が高い（[[シナプス接着因子]]の項参考）。また、同様な証拠から、シナプスオーガナイザーとして知られているFGFファミリーやWntファミリーといった分泌性の因子なども、この冗長な分子ネットワークの一部であると考えられる<ref><pubmed>20646052</pubmed></ref><ref><pubmed>24105999</pubmed></ref><ref><pubmed>29166241</pubmed></ref>。センチュウやショウジョウバエでは、変異体スクリーニングなどから、シナプス形成に関わるとされる遺伝子が多く同定されている<ref><pubmed>31037336</pubmed></ref><ref><pubmed>30986749</pubmed></ref><ref><pubmed>32741370</pubmed></ref>。このことからも、哺乳類の中枢シナプスに関わる分子機構も実際には更に複雑であることが予想される。<br />
<br />
中枢神経系の神経細胞の周りには、シナプス部位を囲むようにペリニューロナルネット（perineuronal nets）と呼ばれるプロテオグリカンやヒアルロナンなどを構成要素とする細胞外マトリックスが存在しており、臨界期などでのシナプス形成の制御にも関わっていると考えられている<ref><pubmed>27911749</pubmed></ref><ref><pubmed>31263252</pubmed></ref>。<br />
<br />
==シナプス形成におけるグリア細胞の役割==<br />
これまでシナプス前部とシナプス後部の接点のみに焦点を当ててきたが、シナプス形成には第3の細胞要素であるグリア細胞も関与している<ref><pubmed>30309945</pubmed></ref><ref><pubmed>30347385</pubmed></ref>。シュワン細胞は神経筋接合部のグリア細胞であり、[[アストロサイト]]は中枢シナプスのグリア細胞である。シュワン細胞がシナプス形成や維持に与える影響については、シュワン細胞を除去した動物での神経筋接合部の異常から考察されている<ref><pubmed>27656017</pubmed></ref>。<br />
<br />
グリア細胞の細胞表面にある分子と外部に分泌される分子の両方がシナプス形成に必要である。巨大な細胞外マトリックス分子であるトロンボスポンジン(thrombospondin) <ref><pubmed>15707899</pubmed></ref>、脂質であるコレステロール<ref><pubmed>12648780</pubmed></ref>、ヘビン（hevin) <ref><pubmed>21788491</pubmed></ref>などである。アストロサイトから分泌されるヘビンは、通常は相互作用しない細胞接着分子であるニューレキシンとニューロリギンの一部のアイソフォームを架橋することにより、シナプス形成を促進する<ref><pubmed>26771491</pubmed></ref>。アストロサイト上のグリピカン（glypican)は、シナプス前終末からAMPAレセプタークラスタリング因子ペントラキシン1(pentraxin1)の放出を誘発する<ref><pubmed>29024665</pubmed></ref><ref><pubmed>27986928</pubmed></ref>。また、シナプス形成に拮抗するSPARCなどのシナプスの負の調節因子も知られている<ref><pubmed>21788491</pubmed></ref>。また[[ミクログリア]]は、シナプス刈り込みに関与することで、神経回路の再編に関与する<ref><pubmed>31283900</pubmed></ref>。 <br />
== 関連項目 ==<br />
*[[標的認識]]<br />
*[[成長円錐]]<br />
*[[神経筋接合部]]<br />
*[[シナプス刈り込み]]<br />
*[[シナプス接着因子]]<br />
*[[細胞外マトリックス]]<br />
*[[基底膜]]<br />
*[[シナプス前終末]]<br />
*[[シナプス後肥厚]]<br />
== 参考文献 ==<br />
<references /></div>
Masahitoyamagata
https://bsd.neuroinf.jp/w/index.php?title=%E3%82%B7%E3%83%8A%E3%83%97%E3%82%B9%E5%BD%A2%E6%88%90&diff=44924
シナプス形成
2020-10-21T23:42:43Z
<p>Masahitoyamagata: /* 中枢神経系のシナプス形成 */</p>
<hr />
<div><div align="right"> <br />
<font size="+1">[http://researchmap.jp/yamagatm 山形方人]</font><br><br />
''Harvard University''<br><br />
DOI：<selfdoi /> 原稿受付日：年月日 原稿完成日：年月日<br><br />
担当編集委員：<br><br />
</div><br />
<br />
英：synapse formation, synaptogenesis<br />
{{box|text=<br />
神経細胞とその相手の細胞（神経細胞、筋肉など）は、シナプスという特殊化した細胞接着構造で結合している。シナプス形成とは、神経回路形成において、機能するシナプスができあがるまでの過程である。化学シナプスの形成には、シナプス前部（通常は軸索）が、シナプス後部（神経細胞の樹状突起、筋肉など）となる標的細胞の適切な細胞上の適切な位置に結合すること（シナプス特異性）と、シナプス前部と後部がシナプス間隙を介して同じ場所に配向して、シナプス前部にシナプス小胞や分泌装置の蓄積、シナプス後部に神経伝達物質受容体の集合やシナプス重厚部が生じるということ（シナプス分化）がある。シナプス形成は、シナプス前部とシナプス後部の間の相互作用によって制御されており、このような細胞間相互作用を担うシナプス接着分子、細胞外マトリックス分子、更に分泌性因子が同定されている。また、グリア細胞など神経細胞以外のプレーヤーの関与も重要である。神経系の発達期や臨界期においては、化学シナプス形成は過剰に行われ、神経活動などの影響により、シナプス刈り込みにより再編成される。また、発達中のシナプス形成とも共通する成熟した神経系でのシナプス新生や構造変化は、学習と記憶にも重要な役割をし、シナプス形成の異常は、自閉症、精神疾患、認知症などの原因になると考えられている。}}<br />
<br />
==はじめに==<br />
神経細胞は、[[シナプス]]で適切に結合、情報伝達し、情報処理ユニットとして機能している。シナプス形成は、神経細胞の間で適切な場所で生じるシナプスの構造構築から機能発現までの過程であるが、正常の発生だけでなく、再生や可塑性でも見られ、正常発生でのシナプス形成と基本的には共通するものであると考えられる。しかし、シナプス形成といった場合、発生における化学シナプスの構造構築について議論されることが多いので、本項目もそれを中心に扱う。また、化学シナプスの形成とは本質的に構造の異なる[[電気シナプス]]（ギャップジャンクション）の形成については、化学シナプス形成との関係性もあると考えられる<ref><pubmed>23237660</pubmed></ref><ref><pubmed>28170151 </pubmed></ref><ref><pubmed>32883654</pubmed></ref>が、本項目では扱わない。<br />
<br />
==シナプス形成の３ステップについての概観==<br />
===ステップ1：シナプス特異性===<br />
軸索は[[軸索ガイダンス]]により、標的細胞近辺に到達する。軸索は特定の標的細胞と特異的にシナプス結合することで、情報を処理できる機能的回路を作る（celluar specificity）。また、シナプスはシナプス後細胞上の特定の部位に形成される（subcellular specificity）<ref><pubmed>19575668</pubmed></ref><ref><pubmed>26656254</pubmed></ref>。この初期のステップについては、「[[標的認識]]」の項を参考にされたい。神経伝達物質や標的細胞が持つ受容体などのシナプスの神経化学的形質は、遺伝子にプログラムされて発生していく神経系の細胞に内在的なものと大方考えられているが、シナプス形成後の誘導により変換するケースもあるかもしれない<ref><pubmed>10202548</pubmed></ref>。<br />
<br />
===ステップ2：シナプス分化===<br />
次に、標的細胞と接触する軸索の一部分は[[シナプス小胞]]や[[アクティブゾーン]]を伴う[[シナプス前終末]]へと分化し（presynaptic differentiation）、軸索と接触した標的細胞では局所的に[[神経伝達物質受容体]]や細胞内足場が集積しシナプス後部へと分化する（postsynaptic differentiation）。シナプス前部とシナプス後部の特殊化は、軸索と標的細胞の間の相互作用で制御される。この細胞間相互作用についての多くの原理的知見は、運動神経細胞からの軸索が骨格筋線維上で作る巨大で単純なシナプスである[[神経筋接合部]]（neuromuscular junction, NMJ)についての20世紀に行われた研究から得られてきた<ref><pubmed>10202544</pubmed></ref>。21世紀になって、小さく多様な中枢神経系でのシナプス形成や無脊椎動物モデル動物のシナプス形成についての分子的な理解が進んでいる<ref><pubmed>30359597</pubmed></ref>。本項目では、特にこのステップについて、原理的な観点から概説する。<br />
<br />
===ステップ3：シナプス再編成===<br />
シナプス形成後は、シナプスの成熟や神経回路の再編成が観察される。発達期においては、シナプス形成は過剰に行われ、神経活動などの影響により過剰なシナプスは除去さ<ref><pubmed>10719884</pubmed></ref><ref><pubmed>26436703</pubmed></ref><ref><pubmed>29716431</pubmed></ref><ref><pubmed>31372212</pubmed></ref>。シナプスの除去（synapse elimination）は、[[神経細胞死]]と同様に、神経回路を再編する重要な過程であるが、これについては「[[シナプス刈り込み]]」の項を参考されたい。シナプス形成は、個体発生の過程だけでなく、成体におけるシナプスの新生や構造変化は、学習と記憶にも重要な役割をし、シナプス形成の異常は、[[自閉症]]、[[精神疾患]]、[[認知症]]などの原因になると考えられている<ref><pubmed>22258914</pubmed></ref><ref><pubmed>22540979</pubmed></ref>。。<br />
<br />
==神経筋接合部におけるシナプス形成==<br />
脊髄動物の神経筋接合部は、脊髄にある運動神経細胞から伸長した軸索終末（シナプス前終末）、筋線維、[[シュワン細胞]]の３つの細胞要素からなり、それぞれ神経筋接合部で特徴的に分化している（図1A)。シナプス形成は、運動神経の軸索が、軸索ガイダンスを経て、発生中の筋線維に接近して開始される。[[成長円錐]]が神経終末に変化し始めると、神経終末と反対側の筋表面の一部が特殊化し始める。発生が進むと、[[シナプス間隙]]（synaptic cleft）を介したシナプス前部とシナプス後部の構造的な特徴が明確になり、最終的に筋線維表面のわずか1000分の1の面積を占める成熟した神経筋接合部となる（図１A）。このように、シナプス前部は、シナプス後部と同じ場所で配向し、シナプス前部では、シナプス小胞、アクティブゾーンなど神経伝達物質（アセチルコリン）の分泌装置や[[電位依存性カルシウムチャネル]]などが集積する。一方、シナプス後部では、効率的なシナプス伝達のために、神経伝達物質受容体（アセチルコリンレセプター）とシグナル伝達装置や足場構造が集合する<ref><pubmed>10202544</pubmed></ref><ref><pubmed>25493308</pubmed></ref><ref><pubmed>29415504</pubmed></ref><ref><pubmed>29195055</pubmed></ref>。<br />
[[ファイル:Fig1-SF.jpg|サムネイル|250px|'''図1 神経筋接合部と中枢シナプスのシナプス形成<br />
A. 脊椎動物の神経筋接合部。運動神経細胞から伸長した軸索末端が多核の筋線維に接触することで、情報交換が始まる。シナプス前部ではシナプス小胞が集積し、シナプス後部では神経伝達物質受容体であるニコチン性アセチルコリンレセプターが集まり始める。成熟した神経筋接合部ではシナプス前部にはシナプス小胞、アクティブゾーンが形成される。シナプス間隙には、シナプス領域で特化したシナプス基底膜が存在し、そこには、アセチルコリンエステラーゼに加え、アグリンやβ2ラミニンなどのシナプスオーガナイザー活性を持つ分子も局在する。シナプス後部には、アセチルコリンレセプターが集積し、Rapsynなどの足場分子やMuSK, Lrp4などのシグナル分子も集まる。シナプスの直下では、核も特殊化しており、アセチルコリンレセプター遺伝子を強く発現している（本文参考）。Sanes & Lichtman (1999) <ref><pubmed>10202544</pubmed></ref>などを参考にした。<br />
B. 中枢シナプス形成。Vaughn (1989) <ref><pubmed>2655146</pubmed></ref>の形態学的モデルをもとに、神経筋接合部のシナプス形成と対比させた。ここでも、シナプス前部と後部の情報交換により、シナプス分化が開始される。中枢シナプスのシナプス間隙には神経筋接合部とは異なり、基底膜は存在せず、前部と後部の直接的な接着が相互作用の中心であり、シナプス小胞や神経伝達物質受容体が、前部と後部にそれぞれ集積する。興奮性シナプスでは顕著なシナプス後肥厚が形成される。]]<br />
<br />
===シナプスオーガナイザー===<br />
運動神経細胞と筋線維は、それぞれ独立してシナプス前部とシナプス後部に対応するシナプス構成要素を合成し、自立的に集合させることが可能である。つまり、運動軸索では、筋線維がない状態でもシナプス小胞が見られ、軸索中に保持することができる。一方、筋線維は神経伝達物質受容体であるアセチルコリンレセプターを合成し、神経がない状態でも、細胞表面上に多数のアセチルコリンレセプターからなる巨大集合構造を作ることができる（クラスタリング, clustering）。したがって、シナプス形成を制御する細胞間相互作用は、シナプス小胞の形成や受容体クラスタリングそのものの誘発因子というより、むしろそれらの位置を決め配向させる指令因子（オーガナイザー, organizer）としての役割が大きい。また、軸索中のシナプス小胞の集積は、ポリリジン被覆ビーズなどとの接触でも容易に引き起こされることから、オーガナイザーとしての役割もAll or nothingといった絶対的なものではなく促進的なものである<ref><pubmed>7127105</pubmed></ref>。しかし、以下に記述するように、シナプス後部やシナプス前部の分化が、それぞれの接触によって誘発、促進される可能性があることを示す証拠もある。これらの証拠のいくつかは、神経筋接合部の再生を利用することで得られた。<br />
<br />
===シナプス後部の分化===<br />
シナプス後部の分化に積極的に関わる分子として想定されたのがアグリン（agrin）である<ref><pubmed>1966767</pubmed></ref>。シナプス前部筋線維は、[[細胞外マトリックス]]である[[基底膜]]（basement membrane, basal lamina）に包まれている。基底膜の成分は、通常、IV型コラーゲン、ヘパラン硫酸プロテオグリカン（パールカンperlecan）、[[ラミニン]]（laminin）などであるが<ref><pubmed>12556454</pubmed></ref>、神経筋接合部の基底膜（シナプス基底膜 synaptic basement membrane）には、シナプス形成に関わる重要な因子であるヘパラン硫酸プロテオグリカンのアグリン（agrin）が存在する。損傷した筋組織の基底膜を再生する筋肉に接触させると、シナプス後部の特徴を誘導することができる。つまり、基底膜にはアセチルコリンレセプターのクラスタリングに関わる因子が存在することが想定されアグリンは生化学的に精製された（図２A）。オールターナティブスプライシングによる特殊エクソン由来配列を含むために、強力な受容体クラスタリング能を持つアグリンは運動神経細胞側で発現し、運動神経を通じて末梢に運搬され、神経筋接合部の基底膜に保持される。アグリン欠損マウスでは、神経筋接合部が乱れており、神経筋接合部におけるアセチルコリンレセプタークラスターの数、大きさ、密度が減少している<ref><pubmed>8653788</pubmed></ref>。 このことから、アグリンはシナプス後部の分化に関わる神経由来の因子であると考えられる。アグリンは、筋特異的チロシンキナーゼ（MuSK）やLRP4を含むいくつかの受容体に結合して、アダプタータンパク質（Dok7）や細胞骨格タンパク質（Rapsyn）とともに、アセチルコリンレセプターのクラスタリングにつながる一連の情報伝達系に影響を与える<ref><pubmed>20215342</pubmed></ref><ref><pubmed>29415504</pubmed></ref><ref><pubmed>8653786</pubmed></ref><ref><pubmed>8653787</pubmed></ref><ref><pubmed>16794080</pubmed></ref><ref><pubmed>7675108</pubmed></ref>。<br />
[[ファイル:Fig2-SF.jpg|サムネイル|250px|'''図２ シナプスオーガナイザー<br />
A. 培養化の筋線維に、アグリンを加えると、アセチルコリンレセプターがクラスタリングする。アグリン欠損マウスでは、神経筋接合部におけるアセチルコリンレセプタークラスターの数、大きさ、密度が減少する<ref><pubmed>8653788</pubmed></ref>。<br />
B. 培養細胞(293細胞など）に、ニューロリギン（通常、シナプス後部の神経細胞で発現）を強制発現させ、その上で神経細胞を培養し神経突起を伸長させると、シナプス小胞の蓄積が観察される<ref><pubmed>10892652</pubmed></ref>。また、ニューレキシン（通常、シナプス前部の神経細胞で発現）を強制発現させると、その上では神経突起にシナプス後肥厚やある種の神経伝達物質受容体が集積する<ref><pubmed>15620359</pubmed></ref>。これらの活性から、これらの分子がシナプス前部や後部の分化と配向に関わるシナプスオーガナイザーであると推定された。]]<br />
<br />
===シナプス前部の分化===<br />
シナプス前部の分化に関わる分子として同定されたものには、神経筋接合部特異的ラミニンのアイソフォームがある。再生神経の軸索が筋線維に到達すると、基底膜に最初に接触する。この際、筋線維を死滅させ、基底膜を抜け殻のように残したままでも、再生神経は正確に元の神経筋接合部の基底膜上でシナプス前部の分化を起こした<ref><pubmed>307554</pubmed></ref>。つまり、神経筋接合部のシナプス基底膜には、シナプス前部の分化を指示する因子があると想定され、その後、そのような分子が同定されている。最もよく研究されているのは、細胞外マトリックス分子ラミニンのアイソフォームである。ラミニンはすべての基底膜の構成分子であり、ラミニンは、α鎖、β鎖、γ鎖のヘテロ3量体であり、少なくとも5本のα鎖、4本のβ鎖、3本のγ鎖のファミリーからなっている。筋線維は複数のラミニンアイソフォームを合成し基底膜に取り込む。シナプス外の通常の筋基底膜にはβ1鎖を含むラミニンが存在するが、神経筋接合部のシナプス間隙の基底膜にはβ2鎖を持つアイソフォームが見られる<ref><pubmed>2922051</pubmed></ref>。in vitroでは、β2ラミニンに運動神経の軸索が接触すると伸長を停止し、シナプス小胞を蓄積し、神経伝達物質を放出するようになる。β2ラミニンを欠く変異マウスでは、シナプス前終末およびシュワン細胞の発達に異常が生じる<ref><pubmed>7885444</pubmed></ref>。<br />
<br />
===シナプス核===<br />
中枢シナプスと違う神経筋接合部の際立った特徴は、筋線維は多数の細胞が融合した[[多核細胞]]（syncytial muscle; multinucleated muscle）となっており、神経筋接合部の直下にはシナプス核（synaptic nucleus)と呼ばれる特化した細胞核が存在することである<ref><pubmed>11498047</pubmed></ref>（図1A）。シナプス核ではアセチルコリンレセプター遺伝子の転写が強く、シナプスから離れた核では転写が低く、アセチルコリンレセプターmRNAを局在化させ、神経筋接合部の近辺でアセチルコリンレセプターが集まる要因にもなっている。これは、神経が、アセチルコリンを使って、アセチルコリンレセプター遺伝子のシナプス外での発現を抑制すると同時に、軸索から放出されるニューレギュリン（neuregulin, ARIA = Acetylcholine Receptor Inducing Activityとも呼ばれた）が、アセチルコリンレセプター遺伝子の転写活性化につながるシグナリング分子となっている<ref><pubmed>9056721</pubmed></ref>。また、発生途中では、アセチルコリンレセプターの組成も変化する。幼若期に特有なδサブユニット遺伝子からε遺伝子への発現の変換がおこる<ref><pubmed>2423878</pubmed></ref>。生体で見られる発生初期のアセチルコリンレセプターのクラスターは単純なプラーク型であるが、最終的には複雑なプレッツェル型になり、神経筋接合部のひだも形成され、シナプス前終末もそれに対応して成熟する<ref><pubmed>15034266</pubmed></ref>。<br />
<br />
==中枢神経系のシナプス形成==<br />
中枢神経系のシナプスの形成も神経筋接合部のシナプス形成と類似した点が多い。シナプス前部とシナプス後部の間の相互作用は、基本的に予め合成されたシナプス構成要素の位置を制御し合うことで、お互いの分化を制御しシナプスを形成すると考えられる<ref><pubmed>2655146</pubmed></ref><ref><pubmed>14556707</pubmed></ref><ref><pubmed>17417940</pubmed></ref><ref><pubmed>27462810</pubmed></ref><ref><pubmed>29096080</pubmed></ref><ref><pubmed>30359597</pubmed></ref>。中枢シナプスでは、神経筋接合部のシナプス核のように転写レベルで局所的に合成を制御することはないが、シナプス近辺での局所的な翻訳や分解の制御はありうる<ref><pubmed>30861464</pubmed></ref>。その結果、中枢シナプスでも、神経筋接合部と同じように、神経伝達物質の受容体がシナプス後膜に集中し<ref><pubmed>22046028</pubmed></ref>、シナプス前部におけるシナプス小胞の分子的な成り立ちや蓄積も基本的には同じであるように見える<ref><pubmed>22794257</pubmed></ref>（図1B）。しかし、中枢シナプスの後部は、神経伝達物質受容体の分子種も異なり、その足場となる分子種も神経筋接合部とは大きく異なっている。特に、神経筋接合部では基底膜という細胞外マトリックスであったシナプス間隙（約50nm）の様相は中枢シナプスでは全く異なっており典型的な細胞外マトリックスは存在しない。中枢シナプスでは、約20nmのシナプス間隙で直接接触するシナプス前膜とシナプス後膜の間に存在する細胞間接着がその相互作用の中心であると考えられている<ref><pubmed>14519398</pubmed></ref><ref><pubmed>22278667</pubmed></ref><ref><pubmed>20832286</pubmed></ref><ref><pubmed>30359597</pubmed></ref><ref><pubmed>32359437</pubmed></ref>（図１B)。<br />
<br />
===中枢シナプス形成のオーガナイザー===<br />
シナプス前部とシナプス後部をつなぐ細胞接着分子は多数ある（[[シナプス接着因子]]の項参考）。それらを代表するものの1つは、シナプス後部の膜に存在するタンパク質であるニューロリギン（neuroligin）である。それに対応するシナプス前膜上の主要なリガンドはニューレキシン（neurexin）である。細胞表面のニューロリギンが、軸索上にシナプス小胞を集積させる能力は、ニューロリギンを強制発現する非神経細胞の上で、神経細胞を培養するin vitroアッセイ系を用いることによって初めて明らかになった<ref><pubmed>10892652</pubmed></ref>（図2B)。しかし、in vitroアッセイ系で見られるニューロリギンなどのシナプス接着分子の作用には、非神経細胞上にデフォールトで発現しているカドヘリンのような別の接着分子の存在が前提になるようである<ref><pubmed>29760652</pubmed></ref>。また、RIM、RIM-BP、liprin、Munc13、ELKSを含むいくつかのタンパク質ファミリーが、シナプス前部の重要な足場分子として同定されており<ref><pubmed>22794257</pubmed></ref>、シナプス前部表面のLAR-RPTPs（受容体型膜貫通チロシンホスファターゼ）を通じてアクティブゾーンを形成に預かる<ref><pubmed>23916315</pubmed></ref>。<br />
<br />
一方、シナプス後部の樹状突起内の一部の神経伝達物質受容体や足場分子は、ニューロリギンのリガンドであるニューレキシンを発現させた非神経細胞と接触する部位で凝集する<ref><pubmed>15620359</pubmed></ref>（図2B）。このような神経伝達物質受容体とそのシグナル伝達タンパク質の一部は、アクチン細胞骨格との直接的および間接的な相互作用を介して固定されている。特に、興奮性シナプスで顕著な[[シナプス後肥厚]]（postsynaptic density)においては、複数のPDZドメインを持った[[PSD95]]などの細胞内タンパク質が、PDZドメイン結合モチーフを持つニューロリギンなどの膜貫通型接着分子、神経伝達物質受容体、イオンチャネルと複数結合することで、シナプス後部の構成要素をつなぐ足場分子として機能し、ShankやHomerなどの他の足場分子とともに、シナプス構造の構築に関与すると考えられる<ref><pubmed>22046028</pubmed></ref><ref><pubmed>28577431</pubmed></ref><ref><pubmed>28179641</pubmed></ref>。一方、抑制性シナプスのシナプス後部では、ゲフィリン（gephyrin）が重要な足場分子として機能する<ref><pubmed>24552784</pubmed></ref><ref><pubmed>28460365</pubmed></ref>。<br />
<br />
4種類あるニューロリギンのうち、ニューロリギン1はグルタミン酸作動性シナプス、ニューロリギン2はGABA作動性シナプス、ニューロリギン3はグルタミン酸とGABA作動性シナプスの両者、そしてニューロリギン4はグリシン作動性シナプスに局在している<ref><pubmed>26209464</pubmed></ref><ref><pubmed>15540461</pubmed></ref><ref><pubmed>17897391</pubmed></ref><ref><pubmed>21282647</pubmed></ref>。培養系の実験では、ニューロリギン1,3,4はグルタミン酸レセプターのクラスタリングを引き起こすが、ニューロリギン２はグルタミン酸レセプターとGABAAレセプターのクラスタリングを引き起こす<ref><pubmed>15620359</pubmed></ref>。<br />
<br />
しかしながら、ニューレキシンやニューロリギンの遺伝子欠失動物では、予想に反して、シナプスの大きさや数にほとんど影響が見られない<ref><pubmed>12827191</pubmed></ref><ref><pubmed>16982420</pubmed></ref><ref><pubmed>28472659</pubmed></ref>ことから、これらの分子の存在が中枢シナプス形成にどの程度の意味を持っているのかは、実は明らかではない。ニューレキシンやニューロリギンの他にも、シナプス接着分子はシナプス分化の誘発能を持つものやニューレキシンに結合するものも含めて多数報告されてきており<ref><pubmed>29100073</pubmed></ref>、冗長性、補完性の高い相互作用システムの一部分である可能性が高い（[[シナプス接着因子]]の項参考）。また、同様な証拠から、シナプスオーガナイザーとして知られているFGFファミリーやWntファミリーといった分泌性の因子なども、この冗長な分子ネットワークの一部であると考えられる<ref><pubmed>20646052</pubmed></ref><ref><pubmed>24105999</pubmed></ref><ref><pubmed>29166241</pubmed></ref>。センチュウやショウジョウバエでは、変異体スクリーニングなどから、シナプス形成に関わるとされる遺伝子が多く同定されている<ref><pubmed>31037336</pubmed></ref><ref><pubmed>30986749</pubmed></ref><ref><pubmed>32741370</pubmed></ref>。このことからも、哺乳類の中枢シナプスに関わる分子機構も実際には更に複雑であることが予想される。<br />
<br />
中枢神経系の神経細胞の周りには、シナプス部位を囲むようにペリニューロナルネット（perineuronal nets）と呼ばれるプロテオグリカンやヒアルロナンなどを構成要素とする細胞外マトリックスが存在しており、臨界期などでのシナプス形成の制御にも関わっていると考えられている<ref><pubmed>27911749</pubmed></ref><ref><pubmed>31263252</pubmed></ref>。<br />
<br />
==シナプス形成におけるグリア細胞の役割==<br />
これまでシナプス前部とシナプス後部の接点のみに焦点を当ててきたが、シナプス形成には第3の細胞要素であるグリア細胞も関与している<ref><pubmed>30309945</pubmed></ref><ref><pubmed>30347385</pubmed></ref>。シュワン細胞は神経筋接合部のグリア細胞であり、[[アストロサイト]]は中枢シナプスのグリア細胞である。シュワン細胞がシナプス形成や維持に与える影響については、シュワン細胞を除去した動物での神経筋接合部の異常から考察されている<ref><pubmed>27656017</pubmed></ref>。<br />
<br />
グリア細胞の細胞表面にある分子と外部に分泌される分子の両方がシナプス形成に必要である。巨大な細胞外マトリックス分子であるトロンボスポンジン(thrombospondin) <ref><pubmed>15707899</pubmed></ref>、脂質であるコレステロール<ref><pubmed>12648780</pubmed></ref>、ヘビン（hevin) <ref><pubmed>21788491</pubmed></ref>などである。アストロサイトから分泌されるヘビンは、通常は相互作用しない細胞接着分子であるニューレキシンとニューロリギンの一部のアイソフォームを架橋することにより、シナプス形成を促進する<ref><pubmed>26771491</pubmed></ref>。アストロサイト上のグリピカン（glypican)は、シナプス前終末からAMPAレセプタークラスタリング因子ペントラキシン1(pentraxin1)の放出を誘発する<ref><pubmed>29024665</pubmed></ref><ref><pubmed>27986928</pubmed></ref>。また、シナプス形成に拮抗するSPARCなどのシナプスの負の調節因子も知られている<ref><pubmed>21788491</pubmed></ref>。また[[ミクログリア]]は、シナプス刈り込みに関与することで、神経回路の再編に関与する<ref><pubmed>31283900</pubmed></ref>。 <br />
== 関連項目 ==<br />
*[[標的認識]]<br />
*[[成長円錐]]<br />
*[[神経筋接合部]]<br />
*[[シナプス刈り込み]]<br />
*[[シナプス接着因子]]<br />
*[[細胞外マトリックス]]<br />
*[[基底膜]]<br />
*[[シナプス前終末]]<br />
*[[シナプス後肥厚]]<br />
== 参考文献 ==<br />
<references /></div>
Masahitoyamagata
https://bsd.neuroinf.jp/w/index.php?title=%E3%82%B7%E3%83%8A%E3%83%97%E3%82%B9%E5%BD%A2%E6%88%90&diff=44923
シナプス形成
2020-10-21T23:16:17Z
<p>Masahitoyamagata: </p>
<hr />
<div><div align="right"> <br />
<font size="+1">[http://researchmap.jp/yamagatm 山形方人]</font><br><br />
''Harvard University''<br><br />
DOI：<selfdoi /> 原稿受付日：年月日 原稿完成日：年月日<br><br />
担当編集委員：<br><br />
</div><br />
<br />
英：synapse formation, synaptogenesis<br />
{{box|text=<br />
神経細胞とその相手の細胞（神経細胞、筋肉など）は、シナプスという特殊化した細胞接着構造で結合している。シナプス形成とは、神経回路形成において、機能するシナプスができあがるまでの過程である。化学シナプスの形成には、シナプス前部（通常は軸索）が、シナプス後部（神経細胞の樹状突起、筋肉など）となる標的細胞の適切な細胞上の適切な位置に結合すること（シナプス特異性）と、シナプス前部と後部がシナプス間隙を介して同じ場所に配向して、シナプス前部にシナプス小胞や分泌装置の蓄積、シナプス後部に神経伝達物質受容体の集合やシナプス重厚部が生じるということ（シナプス分化）がある。シナプス形成は、シナプス前部とシナプス後部の間の相互作用によって制御されており、このような細胞間相互作用を担うシナプス接着分子、細胞外マトリックス分子、更に分泌性因子が同定されている。また、グリア細胞など神経細胞以外のプレーヤーの関与も重要である。神経系の発達期や臨界期においては、化学シナプス形成は過剰に行われ、神経活動などの影響により、シナプス刈り込みにより再編成される。また、発達中のシナプス形成とも共通する成熟した神経系でのシナプス新生や構造変化は、学習と記憶にも重要な役割をし、シナプス形成の異常は、自閉症、精神疾患、認知症などの原因になると考えられている。}}<br />
<br />
==はじめに==<br />
神経細胞は、[[シナプス]]で適切に結合、情報伝達し、情報処理ユニットとして機能している。シナプス形成は、神経細胞の間で適切な場所で生じるシナプスの構造構築から機能発現までの過程であるが、正常の発生だけでなく、再生や可塑性でも見られ、正常発生でのシナプス形成と基本的には共通するものであると考えられる。しかし、シナプス形成といった場合、発生における化学シナプスの構造構築について議論されることが多いので、本項目もそれを中心に扱う。また、化学シナプスの形成とは本質的に構造の異なる[[電気シナプス]]（ギャップジャンクション）の形成については、化学シナプス形成との関係性もあると考えられる<ref><pubmed>23237660</pubmed></ref><ref><pubmed>28170151 </pubmed></ref><ref><pubmed>32883654</pubmed></ref>が、本項目では扱わない。<br />
<br />
==シナプス形成の３ステップについての概観==<br />
===ステップ1：シナプス特異性===<br />
軸索は[[軸索ガイダンス]]により、標的細胞近辺に到達する。軸索は特定の標的細胞と特異的にシナプス結合することで、情報を処理できる機能的回路を作る（celluar specificity）。また、シナプスはシナプス後細胞上の特定の部位に形成される（subcellular specificity）<ref><pubmed>19575668</pubmed></ref><ref><pubmed>26656254</pubmed></ref>。この初期のステップについては、「[[標的認識]]」の項を参考にされたい。神経伝達物質や標的細胞が持つ受容体などのシナプスの神経化学的形質は、遺伝子にプログラムされて発生していく神経系の細胞に内在的なものと大方考えられているが、シナプス形成後の誘導により変換するケースもあるかもしれない<ref><pubmed>10202548</pubmed></ref>。<br />
<br />
===ステップ2：シナプス分化===<br />
次に、標的細胞と接触する軸索の一部分は[[シナプス小胞]]や[[アクティブゾーン]]を伴う[[シナプス前終末]]へと分化し（presynaptic differentiation）、軸索と接触した標的細胞では局所的に[[神経伝達物質受容体]]や細胞内足場が集積しシナプス後部へと分化する（postsynaptic differentiation）。シナプス前部とシナプス後部の特殊化は、軸索と標的細胞の間の相互作用で制御される。この細胞間相互作用についての多くの原理的知見は、運動神経細胞からの軸索が骨格筋線維上で作る巨大で単純なシナプスである[[神経筋接合部]]（neuromuscular junction, NMJ)についての20世紀に行われた研究から得られてきた<ref><pubmed>10202544</pubmed></ref>。21世紀になって、小さく多様な中枢神経系でのシナプス形成や無脊椎動物モデル動物のシナプス形成についての分子的な理解が進んでいる<ref><pubmed>30359597</pubmed></ref>。本項目では、特にこのステップについて、原理的な観点から概説する。<br />
<br />
===ステップ3：シナプス再編成===<br />
シナプス形成後は、シナプスの成熟や神経回路の再編成が観察される。発達期においては、シナプス形成は過剰に行われ、神経活動などの影響により過剰なシナプスは除去さ<ref><pubmed>10719884</pubmed></ref><ref><pubmed>26436703</pubmed></ref><ref><pubmed>29716431</pubmed></ref><ref><pubmed>31372212</pubmed></ref>。シナプスの除去（synapse elimination）は、[[神経細胞死]]と同様に、神経回路を再編する重要な過程であるが、これについては「[[シナプス刈り込み]]」の項を参考されたい。シナプス形成は、個体発生の過程だけでなく、成体におけるシナプスの新生や構造変化は、学習と記憶にも重要な役割をし、シナプス形成の異常は、[[自閉症]]、[[精神疾患]]、[[認知症]]などの原因になると考えられている<ref><pubmed>22258914</pubmed></ref><ref><pubmed>22540979</pubmed></ref>。。<br />
<br />
==神経筋接合部におけるシナプス形成==<br />
脊髄動物の神経筋接合部は、脊髄にある運動神経細胞から伸長した軸索終末（シナプス前終末）、筋線維、[[シュワン細胞]]の３つの細胞要素からなり、それぞれ神経筋接合部で特徴的に分化している（図1A)。シナプス形成は、運動神経の軸索が、軸索ガイダンスを経て、発生中の筋線維に接近して開始される。[[成長円錐]]が神経終末に変化し始めると、神経終末と反対側の筋表面の一部が特殊化し始める。発生が進むと、[[シナプス間隙]]（synaptic cleft）を介したシナプス前部とシナプス後部の構造的な特徴が明確になり、最終的に筋線維表面のわずか1000分の1の面積を占める成熟した神経筋接合部となる（図１A）。このように、シナプス前部は、シナプス後部と同じ場所で配向し、シナプス前部では、シナプス小胞、アクティブゾーンなど神経伝達物質（アセチルコリン）の分泌装置や[[電位依存性カルシウムチャネル]]などが集積する。一方、シナプス後部では、効率的なシナプス伝達のために、神経伝達物質受容体（アセチルコリンレセプター）とシグナル伝達装置や足場構造が集合する<ref><pubmed>10202544</pubmed></ref><ref><pubmed>25493308</pubmed></ref><ref><pubmed>29415504</pubmed></ref><ref><pubmed>29195055</pubmed></ref>。<br />
[[ファイル:Fig1-SF.jpg|サムネイル|250px|'''図1 神経筋接合部と中枢シナプスのシナプス形成<br />
A. 脊椎動物の神経筋接合部。運動神経細胞から伸長した軸索末端が多核の筋線維に接触することで、情報交換が始まる。シナプス前部ではシナプス小胞が集積し、シナプス後部では神経伝達物質受容体であるニコチン性アセチルコリンレセプターが集まり始める。成熟した神経筋接合部ではシナプス前部にはシナプス小胞、アクティブゾーンが形成される。シナプス間隙には、シナプス領域で特化したシナプス基底膜が存在し、そこには、アセチルコリンエステラーゼに加え、アグリンやβ2ラミニンなどのシナプスオーガナイザー活性を持つ分子も局在する。シナプス後部には、アセチルコリンレセプターが集積し、Rapsynなどの足場分子やMuSK, Lrp4などのシグナル分子も集まる。シナプスの直下では、核も特殊化しており、アセチルコリンレセプター遺伝子を強く発現している（本文参考）。Sanes & Lichtman (1999) <ref><pubmed>10202544</pubmed></ref>などを参考にした。<br />
B. 中枢シナプス形成。Vaughn (1989) <ref><pubmed>2655146</pubmed></ref>の形態学的モデルをもとに、神経筋接合部のシナプス形成と対比させた。ここでも、シナプス前部と後部の情報交換により、シナプス分化が開始される。中枢シナプスのシナプス間隙には神経筋接合部とは異なり、基底膜は存在せず、前部と後部の直接的な接着が相互作用の中心であり、シナプス小胞や神経伝達物質受容体が、前部と後部にそれぞれ集積する。興奮性シナプスでは顕著なシナプス後肥厚が形成される。]]<br />
<br />
===シナプスオーガナイザー===<br />
運動神経細胞と筋線維は、それぞれ独立してシナプス前部とシナプス後部に対応するシナプス構成要素を合成し、自立的に集合させることが可能である。つまり、運動軸索では、筋線維がない状態でもシナプス小胞が見られ、軸索中に保持することができる。一方、筋線維は神経伝達物質受容体であるアセチルコリンレセプターを合成し、神経がない状態でも、細胞表面上に多数のアセチルコリンレセプターからなる巨大集合構造を作ることができる（クラスタリング, clustering）。したがって、シナプス形成を制御する細胞間相互作用は、シナプス小胞の形成や受容体クラスタリングそのものの誘発因子というより、むしろそれらの位置を決め配向させる指令因子（オーガナイザー, organizer）としての役割が大きい。また、軸索中のシナプス小胞の集積は、ポリリジン被覆ビーズなどとの接触でも容易に引き起こされることから、オーガナイザーとしての役割もAll or nothingといった絶対的なものではなく促進的なものである<ref><pubmed>7127105</pubmed></ref>。しかし、以下に記述するように、シナプス後部やシナプス前部の分化が、それぞれの接触によって誘発、促進される可能性があることを示す証拠もある。これらの証拠のいくつかは、神経筋接合部の再生を利用することで得られた。<br />
<br />
===シナプス後部の分化===<br />
シナプス後部の分化に積極的に関わる分子として想定されたのがアグリン（agrin）である<ref><pubmed>1966767</pubmed></ref>。シナプス前部筋線維は、[[細胞外マトリックス]]である[[基底膜]]（basement membrane, basal lamina）に包まれている。基底膜の成分は、通常、IV型コラーゲン、ヘパラン硫酸プロテオグリカン（パールカンperlecan）、[[ラミニン]]（laminin）などであるが<ref><pubmed>12556454</pubmed></ref>、神経筋接合部の基底膜（シナプス基底膜 synaptic basement membrane）には、シナプス形成に関わる重要な因子であるヘパラン硫酸プロテオグリカンのアグリン（agrin）が存在する。損傷した筋組織の基底膜を再生する筋肉に接触させると、シナプス後部の特徴を誘導することができる。つまり、基底膜にはアセチルコリンレセプターのクラスタリングに関わる因子が存在することが想定されアグリンは生化学的に精製された（図２A）。オールターナティブスプライシングによる特殊エクソン由来配列を含むために、強力な受容体クラスタリング能を持つアグリンは運動神経細胞側で発現し、運動神経を通じて末梢に運搬され、神経筋接合部の基底膜に保持される。アグリン欠損マウスでは、神経筋接合部が乱れており、神経筋接合部におけるアセチルコリンレセプタークラスターの数、大きさ、密度が減少している<ref><pubmed>8653788</pubmed></ref>。 このことから、アグリンはシナプス後部の分化に関わる神経由来の因子であると考えられる。アグリンは、筋特異的チロシンキナーゼ（MuSK）やLRP4を含むいくつかの受容体に結合して、アダプタータンパク質（Dok7）や細胞骨格タンパク質（Rapsyn）とともに、アセチルコリンレセプターのクラスタリングにつながる一連の情報伝達系に影響を与える<ref><pubmed>20215342</pubmed></ref><ref><pubmed>29415504</pubmed></ref><ref><pubmed>8653786</pubmed></ref><ref><pubmed>8653787</pubmed></ref><ref><pubmed>16794080</pubmed></ref><ref><pubmed>7675108</pubmed></ref>。<br />
[[ファイル:Fig2-SF.jpg|サムネイル|250px|'''図２ シナプスオーガナイザー<br />
A. 培養化の筋線維に、アグリンを加えると、アセチルコリンレセプターがクラスタリングする。アグリン欠損マウスでは、神経筋接合部におけるアセチルコリンレセプタークラスターの数、大きさ、密度が減少する<ref><pubmed>8653788</pubmed></ref>。<br />
B. 培養細胞(293細胞など）に、ニューロリギン（通常、シナプス後部の神経細胞で発現）を強制発現させ、その上で神経細胞を培養し神経突起を伸長させると、シナプス小胞の蓄積が観察される<ref><pubmed>10892652</pubmed></ref>。また、ニューレキシン（通常、シナプス前部の神経細胞で発現）を強制発現させると、その上では神経突起にシナプス後肥厚やある種の神経伝達物質受容体が集積する<ref><pubmed>15620359</pubmed></ref>。これらの活性から、これらの分子がシナプス前部や後部の分化と配向に関わるシナプスオーガナイザーであると推定された。]]<br />
<br />
===シナプス前部の分化===<br />
シナプス前部の分化に関わる分子として同定されたものには、神経筋接合部特異的ラミニンのアイソフォームがある。再生神経の軸索が筋線維に到達すると、基底膜に最初に接触する。この際、筋線維を死滅させ、基底膜を抜け殻のように残したままでも、再生神経は正確に元の神経筋接合部の基底膜上でシナプス前部の分化を起こした<ref><pubmed>307554</pubmed></ref>。つまり、神経筋接合部のシナプス基底膜には、シナプス前部の分化を指示する因子があると想定され、その後、そのような分子が同定されている。最もよく研究されているのは、細胞外マトリックス分子ラミニンのアイソフォームである。ラミニンはすべての基底膜の構成分子であり、ラミニンは、α鎖、β鎖、γ鎖のヘテロ3量体であり、少なくとも5本のα鎖、4本のβ鎖、3本のγ鎖のファミリーからなっている。筋線維は複数のラミニンアイソフォームを合成し基底膜に取り込む。シナプス外の通常の筋基底膜にはβ1鎖を含むラミニンが存在するが、神経筋接合部のシナプス間隙の基底膜にはβ2鎖を持つアイソフォームが見られる<ref><pubmed>2922051</pubmed></ref>。in vitroでは、β2ラミニンに運動神経の軸索が接触すると伸長を停止し、シナプス小胞を蓄積し、神経伝達物質を放出するようになる。β2ラミニンを欠く変異マウスでは、シナプス前終末およびシュワン細胞の発達に異常が生じる<ref><pubmed>7885444</pubmed></ref>。<br />
<br />
===シナプス核===<br />
中枢シナプスと違う神経筋接合部の際立った特徴は、筋線維は多数の細胞が融合した[[多核細胞]]（syncytial muscle; multinucleated muscle）となっており、神経筋接合部の直下にはシナプス核（synaptic nucleus)と呼ばれる特化した細胞核が存在することである<ref><pubmed>11498047</pubmed></ref>（図1A）。シナプス核ではアセチルコリンレセプター遺伝子の転写が強く、シナプスから離れた核では転写が低く、アセチルコリンレセプターmRNAを局在化させ、神経筋接合部の近辺でアセチルコリンレセプターが集まる要因にもなっている。これは、神経が、アセチルコリンを使って、アセチルコリンレセプター遺伝子のシナプス外での発現を抑制すると同時に、軸索から放出されるニューレギュリン（neuregulin, ARIA = Acetylcholine Receptor Inducing Activityとも呼ばれた）が、アセチルコリンレセプター遺伝子の転写活性化につながるシグナリング分子となっている<ref><pubmed>9056721</pubmed></ref>。また、発生途中では、アセチルコリンレセプターの組成も変化する。幼若期に特有なδサブユニット遺伝子からε遺伝子への発現の変換がおこる<ref><pubmed>2423878</pubmed></ref>。生体で見られる発生初期のアセチルコリンレセプターのクラスターは単純なプラーク型であるが、最終的には複雑なプレッツェル型になり、神経筋接合部のひだも形成され、シナプス前終末もそれに対応して成熟する<ref><pubmed>15034266</pubmed></ref>。<br />
<br />
==中枢神経系のシナプス形成==<br />
中枢神経系のシナプスの形成も神経筋接合部のシナプス形成と類似した点が多い。シナプス前部とシナプス後部の間の相互作用は、予め合成されたシナプス構成要素の位置を制御し合うことで、お互いの分化を制御しシナプスを形成する<ref><pubmed>2655146</pubmed></ref><ref><pubmed>14556707</pubmed></ref><ref><pubmed>17417940</pubmed></ref><ref><pubmed>27462810</pubmed></ref><ref><pubmed>29096080</pubmed></ref><ref><pubmed>30359597</pubmed></ref>。中枢シナプスでも、神経筋接合部と同じように、神経伝達物質の受容体がシナプス後膜に集中しているし<ref><pubmed>22046028</pubmed></ref>、シナプス前部におけるシナプス小胞の分子的な成り立ちや蓄積も基本的に同じであるように見える<ref><pubmed>22794257</pubmed></ref>（図1B）。しかし、中枢シナプスの後部は、神経伝達物質受容体の分子種も異なり、その足場となる分子種も神経筋接合部とは大きく異なっている。特に、神経筋接合部では基底膜という細胞外マトリックスであったシナプス間隙（約50nm）の様相は中枢シナプスでは全く異なり、典型的な細胞外マトリックスは存在しない。中枢シナプスでは、約20nmのシナプス間隙で直接接触するシナプス前膜とシナプス後膜の間に存在する細胞間接着がその相互作用の中心であると考えられている<ref><pubmed>14519398</pubmed></ref><ref><pubmed>22278667</pubmed></ref><ref><pubmed>20832286</pubmed></ref><ref><pubmed>30359597</pubmed></ref><ref><pubmed>32359437</pubmed></ref>（図１B)。<br />
<br />
===中枢シナプス形成のオーガナイザー===<br />
シナプス前部とシナプス後部をつなぐ細胞接着分子は多数ある（[[シナプス接着因子]]の項参考）。それらを代表するものの1つは、シナプス後部の膜に存在するタンパク質であるニューロリギン（neuroligin）である。それに対応するシナプス前膜上の主要なリガンドはニューレキシン（neurexin）である。細胞表面のニューロリギンが、軸索上にシナプス小胞を集積させる能力は、ニューロリギンを強制発現する非神経細胞の上で、神経細胞を培養するin vitroアッセイ系を用いることによって初めて明らかになった<ref><pubmed>10892652</pubmed></ref>（図2B)。しかし、in vitroアッセイ系で見られるニューロリギンなどのシナプス接着分子の作用には、非神経細胞上にデフォールトで発現しているカドヘリンのような別の接着分子の存在が前提になるようである<ref><pubmed>29760652</pubmed></ref>。また、RIM、RIM-BP、liprin、Munc13、ELKSを含むいくつかのタンパク質ファミリーが、シナプス前部の重要な足場分子として同定されており<ref><pubmed>22794257</pubmed></ref>、シナプス前部表面のLAR-RPTPs（受容体型膜貫通チロシンホスファターゼ）を通じてアクティブゾーンを形成に預かる<ref><pubmed>23916315</pubmed></ref>。<br />
<br />
一方、シナプス後部の樹状突起内の一部の神経伝達物質受容体や足場分子は、ニューロリギンのリガンドであるニューレキシンを発現させた非神経細胞と接触する部位で凝集する<ref><pubmed>15620359</pubmed></ref>（図2B）。このような神経伝達物質受容体とそのシグナル伝達タンパク質の一部は、アクチン細胞骨格との直接的および間接的な相互作用を介して固定されている。特に、興奮性シナプスで顕著な[[シナプス後肥厚]]（postsynaptic density)においては、複数のPDZドメインを持った[[PSD95]]などの細胞内タンパク質が、PDZドメイン結合モチーフを持つニューロリギンなどの膜貫通型接着分子、神経伝達物質受容体、イオンチャネルと複数結合することで、シナプス後部の構成要素をつなぐ足場分子として機能し、ShankやHomerなどの他の足場分子とともに、シナプス構造の構築に関与すると考えられる<ref><pubmed>22046028</pubmed></ref><ref><pubmed>28577431</pubmed></ref><ref><pubmed>28179641</pubmed></ref>。一方、抑制性シナプスのシナプス後部では、ゲフィリン（gephyrin）が重要な足場分子として機能する<ref><pubmed>24552784</pubmed></ref><ref><pubmed>28460365</pubmed></ref>。<br />
<br />
4種類あるニューロリギンのうち、ニューロリギン1はグルタミン酸作動性シナプス、ニューロリギン2はGABA作動性シナプス、ニューロリギン3はグルタミン酸とGABA作動性シナプスの両者、そしてニューロリギン4はグリシン作動性シナプスに局在している<ref><pubmed>26209464</pubmed></ref><ref><pubmed>15540461</pubmed></ref><ref><pubmed>17897391</pubmed></ref><ref><pubmed>21282647</pubmed></ref>。培養系の実験では、ニューロリギン1,3,4はグルタミン酸レセプターのクラスタリングを引き起こすが、ニューロリギン２はグルタミン酸レセプターとGABAAレセプターのクラスタリングを引き起こす<ref><pubmed>15620359</pubmed></ref>。<br />
<br />
しかしながら、ニューレキシンやニューロリギンの遺伝子欠失動物では、予想に反して、シナプスの大きさや数にほとんど影響が見られない<ref><pubmed>12827191</pubmed></ref><ref><pubmed>16982420</pubmed></ref><ref><pubmed>28472659</pubmed></ref>ことから、これらの分子の存在が中枢シナプス形成にどの程度の意味を持っているのかは、実は明らかではない。ニューレキシンやニューロリギンの他にも、シナプス接着分子はシナプス分化の誘発能を持つものやニューレキシンに結合するものも含めて多数報告されてきており<ref><pubmed>29100073</pubmed></ref>、冗長性、補完性の高い相互作用システムの一部分である可能性が高い（[[シナプス接着因子]]の項参考）。また、同様な証拠から、シナプスオーガナイザーとして知られているFGFファミリーやWntファミリーといった分泌性の因子なども、この冗長な分子ネットワークの一部であると考えられる<ref><pubmed>20646052</pubmed></ref><ref><pubmed>24105999</pubmed></ref><ref><pubmed>29166241</pubmed></ref>。センチュウやショウジョウバエでは、変異体スクリーニングなどから、シナプス形成に関わるとされる遺伝子が多く同定されている<ref><pubmed>31037336</pubmed></ref><ref><pubmed>30986749</pubmed></ref><ref><pubmed>32741370</pubmed></ref>。このことからも、哺乳類の中枢シナプスに関わる分子機構も実際には更に複雑であることが予想される。<br />
<br />
中枢神経系の神経細胞の周りには、シナプス部位を囲むようにペリニューロナルネット（perineuronal nets）と呼ばれるプロテオグリカンやヒアルロナンなどを構成要素とする細胞外マトリックスが存在しており、臨界期などでのシナプス形成の制御にも関わっていると考えられている<ref><pubmed>27911749</pubmed></ref><ref><pubmed>31263252</pubmed></ref>。<br />
<br />
==シナプス形成におけるグリア細胞の役割==<br />
これまでシナプス前部とシナプス後部の接点のみに焦点を当ててきたが、シナプス形成には第3の細胞要素であるグリア細胞も関与している<ref><pubmed>30309945</pubmed></ref><ref><pubmed>30347385</pubmed></ref>。シュワン細胞は神経筋接合部のグリア細胞であり、[[アストロサイト]]は中枢シナプスのグリア細胞である。シュワン細胞がシナプス形成や維持に与える影響については、シュワン細胞を除去した動物での神経筋接合部の異常から考察されている<ref><pubmed>27656017</pubmed></ref>。<br />
<br />
グリア細胞の細胞表面にある分子と外部に分泌される分子の両方がシナプス形成に必要である。巨大な細胞外マトリックス分子であるトロンボスポンジン(thrombospondin) <ref><pubmed>15707899</pubmed></ref>、脂質であるコレステロール<ref><pubmed>12648780</pubmed></ref>、ヘビン（hevin) <ref><pubmed>21788491</pubmed></ref>などである。アストロサイトから分泌されるヘビンは、通常は相互作用しない細胞接着分子であるニューレキシンとニューロリギンの一部のアイソフォームを架橋することにより、シナプス形成を促進する<ref><pubmed>26771491</pubmed></ref>。アストロサイト上のグリピカン（glypican)は、シナプス前終末からAMPAレセプタークラスタリング因子ペントラキシン1(pentraxin1)の放出を誘発する<ref><pubmed>29024665</pubmed></ref><ref><pubmed>27986928</pubmed></ref>。また、シナプス形成に拮抗するSPARCなどのシナプスの負の調節因子も知られている<ref><pubmed>21788491</pubmed></ref>。また[[ミクログリア]]は、シナプス刈り込みに関与することで、神経回路の再編に関与する<ref><pubmed>31283900</pubmed></ref>。 <br />
== 関連項目 ==<br />
*[[標的認識]]<br />
*[[成長円錐]]<br />
*[[神経筋接合部]]<br />
*[[シナプス刈り込み]]<br />
*[[シナプス接着因子]]<br />
*[[細胞外マトリックス]]<br />
*[[基底膜]]<br />
*[[シナプス前終末]]<br />
*[[シナプス後肥厚]]<br />
== 参考文献 ==<br />
<references /></div>
Masahitoyamagata
https://bsd.neuroinf.jp/w/index.php?title=%E3%82%B7%E3%83%8A%E3%83%97%E3%82%B9%E5%BD%A2%E6%88%90&diff=44922
シナプス形成
2020-10-21T23:00:36Z
<p>Masahitoyamagata: </p>
<hr />
<div><div align="right"> <br />
<font size="+1">[http://researchmap.jp/yamagatm 山形方人]</font><br><br />
''Harvard University''<br><br />
DOI：<selfdoi /> 原稿受付日：年月日 原稿完成日：年月日<br><br />
担当編集委員：<br><br />
</div><br />
<br />
英：synapse formation, synaptogenesis<br />
{{box|text=<br />
神経細胞とその相手の細胞（神経細胞、筋肉など）は、シナプスという特殊化した細胞接着構造で結合している。シナプス形成とは、神経回路形成において、機能するシナプスができあがるまでの過程である。化学シナプスの形成には、シナプス前部（通常は軸索）が、シナプス後部（神経細胞の樹状突起、筋肉など）となる標的細胞の適切な細胞上の適切な位置に結合すること（シナプス特異性）と、シナプス前部と後部がシナプス間隙を介して同じ場所に配向して、シナプス前部にシナプス小胞や分泌装置の蓄積、シナプス後部に神経伝達物質受容体の集合やシナプス重厚部が生じるということ（シナプス分化）がある。シナプス形成は、シナプス前部とシナプス後部の間の相互作用によって制御されており、このような細胞間相互作用を担うシナプス接着分子、細胞外マトリックス分子、更に分泌性因子が同定されている。また、グリア細胞など神経細胞以外のプレーヤーの関与も重要である。神経系の発達期や臨界期においては、化学シナプス形成は過剰に行われ、神経活動などの影響により、シナプス刈り込みにより再編成される。また、発達中のシナプス形成とも共通する成熟した神経系でのシナプス新生や構造変化は、学習と記憶にも重要な役割をし、シナプス形成の異常は、自閉症、精神疾患、認知症などの原因になると考えられている。}}<br />
<br />
==はじめに==<br />
神経細胞は、[[シナプス]]で適切に結合、情報伝達し、情報処理ユニットとして機能している。シナプス形成は、神経細胞の間で適切な場所で生じるシナプスの構造構築から機能発現までの過程であるが、正常の発生だけでなく、再生や可塑性でも見られ、正常発生でのシナプス形成と基本的には共通するものであると考えられる。しかし、シナプス形成といった場合、発生における化学シナプスの構造構築について議論されることが多いので、本項目もそれを中心に扱う。また、化学シナプスの形成とは本質的に構造の異なる[[電気シナプス]]（ギャップジャンクション）の形成については、化学シナプス形成との関係性もあると考えられる<ref><pubmed>23237660</pubmed></ref><ref><pubmed>28170151 </pubmed></ref><ref><pubmed>32883654</pubmed></ref>が、本項目では扱わない。<br />
<br />
==シナプス形成の３ステップについての概観==<br />
===ステップ1：シナプス特異性===<br />
軸索は[[軸索ガイダンス]]により、標的細胞近辺に到達する。軸索は特定の標的細胞と特異的にシナプス結合することで、情報を処理できる機能的回路を作る（celluar specificity）。また、シナプスはシナプス後細胞上の特定の部位に形成される（subcellular specificity）<ref><pubmed>19575668</pubmed></ref><ref><pubmed>26656254</pubmed></ref>。この初期のステップについては、「[[標的認識]]」の項を参考にされたい。神経伝達物質や標的細胞が持つ受容体などのシナプスの神経化学的形質は、遺伝子にプログラムされて発生していく神経系の細胞に内在的なものと大方考えられているが、シナプス形成後の誘導により変換するケースもあるかもしれない<ref><pubmed>10202548</pubmed></ref>。<br />
<br />
===ステップ2：シナプス分化===<br />
次に、標的細胞と接触する軸索の一部分はシナプス小胞やアクティブゾーンを伴う[[シナプス前終末]]へと分化し（presynaptic differentiation）、軸索と接触した標的細胞では局所的に[[神経伝達物質受容体]]や細胞内足場が集積しシナプス後部へと分化する（postsynaptic differentiation）。シナプス前部とシナプス後部の特殊化は、軸索と標的細胞の間の相互作用で制御される。この細胞間相互作用についての多くの原理的知見は、運動神経細胞からの軸索が骨格筋線維上で作る巨大で単純なシナプスである[[神経筋接合部]]（neuromuscular junction, NMJ)についての20世紀に行われた研究から得られてきた<ref><pubmed>10202544</pubmed></ref>。21世紀になって、小さく多様な中枢神経系でのシナプス形成や無脊椎動物モデル動物のシナプス形成についての分子的な理解が進んでいる<ref><pubmed>30359597</pubmed></ref>。本項目では、特にこのステップについて、原理的な観点から概観する。<br />
<br />
===ステップ3：シナプス再編成===<br />
シナプス形成後は、シナプスの成熟や神経回路の再編成が観察される。発達期においては、シナプス形成は過剰に行われ、神経活動などの影響により過剰なシナプスは除去さ<ref><pubmed>10719884</pubmed></ref><ref><pubmed>26436703</pubmed></ref><ref><pubmed>29716431</pubmed></ref><ref><pubmed>31372212</pubmed></ref>。シナプスの除去（synapse elimination）は、[[神経細胞死]]と同様に、神経回路を再編する重要な過程であるが、これについては「[[シナプス刈り込み]]」の項を参考されたい。シナプス形成は、個体発生の過程だけでなく、成体におけるシナプスの新生や構造変化は、学習と記憶にも重要な役割をし、シナプス形成の異常は、[[自閉症]]、[[精神疾患]]、[[認知症]]などの原因になると考えられている<ref><pubmed>22258914</pubmed></ref><ref><pubmed>22540979</pubmed></ref>。。<br />
<br />
==神経筋接合部におけるシナプス形成==<br />
脊髄動物の神経筋接合部は、脊髄にある運動神経細胞から伸長した軸索終末、筋線維、[[シュワン細胞]]の３つの細胞要素からなり、それぞれ神経筋接合部で特徴的に分化している（図1A)。シナプス形成は、運動神経の軸索が、軸索ガイダンスを経て、発生中の筋線維に接近して開始される。[[成長円錐]]が神経終末に変化し始めると、神経終末と反対側の筋表面の一部が特殊化し始める。発生が進むと、[[シナプス間隙]]（synaptic cleft）を介したシナプス前部とシナプス後部の構造的な特徴が明確になり、最終的に筋線維表面の1000分の1の面積を占める成熟した神経筋接合部となる（図１A）。このように、シナプス前部は、シナプス後部と同じ場所で配向し、シナプス前部では、シナプス小胞、アクティブゾーンなど神経伝達物質（アセチルコリン）の分泌装置や電位依存性カルシウムチャネルなどが集積する。一方、シナプス後部では、効率的なシナプス伝達のために、神経伝達物質受容体（アセチルコリンレセプター）とシグナル伝達装置や足場構造が集合する<ref><pubmed>10202544</pubmed></ref><ref><pubmed>25493308</pubmed></ref><ref><pubmed>29415504</pubmed></ref><ref><pubmed>29195055</pubmed></ref>。<br />
[[ファイル:Fig1-SF.jpg|サムネイル|250px|'''図1 神経筋接合部と中枢シナプスのシナプス形成<br />
A. 脊椎動物の神経筋接合部。運動神経細胞から伸長した軸索末端が多核の筋線維に接触することで、情報交換が始まる。シナプス前部ではシナプス小胞が集積し、シナプス後部では神経伝達物質受容体であるニコチン性アセチルコリンレセプターが集まり始める。成熟した神経筋接合部ではシナプス前部にはシナプス小胞、アクティブゾーンが形成される。シナプス間隙には、シナプス領域で特化したシナプス基底膜が存在し、そこには、アセチルコリンエステラーゼに加え、アグリンやβ2ラミニンなどのシナプスオーガナイザー活性を持つ分子も局在する。シナプス後部には、アセチルコリンレセプターが集積し、Rapsynなどの足場分子やMuSK, Lrp4などのシグナル分子も集まる。シナプス直下では、核も特殊化しており、アセチルコリンレセプター遺伝子を強く発現している（本文参考）。Sanes & Lichtman (1999) <ref><pubmed>10202544</pubmed></ref>などを参考にした。<br />
B. 中枢シナプス形成。Vaughn (1989) <ref><pubmed>2655146</pubmed></ref>の形態学的モデルをもとに、神経筋接合部のシナプス形成と対比させた。ここでも、シナプス前部と後部の情報交換により、シナプス分化が開始される。中枢シナプスのシナプス間隙には神経筋接合部とは異なり、基底膜は存在せず、前部と後部の直接的な接着が相互作用の中心であり、シナプス小胞や神経伝達物質受容体が、前部と後部にそれぞれ集積する。興奮性シナプスでは顕著なシナプス後肥厚が形成される。<br />
]]<br />
<br />
<br />
===シナプスオーガナイザー===<br />
運動神経細胞と筋線維は、それぞれ独立してシナプス前部とシナプス後部に対応するシナプス構成要素を合成し、自立的に集合させることが可能である。つまり、運動軸索では、筋線維がない状態でもシナプス小胞が見られ、軸索中に保持することができる。一方、筋線維は神経伝達物質受容体であるアセチルコリンレセプターを合成し、神経がない状態でも、細胞表面上に多数のアセチルコリンレセプターからなる巨大集合構造を作ることができる（クラスタリング, clustering）。したがって、シナプス形成を制御する細胞間相互作用は、シナプス小胞の形成や受容体クラスタリングそのものの誘発因子というより、むしろそれらの位置を決め配向させる指令因子（オーガナイザー, organizer）としての役割が大きい。また、軸索中のシナプス小胞の集積は、ポリリジン被覆ビーズなどとの接触でも容易に引き起こされることから、オーガナイザーとしての役割もAll or nothingといった絶対的なものではなく促進的なものである<ref><pubmed>7127105</pubmed></ref>。しかし、以下に記述するように、シナプス後部やシナプス前部の分化が、それぞれの接触によって誘発、促進される可能性があることを示す証拠もある。これらの証拠のいくつかは、神経筋接合部の再生を利用することで得られた。<br />
<br />
===シナプス後部の分化===<br />
シナプス後部の分化に積極的に関わる分子として想定されたのがアグリン（agrin）である<ref><pubmed>1966767</pubmed></ref>。シナプス前部筋線維は、[[細胞外マトリックス]]である[[基底膜]]（basement membrane, basal lamina）に包まれている。基底膜の成分は、通常、IV型コラーゲン、ヘパラン硫酸プロテオグリカン（パールカンperlecan）、[[ラミニン]]（laminin）などであるが<ref><pubmed>12556454</pubmed></ref>、神経筋接合部の基底膜（シナプス基底膜 synaptic basement membrane）には、シナプス形成に関わる重要な因子であるヘパラン硫酸プロテオグリカンのアグリン（agrin）が存在する。損傷した筋組織の基底膜を再生する筋肉に接触させると、シナプス後部の特徴を誘導することができる。つまり、基底膜にはアセチルコリンレセプターのクラスタリングに関わる因子が存在することが想定されアグリンは生化学的に精製された（図２A）。オールターナティブスプライシングによる特殊エクソン由来配列を含むために、強力な受容体クラスタリング能を持つアグリンは運動神経細胞側で発現し、運動神経を通じて末梢に運搬され、神経筋接合部の基底膜に保持される。アグリン欠損マウスでは、神経筋接合部が乱れており、神経筋接合部におけるアセチルコリンレセプタークラスターの数、大きさ、密度が減少している<ref><pubmed>8653788</pubmed></ref>。 このことから、アグリンはシナプス後部の分化に関わる神経由来の因子であると考えられる。アグリンは、筋特異的チロシンキナーゼ（MuSK）やLRP4を含むいくつかの受容体に結合して、アダプタータンパク質（Dok7）や細胞骨格タンパク質（Rapsyn）とともに、アセチルコリンレセプターのクラスタリングにつながる一連の情報伝達系に影響を与える<ref><pubmed>20215342</pubmed></ref><ref><pubmed>29415504</pubmed></ref><ref><pubmed>8653786</pubmed></ref><ref><pubmed>8653787</pubmed></ref><ref><pubmed>16794080</pubmed></ref><ref><pubmed>7675108</pubmed></ref>。<br />
[[ファイル:Fig2-SF.jpg|サムネイル|250px|'''図２ シナプスオーガナイザー<br />
A. 培養化の筋線維に、アグリンを加えると、アセチルコリンレセプターがクラスタリングする。アグリン欠損マウスでは、神経筋接合部におけるアセチルコリンレセプタークラスターの数、大きさ、密度が減少する<ref><pubmed>8653788</pubmed></ref>。<br />
B. 培養細胞(293細胞など）に、ニューロリギン（通常、シナプス後部の神経細胞で発現）を強制発現させ、その上で神経細胞を培養し神経突起を伸長させると、シナプス小胞の蓄積が観察される<ref><pubmed>10892652</pubmed></ref>。また、ニューレキシン（通常、シナプス前部の神経細胞で発現）を強制発現させると、その上では神経突起にシナプス後肥厚やある種の神経伝達物質受容体が集積する<ref><pubmed>15620359</pubmed></ref>。これらの活性から、これらの分子がシナプス前部や後部の分化と配向に関わるシナプスオーガナイザーであると推定された。]]<br />
<br />
===シナプス前部の分化===<br />
シナプス前部の分化に関わる分子として同定されたものには、神経筋接合部特異的ラミニンのアイソフォームがある。再生神経の軸索が筋線維に到達すると、基底膜に最初に接触する。この際、筋線維を死滅させ、基底膜をカラのように残したままでも、再生神経は正確に元の神経筋接合部の基底膜上でシナプス前部の分化を起こした<ref><pubmed>307554</pubmed></ref>。つまり、神経筋接合部のシナプス基底膜には、シナプス前部の分化を指示する因子があると想定され、その後、そのような分子が同定されている。最もよく研究されているのは、細胞外マトリックス分子ラミニンのアイソフォームである。ラミニンはすべての基底膜の構成分子であり、ラミニンは、α鎖、β鎖、γ鎖のヘテロ3量体であり、少なくとも5本のα鎖、4本のβ鎖、3本のγ鎖のファミリーからなっている。筋線維は複数のラミニンアイソフォームを合成し基底膜に取り込む。シナプス外の通常の筋基底膜にはβ1鎖を含むラミニンが存在するが、神経筋接合部のシナプス間隙の基底膜にはβ2鎖を持つアイソフォームが見られる<ref><pubmed>2922051</pubmed></ref>。in vitroでは、β2ラミニンに運動神経の軸索が接触すると伸長を停止し、シナプス小胞を蓄積し、神経伝達物質を放出するようになる。β2ラミニンを欠く変異マウスでは、シナプス前終末およびシュワン細胞の発達に異常が生じる<ref><pubmed>7885444</pubmed></ref>。<br />
===シナプス核===<br />
中枢シナプスと違う神経筋接合部の際立った特徴は、筋線維は多数の細胞が融合した[[多核細胞]]（syncytial muscle; multinucleated muscle）となっており、神経筋接合部の直下にはシナプス核（synaptic nucleus)と呼ばれる特化した細胞核が存在することである<ref><pubmed>11498047</pubmed></ref>（図1A）。シナプス核ではアセチルコリンレセプター遺伝子の転写が強く、シナプスから離れた核では転写が低く、アセチルコリンレセプターmRNAを局在化させ、神経筋接合部の近辺でアセチルコリンレセプターが集まる要因にもなっている。これは、神経が、アセチルコリンを使って、アセチルコリンレセプター遺伝子のシナプス外での発現を抑制すると同時に、軸索から放出されるニューレギュリン（neuregulin, ARIA = Acetylcholine Receptor Inducing Activityとも呼ばれた）が、アセチルコリンレセプター遺伝子の転写活性化につながるシグナリング分子となっている<ref><pubmed>9056721</pubmed></ref>。また、発生途中では、アセチルコリンレセプターの組成も変化する。幼若期に特有なδサブユニット遺伝子からε遺伝子への発現の変換がおこる<ref><pubmed>2423878</pubmed></ref>。生体で見られる発生初期のアセチルコリンレセプターのクラスターは単純なプラーク型であるが、最終的には複雑なプレッツェル型になり、神経筋接合部のひだも形成され、シナプス前終末もそれに対応して成熟する<ref><pubmed>15034266</pubmed></ref>。<br />
==中枢神経系のシナプス形成==<br />
中枢神経系のシナプスの形成も神経筋接合部のシナプス形成と類似した点が多い。シナプス前部とシナプス後部の間の相互作用は、予め合成されたシナプス構成要素の位置を制御し合うことで、お互いの分化を制御しシナプスを形成する<ref><pubmed>2655146</pubmed></ref><ref><pubmed>14556707</pubmed></ref><ref><pubmed>17417940</pubmed></ref><ref><pubmed>27462810</pubmed></ref><ref><pubmed>29096080</pubmed></ref><ref><pubmed>30359597</pubmed></ref>。中枢シナプスでも、神経筋接合部と同じように、神経伝達物質の受容体がシナプス後膜に集中しているし<ref><pubmed>22046028</pubmed></ref>、シナプス前部におけるシナプス小胞の分子的な成り立ちや蓄積も基本的に同じであるように見える<ref><pubmed>22794257</pubmed></ref>（図1B）。しかし、中枢シナプスの後部は、神経伝達物質受容体の分子種も異なり、その足場となる分子種も神経筋接合部とは大きく異なっている。特に、神経筋接合部では基底膜という細胞外マトリックスであったシナプス間隙（約50nm）の様相は中枢シナプスでは全く異なり、典型的な細胞外マトリックスは存在しない。中枢シナプスでは、約20nmのシナプス間隙で直接接触するシナプス前膜とシナプス後膜の間に存在する細胞間接着がその相互作用の中心であると考えられている<ref><pubmed>14519398</pubmed></ref><ref><pubmed>22278667</pubmed></ref><ref><pubmed>20832286</pubmed></ref><ref><pubmed>30359597</pubmed></ref><ref><pubmed>32359437</pubmed></ref>（図１B)。<br />
===中枢シナプス形成のオーガナイザー===<br />
シナプス前部とシナプス後部をつなぐ細胞接着分子は多数ある（[[シナプス接着因子]]の項参考）。それらを代表するものの1つは、シナプス後部の膜に存在するタンパク質であるニューロリギン（neuroligin）である。それに対応するシナプス前膜上の主要なリガンドはニューレキシン（neurexin）である。細胞表面のニューロリギンが、軸索上にシナプス小胞を集積させる能力は、ニューロリギンを強制発現する非神経細胞の上で、神経細胞を培養するin vitroアッセイ系を用いることによって初めて明らかになった<ref><pubmed>10892652</pubmed></ref>（図2B)。しかし、in vitroアッセイ系で見られるニューロリギンなどのシナプス接着分子の作用には、非神経細胞上にデフォールトで発現しているカドヘリンのような別の接着分子の存在が前提になるようである<ref><pubmed>29760652</pubmed></ref>。また、RIM、RIM-BP、liprin、Munc13、ELKSを含むいくつかのタンパク質ファミリーが、シナプス前部の重要な足場分子として同定されており<ref><pubmed>22794257</pubmed></ref>、シナプス前部表面のLAR-RPTPs（受容体型膜貫通チロシンホスファターゼ）を通じてアクティブゾーンを形成に預かる<ref><pubmed>23916315</pubmed></ref>。<br />
<br />
一方、シナプス後部の樹状突起内の一部の神経伝達物質受容体や足場分子は、ニューロリギンのリガンドであるニューレキシンを発現させた非神経細胞と接触する部位で凝集する<ref><pubmed>15620359</pubmed></ref>（図2B）。このような神経伝達物質受容体とそのシグナル伝達タンパク質の一部は、アクチン細胞骨格との直接的および間接的な相互作用を介して固定されている。特に、興奮性シナプスで顕著な[[シナプス後肥厚]]（postsynaptic density)においては、複数のPDZドメインを持った[[PSD95]]などの細胞内タンパク質が、PDZドメイン結合モチーフを持つニューロリギンなどの膜貫通型接着分子、神経伝達物質受容体、イオンチャネルと複数結合することで、シナプス後部の構成要素をつなぐ足場分子として機能し、ShankやHomerなどの他の足場分子とともに、シナプス構造の構築に関与すると考えられる<ref><pubmed>22046028</pubmed></ref><ref><pubmed>28577431</pubmed></ref><ref><pubmed>28179641</pubmed></ref>。一方、抑制性シナプスのシナプス後部では、ゲフィリン（gephyrin）が重要な足場分子として機能する<ref><pubmed>24552784</pubmed></ref><ref><pubmed>28460365</pubmed></ref>。<br />
<br />
4種類あるニューロリギンのうち、ニューロリギン1はグルタミン酸作動性シナプス、ニューロリギン2はGABA作動性シナプス、ニューロリギン3はグルタミン酸とGABA作動性シナプスの両者、そしてニューロリギン4はグリシン作動性シナプスに局在している<ref><pubmed>26209464</pubmed></ref><ref><pubmed>15540461</pubmed></ref><ref><pubmed>17897391</pubmed></ref><ref><pubmed>21282647</pubmed></ref>。培養系の実験では、ニューロリギン1,3,4はグルタミン酸レセプターのクラスタリングを引き起こすが、ニューロリギン２はグルタミン酸レセプターとGABAAレセプターのクラスタリングを引き起こす<ref><pubmed>15620359</pubmed></ref>。<br />
<br />
しかしながら、ニューレキシンやニューロリギンの遺伝子欠失動物では、予想に反して、シナプスの大きさや数にほとんど影響が見られない<ref><pubmed>12827191</pubmed></ref><ref><pubmed>16982420</pubmed></ref><ref><pubmed>28472659</pubmed></ref>ことから、これらの分子の存在が中枢シナプス形成にどの程度の意味を持っているのかは、実は明らかではない。ニューレキシンやニューロリギンの他にも、シナプス接着分子はシナプス分化の誘発能を持つものやニューレキシンに結合するものも含めて多数報告されてきており<ref><pubmed>29100073</pubmed></ref>、冗長性、補完性の高い相互作用システムの一部分である可能性が高い（[[シナプス接着因子]]の項参考）。また、同様な証拠から、シナプスオーガナイザーとして知られているFGFファミリーやWntファミリーといった分泌性の因子なども、この冗長な分子ネットワークの一部であると考えられる<ref><pubmed>20646052</pubmed></ref><ref><pubmed>24105999</pubmed></ref><ref><pubmed>29166241</pubmed></ref>。センチュウやショウジョウバエでは、変異体スクリーニングなどから、シナプス形成に関わるとされる遺伝子が多く同定されている<ref><pubmed>31037336</pubmed></ref><ref><pubmed>30986749</pubmed></ref><ref><pubmed>32741370</pubmed></ref>。このことからも、哺乳類の中枢シナプスに関わる分子機構も実際には更に複雑であることが予想される。<br />
<br />
中枢神経系の神経細胞の周りには、シナプス部位を囲むようにペリニューロナルネット（perineuronal nets）と呼ばれるプロテオグリカンやヒアルロナンなどを構成要素とする細胞外マトリックスが存在しており、臨界期などでのシナプス形成の制御にも関わっていると考えられている<ref><pubmed>27911749</pubmed></ref><ref><pubmed>31263252</pubmed></ref>。<br />
<br />
<br />
==シナプス形成におけるグリア細胞の役割==<br />
これまでシナプス前部とシナプス後部の接点のみに焦点を当ててきたが、シナプス形成には第3の細胞要素であるグリア細胞も関与している<ref><pubmed>30309945</pubmed></ref><ref><pubmed>30347385</pubmed></ref>。シュワン細胞は神経筋接合部のグリア細胞であり、[[アストロサイト]]は中枢シナプスのグリア細胞である。シュワン細胞がシナプス形成や維持に与える影響については、シュワン細胞を除去した動物での神経筋接合部の異常から考察されている<ref><pubmed>27656017</pubmed></ref>。<br />
<br />
グリア細胞の細胞表面にある分子と外部に分泌される分子の両方がシナプス形成に必要である。巨大な細胞外マトリックス分子であるトロンボスポンジン(thrombospondin) <ref><pubmed>15707899</pubmed></ref>、脂質であるコレステロール<ref><pubmed>12648780</pubmed></ref>、ヘビン（hevin) <ref><pubmed>21788491</pubmed></ref>などである。アストロサイトから分泌されるヘビンは、通常は相互作用しない細胞接着分子であるニューレキシンとニューロリギンの一部のアイソフォームを架橋することにより、シナプス形成を促進する<ref><pubmed>26771491</pubmed></ref>。アストロサイト上のグリピカン（glypican)は、シナプス前終末からAMPAレセプタークラスタリング因子ペントラキシン1(pentraxin1)の放出を誘発する<ref><pubmed>29024665</pubmed></ref><ref><pubmed>27986928</pubmed></ref>。また、シナプス形成に拮抗するSPARCなどのシナプスの負の調節因子も知られている<ref><pubmed>21788491</pubmed></ref>。またミクログリアは、シナプス刈り込みに関与することで、神経回路の再編に関与する<ref><pubmed>31283900</pubmed></ref>。 <br />
<br />
== 関連項目 ==<br />
*[[標的認識]]<br />
*[[成長円錐]]<br />
*[[神経筋接合部]]<br />
*[[シナプス刈り込み]]<br />
*[[シナプス接着因子]]<br />
*[[細胞外マトリックス]]<br />
*[[基底膜]]<br />
*[[シナプス前終末]]<br />
*[[シナプス後肥厚]]<br />
== 参考文献 ==<br />
<references /></div>
Masahitoyamagata
https://bsd.neuroinf.jp/w/index.php?title=%E3%82%B7%E3%83%8A%E3%83%97%E3%82%B9%E5%BD%A2%E6%88%90&diff=44921
シナプス形成
2020-10-21T22:25:12Z
<p>Masahitoyamagata: </p>
<hr />
<div><div align="right"> <br />
<font size="+1">[http://researchmap.jp/yamagatm 山形方人]</font><br><br />
''Harvard University''<br><br />
DOI：<selfdoi /> 原稿受付日：年月日 原稿完成日：年月日<br><br />
担当編集委員：<br><br />
</div><br />
<br />
英：synapse formation, synaptogenesis<br />
{{box|text=<br />
神経細胞とその相手の細胞（神経細胞、筋肉など）は、シナプスという特殊化した細胞接着構造で結合している。シナプス形成とは、神経回路形成において、機能するシナプスができあがるまでの過程である。化学シナプスの形成には、シナプス前部（通常は軸索）が、シナプス後部（神経細胞の樹状突起、筋肉など）となる標的細胞の適切な細胞上の適切な位置に結合すること（シナプス特異性）と、シナプス前部と後部がシナプス間隙を介して同じ場所に配向して、シナプス前部にシナプス小胞や分泌装置の蓄積、シナプス後部に神経伝達物質受容体の集合やシナプス重厚部が生じるということ（シナプス分化）がある。シナプス形成は、シナプス前部とシナプス後部の間の相互作用によって制御されており、このような細胞間相互作用を担うシナプス接着分子、細胞外マトリックス分子、更に分泌性因子が同定されている。また、グリア細胞など神経細胞以外のプレーヤーの関与も重要である。神経系の発達期や臨界期においては、化学シナプス形成は過剰に行われ、神経活動などの影響により、シナプス刈り込みにより再編成される。また、発達中のシナプス形成とも共通する成熟した神経系でのシナプス新生や構造変化は、学習と記憶にも重要な役割をし、シナプス形成の異常は、自閉症、精神疾患、認知症などの原因になると考えられている。}}<br />
<br />
==はじめに==<br />
神経細胞は、[[シナプス]]で適切に結合、情報伝達し、情報処理ユニットとして機能している。シナプス形成は、神経細胞の間で適切な場所で生じるシナプスの構造構築から機能発現までの過程であるが、正常の発生だけでなく、再生や可塑性でも見られ、正常発生でのシナプス形成と基本的には共通するものであると考えられる。しかし、シナプス形成といった場合、発生における化学シナプスの構造構築について議論されることが多いので、本項目もそれを中心に扱う。また、化学シナプスの形成とは本質的に構造の異なる[[電気シナプス]]（ギャップジャンクション）の形成については、化学シナプス形成との関係性もあると考えられるが、本項目では扱わない<ref><pubmed>23237660</pubmed></ref><ref><pubmed>28170151 </pubmed></ref><ref><pubmed>32883654</pubmed></ref>。<br />
<br />
==シナプス形成の３ステップについての概観==<br />
===ステップ1：シナプス特異性===<br />
軸索は[[軸索ガイダンス]]により、標的細胞近辺に到達する。軸索は特定の標的細胞と特異的にシナプス結合することで、情報を処理できる機能的回路を作る（celluar specificity）。また、シナプスはシナプス後細胞上の特定の部位に形成される（subcellular specificity）<ref><pubmed>19575668</pubmed></ref><ref><pubmed>26656254</pubmed></ref>。この初期のステップについては、「[[標的認識]]」の項を参考にされたい。神経伝達物質や標的細胞が持つ受容体などのシナプスの神経化学的形質は、遺伝子にプログラムされて発生していく神経系の細胞に内在的なものと大方考えられているが、シナプス形成後の誘導により変換するケースもあるかもしれない<ref><pubmed>10202548</pubmed></ref>。<br />
<br />
===ステップ2：シナプス分化===<br />
次に、標的細胞と接触する軸索の一部分はシナプス小胞やアクティブゾーンを伴う[[シナプス前終末]]へと分化し（presynaptic differentiation）、軸索と接触した標的細胞では局所的に[[神経伝達物質受容体]]や細胞内足場が集積しシナプス後部へと分化する（postsynaptic differentiation）。シナプス前部とシナプス後部の特殊化は、軸索と標的細胞の間の相互作用で制御される。この細胞間相互作用についての多くの原理的知見は、運動神経細胞からの軸索が骨格筋線維上で作る巨大で単純なシナプスである[[神経筋接合部]]（neuromuscular junction, NMJ)についての20世紀に行われた研究から得られてきた<ref><pubmed>10202544</pubmed></ref>。21世紀になって、小さく多様な中枢神経系でのシナプス形成や無脊椎動物モデル動物のシナプス形成についての分子的な理解が進んでいる<ref><pubmed>30359597</pubmed></ref>。本項目では、特にこのステップについて、原理的な観点から概観する。<br />
<br />
===ステップ3：シナプス再編成===<br />
シナプス形成後は、シナプスの成熟や神経回路の再編成が観察される。発達期においては、シナプス形成は過剰に行われ、神経活動などの影響により過剰なシナプスは除去さ<ref><pubmed>10719884</pubmed></ref><ref><pubmed>26436703</pubmed></ref><ref><pubmed>29716431</pubmed></ref><ref><pubmed>31372212</pubmed></ref>。シナプスの除去（synapse elimination）は、[[神経細胞死]]と同様に、神経回路を再編する重要な過程であるが、これについては「[[シナプス刈り込み]]」の項を参考されたい。シナプス形成は、個体発生の過程だけでなく、成体におけるシナプスの新生や構造変化は、学習と記憶にも重要な役割をし、シナプス形成の異常は、[[自閉症]]、[[精神疾患]]、[[認知症]]などの原因になると考えられている<ref><pubmed>22258914</pubmed></ref><ref><pubmed>22540979</pubmed></ref>。。<br />
<br />
==神経筋接合部におけるシナプス形成==<br />
脊髄動物の神経筋接合部は、脊髄にある運動神経細胞から伸長した軸索終末、筋線維、[[シュワン細胞]]の３つの細胞要素からなり、それぞれ神経筋接合部で特徴的に分化している（図1A)。シナプス形成は、運動神経の軸索が、軸索ガイダンスを経て、発生中の筋線維に接近して開始される。[[成長円錐]]が神経終末に変化し始めると、神経終末と反対側の筋表面の一部が特殊化し始める。発生が進むと、[[シナプス間隙]]（synaptic cleft）を介したシナプス前部とシナプス後部の構造的な特徴が明確になり、最終的に筋線維表面の1000分の1の面積を占める成熟した神経筋接合部となる（図１A）。このように、シナプス前部は、シナプス後部と同じ場所で配向し、シナプス前部では、シナプス小胞、アクティブゾーンなど神経伝達物質（アセチルコリン）の分泌装置や電位依存性カルシウムチャネルなどが集積する。一方、シナプス後部では、効率的なシナプス伝達のために、神経伝達物質受容体（アセチルコリンレセプター）とシグナル伝達装置や足場構造が集合する<ref><pubmed>10202544</pubmed></ref><ref><pubmed>25493308</pubmed></ref><ref><pubmed>29415504</pubmed></ref><ref><pubmed>29195055</pubmed></ref>。<br />
[[ファイル:Fig1-SF.jpg|サムネイル|250px|'''図1 神経筋接合部と中枢シナプスのシナプス形成<br />
A. 脊椎動物の神経筋接合部。運動神経細胞から伸長した軸索末端が多核の筋線維に接触することで、情報交換が始まる。シナプス前部ではシナプス小胞が集積し、シナプス後部では神経伝達物質受容体であるニコチン性アセチルコリンレセプターが集まり始める。成熟した神経筋接合部ではシナプス前部にはシナプス小胞、アクティブゾーンが形成される。シナプス間隙には、シナプス領域で特化したシナプス基底膜が存在し、そこには、アセチルコリンエステラーゼに加え、アグリンやβ2ラミニンなどのシナプスオーガナイザー活性を持つ分子も局在する。シナプス後部には、アセチルコリンレセプターが集積し、Rapsynなどの足場分子やMuSK, Lrp4などのシグナル分子も集まる。シナプス直下では、核も特殊化しており、アセチルコリンレセプター遺伝子を強く発現している（本文参考）。Sanes & Lichtman (1999) <ref><pubmed>10202544</pubmed></ref>などを参考にした。<br />
B. 中枢シナプス形成。Vaughn (1989) <ref><pubmed>2655146</pubmed></ref>の形態学的モデルをもとに、神経筋接合部のシナプス形成と対比させた。ここでも、シナプス前部と後部の情報交換により、シナプス分化が開始される。中枢シナプスのシナプス間隙には神経筋接合部とは異なり、基底膜は存在せず、前部と後部の直接的な接着が相互作用の中心であり、シナプス小胞や神経伝達物質受容体が、前部と後部にそれぞれ集積する。興奮性シナプスでは顕著なシナプス後肥厚が形成される。<br />
]]<br />
<br />
<br />
===シナプスオーガナイザー===<br />
運動神経細胞と筋線維は、それぞれ独立してシナプス前部とシナプス後部に対応するシナプス構成要素を合成し、自立的に集合させることが可能である。つまり、運動軸索では、筋線維がない状態でもシナプス小胞が見られ、軸索中に保持することができる。一方、筋線維は神経伝達物質受容体であるアセチルコリンレセプターを合成し、神経がない状態でも、細胞表面上に多数のアセチルコリンレセプターからなる巨大集合構造を作ることができる（クラスタリング, clustering）。したがって、シナプス形成を制御する細胞間相互作用は、シナプス小胞の形成や受容体クラスタリングそのものの誘発因子というより、むしろそれらの位置を決め配向させる指令因子（オーガナイザー, organizer）としての役割が大きい。また、軸索中のシナプス小胞の集積は、ポリリジン被覆ビーズなどとの接触でも容易に引き起こされることから、オーガナイザーとしての役割もAll or nothingといった絶対的なものではなく促進的なものである<ref><pubmed>7127105</pubmed></ref>。しかし、以下に記述するように、シナプス後部やシナプス前部の分化が、それぞれの接触によって誘発、促進される可能性があることを示す証拠もある。これらの証拠のいくつかは、神経筋接合部の再生を利用することで得られた。<br />
<br />
===シナプス後部の分化===<br />
シナプス後部の分化に積極的に関わる分子として想定されたのがアグリン（agrin）である<ref><pubmed>1966767</pubmed></ref>。シナプス前部筋線維は、[[細胞外マトリックス]]である[[基底膜]]（basement membrane, basal lamina）に包まれている。基底膜の成分は、通常、IV型コラーゲン、ヘパラン硫酸プロテオグリカン（パールカンperlecan）、[[ラミニン]]（laminin）などであるが<ref><pubmed>12556454</pubmed></ref>、神経筋接合部の基底膜（シナプス基底膜 synaptic basement membrane）には、シナプス形成に関わる重要な因子であるヘパラン硫酸プロテオグリカンのアグリン（agrin）が存在する。損傷した筋組織の基底膜を再生する筋肉に接触させると、シナプス後部の特徴を誘導することができる。つまり、基底膜にはアセチルコリンレセプターのクラスタリングに関わる因子が存在することが想定されアグリンは生化学的に精製された（図２A）。オールターナティブスプライシングによる特殊エクソン由来配列を含むために、強力な受容体クラスタリング能を持つアグリンは運動神経細胞側で発現し、運動神経を通じて末梢に運搬され、神経筋接合部の基底膜に保持される。アグリン欠損マウスでは、神経筋接合部が乱れており、神経筋接合部におけるアセチルコリンレセプタークラスターの数、大きさ、密度が減少している<ref><pubmed>8653788</pubmed></ref>。 このことから、アグリンはシナプス後部の分化に関わる神経由来の因子であると考えられる。アグリンは、筋特異的チロシンキナーゼ（MuSK）やLRP4を含むいくつかの受容体に結合して、アダプタータンパク質（Dok7）や細胞骨格タンパク質（Rapsyn）とともに、アセチルコリンレセプターのクラスタリングにつながる一連の情報伝達系に影響を与える<ref><pubmed>20215342</pubmed></ref><ref><pubmed>29415504</pubmed></ref><ref><pubmed>8653786</pubmed></ref><ref><pubmed>8653787</pubmed></ref><ref><pubmed>16794080</pubmed></ref><ref><pubmed>7675108</pubmed></ref>。<br />
[[ファイル:Fig2-SF.jpg|サムネイル|250px|'''図２ シナプスオーガナイザー<br />
A. 培養化の筋線維に、アグリンを加えると、アセチルコリンレセプターがクラスタリングする。アグリン欠損マウスでは、神経筋接合部におけるアセチルコリンレセプタークラスターの数、大きさ、密度が減少する<ref><pubmed>8653788</pubmed></ref>。<br />
B. 培養細胞(293細胞など）に、ニューロリギン（通常、シナプス後部の神経細胞で発現）を強制発現させ、その上で神経細胞を培養し神経突起を伸長させると、シナプス小胞の蓄積が観察される<ref><pubmed>10892652</pubmed></ref>。また、ニューレキシン（通常、シナプス前部の神経細胞で発現）を強制発現させると、その上では神経突起にシナプス後肥厚やある種の神経伝達物質受容体が集積する<ref><pubmed>15620359</pubmed></ref>。これらの活性から、これらの分子がシナプス前部や後部の分化と配向に関わるシナプスオーガナイザーであると推定された。]]<br />
<br />
===シナプス前部の分化===<br />
シナプス前部の分化に関わる分子として同定されたものには、神経筋接合部特異的ラミニンのアイソフォームがある。再生神経の軸索が筋線維に到達すると、基底膜に最初に接触する。この際、筋線維を死滅させ、基底膜をカラのように残したままでも、再生神経は正確に元の神経筋接合部の基底膜上でシナプス前部の分化を起こした<ref><pubmed>307554</pubmed></ref>。つまり、神経筋接合部のシナプス基底膜には、シナプス前部の分化を指示する因子があると想定され、その後、そのような分子が同定されている。最もよく研究されているのは、細胞外マトリックス分子ラミニンのアイソフォームである。ラミニンはすべての基底膜の構成分子であり、ラミニンは、α鎖、β鎖、γ鎖のヘテロ3量体であり、少なくとも5本のα鎖、4本のβ鎖、3本のγ鎖のファミリーからなっている。筋線維は複数のラミニンアイソフォームを合成し基底膜に取り込む。シナプス外の通常の筋基底膜にはβ1鎖を含むラミニンが存在するが、神経筋接合部のシナプス間隙の基底膜にはβ2鎖を持つアイソフォームが見られる<ref><pubmed>2922051</pubmed></ref>。in vitroでは、β2ラミニンに運動神経の軸索が接触すると伸長を停止し、シナプス小胞を蓄積し、神経伝達物質を放出するようになる。β2ラミニンを欠く変異マウスでは、シナプス前終末およびシュワン細胞の発達に異常が生じる<ref><pubmed>7885444</pubmed></ref>。<br />
===シナプス核===<br />
中枢シナプスと違う神経筋接合部の際立った特徴は、筋線維は多数の細胞が融合した[[多核細胞]]（syncytial muscle; multinucleated muscle）となっており、神経筋接合部の直下にはシナプス核（synaptic nucleus)と呼ばれる特化した細胞核が存在することである<ref><pubmed>11498047</pubmed></ref>（図1A）。シナプス核ではアセチルコリンレセプター遺伝子の転写が強く、シナプスから離れた核では転写が低く、アセチルコリンレセプターmRNAを局在化させ、神経筋接合部の近辺でアセチルコリンレセプターが集まる要因にもなっている。これは、神経が、アセチルコリンを使って、アセチルコリンレセプター遺伝子のシナプス外での発現を抑制すると同時に、軸索から放出されるニューレギュリン（neuregulin, ARIA = Acetylcholine Receptor Inducing Activityとも呼ばれた）が、アセチルコリンレセプター遺伝子の転写活性化につながるシグナリング分子となっている<ref><pubmed>9056721</pubmed></ref>。また、発生途中では、アセチルコリンレセプターの組成も変化する。幼若期に特有なδサブユニット遺伝子からε遺伝子への発現の変換がおこる<ref><pubmed>2423878</pubmed></ref>。生体で見られる発生初期のアセチルコリンレセプターのクラスターは単純なプラーク型であるが、最終的には複雑なプレッツェル型になり、神経筋接合部のひだも形成され、シナプス前終末もそれに対応して成熟する<ref><pubmed>15034266</pubmed></ref>。<br />
==中枢神経系のシナプス形成==<br />
中枢神経系のシナプスの形成も神経筋接合部のシナプス形成と類似した点が多い。シナプス前部とシナプス後部の間の相互作用は、予め合成されたシナプス構成要素の位置を制御し合うことで、お互いの分化を制御しシナプスを形成する<ref><pubmed>2655146</pubmed></ref><ref><pubmed>17417940</pubmed></ref><ref><pubmed>14556707</pubmed></ref><ref><pubmed>30359597</pubmed></ref><ref><pubmed>27462810</pubmed></ref><ref><pubmed>29096080</pubmed></ref>。中枢シナプスでも、神経筋接合部と同じように、神経伝達物質の受容体がシナプス後膜に集中しているし<ref><pubmed>22046028</pubmed></ref>、シナプス前部におけるシナプス小胞の分子的な成り立ちや蓄積も基本的に同じであるように見える<ref><pubmed>22794257</pubmed></ref>（図1B）。しかし、中枢シナプスの後部は、神経伝達物質受容体の分子種も異なり、その足場となる分子種も神経筋接合部とは大きく異なっている。特に、神経筋接合部では基底膜という細胞外マトリックスであったシナプス間隙（約50nm）の様相は中枢シナプスでは全く異なり、典型的な細胞外マトリックスは存在しない。中枢シナプスでは、約20nmのシナプス間隙で直接接触するシナプス前膜とシナプス後膜の間に存在する細胞間接着がその相互作用の中心であると考えられている<ref><pubmed>14519398</pubmed></ref> <ref><pubmed>20832286</pubmed></ref> <ref><pubmed>30359597</pubmed></ref><ref><pubmed>32359437</pubmed></ref><ref><pubmed>22278667</pubmed></ref>（図１B)。<br />
===中枢シナプス形成のオーガナイザー===<br />
シナプス前部とシナプス後部をつなぐ細胞接着分子は多数ある（[[シナプス接着因子]]の項参考）。それらを代表するものの1つは、シナプス後部の膜に存在するタンパク質であるニューロリギン（neuroligin）である。それに対応するシナプス前膜上の主要なリガンドはニューレキシン（neurexin）である。細胞表面のニューロリギンが、軸索上にシナプス小胞を集積させる能力は、ニューロリギンを強制発現する非神経細胞の上で、神経細胞を培養するin vitroアッセイ系を用いることによって初めて明らかになった<ref><pubmed>10892652</pubmed></ref>（図2B)。しかし、in vitroアッセイ系で見られるニューロリギンなどのシナプス接着分子の作用には、非神経細胞上にデフォールトで発現しているカドヘリンのような別の接着分子の存在が前提になるようである<ref><pubmed>29760652</pubmed></ref>。また、RIM、RIM-BP、liprin、Munc13、ELKSを含むいくつかのタンパク質ファミリーが、シナプス前部の重要な足場分子として同定されており<ref><pubmed>22794257</pubmed></ref>、シナプス前部表面のLAR-RPTPs（受容体型膜貫通チロシンホスファターゼ）を通じてアクティブゾーンを形成に預かる<ref><pubmed>23916315</pubmed></ref>。<br />
<br />
一方、シナプス後部の樹状突起内の一部の神経伝達物質受容体や足場分子は、ニューロリギンのリガンドであるニューレキシンを発現させた非神経細胞と接触する部位で凝集する<ref><pubmed>15620359</pubmed></ref>（図2B）。このような神経伝達物質受容体とそのシグナル伝達タンパク質の一部は、アクチン細胞骨格との直接的および間接的な相互作用を介して固定されている。特に、興奮性シナプスで顕著な[[シナプス後肥厚]]（postsynaptic density)においては、複数のPDZドメインを持った[[PSD95]]などの細胞内タンパク質が、PDZドメイン結合モチーフを持つニューロリギンなどの膜貫通型接着分子、神経伝達物質受容体、イオンチャネルと複数結合することで、シナプス後部の構成要素をつなぐ足場分子として機能し、ShankやHomerなどの他の足場分子とともに、シナプス構造の構築に関与すると考えられる<ref><pubmed>22046028</pubmed></ref><ref><pubmed>28577431</pubmed></ref><ref><pubmed>28179641</pubmed></ref>。一方、抑制性シナプスのシナプス後部では、ゲフィリン（gephyrin）が重要な足場分子として機能する<ref><pubmed>24552784</pubmed></ref><ref><pubmed>28460365</pubmed></ref>。<br />
<br />
4種類あるニューロリギンのうち、ニューロリギン1はグルタミン酸作動性シナプス、ニューロリギン2はGABA作動性シナプス、ニューロリギン3はグルタミン酸とGABA作動性シナプスの両者、そしてニューロリギン4はグリシン作動性シナプスに局在している<ref><pubmed>26209464</pubmed></ref><ref><pubmed>15540461</pubmed></ref><ref><pubmed>17897391</pubmed></ref><ref><pubmed>21282647</pubmed></ref>。培養系の実験では、ニューロリギン1,3,4はグルタミン酸レセプターのクラスタリングを引き起こすが、ニューロリギン２はグルタミン酸レセプターとGABAAレセプターのクラスタリングを引き起こす<ref><pubmed>15620359</pubmed></ref>。<br />
<br />
しかしながら、ニューレキシンやニューロリギンの遺伝子欠失動物では、予想に反して、シナプスの大きさや数にほとんど影響が見られない<ref><pubmed>12827191</pubmed></ref><ref><pubmed>16982420</pubmed></ref><ref><pubmed>28472659</pubmed></ref>ことから、これらの分子の存在が中枢シナプス形成にどの程度の意味を持っているのかは、実は明らかではない。ニューレキシンやニューロリギンの他にも、シナプス接着分子はシナプス分化の誘発能を持つものやニューレキシンに結合するものも含めて多数報告されてきており<ref><pubmed>29100073</pubmed></ref>、冗長性、補完性の高い相互作用システムの一部分である可能性が高い（[[シナプス接着因子]]の項参考）。また、同様な証拠から、シナプスオーガナイザーとして知られているFGFファミリーやWntファミリーといった分泌性の因子なども、この冗長な分子ネットワークの一部であると考えられる<ref><pubmed>20646052</pubmed></ref><ref><pubmed>24105999</pubmed></ref><ref><pubmed>29166241</pubmed></ref>。センチュウやショウジョウバエでは、変異体スクリーニングなどから、シナプス形成に関わるとされる遺伝子が多く同定されている<ref><pubmed>31037336</pubmed></ref><ref><pubmed>30986749</pubmed></ref><ref><pubmed>32741370</pubmed></ref>。このことからも、哺乳類の中枢シナプスに関わる分子機構も実際には更に複雑であることが予想される。<br />
<br />
中枢神経系の神経細胞の周りには、シナプス部位を囲むようにペリニューロナルネット（perineuronal nets）と呼ばれるプロテオグリカンやヒアルロナンなどを構成要素とする細胞外マトリックスが存在しており、臨界期などでのシナプス形成の制御にも関わっていると考えられている<ref><pubmed>27911749</pubmed></ref><ref><pubmed>31263252</pubmed></ref>。<br />
<br />
<br />
==シナプス形成におけるグリア細胞の役割==<br />
これまでシナプス前部とシナプス後部の接点のみに焦点を当ててきたが、シナプス形成には第3の細胞要素であるグリア細胞も関与している<ref><pubmed>30309945</pubmed></ref><ref><pubmed>30347385</pubmed></ref>。シュワン細胞は神経筋接合部のグリア細胞であり、[[アストロサイト]]は中枢シナプスのグリア細胞である。シュワン細胞がシナプス形成や維持に与える影響については、シュワン細胞を除去した動物での神経筋接合部の異常から考察されている<ref><pubmed>27656017</pubmed></ref>。<br />
<br />
グリア細胞の細胞表面にある分子と外部に分泌される分子の両方がシナプス形成に必要である。巨大な細胞外マトリックス分子であるトロンボスポンジン(thrombospondin) <ref><pubmed>15707899</pubmed></ref>、脂質であるコレステロール<ref><pubmed>12648780</pubmed></ref>、ヘビン（hevin) <ref><pubmed>21788491</pubmed></ref>などである。アストロサイトから分泌されるヘビンは、通常は相互作用しない細胞接着分子であるニューレキシンとニューロリギンの一部のアイソフォームを架橋することにより、シナプス形成を促進する<ref><pubmed>26771491</pubmed></ref>。アストロサイト上のグリピカン（glypican)は、シナプス前終末からAMPAレセプタークラスタリング因子ペントラキシン1(pentraxin1)の放出を誘発する<ref><pubmed>29024665</pubmed></ref><ref><pubmed>27986928</pubmed></ref>。また、シナプス形成に拮抗するSPARCなどのシナプスの負の調節因子も知られている<ref><pubmed>21788491</pubmed></ref>。またミクログリアは、シナプス刈り込みに関与することで、神経回路の再編に関与する<ref><pubmed>31283900</pubmed></ref>。 <br />
<br />
== 関連項目 ==<br />
*[[標的認識]]<br />
*[[成長円錐]]<br />
*[[神経筋接合部]]<br />
*[[シナプス刈り込み]]<br />
*[[シナプス接着因子]]<br />
*[[細胞外マトリックス]]<br />
*[[基底膜]]<br />
*[[シナプス前終末]]<br />
*[[シナプス後肥厚]]<br />
== 参考文献 ==<br />
<references /></div>
Masahitoyamagata
https://bsd.neuroinf.jp/w/index.php?title=%E3%82%B7%E3%83%8A%E3%83%97%E3%82%B9%E5%BD%A2%E6%88%90&diff=44920
シナプス形成
2020-10-21T22:00:50Z
<p>Masahitoyamagata: </p>
<hr />
<div><div align="right"> <br />
<font size="+1">[http://researchmap.jp/yamagatm 山形方人]</font><br><br />
''Harvard University''<br><br />
DOI：<selfdoi /> 原稿受付日：年月日 原稿完成日：年月日<br><br />
担当編集委員：<br><br />
</div><br />
<br />
英：synapse formation, synaptogenesis<br />
{{box|text=<br />
神経細胞とその相手の細胞（神経細胞、筋肉など）は、シナプスという特殊化した細胞接着構造で結合している。シナプス形成とは、神経回路形成において、機能するシナプスができあがるまでの過程である。化学シナプスの形成には、シナプス前部（通常は軸索）が、シナプス後部（神経細胞の樹状突起、筋肉など）となる標的細胞の適切な細胞上の適切な位置に結合すること（シナプス特異性）と、シナプス前部と後部がシナプス間隙を介して同じ場所に配向して、シナプス前部にシナプス小胞や分泌装置の蓄積、シナプス後部に神経伝達物質受容体の集合やシナプス重厚部が生じるということ（シナプス分化）がある。シナプス形成は、シナプス前部とシナプス後部の間の相互作用によって制御されており、このような細胞間相互作用を担うシナプス接着分子、細胞外マトリックス分子、更に分泌性因子が同定されている。また、グリア細胞など神経細胞以外のプレーヤーの関与も重要である。神経系の発達期や臨界期においては、化学シナプス形成は過剰に行われ、神経活動などの影響により、シナプス刈り込みにより再編成される。また、発達中のシナプス形成とも共通する成熟した神経系でのシナプス新生は、学習と記憶にも重要な役割をし、シナプス形成の異常は、自閉症、精神疾患、認知症などの原因になると考えられている。}}<br />
<br />
==はじめに==<br />
神経細胞は、[[シナプス]]で適切に結合、情報伝達し、情報処理ユニットとして機能している。シナプス形成は、神経細胞の間で適切な場所で生じるシナプスの構造構築から機能発現までの過程であるが、正常の発生だけでなく、可塑性や再生でも見られ、正常発生でのシナプス形成と基本的には共通するものであると考えられる。しかし、シナプス形成といった場合、発生における化学シナプスの構造構築に限定して議論されることが多いので、本項目もそれを中心に扱う。また、化学シナプスの形成とは本質的に構造の異なる[[電気シナプス]]（ギャップジャンクション）の形成については、化学シナプス形成との関係性もあると考えられるが、本項目では扱わない<ref><pubmed>23237660</pubmed></ref><ref><pubmed>28170151 </pubmed></ref><ref><pubmed>32883654</pubmed></ref>。<br />
<br />
==シナプス形成の３ステップについての概観==<br />
===（ステップ１）シナプス特異性===<br />
軸索は[[軸索ガイダンス]]により、標的細胞近辺に到達する。軸索は特定の標的細胞と特異的にシナプス結合することで、情報を処理できる機能的回路を作る（celluar specificity）。また、シナプスはシナプス後細胞上の特定の部位に形成される（subcellular specificity）<ref><pubmed>19575668</pubmed></ref><ref><pubmed>26656254</pubmed></ref>。この初期のステップについては、「[[標的認識]]」の項を参考にされたい。神経伝達物質や標的細胞が持つ受容体などのシナプスの神経化学的形質は、遺伝子にプログラムされて発生していく神経系の細胞に内在的なものと大方考えられているが、シナプス形成後の誘導により変換するケースもあるかもしれない<ref><pubmed>10202548</pubmed></ref>。<br />
<br />
===（ステップ２）シナプス分化===<br />
次に、標的細胞と接触する軸索の一部分はシナプス小胞やアクティブゾーンを伴う[[シナプス前終末]]へと分化し（presynaptic differentiation）、軸索と接触した標的細胞では局所的に[[神経伝達物質受容体]]や細胞内足場が集積しシナプス後部へと分化する（postsynaptic differentiation）。シナプス前部とシナプス後部の特殊化は、軸索と標的細胞の間の相互作用で制御される。この細胞間相互作用についての多くの原理的知見は、運動神経細胞からの軸索が骨格筋線維上で作る巨大で単純なシナプスである[[神経筋接合部]]（neuromuscular junction, NMJ)についての20世紀に行われた研究から得られてきた<ref><pubmed>10202544</pubmed></ref>。21世紀になって、小さく多様な中枢神経系でのシナプス形成や無脊椎動物モデル動物のシナプス形成についての分子的な理解が進んでいる<ref><pubmed>30359597</pubmed></ref>。本項目では、特にこのステップについて、原理的な観点から概観する。<br />
<br />
===（ステップ３）シナプス再編成===<br />
シナプス形成後は、シナプスの成熟や神経回路の再編成が観察される。発達期においては、シナプス形成は過剰に行われ、神経活動などの影響により過剰なシナプスは除去さ<ref><pubmed>10719884</pubmed></ref><ref><pubmed>26436703</pubmed></ref><ref><pubmed>29716431</pubmed></ref><ref><pubmed>31372212</pubmed></ref>。シナプスの除去（synapse elimination）は、[[神経細胞死]]と同様に、神経回路を再編する重要な過程であるが、これについては「[[シナプス刈り込み]]」の項を参考されたい。シナプス形成は、個体発生の過程だけでなく、成体におけるシナプスの新生や構造変化は、記憶と学習にも重要な役割をしているし、シナプス形成の異常は、[[自閉症]]、[[精神疾患]]、[[認知症]]などの原因になると考えられている<ref><pubmed>22258914</pubmed></ref><ref><pubmed>22540979</pubmed></ref>。。<br />
<br />
==神経筋接合部におけるシナプス形成==<br />
脊髄動物の神経筋接合部は、脊髄にある運動神経細胞から伸長した軸索終末、筋線維、[[シュワン細胞]]の３つの細胞要素からなり、それぞれ神経筋接合部で特徴的に分化している（図1A)。シナプス形成は、運動神経の軸索が、軸索ガイダンスを経て、発生中の筋線維に接近して開始される。[[成長円錐]]が神経終末に変化し始めると、神経終末と反対側の筋表面の一部が特殊化し始める。発生が進むと、[[シナプス間隙]]（synaptic cleft）を介したシナプス前部とシナプス後部の構造的な特徴が明確になり、最終的に筋線維表面の1000分の1の面積を占める成熟した神経筋接合部となる（図１A）。このように、シナプス前部は、シナプス後部と同じ場所で配向し、シナプス前部では、シナプス小胞、アクティブゾーンなど神経伝達物質（アセチルコリン）の分泌装置や電位依存性カルシウムチャネルなどが集積する。一方、シナプス後部では、効率的なシナプス伝達のために、神経伝達物質受容体（アセチルコリンレセプター）とシグナル伝達装置や足場構造が集合する<ref><pubmed>10202544</pubmed></ref><ref><pubmed>25493308</pubmed></ref><ref><pubmed>29415504</pubmed></ref><ref><pubmed>29195055</pubmed></ref>。<br />
[[ファイル:Fig1-SF.jpg|サムネイル|250px|'''図1 神経筋接合部と中枢シナプスのシナプス形成<br />
A. 脊椎動物の神経筋接合部。運動神経細胞から伸長した軸索末端が多核の筋線維に接触することで、情報交換が始まる。シナプス前部ではシナプス小胞が集積し、シナプス後部では神経伝達物質受容体であるニコチン性アセチルコリンレセプターが集まり始める。成熟した神経筋接合部ではシナプス前部にはシナプス小胞、アクティブゾーンが形成される。シナプス間隙には、シナプス領域で特化したシナプス基底膜が存在し、そこには、アセチルコリンエステラーゼに加え、アグリンやβ2ラミニンなどのシナプスオーガナイザー活性を持つ分子も局在する。シナプス後部には、アセチルコリンレセプターが集積し、Rapsynなどの足場分子やMuSK, Lrp4などのシグナル分子も集まる。シナプス直下では、核も特殊化しており、アセチルコリンレセプター遺伝子を強く発現している（本文参考）。Sanes & Lichtman (1999) <ref><pubmed>10202544</pubmed></ref>などを参考にした。<br />
B. 中枢シナプス形成。Vaughn (1989) <ref><pubmed>2655146</pubmed></ref>の形態学的モデルをもとに、神経筋接合部のシナプス形成と対比させた。ここでも、シナプス前部と後部の情報交換により、シナプス分化が開始される。中枢シナプスのシナプス間隙には神経筋接合部とは異なり、基底膜は存在せず、前部と後部の直接的な接着が相互作用の中心であり、シナプス小胞や神経伝達物質受容体が、前部と後部にそれぞれ集積する。興奮性シナプスでは顕著なシナプス後肥厚が形成される。<br />
]]<br />
<br />
<br />
===シナプスオーガナイザー===<br />
運動神経細胞と筋線維は、それぞれ独立してシナプス前部とシナプス後部に対応するシナプス構成要素を合成し、自立的に集合させることが可能である。つまり、運動軸索では、筋線維がない状態でもシナプス小胞が見られ、軸索中に保持することができる。一方、筋線維は神経伝達物質受容体であるアセチルコリンレセプターを合成し、神経がない状態でも、細胞表面上に多数のアセチルコリンレセプターからなる巨大集合構造を作ることができる（クラスタリング, clustering）。したがって、シナプス形成を制御する細胞間相互作用は、シナプス小胞の形成や受容体クラスタリングそのものの誘発因子というより、むしろそれらの位置を決め配向させる指令因子（オーガナイザー, organizer）としての役割が大きい。また、軸索中のシナプス小胞の集積は、ポリリジン被覆ビーズなどとの接触でも容易に引き起こされることから、オーガナイザーとしての役割もAll or nothingといった絶対的なものではなく促進的なものである<ref><pubmed>7127105</pubmed></ref>。しかし、以下に記述するように、シナプス後部やシナプス前部の分化が、それぞれの接触によって誘発、促進される可能性があることを示す証拠もある。<br />
<br />
===シナプス後部の分化===<br />
シナプス後部の分化に積極的に関わる分子として想定されたのがアグリン（agrin）である<ref><pubmed>1966767</pubmed></ref>。シナプス前部筋線維は、[[細胞外マトリックス]]である[[基底膜]]（basement membrane, basal lamina）に包まれている。基底膜の成分は、通常、IV型コラーゲン、ヘパラン硫酸プロテオグリカン（パールカンperlecan）、[[ラミニン]]（laminin）などであるが<ref><pubmed>12556454</pubmed></ref>、神経筋接合部の基底膜（シナプス基底膜 synaptic basement membrane）には、シナプス形成に関わる重要な因子であるヘパラン硫酸プロテオグリカンのアグリン（agrin）が存在する。損傷した筋組織の基底膜を再生する筋肉に接触させると、シナプス後部の特徴を誘導することができる。つまり、基底膜にはアセチルコリンレセプターのクラスタリングに関わる因子が存在することが想定されアグリンは生化学的に精製された（図２A）。オールターナティブスプライシングによる特殊エクソン由来配列を含むために、強力な受容体クラスタリング能を持つアグリンは運動神経細胞側で発現し、運動神経を通じて末梢に運搬され、神経筋接合部の基底膜に保持される。アグリン欠損マウスでは、神経筋接合部が乱れており、神経筋接合部におけるアセチルコリンレセプタークラスターの数、大きさ、密度が減少している<ref><pubmed>8653788</pubmed></ref>。 このことから、アグリンはシナプス後部の分化に関わる神経由来の因子であると考えられる。アグリンは、筋特異的チロシンキナーゼ（MuSK）やLRP4を含むいくつかの受容体に結合して、アダプタータンパク質（Dok7）や細胞骨格タンパク質（Rapsyn）とともに、アセチルコリンレセプターのクラスタリングにつながる一連の情報伝達系に影響を与える<ref><pubmed>20215342</pubmed></ref><ref><pubmed>29415504</pubmed></ref><ref><pubmed>8653786</pubmed></ref><ref><pubmed>8653787</pubmed></ref><ref><pubmed>16794080</pubmed></ref><ref><pubmed>7675108</pubmed></ref>。<br />
[[ファイル:Fig2-SF.jpg|サムネイル|250px|'''図２ シナプスオーガナイザー<br />
A. 培養化の筋線維に、アグリンを加えると、アセチルコリンレセプターがクラスタリングする。アグリン欠損マウスでは、神経筋接合部におけるアセチルコリンレセプタークラスターの数、大きさ、密度が減少する<ref><pubmed>8653788</pubmed></ref>。<br />
B. 培養細胞(293細胞など）に、ニューロリギン（通常、シナプス後部の神経細胞で発現）を強制発現させ、その上で神経細胞を培養し神経突起を伸長させると、シナプス小胞の蓄積が観察される<ref><pubmed>10892652</pubmed></ref>。また、ニューレキシン（通常、シナプス前部の神経細胞で発現）を強制発現させると、その上では神経突起にシナプス後肥厚やある種の神経伝達物質受容体が集積する<ref><pubmed>15620359</pubmed></ref>。これらの活性から、これらの分子がシナプス前部や後部の分化と配向に関わるシナプスオーガナイザーであると推定された。]]<br />
<br />
===シナプス前部の分化===<br />
シナプス前部の分化に関わる分子として同定されたものには、神経筋接合部特異的ラミニンのアイソフォームがある。再生神経の軸索が筋線維に到達すると、基底膜に最初に接触する。この際、筋線維を死滅させ、基底膜をカラのように残したままでも、再生神経は正確に元の神経筋接合部の基底膜上でシナプス前部の分化を起こした<ref><pubmed>307554</pubmed></ref>。つまり、神経筋接合部のシナプス基底膜には、シナプス前部の分化を指示する因子があると想定され、その後、そのような分子が同定されている。最もよく研究されているのは、細胞外マトリックス分子ラミニンのアイソフォームである。ラミニンはすべての基底膜の構成分子であり、ラミニンは、α鎖、β鎖、γ鎖のヘテロ3量体であり、少なくとも5本のα鎖、4本のβ鎖、3本のγ鎖のファミリーからなっている。筋線維は複数のラミニンアイソフォームを合成し基底膜に取り込む。シナプス外の通常の筋基底膜にはβ1鎖を含むラミニンが存在するが、神経筋接合部のシナプス間隙の基底膜にはβ2鎖を持つアイソフォームが見られる<ref><pubmed>2922051</pubmed></ref>。in vitroでは、β2ラミニンに運動神経の軸索が接触すると伸長を停止し、シナプス小胞を蓄積し、神経伝達物質を放出するようになる。β2ラミニンを欠く変異マウスでは、シナプス前終末およびシュワン細胞の発達に異常が生じる<ref><pubmed>7885444</pubmed></ref>。<br />
===シナプス核===<br />
中枢シナプスと違う神経筋接合部の際立った特徴は、筋線維は多数の細胞が融合した[[多核細胞]]（syncytial muscle; multinucleated muscle）となっており、神経筋接合部の直下にはシナプス核（synaptic nucleus)と呼ばれる特化した細胞核が存在することである<ref><pubmed>11498047</pubmed></ref>（図1A）。シナプス核ではアセチルコリンレセプター遺伝子の転写が強く、シナプスから離れた核では転写が低く、アセチルコリンレセプターmRNAを局在化させ、神経筋接合部の近辺でアセチルコリンレセプターが集まる要因にもなっている。これは、神経が、アセチルコリンを使って、アセチルコリンレセプター遺伝子のシナプス外での発現を抑制すると同時に、軸索から放出されるニューレギュリン（neuregulin, ARIA = Acetylcholine Receptor Inducing Activityとも呼ばれた）が、アセチルコリンレセプター遺伝子の転写活性化につながるシグナリング分子となっている<ref><pubmed>9056721</pubmed></ref>。また、発生途中では、アセチルコリンレセプターの組成も変化する。幼若期に特有なδサブユニット遺伝子からε遺伝子への発現の変換がおこる<ref><pubmed>2423878</pubmed></ref>。生体で見られる発生初期のアセチルコリンレセプターのクラスターは単純なプラーク型であるが、最終的には複雑なプレッツェル型になり、神経筋接合部のひだも形成され、シナプス前終末もそれに対応して成熟する<ref><pubmed>15034266</pubmed></ref>。<br />
==中枢神経系のシナプス形成==<br />
中枢神経系のシナプスの形成も神経筋接合部のシナプス形成と類似した点が多い。シナプス前部とシナプス後部の間の相互作用は、予め合成されたシナプス構成要素の位置を制御し合うことで、お互いの分化を制御しシナプスを形成する<ref><pubmed>2655146</pubmed></ref><ref><pubmed>17417940</pubmed></ref><ref><pubmed>14556707</pubmed></ref><ref><pubmed>30359597</pubmed></ref><ref><pubmed>27462810</pubmed></ref><ref><pubmed>29096080</pubmed></ref>。中枢シナプスでも、神経筋接合部と同じように、神経伝達物質の受容体がシナプス後膜に集中しているし<ref><pubmed>22046028</pubmed></ref>、シナプス前部におけるシナプス小胞の分子的な成り立ちや蓄積も基本的に同じであるように見える<ref><pubmed>22794257</pubmed></ref>（図1B）。しかし、中枢シナプスの後部は、神経伝達物質受容体の分子種も異なり、その足場となる分子種も神経筋接合部とは大きく異なっている。特に、神経筋接合部では基底膜という細胞外マトリックスであったシナプス間隙（約50nm）の様相は中枢シナプスでは全く異なり、典型的な細胞外マトリックスは存在しない。中枢シナプスでは、約20nmのシナプス間隙で直接接触するシナプス前膜とシナプス後膜の間に存在する細胞間接着がその相互作用の中心であると考えられている<ref><pubmed>14519398</pubmed></ref> <ref><pubmed>20832286</pubmed></ref> <ref><pubmed>30359597</pubmed></ref><ref><pubmed>32359437</pubmed></ref><ref><pubmed>22278667</pubmed></ref>（図１B)。<br />
===中枢シナプス形成のオーガナイザー===<br />
シナプス前部とシナプス後部をつなぐ細胞接着分子は多数ある（[[シナプス接着因子]]の項参考）。それらを代表するものの1つは、シナプス後部の膜に存在するタンパク質であるニューロリギン（neuroligin）である。それに対応するシナプス前膜上の主要なリガンドはニューレキシン（neurexin）である。細胞表面のニューロリギンが、軸索上にシナプス小胞を集積させる能力は、ニューロリギンを強制発現する非神経細胞の上で、神経細胞を培養するin vitroアッセイ系を用いることによって初めて明らかになった<ref><pubmed>10892652</pubmed></ref>（図2B)。しかし、in vitroアッセイ系で見られるニューロリギンなどのシナプス接着分子の作用には、非神経細胞上にデフォールトで発現しているカドヘリンのような別の接着分子の存在が前提になるようである<ref><pubmed>29760652</pubmed></ref>。また、RIM、RIM-BP、liprin、Munc13、ELKSを含むいくつかのタンパク質ファミリーが、シナプス前部の重要な足場分子として同定されており<ref><pubmed>22794257</pubmed></ref>、シナプス前部表面のLAR-RPTPs（受容体型膜貫通チロシンホスファターゼ）を通じてアクティブゾーンを形成に預かる<ref><pubmed>23916315</pubmed></ref>。<br />
<br />
一方、シナプス後部の樹状突起内の一部の神経伝達物質受容体や足場分子は、ニューロリギンのリガンドであるニューレキシンを発現させた非神経細胞と接触する部位で凝集する<ref><pubmed>15620359</pubmed></ref>（図2B）。このような神経伝達物質受容体とそのシグナル伝達タンパク質の一部は、アクチン細胞骨格との直接的および間接的な相互作用を介して固定されている。特に、興奮性シナプスで顕著な[[シナプス後肥厚]]（postsynaptic density)においては、複数のPDZドメインを持った[[PSD95]]などの細胞内タンパク質が、PDZドメイン結合モチーフを持つニューロリギンなどの膜貫通型接着分子、神経伝達物質受容体、イオンチャネルと複数結合することで、シナプス後部の構成要素をつなぐ足場分子として機能し、ShankやHomerなどの他の足場分子とともに、シナプス構造の構築に関与すると考えられる<ref><pubmed>22046028</pubmed></ref><ref><pubmed>28577431</pubmed></ref><ref><pubmed>28179641</pubmed></ref>。一方、抑制性シナプスのシナプス後部では、ゲフィリン（gephyrin）が重要な足場分子として機能する<ref><pubmed>24552784</pubmed></ref><ref><pubmed>28460365</pubmed></ref>。<br />
<br />
4種類あるニューロリギンのうち、ニューロリギン1はグルタミン酸作動性シナプス、ニューロリギン2はGABA作動性シナプス、ニューロリギン3はグルタミン酸とGABA作動性シナプスの両者、そしてニューロリギン4はグリシン作動性シナプスに局在している<ref><pubmed>26209464</pubmed></ref><ref><pubmed>15540461</pubmed></ref><ref><pubmed>17897391</pubmed></ref><ref><pubmed>21282647</pubmed></ref>。培養系の実験では、ニューロリギン1,3,4はグルタミン酸レセプターのクラスタリングを引き起こすが、ニューロリギン２はグルタミン酸レセプターとGABAAレセプターのクラスタリングを引き起こす<ref><pubmed>15620359</pubmed></ref>。<br />
<br />
しかしながら、ニューレキシンやニューロリギンの遺伝子欠失動物では、予想に反して、シナプスの大きさや数にほとんど影響が見られない<ref><pubmed>12827191</pubmed></ref><ref><pubmed>16982420</pubmed></ref><ref><pubmed>28472659</pubmed></ref>ことから、これらの分子の存在が中枢シナプス形成にどの程度の意味を持っているのかは、実は明らかではない。ニューレキシンやニューロリギンの他にも、シナプス接着分子はシナプス分化の誘発能を持つものやニューレキシンに結合するものも含めて多数報告されてきており<ref><pubmed>29100073</pubmed></ref>、冗長性、補完性の高い相互作用システムの一部分である可能性が高い（[[シナプス接着因子]]の項参考）。また、同様な証拠から、シナプスオーガナイザーとして知られているFGFファミリーやWntファミリーといった分泌性の因子なども、この冗長な分子ネットワークの一部であると考えられる<ref><pubmed>20646052</pubmed></ref><ref><pubmed>24105999</pubmed></ref><ref><pubmed>29166241</pubmed></ref>。センチュウやショウジョウバエでは、変異体スクリーニングなどから、シナプス形成に関わるとされる遺伝子が多く同定されている<ref><pubmed>31037336</pubmed></ref><ref><pubmed>30986749</pubmed></ref><ref><pubmed>32741370</pubmed></ref>。このことからも、哺乳類の中枢シナプスに関わる分子機構も実際には更に複雑であることが予想される。<br />
<br />
中枢神経系の神経細胞の周りには、シナプス部位を囲むようにペリニューロナルネット（perineuronal nets）と呼ばれるプロテオグリカンやヒアルロナンなどを構成要素とする細胞外マトリックスが存在しており、臨界期などでのシナプス形成の制御にも関わっていると考えられている<ref><pubmed>27911749</pubmed></ref><ref><pubmed>31263252</pubmed></ref>。<br />
<br />
<br />
==シナプス形成におけるグリア細胞の役割==<br />
これまでシナプス前部とシナプス後部の接点のみに焦点を当ててきたが、シナプス形成には第3の細胞要素であるグリア細胞も関与している<ref><pubmed>30309945</pubmed></ref><ref><pubmed>30347385</pubmed></ref>。シュワン細胞は神経筋接合部のグリア細胞であり、[[アストロサイト]]は中枢シナプスのグリア細胞である。シュワン細胞がシナプス形成や維持に与える影響については、シュワン細胞を除去した動物での神経筋接合部の異常から考察されている<ref><pubmed>27656017</pubmed></ref>。<br />
<br />
グリア細胞の細胞表面にある分子と外部に分泌される分子の両方がシナプス形成に必要である。巨大な細胞外マトリックス分子であるトロンボスポンジン(thrombospondin) <ref><pubmed>15707899</pubmed></ref>、脂質であるコレステロール<ref><pubmed>12648780</pubmed></ref>、ヘビン（hevin) <ref><pubmed>21788491</pubmed></ref>などである。アストロサイトから分泌されるヘビンは、通常は相互作用しない細胞接着分子であるニューレキシンとニューロリギンの一部のアイソフォームを架橋することにより、シナプス形成を促進する<ref><pubmed>26771491</pubmed></ref>。アストロサイト上のグリピカン（glypican)は、シナプス前終末からAMPAレセプタークラスタリング因子ペントラキシン1(pentraxin1)の放出を誘発する<ref><pubmed>29024665</pubmed></ref><ref><pubmed>27986928</pubmed></ref>。また、シナプス形成に拮抗するSPARCなどのシナプスの負の調節因子も知られている<ref><pubmed>21788491</pubmed></ref>。またミクログリアは、シナプス刈り込みに関与することで、神経回路の再編に関与する<ref><pubmed>31283900</pubmed></ref>。 <br />
<br />
== 関連項目 ==<br />
*[[標的認識]]<br />
*[[成長円錐]]<br />
*[[神経筋接合部]]<br />
*[[シナプス刈り込み]]<br />
*[[シナプス接着因子]]<br />
*[[細胞外マトリックス]]<br />
*[[基底膜]]<br />
*[[シナプス前終末]]<br />
*[[シナプス後肥厚]]<br />
== 参考文献 ==<br />
<references /></div>
Masahitoyamagata
https://bsd.neuroinf.jp/w/index.php?title=%E3%83%95%E3%82%A1%E3%82%A4%E3%83%AB:Fig2-SF.jpg&diff=44919
ファイル:Fig2-SF.jpg
2020-10-21T20:49:06Z
<p>Masahitoyamagata: </p>
<hr />
<div>図２ シナプス形成</div>
Masahitoyamagata
https://bsd.neuroinf.jp/w/index.php?title=%E3%83%95%E3%82%A1%E3%82%A4%E3%83%AB:Fig1-SF.jpg&diff=44918
ファイル:Fig1-SF.jpg
2020-10-21T20:48:12Z
<p>Masahitoyamagata: </p>
<hr />
<div>図１ シナプス形成</div>
Masahitoyamagata
https://bsd.neuroinf.jp/w/index.php?title=%E3%82%B7%E3%83%8A%E3%83%97%E3%82%B9%E5%BD%A2%E6%88%90&diff=44917
シナプス形成
2020-10-20T21:06:47Z
<p>Masahitoyamagata: </p>
<hr />
<div><div align="right"> <br />
<font size="+1">[http://researchmap.jp/yamagatm 山形方人]</font><br><br />
''Harvard University''<br><br />
DOI：<selfdoi /> 原稿受付日：年月日 原稿完成日：年月日<br><br />
担当編集委員：<br><br />
</div><br />
<br />
英：synapse formation, synaptogenesis<br />
{{box|text=<br />
神経細胞とその相手の細胞（神経細胞、筋肉など）は、シナプスという特殊化した細胞接着構造で結合している。シナプス形成とは、神経回路形成において、機能するシナプスができあがるまでの過程である。化学シナプスの形成には、シナプス前部（通常は軸索）が、シナプス後部（神経細胞の樹状突起、筋肉など）となる標的細胞の適切な細胞上の適切な位置に結合すること（シナプス特異性）と、シナプス前部と後部がシナプス間隙を介して同じ場所に配向して、シナプス前部にシナプス小胞や分泌装置の蓄積、シナプス後部に神経伝達物質受容体の集合やシナプス重厚部が生じるということ（シナプス分化）がある。シナプス形成は、シナプス前部とシナプス後部の間の相互作用によって制御されており、このような細胞間相互作用を担うシナプス接着分子、細胞外マトリックス分子、更に分泌性因子が同定されている。また、グリア細胞など神経細胞以外のプレーヤーの関与も重要である。神経系の発達期や臨界期においては、化学シナプス形成は過剰に行われ、神経活動などの影響により、シナプス刈り込みにより再編成される。また、発達中のシナプス形成とも共通する成熟した神経系でのシナプス新生は、学習と記憶にも重要な役割をし、シナプス形成の異常は、自閉症、精神疾患、認知症などの原因になると考えられている。}}<br />
<br />
==はじめに==<br />
神経細胞は、[[シナプス]]で適切に結合、情報伝達し、情報処理ユニットとして機能している。シナプスの構造と機能の変化は学習と記憶の基礎であり、シナプスの異常な発達は自閉症、精神疾患、認知症などの原因になる。シナプス形成は、神経細胞の間で適切な場所で生じるシナプスの構造構築から機能発現までの過程であるが、正常の発生だけでなく、可塑性や再生でも見られ、正常発生でのシナプス形成と基本的には共通するものであると考えられる。しかし、シナプス形成といった場合、発生における化学シナプスの構造構築に限定して議論されることが多いので、本項目もそれを中心に扱う。また、化学シナプスの形成とは様相の異なる[[電気シナプス]]（ギャップジャンクション）の形成については、化学シナプス形成との関係もあると考えられるが、本項目では扱わない<ref><pubmed>23237660</pubmed></ref><ref><pubmed>28170151 </pubmed></ref>。<br />
<br />
==シナプス形成の３ステップについての概観==<br />
===（１）シナプス特異性===<br />
軸索は[[軸索ガイダンス]]により、標的細胞近辺に到達する。軸索は特定の標的細胞と特異的にシナプス結合することで、情報を処理できる機能的回路を作る（celluar specificity）。また、シナプスはシナプス後細胞上の特定の部位に形成される（subcellular specificity）<ref><pubmed>19575668</pubmed></ref>。この初期のステップについては、「[[標的認識]]」の項を参考にされたい。神経伝達物質や標的細胞が持つ受容体などのシナプスの神経化学的形質は、遺伝子にプログラムされて発生していく神経系の細胞に内在的なものと大方考えられているが、シナプス形成後の誘導により変換するケースもあるかもしれない<ref><pubmed>10202548</pubmed></ref>。<br />
<br />
===（２）シナプス分化===<br />
次に、標的細胞と接触する軸索の一部分はシナプス小胞やアクティブゾーンを伴うシナプス前終末へと分化し、軸索と接触した標的細胞では局所的に神経伝達物質受容体や細胞内足場が集積しシナプス後部へと分化する。シナプス前部とシナプス後部の特殊化は、軸索と標的細胞の間の相互作用で制御される。この細胞間相互作用についての多くの原理的な知見は、運動神経細胞からの軸索が骨格筋線維上で作る巨大で単純なシナプスである[[神経筋接合部]]（neuromuscular junction, NMJ)についての20世紀に行われた研究から得られてきた<ref><pubmed>10202544</pubmed></ref>。本項目では、神経筋接合部のシナプス形成とともに、今世紀になって、その理解が進んできた中枢神経系でのシナプス形成などについて説明する<ref><pubmed>30359597</pubmed></ref>。<br />
<br />
===（３）シナプス再編成===<br />
シナプス形成後は、シナプスの成熟や神経回路の再編成が観察される。発達期においては、シナプス形成は過剰に行われ、神経活動などの影響により過剰なシナプスは除去さ<ref><pubmed>10719884</pubmed></ref><ref><pubmed>26436703</pubmed></ref><ref><pubmed>29716431</pubmed></ref><ref><pubmed>31372212</pubmed></ref>。シナプスの除去（synapse elimination）は、神経細胞死と同様に、神経回路を再編する重要な過程であるが、これについては「[[シナプス刈り込み]]」の項を参考されたい。シナプス形成は、個体発生の過程だけでなく、成体におけるシナプスの新生は、記憶と学習にも重要な役割をしているし、シナプス形成の異常は、自閉症、精神疾患、認知症などの原因になるとも考えられている。<br />
<br />
==神経筋接合部におけるシナプス形成==<br />
脊髄動物の神経筋接合部は、脊髄にある運動神経細胞から伸長した軸索終末、筋繊維、シュワン細胞の３つの細胞要素からなり、それぞれ特徴的に分化している。シナプス形成は、運動神経の軸索が、軸索ガイダンスを経て、発生中の筋線維に接近して開始される。成長円錐が神経終末に変化し始めると、神経終末と反対側の筋表面の一部が特殊化し始める。発生が進むと、シナプス間隙を介したシナプス前部とシナプス後部の構造的な特徴が明確になり、最終的に筋線維表面の1000分の1の面積を占める成熟した神経筋接合部となる（図１A）。このように、シナプス前部は、シナプス後部と同じ場所で配向し、シナプス前部では、シナプス小胞やアクティブゾーンなど神経伝達物質（アセチルコリン）の分泌装置が集積する。一方、シナプス後部では、効率的なシナプス伝達のために、神経伝達物質受容体（アセチルコリンレセプター）とシグナル伝達装置が集合する<ref><pubmed>10202544</pubmed></ref><ref><pubmed>25493308</pubmed></ref><ref><pubmed>29415504</pubmed></ref><ref><pubmed>29195055</pubmed></ref>。<br />
<br />
===シナプスオーガナイザー===<br />
運動神経細胞と筋線維は、それぞれ独立してシナプス前部とシナプス後部に対応するシナプス構成要素を合成し、自立的に集合させることが可能である。つまり、運動軸索では、筋線維がない状態でもシナプス小胞が見られ、軸索中に保持することができる。一方、筋線維は神経伝達物質受容体であるアセチルコリンレセプターを合成し、神経がない状態でも、細胞表面上に多数のアセチルコリンレセプターからなる巨大集合構造を作ることができる（クラスタリング）。つまり、シナプス形成を制御する細胞間相互作用は、シナプス小胞や受容体クラスタリングそのものの誘発因子というより、むしろそれらの位置を決め配向させる指令因子（オーガナイザー）としての役割が強い。また、軸索中のシナプス小胞の集積は、ポリリジン被覆ビーズなどとの接触でも容易に引き起こされることから、オーガナイザーとしての役割も絶対的なものではなく促進的なものである<ref><pubmed>7127105</pubmed></ref>。 <br />
<br />
===シナプス後部の分化===<br />
しかし、シナプス後部やシナプス前部の分化が、それぞれの接触によって誘発される可能性があることを示す証拠もある。シナプス後部の分化に関わる分子として想定されたがアグリン（agrin）である<ref><pubmed>1966767</pubmed></ref>。シナプス前部筋線維は、[[細胞外マトリックス]]である基底膜（basement membrane, basal lamina）に包まれている。基底膜の成分は、通常、IV型コラーゲン、ヘパラン硫酸プロテオグリカン（パールカンperlecan）、[[ラミニン]]（laminin）などであるが<ref><pubmed>12556454</pubmed></ref>、神経筋接合部の基底膜には、シナプス形成に関わる重要な因子であるヘパラン硫酸プロテオグリカンの一つであるアグリン（agrin）が存在する（図２A）。損傷した筋組織の基底膜を再生する筋肉に接触させると、シナプス後部の特徴を誘導することができる。つまり、基底膜にはアセチルコリンレセプターのクラスタリングに関わる因子が存在することが想定されアグリンは精製された。強いクラスタリング能を持つアグリンは運動神経細胞で発現し、運動神経を通じて運搬され、神経筋接合部の基底膜に保持される。アグリン欠損マウスでは、神経筋接合部が乱れており、神経筋接合部におけるアセチルコリンレセプタークラスターの数、大きさ、密度が減少している<ref><pubmed>8653788</pubmed></ref>。 このことから、アグリンはシナプス後部の分化に関わる神経由来の因子であると考えられる。アグリンは、筋特異的チロシンキナーゼ（MuSK）やLRP4を含むいくつかの受容体に結合して、アダプタータンパク質（Dok7）や細胞骨格タンパク質（Rapsyn）とともに、アセチルコリンレセプターのクラスタリングにつながる一連の情報伝達系に影響を与える<ref><pubmed>20215342</pubmed></ref><ref><pubmed>29415504</pubmed></ref><ref><pubmed>8653786</pubmed></ref><ref><pubmed>8653787</pubmed></ref><ref><pubmed>16794080</pubmed></ref><ref><pubmed>7675108</pubmed></ref>。<br />
===シナプス前部の分化===<br />
一方、シナプス前部の分化に関わる分子として同定されたものには、神経筋接合部特異的ラミニンのアイソフォームがある。再生神経の軸索が筋線維に到達すると、基底膜に最初に接触する。この際、筋線維を死滅させ、基底膜をカラのように残したままでも、再生神経は正確に元の神経筋接合部の基底膜上でシナプス前部の分化を起こした<ref><pubmed>307554</pubmed></ref>。つまり、神経筋接合部の基底膜には、シナプス前部の分化を指示する因子があると想定され、いくつかのそのような分子が同定されている。最もよく研究されているのは、細胞外マトリックス分子ラミニンのアイソフォームである。ラミニンはすべての基底膜の構成分子であり、ラミニンは、α鎖、β鎖、γ鎖のヘテロ3量体であり、少なくとも5本のα鎖、4本のβ鎖、3本のγ鎖のファミリーからなっている。筋線維は複数のラミニンアイソフォームを合成し、基底膜に取り込む。通常の基底膜にはβ1を含むラミニンが存在するが、神経筋接合部のシナプス間隙の基底膜にはβ2を持つアイソフォームが見られる<ref><pubmed>2922051</pubmed></ref>（図２B）。in vitroでは、β2ラミニンに運動神経の軸索が接触すると伸長を停止し、シナプス小胞を蓄積し、神経伝達物質を放出するようになる。β2ラミニンを欠く変異マウスでは、神経末端およびシュワン細胞の発達に異常が生じる<ref><pubmed>7885444</pubmed></ref>。<br />
===シナプス核===<br />
中枢シナプスと違う神経筋接合部の際立った特徴は、筋線維は多数の細胞が融合した多核細胞となっており、神経筋接合部の直下にはシナプス核（synaptic nucleus)と呼ばれる特化した細胞核が存在することである<ref><pubmed>11498047</pubmed></ref>（図２C）。シナプス核ではアセチルコリンレセプター遺伝子の転写が強く、シナプスから離れた核では転写が低く、アセチルコリンレセプターmRNAを局在化させ、神経筋接合部の近辺でアセチルコリンレセプターが集まる要因にもなっている。これは、神経が、アセチルコリンを使って、アセチルコリンレセプター遺伝子のシナプス外での発現を抑制すると同時に、軸索から放出されるニューレギュリン（neuregulin）が、アセチルコリンレセプター遺伝子の転写活性化につながるシグナリング分子となっている<ref><pubmed>9056721</pubmed></ref>。また、発生途中では、アセチルコリンレセプターの組成も変化する。幼若期に特有なδサブユニット遺伝子からε遺伝子への発現の変換がおこる<ref><pubmed>2423878</pubmed></ref>。生体で見られる発生初期のアセチルコリンレセプターのクラスターはプラーク型であるが、最終的にはプレッツェル型になり、神経筋接合部のひだも形成され、運動神経前終末もそれに対応して成熟する<ref><pubmed>15034266</pubmed></ref>。<br />
==中枢神経系のシナプス形成==<br />
中枢神経系のシナプスの形成も神経筋接合部のシナプス形成と類似した点が多い。シナプス前部とシナプス後部の間の相互作用は、予め合成されたシナプス構成要素の位置を制御し合うことで、お互いの分化を制御しシナプスを形成する<ref><pubmed>2655146</pubmed></ref><ref><pubmed>14556707</pubmed></ref><ref><pubmed>30359597</pubmed></ref><ref><pubmed>27462810</pubmed></ref><ref><pubmed>29096080</pubmed></ref>。中枢シナプスでも、神経筋接合部と同じように、神経伝達物質の受容体がシナプス後膜に集中しているし<ref><pubmed>22046028</pubmed></ref>、シナプス前部におけるシナプス小胞の分子的な成り立ちや蓄積も基本的に同じであるように見える<ref><pubmed>22794257</pubmed></ref>。しかし、中枢シナプスの後部は、神経伝達物質受容体の分子種も異なり、その足場となる分子種も神経筋接合部とは大きく異なっている。特に、神経筋接合部では基底膜という細胞外マトリックスであったシナプス間隙の様相は、中枢シナプスでは全く異なり、典型的な細胞外マトリックスは存在せず、シナプス前膜とシナプス後膜の間に存在する細胞間接着がその相互作用の中心であると考えられている<ref><pubmed>20832286</pubmed></ref> <ref><pubmed>30359597</pubmed></ref><ref><pubmed>32359437</pubmed></ref>（図１B)。<br />
===中枢シナプス形成に関わる分子===<br />
シナプス前部とシナプス後部をつなぐ接着分子は多数ある。その中には、シナプス後部の膜に存在するタンパク質であるニューロリギン（neuroligin）がある。それに対応するシナプス前膜上の主要なリガンドはニューレキシン（neurexin）である。細胞表面のニューロリギンが、軸索上にシナプス小胞を集積させる能力は、ニューロリギンを強制発現する非神経細胞の上で、神経細胞を培養するin vitroアッセイ系を用いることによって初めて明らかになった<ref><pubmed>10892652</pubmed></ref>（図3A)。しかし、in vitroアッセイ系で見られるニューロリギンなどのシナプス接着分子の作用には、非神経細胞上にデフォールトで発現しているカドヘリンのような別の接着分子の存在が前提になるようである<ref><pubmed>29760652</pubmed></ref>。また、RIM、RIM-BP、liprin、Munc13、ELKSを含むいくつかのタンパク質ファミリーが、シナプス前部の重要な足場分子として同定されており<ref><pubmed>22794257</pubmed></ref>、シナプス前部表面のLAR-RPTPs（受容体型膜貫通チロシンホスファターゼ）を通じてアクティブゾーンを形成する<ref><pubmed>23916315</pubmed></ref>。<br />
<br />
一方、シナプス後部の樹状突起内の神経伝達物質受容体は、ニューレキシンを発現させた非神経細胞と接触する部位で凝集する<ref><pubmed>15620359</pubmed></ref>。このような神経伝達物質受容体とそのシグナル伝達タンパク質の一部は、アクチン細胞骨格との直接的および間接的な相互作用を介して固定されている。特に、興奮性シナプスで顕著な[[後部肥厚部]]（postsynaptic density)においては、複数のPDZドメインを持ったPSD95などの細胞内タンパク質が、PDZドメイン結合モチーフを持つニューロリギンなどの膜貫通型接着分子、神経伝達物質受容体、イオンチャネルと複数結合することで、シナプス後部の構成要素をつなぐ足場分子として機能し、ShankやHomerなどの他の足場分子とともに、シナプス構造の構築に関与すると考えられる<ref><pubmed>22046028</pubmed></ref><ref><pubmed>28577431</pubmed></ref><ref><pubmed>28179641</pubmed></ref>。一方、抑制性シナプスでは、ゲフィリン（gephyrin）が重要な足場分子として機能する<ref><pubmed>24552784</pubmed></ref>。<br />
<br />
4種類あるニューロリギンのうち、ニューロリギン1はグルタミン酸作動性シナプス、ニューロリギン2はGABA作動性シナプス、ニューロリギン3はグルタミン酸とGABA作動性シナプスの両者、そしてニューロリギン4はグリシン作動性シナプスに局在している<ref><pubmed>26209464</pubmed></ref><ref><pubmed>15540461</pubmed></ref><ref><pubmed>17897391</pubmed></ref><ref><pubmed>21282647</pubmed></ref>。培養系の実験では、ニューロリギン1,3,4はグルタミン酸レセプターのクラスタリングを引き起こすが、ニューロリギン２はグルタミン酸レセプターとGABAAレセプターのクラスタリングを引き起こす<ref><pubmed>15620359</pubmed></ref>。<br />
<br />
しかしながら、ニューレキシンやニューロリギンの遺伝子欠失動物では、予想に反して、シナプスの大きさや数にほとんど影響が見られない<ref><pubmed>12827191</pubmed></ref><ref><pubmed>16982420</pubmed></ref><ref><pubmed>28472659</pubmed></ref>ことから、これらの分子の存在が中枢シナプス形成にどの程度の意味を持っているのかは、実は明らかではない。ニューレキシンやニューロリギンの他にも、シナプス接着分子はシナプス分化の誘発能を持つものやニューレキシンに結合するものも含めて多数報告されており<ref><pubmed>29100073</pubmed></ref>、冗長性、補完性の高い相互作用システムの中にある可能性が高い（[[シナプス接着因子]]の項参考）。また、同様な証拠から、FGFファミリーやWntファミリーといった分泌性の因子なども、この冗長な分子ネットワークの一部であると考えられる<ref><pubmed>20646052</pubmed></ref><ref><pubmed>24105999</pubmed></ref>。<br />
<br />
なお、センチュウやショウジョウバエでは、変異体スクリーニングなどから、シナプス形成に関わるとされる遺伝子が多く同定されている<ref><pubmed>31037336</pubmed></ref><ref><pubmed>30986749</pubmed></ref><ref><pubmed>32741370</pubmed></ref>。このことからも、哺乳類の中枢シナプスに関わる分子機構も実際には更に複雑であることが予想される。<br />
<br />
中枢神経系の神経細胞の周りには、シナプス部位を囲むようにペリニューロナルネット（perineuronal nets）と呼ばれるプロテオグリカンやヒアルロナンなどを構成要素とする細胞外マトリックスが存在しており、臨界期などでのシナプス形成の制御にも関わっていることが想定されている<ref><pubmed>27911749</pubmed></ref><ref><pubmed>31263252</pubmed></ref>。<br />
<br />
<br />
==シナプス形成におけるグリア細胞の役割==<br />
これまでシナプス前部とシナプス後部の接点のみに焦点を当ててきたが、シナプス形成には第3の細胞要素であるグリア細胞も関与している<ref><pubmed>30309945</pubmed></ref><ref><pubmed>30347385</pubmed></ref>。シュワン細胞は神経筋接合部のグリア細胞であり、[[アストロサイト]]は中枢シナプスのグリア細胞である。シュワン細胞がシナプス形成や維持に与える影響については、シュワン細胞を除去した動物での神経筋接合部の異常から考察されている<ref><pubmed>27656017</pubmed></ref>。<br />
<br />
グリア細胞の細胞表面にある分子と外部に分泌される分子の両方がシナプス形成に必要である。巨大な細胞外マトリックス分子であるトロンボスポンジン(thrombospondin) <ref><pubmed>15707899</pubmed></ref>、脂質であるコレステロール<ref><pubmed>12648780</pubmed></ref>、ヘビン（hevin) <ref><pubmed>21788491</pubmed></ref>などである。アストロサイトから分泌されるヘビンは、通常は相互作用しない細胞接着分子であるニューレキシンとニューロリギンの一部のアイソフォームを架橋することにより、シナプス形成を促進する<ref><pubmed>26771491</pubmed></ref>。アストロサイト上のグリピカン（glypican)は、シナプス前終末からAMPAレセプタークラスタリング因子ペントラキシン1(pentraxin1)の放出を誘発する<ref><pubmed>29024665</pubmed></ref><ref><pubmed>27986928</pubmed></ref>。また、シナプス形成に拮抗するSPARCなどのシナプスの負の調節因子も知られている<ref><pubmed>21788491</pubmed></ref>。またミクログリアは、シナプス刈り込みに関与する<ref><pubmed>31283900</pubmed></ref>。 <br />
<br />
== 関連項目 ==<br />
*[[標的認識]]<br />
*[[シナプス刈り込み]]<br />
*[[シナプス接着因子]]<br />
*[[神経筋接合部]]<br />
*[[細胞外マトリックス]]<br />
== 参考文献 ==<br />
<references /></div>
Masahitoyamagata
https://bsd.neuroinf.jp/w/index.php?title=%E3%82%B7%E3%83%8A%E3%83%97%E3%82%B9%E5%BD%A2%E6%88%90&diff=44916
シナプス形成
2020-10-20T21:03:28Z
<p>Masahitoyamagata: </p>
<hr />
<div><div align="right"> <br />
<font size="+1">[http://researchmap.jp/yamagatm 山形方人]</font><br><br />
''Harvard University''<br><br />
DOI：<selfdoi /> 原稿受付日：年月日 原稿完成日：年月日<br><br />
担当編集委員：<br><br />
</div><br />
<br />
英：synapse formation, synaptogenesis<br />
{{box|text=<br />
神経細胞とその相手の細胞（神経細胞、筋肉など）は、シナプスという特殊化した細胞接着構造で結合している。シナプス形成とは、神経回路形成において、機能するシナプスができあがるまでの過程である。化学シナプスの形成には、シナプス前部（通常は軸索）が、シナプス後部（神経細胞の樹状突起、筋肉など）となる標的細胞の適切な細胞上の適切な位置に結合すること（シナプス特異性）と、シナプス前部と後部がシナプス間隙を介して同じ場所に配向して、シナプス前部にシナプス小胞や分泌装置の蓄積、シナプス後部に神経伝達物質受容体の集合やシナプス重厚部が生じるということ（シナプス分化）がある。シナプス形成は、シナプス前部とシナプス後部の間の相互作用によって制御されており、このような細胞間相互作用を担うシナプス接着分子、細胞外マトリックス分子、更に分泌性因子が同定されている。また、グリア細胞など神経細胞以外のプレーヤーの関与も重要である。神経系の発達期や臨界期においては、化学シナプス形成は過剰に行われ、神経活動などの影響により、シナプス刈り込みにより再編成される。また、発達中のシナプス形成とも共通する成熟した神経系でのシナプス新生は、学習と記憶にも重要な役割をし、シナプス形成の異常は、自閉症、精神疾患、認知症などの原因になると考えられている。}}<br />
<br />
==はじめに==<br />
神経細胞は、[[シナプス]]で適切に結合、情報伝達し、情報処理ユニットとして機能している。シナプスの構造と機能の変化は学習と記憶の基礎であり、シナプスの異常な発達は自閉症、精神疾患、認知症などの原因になる。シナプス形成は、神経細胞の間で適切な場所で生じるシナプスの構造構築から機能発現までの過程であるが、正常の発生だけでなく、可塑性や再生でも見られ、正常発生でのシナプス形成と基本的には共通するものであると考えられる。しかし、シナプス形成といった場合、発生における化学シナプスの構造構築に限定して議論されることが多いので、本項目もそれを中心に扱う。また、化学シナプスの形成とは様相の異なる[[電気シナプス]]（ギャップジャンクション）の形成については、化学シナプス形成との関係もあると考えられるが、本項目では扱わない<ref><pubmed>23237660</pubmed></ref><ref><pubmed>28170151 </pubmed></ref>。<br />
<br />
==シナプス形成の３ステップについての概観==<br />
===（１）シナプス特異性===<br />
軸索は[[軸索ガイダンス]]により、標的細胞近辺に到達する。軸索は特定の標的細胞と特異的にシナプス結合することで、情報を処理できる機能的回路を作る（celluar specificity）。また、シナプスはシナプス後細胞上の特定の部位に形成される（subcellular specificity）<ref><pubmed>19575668</pubmed></ref>。この初期のステップについては、「[[標的認識]]」の項を参考にされたい。神経伝達物質や標的細胞が持つ受容体などのシナプスの神経化学的形質は、遺伝子にプログラムされて発生していく神経系の細胞に内在的なものと大方考えられているが、シナプス形成後の誘導により変換するケースもあるかもしれない<ref><pubmed>10202548</pubmed></ref>。<br />
<br />
===（２）シナプス分化===<br />
次に、標的細胞と接触する軸索の一部分はシナプス小胞やアクティブゾーンを伴うシナプス前終末へと分化し、軸索と接触した標的細胞では局所的に神経伝達物質受容体や細胞内足場が集積しシナプス後部へと分化する。シナプス前部とシナプス後部の特殊化は、軸索と標的細胞の間の相互作用で制御される。この細胞間相互作用についての多くの原理的な知見は、運動神経細胞からの軸索が骨格筋線維上で作る巨大で単純なシナプスである[[神経筋接合部]]（neuromuscular junction, NMJ)についての20世紀に行われた研究から得られてきた<ref><pubmed>10202544</pubmed></ref>。本項目では、神経筋接合部のシナプス形成とともに、今世紀になって、その理解が進んできた中枢神経系でのシナプス形成などについて説明する<ref><pubmed>30359597</pubmed></ref>。<br />
<br />
===（３）シナプス再編成===<br />
シナプス形成後は、シナプスの成熟や神経回路の再編成が観察される。発達期においては、シナプス形成は過剰に行われ、神経活動などの影響により過剰なシナプスは除去さ<ref><pubmed>10719884</pubmed></ref><ref><pubmed>26436703</pubmed></ref><ref><pubmed>29716431</pubmed></ref><ref><pubmed>31372212</pubmed></ref>。シナプスの除去（synapse elimination）は、神経細胞死と同様に、神経回路を再編する重要な過程であるが、これについては「[[シナプス刈り込み]]」の項を参考されたい。シナプス形成は、個体発生の過程だけでなく、成体におけるシナプスの新生は、記憶と学習にも重要な役割をしているし、シナプス形成の異常は、自閉症、精神疾患、認知症などの原因になるとも考えられている。<br />
<br />
==神経筋接合部におけるシナプス形成==<br />
脊髄動物の神経筋接合部は、脊髄にある運動神経細胞から伸長した軸索終末、筋繊維、シュワン細胞の３つの細胞要素からなり、それぞれ特徴的に分化している。シナプス形成は、運動神経の軸索が、軸索ガイダンスを経て、発生中の筋線維に接近して開始される。成長円錐が神経終末に変化し始めると、神経終末と反対側の筋表面の一部が特殊化し始める。発生が進むと、シナプス間隙を介したシナプス前部とシナプス後部の構造的な特徴が明確になり、最終的に筋線維表面の1000分の1の面積を占める成熟した神経筋接合部となる（図１A）。このように、シナプス前部は、シナプス後部と同じ場所で配向し、シナプス前部では、シナプス小胞やアクティブゾーンなど神経伝達物質（アセチルコリン）の分泌装置が集積する。一方、シナプス後部では、効率的なシナプス伝達のために、神経伝達物質受容体（アセチルコリンレセプター）とシグナル伝達装置が集合する<ref><pubmed>10202544</pubmed></ref><ref><pubmed>25493308</pubmed></ref><ref><pubmed>29415504</pubmed></ref><ref><pubmed>29195055</pubmed></ref>。<br />
<br />
===シナプスオーガナイザー===<br />
運動神経細胞と筋線維は、それぞれ独立してシナプス前部とシナプス後部に対応するシナプス構成要素を合成し、自立的に集合させることが可能である。つまり、運動軸索では、筋線維がない状態でもシナプス小胞が見られ、軸索中に保持することができる。一方、筋線維は神経伝達物質受容体であるアセチルコリンレセプターを合成し、神経がない状態でも、細胞表面上に多数のアセチルコリンレセプターからなる巨大集合構造を作ることができる（クラスタリング）。つまり、シナプス形成を制御する細胞間相互作用は、シナプス小胞や受容体クラスタリングそのものの誘発因子というより、むしろそれらの位置を決め配向させる指令因子（オーガナイザー）としての役割が強い。また、軸索中のシナプス小胞の集積は、ポリリジン被覆ビーズなどとの接触でも容易に引き起こされることから、オーガナイザーとしての役割も絶対的なものではなく促進的なものである<ref><pubmed>7127105</pubmed></ref>。 <br />
<br />
===シナプス後部の分化===<br />
しかし、シナプス後部やシナプス前部の分化が、それぞれの接触によって誘発される可能性があることを示す証拠もある。シナプス後部の分化に関わる分子として想定されたがアグリン（agrin）である<ref><pubmed>1966767</pubmed></ref>。シナプス前部筋線維は、[[細胞外マトリックス]]である基底膜（basement membrane, basal lamina）に包まれている。基底膜の成分は、通常、IV型コラーゲン、ヘパラン硫酸プロテオグリカン（パールカンperlecan）、[[ラミニン]]（laminin）などであるが<ref><pubmed>12556454</pubmed></ref>、神経筋接合部の基底膜には、シナプス形成に関わる重要な因子であるヘパラン硫酸プロテオグリカンの一つであるアグリン（agrin）が存在する（図２A）。損傷した筋組織の基底膜を再生する筋肉に接触させると、シナプス後部の特徴を誘導することができる。つまり、基底膜にはアセチルコリンレセプターのクラスタリングに関わる因子が存在することが想定されアグリンは精製された。強いクラスタリング能を持つアグリンは運動神経細胞で発現し、運動神経を通じて運搬され、神経筋接合部の基底膜に保持される。アグリン欠損マウスでは、神経筋接合部が乱れており、神経筋接合部におけるアセチルコリンレセプタークラスターの数、大きさ、密度が減少している<ref><pubmed>8653788</pubmed></ref>。 このことから、アグリンはシナプス後部の分化に関わる神経由来の因子であると考えられる。アグリンは、筋特異的チロシンキナーゼ（MuSK）やLRP4を含むいくつかの受容体に結合して、アダプタータンパク質（Dok7）や細胞骨格タンパク質（Rapsyn）とともに、アセチルコリンレセプターのクラスタリングにつながる一連の情報伝達系に影響を与える<ref><pubmed>20215342</pubmed></ref><ref><pubmed>29415504</pubmed></ref><ref><pubmed>8653786</pubmed></ref><ref><pubmed>8653787</pubmed></ref><ref><pubmed>16794080</pubmed></ref><ref><pubmed>7675108</pubmed></ref>。<br />
===シナプス前部の分化===<br />
一方、シナプス前部の分化に関わる分子として同定されたものには、神経筋接合部特異的ラミニンのアイソフォームがある。再生神経の軸索が筋線維に到達すると、基底膜に最初に接触する。この際、筋線維を死滅させ、基底膜をカラのように残したままでも、再生神経は正確に元の神経筋接合部の基底膜上でシナプス前部の分化を起こした<ref><pubmed>307554</pubmed></ref>。つまり、神経筋接合部の基底膜には、シナプス前部の分化を指示する因子があると想定され、いくつかのそのような分子が同定されている。最もよく研究されているのは、細胞外マトリックス分子ラミニンのアイソフォームである。ラミニンはすべての基底膜の構成分子であり、ラミニンは、α鎖、β鎖、γ鎖のヘテロ3量体であり、少なくとも5本のα鎖、4本のβ鎖、3本のγ鎖のファミリーからなっている。筋線維は複数のラミニンアイソフォームを合成し、基底膜に取り込む。通常の基底膜にはβ1を含むラミニンが存在するが、神経筋接合部のシナプス間隙の基底膜にはβ2を持つアイソフォームが見られる<ref><pubmed>2922051</pubmed></ref>（図２B）。in vitroでは、β2ラミニンに運動神経の軸索が接触すると伸長を停止し、シナプス小胞を蓄積し、神経伝達物質を放出するようになる。β2ラミニンを欠く変異マウスでは、神経末端およびシュワン細胞の発達に異常が生じる<ref><pubmed>7885444</pubmed></ref>。<br />
===シナプス核===<br />
中枢シナプスと違う神経筋接合部の際立った特徴は、筋線維は多数の細胞が融合した多核細胞となっており、神経筋接合部の直下にはシナプス核（synaptic nucleus)と呼ばれる特化した細胞核が存在することである<ref><pubmed>11498047</pubmed></ref>（図２C）。シナプス核ではアセチルコリンレセプター遺伝子の転写が強く、シナプスから離れた核では転写が低く、アセチルコリンレセプターmRNAを局在化させ、神経筋接合部の近辺でアセチルコリンレセプターが集まる要因にもなっている。これは、神経が、アセチルコリンを使って、アセチルコリンレセプター遺伝子のシナプス外での発現を抑制すると同時に、軸索から放出されるニューレギュリン（neuregulin）が、アセチルコリンレセプター遺伝子の転写活性化につながるシグナリング分子となっている<ref><pubmed>9056721</pubmed></ref>。また、発生途中では、アセチルコリンレセプターの組成も変化する。幼若期に特有なδサブユニット遺伝子からε遺伝子への発現の変換がおこる<ref><pubmed>2423878</pubmed></ref>。生体で見られる発生初期のアセチルコリンレセプターのクラスターはプラーク型であるが、最終的にはプレッツェル型になり、神経筋接合部のひだも形成され、運動神経前終末もそれに対応して成熟する<ref><pubmed>15034266</pubmed></ref>。<br />
==中枢神経系のシナプス形成==<br />
中枢神経系のシナプスの形成も神経筋接合部のシナプス形成と類似した点が多い。シナプス前部とシナプス後部の間の相互作用は、予め合成されたシナプス構成要素の位置を制御し合うことで、お互いの分化を制御しシナプスを形成する<ref><pubmed>2655146</pubmed></ref><ref><pubmed>14556707</pubmed></ref><ref><pubmed>30359597</pubmed></ref><ref><pubmed>27462810</pubmed></ref><ref><pubmed>29096080</pubmed></ref>。中枢シナプスでも、神経筋接合部と同じように、神経伝達物質の受容体がシナプス後膜に集中しているし<ref><pubmed>22046028</pubmed></ref>、シナプス前部におけるシナプス小胞の分子的な成り立ちや蓄積も基本的に同じであるように見える<ref><pubmed>22794257</pubmed></ref>。しかし、中枢シナプスの後部は、神経伝達物質受容体の分子種も異なり、その足場となる分子種も神経筋接合部とは大きく異なっている。特に、神経筋接合部では基底膜という細胞外マトリックスであったシナプス間隙の様相は、中枢シナプスでは全く異なり、典型的な細胞外マトリックスは存在せず、シナプス前膜とシナプス後膜の間に存在する細胞間接着がその相互作用の中心であると考えられている<ref><pubmed>20832286</pubmed></ref> <ref><pubmed>30359597</pubmed></ref><ref><pubmed>32359437</pubmed></ref>（図１B)。<br />
===中枢シナプス形成に関わる分子===<br />
シナプス前部とシナプス後部をつなぐ接着分子は多数ある。その中には、シナプス後部の膜に存在するタンパク質であるニューロリギン（neuroligin）がある。それに対応するシナプス前膜上の主要なリガンドはニューレキシン（neurexin）である。細胞表面のニューロリギンが、軸索上にシナプス小胞を集積させる能力は、ニューロリギンを強制発現する非神経細胞の上で、神経細胞を培養するin vitroアッセイ系を用いることによって初めて明らかになった<ref><pubmed>10892652</pubmed></ref>（図3A)。しかし、in vitroアッセイ系で見られるニューロリギンなどのシナプス接着分子の作用には、非神経細胞上にデフォールトで発現しているカドヘリンのような別の接着分子の存在が前提になるようである<ref><pubmed>29760652</pubmed></ref>。また、RIM、RIM-BP、liprin、Munc13、ELKSを含むいくつかのタンパク質ファミリーが、シナプス前部の重要な足場分子として同定されており<ref><pubmed>22794257</pubmed></ref>、シナプス前部表面のLAR-RPTPs（受容体型膜貫通チロシンホスファターゼ）を通じてアクティブゾーンを形成する<ref><pubmed>23916315</pubmed></ref>。<br />
<br />
一方、シナプス後部の樹状突起内の神経伝達物質受容体は、ニューレキシンを発現させた非神経細胞と接触する部位で凝集する<ref><pubmed>15620359</pubmed></ref>。このような神経伝達物質受容体とそのシグナル伝達タンパク質の一部は、アクチン細胞骨格との直接的および間接的な相互作用を介して固定されている。特に、興奮性シナプスで顕著な[[後部肥厚部]]（postsynaptic density)においては、複数のPDZドメインを持ったPSD95などの細胞内タンパク質が、PDZドメイン結合モチーフを持つニューロリギンなどの膜貫通型接着分子、神経伝達物質受容体、イオンチャネルと複数結合することで、シナプス後部の構成要素をつなぐ足場分子として機能し、ShankやHomerなどの他の足場分子とともに、シナプス構造の構築に関与すると考えられる<ref><pubmed>22046028</pubmed></ref><ref><pubmed>28577431</pubmed></ref><ref><pubmed>28179641</pubmed></ref>。一方、抑制性シナプスでは、ゲフィリン（gephyrin）が重要な足場分子として機能する<ref><pubmed>24552784</pubmed></ref>。<br />
<br />
4種類あるニューロリギンのうち、ニューロリギン1はグルタミン酸作動性シナプス、ニューロリギン2はGABA作動性シナプス、ニューロリギン3はグルタミン酸とGABA作動性シナプスの両者、そしてニューロリギン4はグリシン作動性シナプスに局在している<ref><pubmed>26209464</pubmed></ref><ref><pubmed>15540461</pubmed></ref><ref><pubmed>17897391</pubmed></ref><ref><pubmed>21282647</pubmed></ref>。培養系の実験では、ニューロリギン1,3,4はグルタミン酸レセプターのクラスタリングを引き起こすが、ニューロリギン２はグルタミン酸レセプターとGABAAレセプターのクラスタリングを引き起こす<ref><pubmed>15620359</pubmed></ref>。<br />
<br />
しかしながら、ニューレキシンやニューロリギンの遺伝子欠失動物では、予想に反して、シナプスの大きさや数にほとんど影響が見られない<ref><pubmed>12827191</pubmed></ref><ref><pubmed>16982420</pubmed></ref><ref><pubmed>28472659</pubmed></ref>ことから、これらの分子の存在が中枢シナプス形成にどの程度の意味を持っているのかは、実は明らかではない。ニューレキシンやニューロリギンの他にも、シナプス接着分子はシナプス分化の誘発能を持つものやニューレキシンに結合するものも含めて多数報告されており<ref><pubmed>29100073</pubmed></ref>、冗長性、補完性の高い相互作用システムの中にある可能性が高い（[[シナプス接着因子]]の項参考）。また、同様な証拠から、FGFファミリーやWntファミリーといった分泌性の因子なども、この冗長な分子ネットワークの一部であると考えられる<ref><pubmed>20646052</pubmed></ref><ref><pubmed>24105999</pubmed></ref>。<br />
<br />
なお、センチュウやショウジョウバエでは、変異体スクリーニングなどから、シナプス形成に関わるとされる遺伝子が多く同定されている<ref><pubmed>31037336</pubmed></ref><ref><pubmed>30986749</pubmed></ref><ref><pubmed>32741370</pubmed></ref>。このことからも、哺乳類の中枢シナプスに関わる分子機構も実際には更に複雑であることが予想される。<br />
<br />
中枢神経系の神経細胞の周りには、シナプス部位を囲むようにペリニューロナルネット（perineuronal nets）と呼ばれるプロテオグリカンやヒアルロナンなどを構成要素とする細胞外マトリックスが存在しており、臨界期などでのシナプス形成の制御にも関わっていることが想定されている<ref><pubmed>227911749</pubmed></ref><ref><pubmed>31263252</pubmed></ref>。<br />
<br />
<br />
==シナプス形成におけるグリア細胞の役割==<br />
これまでシナプス前部とシナプス後部の接点のみに焦点を当ててきたが、シナプス形成には第3の細胞要素であるグリア細胞も関与している<ref><pubmed>30309945</pubmed></ref><ref><pubmed>30347385</pubmed></ref>。シュワン細胞は神経筋接合部のグリア細胞であり、[[アストロサイト]]は中枢シナプスのグリア細胞である。シュワン細胞がシナプス形成や維持に与える影響については、シュワン細胞を除去した動物での神経筋接合部の異常から考察されている<ref><pubmed>27656017</pubmed></ref>。<br />
<br />
グリア細胞の細胞表面にある分子と外部に分泌される分子の両方がシナプス形成に必要である。巨大な細胞外マトリックス分子であるトロンボスポンジン(thrombospondin) <ref><pubmed>15707899</pubmed></ref>、脂質であるコレステロール<ref><pubmed>12648780</pubmed></ref>、ヘビン（hevin) <ref><pubmed>21788491</pubmed></ref>などである。アストロサイトから分泌されるヘビンは、通常は相互作用しない細胞接着分子であるニューレキシンとニューロリギンの一部のアイソフォームを架橋することにより、シナプス形成を促進する<ref><pubmed>26771491</pubmed></ref>。アストロサイト上のグリピカン（glypican)は、シナプス前終末からAMPAレセプタークラスタリング因子ペントラキシン1(pentraxin1)の放出を誘発する<ref><pubmed>29024665</pubmed></ref><ref><pubmed>27986928</pubmed></ref>。また、シナプス形成に拮抗するSPARCなどのシナプスの負の調節因子も知られている<ref><pubmed>21788491</pubmed></ref>。またミクログリアは、シナプス刈り込みに関与する<ref><pubmed>31283900</pubmed></ref>。 <br />
<br />
== 関連項目 ==<br />
*[[標的認識]]<br />
*[[シナプス刈り込み]]<br />
*[[シナプス接着因子]]<br />
*[[神経筋接合部]]<br />
*[[細胞外マトリックス]]<br />
== 参考文献 ==<br />
<references /></div>
Masahitoyamagata
https://bsd.neuroinf.jp/w/index.php?title=%E3%82%B7%E3%83%8A%E3%83%97%E3%82%B9%E5%BD%A2%E6%88%90&diff=44915
シナプス形成
2020-10-20T19:12:46Z
<p>Masahitoyamagata: </p>
<hr />
<div><div align="right"> <br />
<font size="+1">[http://researchmap.jp/yamagatm 山形方人]</font><br><br />
''Harvard University''<br><br />
DOI：<selfdoi /> 原稿受付日：年月日 原稿完成日：年月日<br><br />
担当編集委員：<br><br />
</div><br />
<br />
英：synapse formation, synaptogenesis<br />
{{box|text=<br />
神経細胞とその相手の細胞（神経細胞、筋肉など）は、シナプスという特殊化した細胞接着構造で結合している。シナプス形成とは、神経回路形成において、機能するシナプスができあがるまでの過程である。化学シナプスの形成には、シナプス前部（通常は軸索）が、シナプス後部（神経細胞の樹状突起、筋肉など）となる標的細胞の適切な細胞上の適切な位置に結合すること（シナプス特異性）と、シナプス前部と後部がシナプス間隙を介して同じ場所に配向して、シナプス前部にシナプス小胞や分泌装置の蓄積、シナプス後部に神経伝達物質受容体の集合やシナプス重厚部が生じるということ（シナプス分化）がある。シナプス形成は、シナプス前部とシナプス後部の間の相互作用によって制御されており、このような細胞間相互作用を担うシナプス接着分子、細胞外マトリックス分子、更に分泌性因子が同定されている。また、グリア細胞など神経細胞以外のプレーヤーの関与も重要である。神経系の発達期や臨界期においては、化学シナプス形成は過剰に行われ、神経活動などの影響により、シナプス刈り込みにより再編成される。また、発達中のシナプス形成とも共通する成熟した神経系でのシナプス新生は、学習と記憶といった可塑性にも重要な役割をしている。シナプス形成の異常は、自閉症、精神疾患、認知症などの原因になると考えられている。}}<br />
<br />
==はじめに==<br />
神経細胞は、[[シナプス]]で適切に結合、情報伝達し、情報処理ユニットとして機能している。シナプスの構造と機能の変化は学習と記憶の基礎であり、シナプスの異常な発達は自閉症、精神疾患、認知症などの原因になる。シナプス形成は、神経細胞の間で適切な場所で生じるシナプスの構造構築から機能発現までの過程であるが、正常の発生だけでなく、可塑性や再生でも見られ、正常発生でのシナプス形成と基本的には共通するものであると考えられる。しかし、シナプス形成といった場合、発生における化学シナプスの構造構築に限定して議論されることが多いので、本項目もそれを中心に扱う。また、化学シナプスの形成とは様相の異なる[[電気シナプス]]（ギャップジャンクション）の形成については、化学シナプス形成との関係もあると考えられるが、本項目では扱わない<ref><pubmed>23237660</pubmed></ref><ref><pubmed>28170151 </pubmed></ref>。<br />
<br />
==シナプス形成の３ステップについての概観==<br />
===（１）シナプス特異性===<br />
軸索は特定の標的細胞と特異的にシナプス結合することで、情報を処理できる機能的回路を作る（細胞特異性celluar specificity）。また、シナプスはシナプス後細胞上の特定の部位に形成される（細胞下の特異性subcellular specificity）。この初期のステップについては、「[[標的認識]]」の項を参考にされたい。<br />
<br />
===（２）シナプス分化===<br />
次に、標的細胞と接触する軸索の一部分はシナプス小胞やアクティブゾーンを伴うシナプス前終末へと分化し、軸索と接触した標的細胞では局所的に神経伝達物質受容体や細胞内足場が集積しシナプス後部へと分化する。シナプス前部とシナプス後部の特殊化は、軸索と標的細胞の間の相互作用で制御される。この細胞間相互作用についての多くの原理的な知見は、運動神経細胞からの軸索が骨格筋線維上で作る巨大で単純なシナプスである[[神経筋接合部]]（neuromuscular junction, NMJ)についての20世紀に行われた研究から得られてきた<ref><pubmed>10202544</pubmed></ref>。本項目では、神経筋接合部のシナプス形成とともに、今世紀になって、その理解が進んできた中枢神経系でのシナプス形成などについて説明する<ref><pubmed>30359597</pubmed></ref>。<br />
<br />
===（３）シナプス再編成===<br />
シナプス形成後は、シナプスの成熟や神経回路の再編成が観察される。発達期においては、シナプス形成は過剰に行われ、神経活動などの影響により過剰なシナプスは除去される。シナプスの除去（synapse elimination）は、神経細胞死と同様に、神経回路を再編する重要な過程であるが、これについては「[[シナプス刈り込み]]」の項を参考されたい。シナプス形成は、個体発生の過程だけでなく、成体におけるシナプスの新生は、記憶と学習にも重要な役割をしているし、シナプス形成の異常は、自閉症、精神疾患、認知症などの原因になるとも考えられている。<br />
<br />
==神経筋接合部におけるシナプス形成==<br />
脊髄動物の神経筋接合部は、脊髄にある運動神経細胞から伸長した軸索終末、筋繊維、シュワン細胞の３つの細胞要素からなり、それぞれ特徴的に分化している。シナプス形成は、運動神経の軸索が、軸索ガイダンスを経て、発生中の筋繊維に接近して開始される。成長円錐が神経終末に変化し始めると、神経終末と反対側の筋表面の一部が特殊化し始める。発生が進むと、シナプス間隙を介したシナプス前部とシナプス後部の構造的な特徴が明確になり、最終的に成熟した神経筋接合部となる（図１）。このように、シナプス前部は、シナプス後部と同じ場所で配向し、シナプス前部では、シナプス小胞やアクティブゾーンなど神経伝達物質（アセチルコリン）の分泌装置が集積する。一方、シナプス後部では、効率的なシナプス伝達のために、神経伝達物質受容体（アセチルコリンレセプター）とシグナル伝達装置が集合する<ref><pubmed>10202544</pubmed></ref><ref><pubmed>25493308</pubmed></ref><ref><pubmed>29415504</pubmed></ref><ref><pubmed>29195055</pubmed></ref>。<br />
<br />
===シナプスオーガナイザー===<br />
運動神経細胞と筋線維は、それぞれ独立してシナプス前部とシナプス後部に対応するシナプス構成要素を合成し、自立的に集合させることが可能である。つまり、運動軸索では、筋線維がない状態でもシナプス小胞が見られ、軸索中に保持することができる。一方、筋線維は神経伝達物質受容体であるアセチルコリンレセプターを合成し、神経がない状態でも、細胞表面上に多数のアセチルコリンレセプターからなる巨大集合構造を作ることができる（クラスタリング）。つまり、シナプス形成を制御する細胞間相互作用は、シナプス小胞や受容体クラスタリングそのものの誘発因子というより、むしろそれらの位置を決め配向させる指令因子（オーガナイザー）としての役割が強い。また、軸索中のシナプス小胞の集積は、ポリリジン被覆ビーズなどとの接触でも容易に引き起こされることから、オーガナイザーとしての役割も絶対的なものではなく促進的なものである<ref><pubmed>7127105</pubmed></ref>。 <br />
<br />
===シナプス後部の分化===<br />
しかし、シナプス後部やシナプス前部の分化が、それぞれの接触によって誘発される可能性があることを示す証拠もある。シナプス後部の分化に関わる分子として想定されたがアグリン（agrin）である<ref><pubmed>1966767</pubmed></ref>。シナプス前部筋線維は、[[細胞外マトリックス]]である基底膜（basement membrane, basal lamina）に包まれている。基底膜の成分は、通常、IV型コラーゲン、ヘパラン硫酸プロテオグリカン（パールカンperlecan）、[[ラミニン]]（laminin）などであるが<ref><pubmed>12556454</pubmed></ref>、神経筋接合部の基底膜には、シナプス形成に関わる重要な因子であるヘパラン硫酸プロテオグリカンの一つであるアグリン（agrin）が存在する。損傷した筋組織の基底膜を再生する筋肉に接触させると、シナプス後部の特徴を誘導することができる。つまり、基底膜にはアセチルコリンレセプターのクラスタリングに関わる因子が存在することが想定されアグリンは精製された。アグリンは運動神経細胞で発現し、運動神経を通じて運搬され、神経筋接合部の基底膜に保持される。アグリン欠損マウスでは、神経筋接合部が乱れており、神経筋接合部におけるアセチルコリンレセプタークラスターの数、大きさ、密度が減少している<ref><pubmed>8653788</pubmed></ref>。 このことから、アグリンはシナプス後部の分化に関わる神経由来の因子であると考えられる。アグリンは、筋特異的チロシンキナーゼ（MuSK）やLRP4を含むいくつかの受容体に結合して、アダプタータンパク質（Dok7）や細胞骨格タンパク質（Rapsyn）とともに、アセチルコリンレセプターのクラスタリングにつながる一連の情報伝達系に影響を与える<ref><pubmed>20215342</pubmed></ref><ref><pubmed>29415504</pubmed></ref><ref><pubmed>8653786</pubmed></ref><ref><pubmed>8653787</pubmed></ref><ref><pubmed>16794080</pubmed></ref><ref><pubmed>7675108</pubmed></ref>。<br />
===シナプス前部の分化===<br />
一方、シナプス前部の分化に関わる分子として同定されたものには、神経筋接合部特異的ラミニンのアイソフォームがある。再生神経の軸索が筋線維に到達すると、基底膜に最初に接触する。この際、筋線維を死滅させ、基底膜をカラのように残したままでも、再生神経は正確に元の神経筋接合部の基底膜上でシナプス前部の分化を起こした<ref><pubmed>307554</pubmed></ref>。つまり、神経筋接合部の基底膜には、シナプス前部の分化を指示する因子があると想定され、いくつかのそのような分子が同定されている。最もよく研究されているのは、細胞外マトリックス分子ラミニンのアイソフォームである。ラミニンはすべての基底膜の構成分子であり、ラミニンは、α鎖、β鎖、γ鎖のヘテロ3量体であり、少なくとも5本のα鎖、4本のβ鎖、3本のγ鎖のファミリーからなっている。筋線維は複数のラミニンアイソフォームを合成し、基底膜に取り込む。通常の基底膜にはβ1を含むラミニンが存在するが、神経筋接合部のシナプス間隙の基底膜にはβ2を持つアイソフォームが見られる<ref><pubmed>2922051</pubmed></ref>。in vitroでは、β2ラミニンに運動神経の軸索が接触すると伸長を停止し、シナプス小胞を蓄積し、神経伝達物質を放出するようになる。β2ラミニンを欠く変異マウスでは、神経末端およびシュワン細胞の発達に異常が生じる<ref><pubmed>7885444</pubmed></ref>。<br />
===シナプス核===<br />
中枢シナプスと違う神経筋接合部の際立った特徴は、筋線維は多数の細胞が融合した多核細胞となっており、神経筋接合部の直下にはシナプス核（synaptic nucleus)と呼ばれる特化した細胞核が存在することである<ref><pubmed>11498047</pubmed></ref>。シナプス核ではアセチルコリンレセプター遺伝子の転写が強く、シナプスから離れた核では転写が低く、アセチルコリンレセプターmRNAを局在化させ、神経筋接合部の近辺でアセチルコリンレセプターが集まる要因にもなっている。これは、神経が、アセチルコリンを使って、アセチルコリンレセプター遺伝子のシナプス外での発現を抑制すると同時に、軸索から放出されるニューレギュリン（neuregulin）が、アセチルコリンレセプター遺伝子の転写活性化につながるシグナリング分子となっている<ref><pubmed>9056721</pubmed></ref>。また、発生途中では、アセチルコリンレセプターの組成も変化する。幼若期に特有なδサブユニット遺伝子からε遺伝子への発現の変換がおこる<ref><pubmed>2423878</pubmed></ref>。生体で見られる発生初期のアセチルコリンレセプターのクラスターはプラーク型であるが、最終的にはプレッツェル型になり、神経筋接合部のひだも形成され、運動神経前終末もそれに対応して成熟する<ref><pubmed>15034266</pubmed></ref>。<br />
==中枢神経系のシナプス形成==<br />
中枢神経系のシナプスの形成も神経筋接合部のシナプス形成と類似した点が多い。シナプス前部とシナプス後部の間の相互作用は、予め合成されたシナプス構成要素の位置を制御し合うことで、お互いの分化を制御しシナプスを形成する<ref><pubmed>2655146</pubmed></ref><ref><pubmed>14556707</pubmed></ref><ref><pubmed>30359597</pubmed></ref><ref><pubmed>27462810</pubmed></ref><ref><pubmed>29096080</pubmed></ref>。中枢シナプスでも、神経筋接合部と同じように、神経伝達物質の受容体がシナプス後膜に集中しているし<ref><pubmed>22046028</pubmed></ref>、シナプス前部におけるシナプス小胞の分子的な成り立ちや蓄積も基本的に同じであるように見える<ref><pubmed>22794257</pubmed></ref>。しかし、中枢シナプスの後部は、神経伝達物質受容体の分子種も異なり、その足場となる分子種も神経筋接合部とは大きく異なっている。特に、神経筋接合部では基底膜という細胞外マトリックスであったシナプス間隙の様相は、中枢シナプスでは全く異なり、典型的な細胞外マトリックスは存在せず、シナプス前膜とシナプス後膜の間に存在する細胞間接着がその相互作用の中心であると考えられている<ref><pubmed>20832286</pubmed></ref> <ref><pubmed>30359597</pubmed></ref><ref><pubmed>32359437</pubmed></ref>。<br />
===中枢シナプス形成に関わる分子===<br />
シナプス前部とシナプス後部をつなぐ接着分子は多数ある。その中には、シナプス後部の膜に存在するタンパク質であるニューロリギン（neuroligin）がある。それに対応するシナプス前膜上の主要なリガンドはニューレキシン（neurexin）である。細胞表面のニューロリギンが、軸索上にシナプス小胞を集積させる能力は、ニューロリギンを強制発現する非神経細胞の上で、神経細胞を培養するin vitroアッセイ系を用いることによって初めて明らかになった<ref><pubmed>10892652</pubmed></ref>。しかし、in vitroアッセイ系で見られるニューロリギンなどのシナプス接着分子の作用には、非神経細胞上にデフォールトで発現しているカドヘリンのような別の接着分子の存在が前提になるようである<ref><pubmed>29760652</pubmed></ref>。また、RIM、RIM-BP、liprin、Munc13、ELKSを含むいくつかのタンパク質ファミリーが、シナプス前部の重要な足場分子として同定されており<ref><pubmed>22794257</pubmed></ref>、シナプス前部表面のLAR-RPTPs（受容体型膜貫通チロシンホスファターゼ）を通じてアクティブゾーンを形成する<ref><pubmed>23916315</pubmed></ref>。<br />
<br />
一方、シナプス後部の樹状突起内の神経伝達物質受容体は、ニューレキシンを発現させた非神経細胞と接触する部位で凝集する<ref><pubmed>15620359</pubmed></ref>。このような神経伝達物質受容体とそのシグナル伝達タンパク質の一部は、アクチン細胞骨格との直接的および間接的な相互作用を介して固定されている。特に、興奮性シナプスで顕著な[[後部肥厚部]]（postsynaptic density)においては、複数のPDZドメインを持ったPSD95などの細胞内タンパク質が、PDZドメイン結合モチーフを持つニューロリギンなどの膜貫通型接着分子、神経伝達物質受容体、イオンチャネルと複数結合することで、シナプス後部の構成要素をつなぐ足場分子として機能し、ShankやHomerなどの他の足場分子とともに、シナプス構造の構築に関与すると考えられる<ref><pubmed>22046028</pubmed></ref><ref><pubmed>28577431</pubmed></ref><ref><pubmed>28179641</pubmed></ref>。一方、抑制性シナプスでは、ゲフィリン（gephyrin）が重要な足場分子として機能する<ref><pubmed>24552784</pubmed></ref>。<br />
<br />
4種類あるニューロリギンのうち、ニューロリギン1はグルタミン酸作動性シナプス、ニューロリギン2はGABA作動性シナプス、ニューロリギン3はグルタミン酸とGABA作動性シナプスの両者、そしてニューロリギン4はグリシン作動性シナプスに局在している<ref><pubmed>26209464</pubmed></ref><ref><pubmed>15540461</pubmed></ref><ref><pubmed>17897391</pubmed></ref><ref><pubmed>21282647</pubmed></ref>。培養系の実験では、ニューロリギン1,3,4はグルタミン酸レセプターのクラスタリングを引き起こすが、ニューロリギン２はグルタミン酸レセプターとGABAAレセプターのクラスタリングを引き起こす<ref><pubmed>15620359</pubmed></ref>。<br />
<br />
しかしながら、ニューレキシンやニューロリギンの遺伝子欠失動物では、予想に反して、シナプスの大きさや数にほとんど影響が見られない<ref><pubmed>12827191</pubmed></ref><ref><pubmed>16982420</pubmed></ref><ref><pubmed>28472659</pubmed></ref>ことから、これらの分子の存在が中枢シナプス形成にどの程度の意味を持っているのかは、実は明らかではない。ニューレキシンやニューロリギンの他にも、シナプス接着分子はシナプス分化の誘発能を持つものやニューレキシンに結合するものも含めて多数報告されており<ref><pubmed>29100073</pubmed></ref>、冗長性、補完性の高い相互作用システムの中にある可能性が高い（[[シナプス接着因子]]の項参考）。また、同様な証拠から、FGFファミリーやWntファミリーといった分泌性の因子なども、この冗長な分子ネットワークの一部であると考えられる<ref><pubmed>25926357</pubmed></ref><ref><pubmed>24105999</pubmed></ref>。<br />
<br />
なお、センチュウやショウジョウバエでは、変異体スクリーニングなどから、シナプス形成に関わるとされる遺伝子が多く同定されている<ref><pubmed>31037336</pubmed></ref><ref><pubmed>30986749</pubmed></ref><ref><pubmed>32741370</pubmed></ref>。このことからも、哺乳類の中枢シナプスに関わる分子機構も実際には更に複雑であることが予想される。<br />
<br />
中枢神経系の神経細胞の周りには、シナプス部位を囲むようにペリニューロナルネット（perineuronal nets）と呼ばれるプロテオグリカンやヒアルロナンなどを構成要素とする細胞外マトリックスが存在しており、臨界期などでのシナプス形成の制御にも関わっていることが想定されている<ref><pubmed>227911749</pubmed></ref><ref><pubmed>31263252</pubmed></ref>。<br />
<br />
<br />
==シナプス形成におけるグリア細胞の役割==<br />
これまでシナプス前部とシナプス後部の接点のみに焦点を当ててきたが、シナプス形成には第3の細胞要素であるグリア細胞も関与している<ref><pubmed>30309945</pubmed></ref><ref><pubmed>30347385</pubmed></ref>。シュワン細胞は神経筋接合部のグリア細胞であり、[[アストロサイト]]は中枢シナプスのグリア細胞である。シュワン細胞がシナプス形成や維持に与える影響については、シュワン細胞を除去した動物での神経筋接合部の異常から考察されている<ref><pubmed>27656017</pubmed></ref>。<br />
<br />
グリア細胞の細胞表面にある分子と外部に分泌される分子の両方がシナプス形成に必要である。巨大な細胞外マトリックス分子であるトロンボスポンジン(thrombospondin) <ref><pubmed>15707899</pubmed></ref>、脂質であるコレステロール<ref><pubmed>12648780</pubmed></ref>、ヘビン（hevin) <ref><pubmed>21788491</pubmed></ref>などである。アストロサイトから分泌されるヘビンは、通常は相互作用しない細胞接着分子であるニューレキシンとニューロリギンの一部のアイソフォームを架橋することにより、シナプス形成を促進する<ref><pubmed>26771491</pubmed></ref>。アストロサイト上のグリピカン（glypican)は、シナプス前終末からAMPAレセプタークラスタリング因子ペントラキシン1(pentraxin1)の放出を誘発する<ref><pubmed>29024665</pubmed></ref><ref><pubmed>27986928</pubmed></ref>。また、シナプス形成に拮抗するSPARCなどのシナプスの負の調節因子も知られている<ref><pubmed>21788491</pubmed></ref>。またミクログリアは、シナプス刈り込みに関与する<ref><pubmed>31283900</pubmed></ref>。 <br />
<br />
== 関連項目 ==<br />
*[[標的認識]]<br />
*[[シナプス刈り込み]]<br />
*[[シナプス接着因子]]<br />
*[[神経筋接合部]]<br />
*[[細胞外マトリックス]]<br />
== 参考文献 ==<br />
<references /></div>
Masahitoyamagata
https://bsd.neuroinf.jp/w/index.php?title=%E5%A4%A7%E8%84%B3%E7%9A%AE%E8%B3%AA%E4%BB%8B%E5%9C%A8%E3%83%8B%E3%83%A5%E3%83%BC%E3%83%AD%E3%83%B3%E3%81%AE%E7%99%BA%E7%94%9F&diff=44842
大脳皮質介在ニューロンの発生
2020-09-20T09:52:19Z
<p>Masahitoyamagata: 分化を分裂にしました。</p>
<hr />
<div><div align="right"> <br />
<font size="+1">[https://researchmap.jp/Goichi.Miyoshi 三好 悟一]</font><br><br />
''東京女子医科大学''<br><br />
DOI：<selfdoi /> 原稿受付日：2020年9月14日 原稿完成日：2020年9月20日<br><br />
担当編集委員：[https://researchmap.jp/yamagatm 山形 方人]（ハーバード大学・脳科学センター）<br><br />
</div><br />
<br />
英：migration of cortical interneurons<br />
{{box|text= 高次機能を司る哺乳類大脳皮質神経の約2割を占める介在ニューロンは、神経伝達物質GABAを放出する抑制機構により神経活動伝播の局所的な調整、修飾や同期を行い脳波生成にも重要な役割を果たす。大脳皮質の各層に存在する介在ニューロンに認められる形態、軸索投射、分子発現ならびに電気生理活性など極めて多様な性質は発生発達過程において獲得される。介在ニューロンは投射ニューロンである錐体細胞のように皮質内で生まれるのではなく、遠く離れた大脳腹側の増殖細胞から産生され、あらゆる皮質領野まで長距離を移動し、最終目的地の皮質層に到着した後は、最終分化する過程で取捨選択され回路に組み込まれるという特徴的な発生の過程をたどる。}}<br />
[[ファイル:Miyoshi Interneuron.png|サムネイル|400px|'''図. 介在ニューロン発生の模式図'''<br><ref name=Miyoshi2013>'''Miyoshi, G., Machold, R.P., Fishell, G. (2013).'''<br>Specification of GABAergic Neocortical Interneurons. In: Cortical Development (Kageyama R, Yamamori T, eds), pp 89-126: Springer Japan.</ref> より改変]]<br />
<br />
==発生起源==<br />
[[哺乳類]][[大脳皮質]]にある[[錐体細胞]]が皮質自身の[[脳室帯]]で生まれるのとは異なり、[[介在ニューロン]]の全ては皮質とは離れた[[終脳胞]]の腹側で産生される。このことは、1997年に[[マウス]]で示され<ref name=Anderson1997><pubmed>9334308</pubmed></ref> 、後に[[サル]]および[[ヒト]]においてもほぼ同様であることが確認された<ref name=Hansen2013><pubmed>24097039</pubmed></ref><ref name=Ma2013><pubmed>24097041</pubmed></ref> 。現在では、大脳皮質にある介在ニューロンのほぼ全てが胎仔終脳胞に一過性に存在する[[内側基底核原基]] ([[medial ganglionic eminence]], MGE)<ref name=Sussel1999><pubmed>10393115</pubmed></ref><ref name=Wichterle2001><pubmed>11585802</pubmed></ref> と[[尾側基底核原基]]（[[caudal ganglionic eminence]], CGE）<ref name=Nery2002><pubmed>12411960</pubmed></ref> という構造でつくられると考えられている（'''図左'''）。胎仔の大脳腹側に位置する構造の中では、胎生13日目の外側基底核原基（lateral ganglionic eminence）<ref name=Wichterle2001><pubmed>11585802</pubmed></ref> や[[中隔]]（[[septum]]）<ref name=Rubin2010><pubmed>20826668</pubmed></ref> は介在ニューロンの発生起源として否定されている。一方、内側基底核原基の腹側に隣接し、また内側基底核原基と同じ[[Nkx2-1]]因子<ref name=Sussel1999><pubmed>10393115</pubmed></ref> を発現するする[[視索前野]]（[[preoptic area]]）から少量の介在ニューロンが分化すると報告されている<ref name=Gelman2009><pubmed>19625528</pubmed></ref><ref name=Gelman2011><pubmed>22090484</pubmed></ref> 。<br />
<br />
==皮質への大移動==<br />
胎仔大脳腹側の増殖細胞から最終分裂し産生された未分化介在ニューロンは（'''図左'''）、内側基底核原基起源のものは尾側基底核原基内部<ref name=Butt2005><pubmed>16301176</pubmed></ref> や将来に[[線条体]]となる構造の内側を通過して背側にある皮質にたどりつく<ref name=Flames2004><pubmed>15473965</pubmed></ref> 。一方、尾側基底核原基起源のものの多くは後方へ遊走し直接皮質へと到達する<ref name=Kanatani2008><pubmed>19074032</pubmed></ref> 。<br />
<br />
皮質では、構築途中である[[皮質板]]（将来の皮質2-6層）の上（[[辺縁帯]]）と下（[[中間帯]]と[[脳室下帯]]）にある経路をまるで高速道路のように使って「[[接線方向移動]]（tangential migration）」により皮質全域に拡散していく（'''図上'''、胎生期）。大脳の内側外側（左右）のみならず吻尾（前後）方向へも大移動し、あらゆる皮質領野へと到達する<ref name=Tanaka2006><pubmed>16672340</pubmed></ref> 。<br />
<br />
皮質板へは「[[放射状方向移動]]（radial migration）」によって侵入するが、一旦皮質層全体に散らばった後に特定の層に落ち着く（'''図上'''、生後初期）<ref name=Miyoshi2011><pubmed>20732898</pubmed></ref> 。介在ニューロンの移動は生後１週には終了する<ref name=Inamura2012><pubmed>22539863</pubmed></ref><ref name=Bortone2009><pubmed>19376067</pubmed></ref> 。<br />
<br />
==過剰生産と細胞死==<br />
生後発達期の皮質では、未分化介在ニューロンの約40%が死滅する（'''図上'''、生後一週）<ref name=Southwell2012><pubmed>23041929</pubmed></ref> 。マウスで生後5日目に始まり生後7日目にピークを迎える[[細胞死]]は、介在ニューロンに内在する「発生時計」によりあらかじめプログラムされている。胎仔由来の未分化介在ニューロンを生後皮質に移植すると、移植先の発達度合いとは関係なく本来の細胞死が起こる時期になってはじめて移植された細胞が減り始める（'''図下'''）。未分化介在ニューロンは長距離かつ複雑な移動を経た後に精密な局所回路を形成するので、大脳皮質のあらゆる領域に多様な介在ニューロンを正確に配置するには過剰に供給して必要なものだけを残す必要があると考えられる。一方で、過剰供給には生物学的意義があることも予想され検証が待たれる（皮質の[[GABA]]量確保、集団での移動は効率が良い、など）。<br />
<br />
==皮質層への配置と産生時期==<br />
大脳皮質の錐体細胞は早期に産生された細胞が深い層、後期に産生された細胞が浅い層とインサイドアウト配置されることが知られている。介在ニューロンでは、錐体細胞よりもゆるやかなインサイドアウト傾向で配置されることが知られている（古典的[[wj:DNA|DNA]]アナログ取り込みによる誕生日ラベル法と、GABA合成酵素[[グルタミン酸デカルボキシラーゼ]] (GAD)による標識の組み合わせ）<ref name=Miller1985><pubmed>3910166</pubmed></ref><ref name=Fairen1986><pubmed>3760259</pubmed></ref> 。より詳細には、内側基底核原基起源の介在ニューロンは錐体細胞層と同様に6層から2層にインサイドアウト配置される（'''図上'''、成熟期）<ref name=Miyoshi2007><pubmed>17634372</pubmed></ref> 。その一方、尾側基底核原基起源のものは皮質1層でも分化し、また誕生時期に関わらず常に約75%が1-3層に配置される<ref name=Miyoshi2010><pubmed>20130169</pubmed></ref> 。内側基底核原基起源の介在ニューロン発生の開始はマウスで胎生9日目でピークが13日目であるのに対して、尾側基底核原基起源ではいずれもが3日遅れることで、介在ニューロン全体としては6層から1層への緩やかなインサイドアウト配置となる。<br />
<br />
==神経伝達物質GABAによる発生制御==<br />
介在ニューロンが成熟回路で抑制機能を発揮する上で欠かせない[[神経伝達物質]]GABAは、発生過程においても未分化な介在ニューロンから放出され重要な役割を果たす。成熟したニューロンが神経伝達物質GABAを受容すると、細胞内外のCl<sup>-</sup>濃度勾配にしたがってCl<sup>-</sup>イオンが受容体から流入し神経活動が抑制される。ところが、未分化ニューロンでは[[塩化物イオントランスポーター|Cl<sup>-</sup>トランスポーター]]（[[Kcc2]]/[[Slc12a5]]）が未発現のために細胞内外のCl<sup>-</sup>濃度勾配が成熟細胞とは逆転しており、したがってGABAは興奮性に働く<ref name=BenAri2002><pubmed>12209121</pubmed></ref> 。皮質錐体細胞の発生過程では、細胞の増殖や遊走をGABAが制御することが報告されている<ref name=Owens2002><pubmed>12209120</pubmed></ref> 。また遊走中の未分化な介在ニューロンはKcc2を発現することで移動を停止する（'''図上'''、生後初期）<ref name=Bortone2009><pubmed>19376067</pubmed></ref> 。介在ニューロンの移動が生後１週にほぼ停止するのは主にKcc2発現機構によると考えられている<ref name=Inamura2012><pubmed>22539863</pubmed></ref><ref name=Inada2011><pubmed>22180776</pubmed></ref> 。介在ニューロンの発達は皮質視覚野で観察される[[眼優位性可塑性]]の[[臨界期]]の制御に関わり、GABAが可塑性を産み出す機構が示されている<ref name=Hensch2005><pubmed>16261181</pubmed></ref> 。生後回路発達期においては、皮質GABA総量を増やしたり（[[GABA受容体]][[リガンド]]の投与）減らしたり（GABA合成酵素GADの機能損失変異）することによって、発達臨界期を早めたり遅らせることができる（'''図上'''、成熟期）。<br />
<br />
==サブタイプ特異的な局所抑制シナプスの形成==<br />
皮質介在ニューロンの多様性を分類するには層位置、形態、[[軸索投射]]様式、分子発現、電気生理活性などの指標を統合的に理解する必要がある<ref name=Yuste2020><pubmed>32839617</pubmed></ref> 。介在ニューロンの特性と発生起源には密接な関係があり、おおまかには４種類が内側基底核原基と尾側基底核原基の２箇所からつくられると考えられている<ref name=Miyoshi2010><pubmed>20130169</pubmed></ref><ref name=Fishell2020><pubmed>31299170</pubmed></ref> （'''図右上'''、抑制回路）。<br />
<br />
皮質介在ニューロン全体の約7割を占める内側基底核原基起源では主に、4割の[[パルブアルブミン]] (Pvalb）陽性細胞と3割の[[ソマトスタチン]] (Sst）細胞に分類される。パルブアルブミン陽性細胞は主に細胞体付近を抑制する[[バスケット細胞]]と[[軸索]]を抑制する[[シャンデリア細胞]]<ref name=Taniguchi2013><pubmed>23180771</pubmed></ref> 、ソマトスタチン陽性細胞は主に[[尖端樹状突起]]を抑制する[[マルチノッチ細胞]]である（'''図右上'''、赤と橙）。<br />
<br />
介在ニューロン全体の約3割である尾側基底核原基起源では、その約半分が[[リーリン]] ([[リーリン|Reln]]）/[[Id2]]陽性細胞で残りは[[血管作動性腸管ペプチド]] ([[vasoactive intestinal peptide]], [[Vip]]）陽性の２つに分類される<ref name=Miyoshi2010><pubmed>20130169</pubmed></ref><ref name=Miyoshi2015><pubmed>26377473</pubmed></ref> 。リーリン陽性細胞の多くは[[ニューログリアフォーム]]形態をもつ細胞で主に1層で[[拡散性伝達]]（Volume transmission）による抑制を担い（'''図右上'''、濃青）、Vip陽性細胞の多くは[[双極性細胞]]でありまた抑制細胞を抑制する脱抑制機能を果たす（'''図右上'''、青）。<br />
<br />
つまり発達過程において介在ニューロンの軸索が標的細胞（錐体か介在か）、特異的部位（細胞体か、軸索か、[[樹状突起]]か、その尖端か）を認識しシナプス形成することが機能を発揮する上で必須である（'''図上'''、成熟期）。一方、生後発達期のどの時期に、どのような機構によって、特異的な抑制性シナプスが形成されるのかはほとんど理解されておらず、分子機構の一部が示されたのみである<ref name=Favuzzi2019><pubmed>30679375</pubmed></ref> 。<br />
<br />
==海馬の介在ニューロンは皮質を通過して発生する==<br />
[[海馬]]にみられる多様な介在ニューロンは<ref name=Pelkey2017><pubmed>28954853</pubmed></ref><ref name=Klausberger2008><pubmed>18599766</pubmed></ref> 、胎仔の大脳腹側で産生されたのちに多くが皮質を通過して海馬へ到達するが<ref name=Pleasure2000><pubmed>11163262</pubmed></ref><ref name=Polleux2002><pubmed>12070090</pubmed></ref> 、尾側基底核原基からは海馬に直接侵入するものも報告されている<ref name=Yozu2005><pubmed>16079409</pubmed></ref> 。海馬介在ニューロンの発生起源は基本的には大脳皮質と同様のサブタイプが内側基底核原基と尾側基底核原基に起源をもつ傾向がみられる<ref name=Tricoire2010><pubmed>20147544</pubmed></ref><ref name=Tricoire2011><pubmed>21795545</pubmed></ref> 。<br />
<br />
その一方で、皮質とは異なり多くの[[一酸化窒素合成酵素1]]（[[nitric oxide synthase 1]], [[Nos1]]）および[[コレシストキニン]] ([[cholecystokinin]], Cck）陽性細胞がみられ、また内側基底核原基起源の[[ニューログリアフォーム]]細胞が確認されることから<ref name=OverstreetWadiche2015><pubmed>26189693</pubmed></ref> 、これらの介在ニューロンは皮質を通過しないルートで供給されている可能性が示唆されている。<br />
<br />
==細胞系譜==<br />
内側基底核原基からパルブアルブミンとソマトスタチン陽性、尾側基底核原基からリーリンとVip陽性の介在ニューロンが個別に分化する発生機構は未だに解明されていない。内側基底核原基の腹側からはパルブアルブミン、背側からはソマトスタチンという場所仮説<ref name=Flames2007><pubmed>17804629</pubmed></ref><ref name=Wonders2008><pubmed>18155689</pubmed></ref> 、増殖細胞層の中でも脳室下帯（Subventricular zone）からはパルブアルブミン、脳室帯（Ventricular zone）からはソマトスタチンという空間仮説が提唱されているが<ref name=Glickstein2007><pubmed>17965053</pubmed></ref><ref name=Petros2015><pubmed>26526999</pubmed></ref> 、いずれも片方にバイアスがみられる程度である。尾側基底核原基の各部位をエレクトロポレーション法を用いて蛍光ラベルすることで、尾側基底核原基の前方からVip、後方からはリーリン陽性細胞が生まれることが示唆されている <ref name=Torigoe2016><pubmed>26865626</pubmed></ref> 。<br />
<br />
単一細胞の運命を追跡するクローナル解析（バーコードタグをもつウイルスを胎仔増殖細胞に感染させる手法）では、内側基底核原基に在る１つの増殖細胞からパルブアルブミンとソマトスタチン陽性の両者が確認されており、大脳腹側の増殖細胞レベルで両者の運命が別れていることは否定されている<ref name=Harwell2015><pubmed>26299474</pubmed></ref><ref name=Mayer2015><pubmed>26299473</pubmed></ref> 。発生ステージごとに[[単一細胞RNAシークエンシング法]]を網羅的に実施し、得られた遺伝子発現の比較相関解析による[[細胞系譜]]の構築が盛んに行われている<ref name=Nowakowski2017><pubmed>29217575</pubmed></ref><ref name=Wagner2018><pubmed>29700229</pubmed></ref> 。介在ニューロン発生においても同様の試みがなされたが<ref name=Mayer2018><pubmed>29513653</pubmed></ref><ref name=Mi2018><pubmed>29472441</pubmed></ref> 、未だにパルブアルブミンとソマトスタチン、リーリンとVip系譜の分岐点は解明されていない。より密接した発生ステージを比較解析することで、詳細な細胞系譜が解明されることが期待される。<br />
<br />
==介在ニューロン発生の分子制御機構==<br />
[[ホメオドメイン]][[転写因子]][[Dlx]]、[[Arx]]や[[Zeb2]]は未分化介在ニューロンの移動を制御する。中でも[[Dlx1]]/[[Dlx2|2]]ダブル[[ノックアウトマウス]]では皮質に到達するGABA細胞が見られないことを利用し、介在ニューロンの起源が大脳腹側がであることが解明された<ref name=Anderson1997><pubmed>9334308</pubmed></ref> 。内側基底核原基起源の介在ニューロンの分化発生は、Nkx2-1>[[Lhx6]]>[[Sox6]]/[[Satb1]]という転写因子カスケードにより制御されることが示されている<ref name=Sussel1999><pubmed>10393115</pubmed></ref><ref name=Azim2009><pubmed>19657336</pubmed></ref><ref name=Batista-Brito2009><pubmed>19709629</pubmed></ref><ref name=Close2012><pubmed>23223290</pubmed></ref><ref name=Denaxa2012><pubmed>23142661</pubmed></ref><ref name=Liodis2007><pubmed>17376969</pubmed></ref><ref name=Butt2008><pubmed>18786356</pubmed></ref> 。一方、尾側基底核原基起源の介在ニューロンに特異的な分子制御プログラムは[[Prox1]]転写因子しか現在同定されていない<ref name=Miyoshi2015><pubmed>26377473</pubmed></ref> 。さらには、パルブアルブミンとソマトスタチン、リーリンとVip系譜の分岐を制御するような因子も現在のところ報告されていない。<br />
<br />
==細胞移植を用いた介在ニューロン発生研究とその応用==<br />
<br />
細胞移植実験は発生機構を理解するための強力な手法であり、古典的には[[ニワトリ]]と[[ウズラ]]という他種間の細胞と組織の組み合わせから、移植された細胞が移動し分化する機構が解析されてきた。介在ニューロン発生研究においてもマウス遺伝学手法を組み合わせた細胞移植実験が多用されてきた歴史があり、起源である大脳腹側（内側基底核原基や尾側基底核原基）や蛍光ラベルされた移動中の介在ニューロンを単離調製し、胎児や生後の特定脳部位へ細胞移植する実験が盛んに行われてきた。介在ニューロンの発生起源、分子制御機構、細胞外環境の影響、細胞死などの多くが検証され解明されてきた<ref name=Miyoshi2019><pubmed>30227162</pubmed></ref> 。<br />
<br />
介在ニューロンは発生過程において長距離を移動し、GABA放出により細胞移動のみならず可塑性をも制御し、過剰に産生され不要なものが除去される特徴がみられる。この発生機構を応用し、胎仔大脳腹側から未分化介在ニューロンを単離調製し生後の皮質に移植すると、移植場所から周囲に拡散移動し、GABA放出により可塑性を生み出し局所回路に組み込まれ、抑制回路を形成しないものは消失することが知られている（'''図下'''）。<br />
<br />
胎仔や[[胚性幹細胞]]([[ES細胞]])などから調製した未分化介在ニューロン移植による治療効果が多数報告されており、[[てんかん]]、[[パーキンソン病]]、[[慢性痛]]などの疾患モデルマウスにおいてその有用性が示されている<ref name=Southwell2014><pubmed>24723614</pubmed></ref> 。今後も介在ニューロン発生研究が進展することによって治療法開発に繋がる新たな知見が得られることが期待される。<br />
<br />
==参考文献==</div>
Masahitoyamagata
https://bsd.neuroinf.jp/w/index.php?title=%E9%AB%98%E8%A6%AA%E5%92%8C%E6%80%A7%E3%83%8B%E3%83%A5%E3%83%BC%E3%83%AD%E3%83%88%E3%83%AD%E3%83%95%E3%82%A3%E3%83%B3%E5%8F%97%E5%AE%B9%E4%BD%93&diff=44511
高親和性ニューロトロフィン受容体
2020-08-08T16:55:36Z
<p>Masahitoyamagata: </p>
<hr />
<div><div align="right"> <br />
<font size="+1">[http://researchmap.jp/nobtak2010 武井 延之]</font><br><br />
''新潟大学 脳研究所 基礎神経科学部門 分子神経生物学分野''<br><br />
DOI：<selfdoi /> 原稿受付日：2020年8月7日 原稿完成日：2020年XX月XX日<br><br />
担当編集委員：[https://researchmap.jp/yamagatm 山形 方人]（ハーバード大学・脳科学センター）<br><br />
</div><br />
<br />
同義語：高親和性神経成長因子受容体<br><br />
類義語：Trk受容体<br><br />
英：high-affinity neurotrophin receptor<br />
<br />
{{box|text= 高親和性ニューロトロフィン受容体とはニューロトロフィンファミリー(神経成長因子 (nerve growth factor, NGF)、脳由来神経栄養因子 (brain-derived neurotrophic factor, BDNF)、ニューロトロフィン-3 (neurotrophin-3, NT-3）、ニューロトロフィン-4 (neurotrophin-4, NT-4)からなる)の受容体であり、TrkA, B, Cがある。低親和性神経栄養因子受容体（p75）が全てのニューロトロフィンと結合(Kd=10<sup>-9</sup>M)するのに対し、TrkAにはNGFが、TrkBにはBDNFとNT-4が、TrkCにはNT-3がそれぞれ高親和性(Kd=10<sup>-11</sup>M)に結合、作用する。またTrkA, BはNT-3とも低親和性に結合する。<u>（編集部コメント：対応する内容が本文に無いようです。機能などについてもご言及頂ければと思います。）</u>}}<br />
<br />
<u>（査読者コメント：（１）編集部コメントに賛同します。下記の「生理的機能」の内容を、一文でまとめたような文章を追加されるとよいと思います。例えば、神経細胞の分化、生存維持、神経可塑性などに関与する、とか。（２）最初にTrkA, B, Cとでてくるところは、TrkA, TrkB, TrkCとすると、それぞれの違いがよくわかると思います。）</u><br />
<br />
<br />
==高親和性ニューロトロフィン受容体とは==<br />
Trk（トラックと読む）は大腸癌で見出されたトロポミオシンと受容体型チロシンキナーゼ様の分子の融合遺伝子として同定された癌遺伝子trkの遺伝子産物で、tropomyosin receptor kinaseとして1986年にクローニングされていた<ref name=Martin-Zanca1986><pubmed>2869410</pubmed></ref> (1)。受容体型チロシンキナーゼと示唆されていたが、同定時にはリガンドは不明であった。Trkが神経系に高発現していることがわかり、1991年になってTrkA, B, Cが相次いでニューロトロフィンの受容体と同定された<ref name=Lamballe1991><pubmed>1844238</pubmed></ref> (2)。<u>（編集部コメント：高親和性ニューロトロフィン受容体と低親和性受容体の関連についてご言及いただいたうえ、どうして高親和性受容体と言われるようになったのかご説明下さい）</u><br />
<br />
<u>（査読者コメント：近年はゲノムやトランスクリプトームの研究が大きくなってきていて、TrkA, TrkB, TrkCに対応するNTRK, NTRK2, NTRK3という「遺伝子名」で見かけることも増えていると思います。これらの関係性を一目で見てわかるように4つのニューロトロフィンとの結合性を含めて簡単な表にするとわかりやすくなるのではないかと思います。<br />
TrkA NTRK NGF (弱）NT-3<br />
TrkB NTRK2 BDNF, NT-4 (弱）NT-3）</u><br />
<br />
<br />
[[ファイル:Takei Trk Fig1.png|サムネイル|'''図1. Trk受容体（A B C共通）の構造と活性化機構'''<br>2量体リガンド(NGF, BDNF, NT-3, NT-4)が各Trkに結合することによってTrkの2量体化が起こり、キナーゼドメインの活性によってお互いのチロシン残基をリン酸化する。C1,2:システインリッチクラスター、LRR1-3:ロイシンリッチリピート、Ig1,2:I イムノグロブリン様ドメイン。]]<br />
<br />
==分子構造==<br />
TrkはA,B,Cともアミノ酸約800個からなり、糖鎖付加を受けて分子量140-145kDaの成熟分子となる。EGF受容体やインシュリン受容体と同じく受容体型チロシンキナーゼであり、細胞内にキナーゼドメインを持つ。細胞外には2つのシステインリッチクラスターとそれに挟まれた3つのロイシンリッチリピート、さらに2つのイムノグロブリン様ドメインがある。2つ目のイムノグロブリン様ドメインにリガンドである各ニューロトロフィンが結合する。2量体リガンドが結合するとTrk自体も2量体化し、細胞内ドメインのチロシン残基を相互にリン酸化する。このリン酸化チロシンに種々の分子が結合し、細胞内にシグナルを伝達する（'''図1'''）<ref name=Barbacid1994><pubmed>7852993</pubmed></ref><ref name=Barbacid1995><pubmed>7486690</pubmed></ref> (3)。リガンド結合部位（'''図2'''）、キナーゼドメイン共に結晶構造解析がなされている。<br />
<br />
<u>（査読者：ここで、EGF受容体やインシュリン受容体以外に、例えばRORファミリーなど関連した受容体との関係、あるいは他の生物、特に無脊椎動物（Drosophilaなど）に見られる類似のレセプター型チロシンキナーゼとの関係が明示されると、分子構造の説明としての視点が広がると思います。）</u><br />
<br />
<br />
<br />
[[ファイル:1he7.pdb|サムネイル|200px|図2. ヒトTrkAリガンド結合部位の結晶構造<br><ref><pubmed> 11263982</pubmed></ref>による。]]<br />
<br />
Trkにはスプライスバリアントが複数存在するが、TrkB, TrkCにはキナーゼドメインを欠失した短いタイプ（truncated型）があり、このタイプの受容体はリガンドと結合はするが、シグナルを伝えることはできない。そのためドミナントネガティブとして働くが、それ以外の働きも示されている<ref name=Deinhardt2014><pubmed> 24668471 </pubmed></ref> (5)。<br />
<br />
==分布==<br />
TrkA,B,Cとも末梢神経系の神経細胞に広く発現している。脳内ではTrkB, Cは幅広く分布し、ほとんどの神経細胞に発現している。一方、TrkAの発現はほぼ前脳基底野のアセチルコリン作働性神経細胞に限られておりNGFの作用も限定されている。細胞内局在では末梢系では主に前シナプスに発現し、ニューロトロフィンの標的由来/逆行性作用を受けている。TrkAは中枢でも逆行性作用が主と考えられており前シナプスに発現しているのに対し、TrkBは主に後シナプスに発現して、前シナプスから活動依存的に放出されるBDNFを受容して機能している<ref name=Nawa2001><pubmed>11718853</pubmed></ref> (6)。<br />
<br />
<u>（査読者：<br />
（１）発現、分布、局在という単語の使い分けが曖昧と感じられる箇所がありますので、ご確認ください。<br />
「発現している」とした場合、一般には遺伝子の発現だと思われますが、TrkAはタンパク質ということで、この文章がタンパク質なのか、遺伝子なのか、曖昧だと思います。また、「細胞内局在では末梢系では主に前シナプスに発現し」という箇所ですが、この場合、細胞内局在と言っています。前シナプスの神経細胞で発現し、前シナプス部に局在するという表現だと思いますが、発現という単語を使用されることで、この辺が曖昧になっていると感じます。「TrkBは主に後シナプスに発現して、」という部分も、細胞での発現なのか、後シナプスでの細胞内局在に言及しているのか、曖昧だと思います。<br />
（２）前脳基底野ー＞前脳基底部）</u><br />
<br />
<br />
<br />
[[ファイル:Takei Trk Fig2.png|サムネイル|'''図3. Trk受容体による細胞内情報伝達'''<br>リン酸化したチロシン残基にアダプタータンパク質(Shc, FRS2)や酵素(PLC&gamma;)のSH2ドメインが結合し、シグナルが伝わる。]]<br />
<br />
== 生化学的機能 ==<br />
受容体型チロシンキナーゼに共通の仕組みとして、リガンドの結合によって受容体分子が２量体化し、キナーゼドメインによって相手側のチロシン残基がリン酸化される。リン酸化チロシンにアダプター分子が結合し、リン酸化カスケードが駆動され、様々なシグナルが細胞内に伝わる（'''図3'''）<ref name=Chao2003><pubmed>12671646</pubmed></ref><ref name=Huang2003><pubmed>12676795</pubmed></ref> (7,8)。Trkの特徴として、下流シグナルも含めて、活性化の時間経過がEGF受容体などに比べて長く持続することが知られている。TrkAではリン酸化したY496 (TrkBはY532、TrkCはY516)にShcあるいはFRS2が結合し、Ras-MAPK系とPI3K-Akt系が活性化される（'''図3'''）。<br />
<br />
<u>（査読者コメント：Y496などと言った場合、番号はヒトのものでしょうか。種を限定する必要があるかもです。）</u><br />
<br />
ShcあるいはFRS2を介してGrb2-Sosから、癌遺伝子rasの産物で、低分子GTP結合蛋白質であるRasを活性化する。さらにRaf、MEK (MAPキナーゼキナーゼ, MAPKKとも呼ばれる)を介しErk1,2 (Extracellular regulated kinase 1, 2、あるいはmitogen activated protein kinase (MAPK)とも呼ばれる)を活性化する経路であり、転写調節などメインとして多くの細胞応答を引き起こす。<br />
<u>（査読者コメント：「転写調節などメインとして」＞転写調節などを中心に）</u><br />
<br />
Grb2からGab1を介して、脂質キナーゼであるphosphatidilyinositol 3-OH kinase (PI3キナーゼ, PI3K)を活性化する。PI3Kはホスファチジルイノシトール4,5-ビスホスフェート (PIP2)からPIP3を産生し、PDK1-Aktを活性化するシグナルを伝える。アポトーシスの抑制に作用しているとともに、mTORを活性化し翻訳調節などの細胞内代謝を制御している。<br />
<br />
もう一つの経路はPLC&gamma;の系で、TrkAではリン酸化したY791(TrkBではY833、TrkCではY834)にホスホリパーゼC&gamma; (phospholipase C&gamma;)が自身のSH2ドメインを介して結合し活性化され、PIP2からIP3イノシトール３リン酸(IP3)とジアシルグリセロール(DG)を産生する。IP3は細胞内カルシウム貯蔵部位からカルシウムを放出させることによってカルシウムシグナルを駆動させ、ジアシルグリセロールはprotein kinase C (PKC)を活性化させる。どちらも細胞内情報系として様々な重要な働きをしている。<br />
<u>（査読者コメント：ここでは主に生化学的なシグナル伝達を中心に説明していますが、逆行性のNGF-TrkA輸送などのような影響もしばしば議論されていると思います。簡単でよいと思いますので、このような細胞生物学的な動的観点も追加することは可能でしょうか。）</u><br />
<br />
==生理的機能==<br />
Trkの生理的機能としてではなくニューロトロフィン(NGF, BDNF, NT-3)の生理作用として多くの総説があるので参照されたい<ref name=Bibel2000><pubmed>11114882</pubmed></ref><ref name=Park2013><pubmed>23254191</pubmed></ref><ref name=武井延之>'''武井延之、那波宏之 (2004)'''<br>ニューロトロフィンによる脳機能の調節―細胞応答から行動変容までー<br>生化学 76:111-123</ref> (9-11)。<br />
<u>（査読者コメント：「Trkの生理的機能としてではなくニューロトロフィン(NGF, BDNF, NT-3)の生理作用として多くの総説がある」で、NT-4を入れていないのは理由があるのでしょうか。）</u><br />
<br />
各種Trkの発現は末梢神経系に幅広く見られ、末梢神経細胞の分化、生存維持に必須の役割をはたしている。そのためTrkノックアウトマウスは生後まもなく死亡する。表現型としてはリガンドであるニューロトロフィンのノックアウトより重篤である。このため、中枢神経系で研究はコンディショナルノックアウトを用いる必要がある。中枢神経系での機能としては、BDNF-TrkB系が神経可塑性に特に重要であることが示されている。TrkB自体の関与としては、活動依存性に神経細胞の膜表面に移行して(やはり活動依存性に発現、放出が増強されるBDNFとともに)、神経活動とリンクして働くことがわかっている<ref name=Andreska2020><pubmed>32556728</pubmed></ref> (12)。またBDNF-TrkBは中枢性の摂食/代謝にも関与している<ref name=Takei2014><pubmed>25309497</pubmed></ref> (13)。TrkCは広く発現しているものの、NT-3の中枢作用はあまり認められていない。TrkCはシナプスオーガナイザーの働きがあることも報告されており<ref name=Naito2017><pubmed>27697534</pubmed></ref> (14)、Trkはニューロトロフィン受容体としての働き以外にも機能がある可能性もある。<br />
<u>(査読者コメント：「シナプスオーガナイザー」はわかりますが、説明せずに使っても理解しにくい読者が多い可能性があります。シナプス形成に関与するなどとした方が無難であると思います。）</u><br />
<br />
==疾患との関連==<br />
遺伝性感覚ニューロパチーの患者においてNTRK1(ヒトTrkAをコード)のloss of function変異を認めている<ref name=Indo1996><pubmed>8696348</pubmed></ref> (15)。感覚神経にTrkAが発現していることから関与が強く示唆されている。またNTRK2(TrkB)のloss of function変異では摂食異常、肥満、発達遅滞が認められいる<ref name=Yeo2004><pubmed>15494731</pubmed></ref> (16)。これも動物実験の結果と一致している<ref name=Takei2014><pubmed>25309497</pubmed></ref> (13)。疾患に関して近年最も注目を集めているのはNTRK融合遺伝子である。Trkのキナーゼドメインと他の分子との融合遺伝子が癌のドライバーとなることが多くの癌種で明らかになっている <ref name=Cocco2018><pubmed>30333516</pubmed></ref> (17)。Trk発見の経緯も癌における融合遺伝子によることから、驚くことではないが、シークエンス技術の向上により多く見出されるようになってきた。Trk阻害剤が抗癌剤として開発されており、日本でもエヌトレクチニブが抗癌剤として承認されている。（ちなみに副作用として認知障害や運動失調が報告されており、Trkの正常作用を考えるとうなずける。）<br />
<u>（査読者コメント：最後のちなみにの文章のカッコは必要でしょうか。）</u><br />
<br />
==阻害剤とアゴニスト==<br />
これまでTrk阻害剤としてK252aが広く使われていたが、K252aは実際はTrk特異性は高くなく、PKAやPKCを阻害するし、CaMKに対するIC50は一桁低い。抗癌剤として開発された阻害剤はTrkに作用する（はず）であるが、癌研究以外ではあまり使われていない。これらはキナーゼ阻害剤であるため、キナーゼの構造の似ている各Trkに対する特異性/選択性はない<ref name=Cocco2018><pubmed>30333516</pubmed></ref> (17)。各Trkの働きを個別に阻害するためにはTrk-Fc(あるいはTrk-IgG)と言われる各Trkの細胞外ドメインとIgGのFcドメインの融合タンパクが用いられる。<br />
<u>（査読者コメント：PKAやPKCという略号はわかりますが、わからない可能性もあるので、書き下していただいた方がよいかもしれません。<br />
（はず）：（はず）カッコをつけている意図はなんとなくわかりますが、なんとなくわかるというのは科学的な文章としてはあまりよくないと思います。カッコは必要でしょうか。<br />
融合タンパク＞融合タンパク質）</u><br />
<br />
<br />
<br />
アゴニスト、特にTrkBのアゴニストとして低分子の7,8-DHFやLM22A-4などが報告されている<ref name=Josephy-Hernandez2017><pubmed>27546056</pubmed></ref> (18)が、完全なコンセンサスが得られているとは言い難い。<br />
<br />
==リソース==<br />
=== 抗体 ===<br />
Trkに対する抗体が市販されている。免疫染色、ウエスタンブロット、免疫沈降などに利用可。またリン酸化Trkに対する抗体も市販されているが、リン酸化サイトは各Trk間（その他の受容体型チロシンキナーゼでも）で良く保存されているので、特異性には問題がある。<br />
=== cDNA ===<br />
研究者より入手可能。<br />
=== 遺伝子改変マウス ===<br />
各Trkのトランスジェニック、及びノックアウトマウスが作成されている。ノックアウトマウスに関してはジャクソン(http://jaxmice.jax.org/index.html) で全種購入可能。TrkBに関してはコンディショナルノックアウトも作成されている。またtruncated TrkBトランスジェニックマウスも報告されている。大抵のマウスは作成者より入手可能。<br />
=== Database ===<br />
NCBI等で検索可能。（例えばヒトtrkBのmRNAはNM_006180 NTRK2: neurotrophic tyrosine kinase, receptor, type 2と表示）<br />
（査読者コメント：cDNAとDatabaseは不要だと感じます。）<br />
<br />
==関連項目==<br />
* [[低親和性神経成長因子受容体]]<br />
* [[神経成長因子]]<br />
* [[脳由来神経栄養因子]]<br />
* [[ニューロトロフィン-3]]<br />
* [[ニューロトロフィン-4]]<br />
<br />
==参考文献==<br />
<references /></div>
Masahitoyamagata
https://bsd.neuroinf.jp/w/index.php?title=%E9%AB%98%E8%A6%AA%E5%92%8C%E6%80%A7%E3%83%8B%E3%83%A5%E3%83%BC%E3%83%AD%E3%83%88%E3%83%AD%E3%83%95%E3%82%A3%E3%83%B3%E5%8F%97%E5%AE%B9%E4%BD%93&diff=44510
高親和性ニューロトロフィン受容体
2020-08-08T16:39:29Z
<p>Masahitoyamagata: </p>
<hr />
<div><div align="right"> <br />
<font size="+1">[http://researchmap.jp/nobtak2010 武井 延之]</font><br><br />
''新潟大学 脳研究所 基礎神経科学部門 分子神経生物学分野''<br><br />
DOI：<selfdoi /> 原稿受付日：2020年8月7日 原稿完成日：2020年XX月XX日<br><br />
担当編集委員：[https://researchmap.jp/yamagatm 山形 方人]（ハーバード大学・脳科学センター）<br><br />
</div><br />
<br />
同義語：高親和性神経成長因子受容体<br><br />
類義語：Trk受容体<br><br />
英：high-affinity neurotrophin receptor<br />
<br />
{{box|text= 高親和性ニューロトロフィン受容体とはニューロトロフィンファミリー(神経成長因子 (nerve growth factor, NGF)、脳由来神経栄養因子 (brain-derived neurotrophic factor, BDNF)、ニューロトロフィン-3 (neurotrophin-3, NT-3）、ニューロトロフィン-4 (neurotrophin-4, NT-4)からなる)の受容体であり、TrkA, B, Cがある。低親和性神経栄養因子受容体（p75）が全てのニューロトロフィンと結合(Kd=10<sup>-9</sup>M)するのに対し、TrkAにはNGFが、TrkBにはBDNFとNT-4が、TrkCにはNT-3がそれぞれ高親和性(Kd=10<sup>-11</sup>M)に結合、作用する。またTrkA, BはNT-3とも低親和性に結合する。<u>（編集部コメント：対応する内容が本文に無いようです。機能などについてもご言及頂ければと思います。）</u>}}<br />
<br />
<u>（査読者コメント：（１）編集部コメントに賛同します。下記の「生理的機能」の内容を、一文でまとめたような文章を追加されるとよいと思います。例えば、神経細胞の分化、生存維持、神経可塑性などに関与する、とか。（２）最初にTrkA, B, Cとでてくるところは、TrkA, TrkB, TrkCとすると、それぞれの違いがよくわかると思います。）</u><br />
<br />
<br />
==高親和性ニューロトロフィン受容体とは==<br />
Trk（トラックと読む）は大腸癌で見出されたトロポミオシンと受容体型チロシンキナーゼ様の分子の融合遺伝子として同定された癌遺伝子trkの遺伝子産物で、tropomyosin receptor kinaseとして1986年にクローニングされていた<ref name=Martin-Zanca1986><pubmed>2869410</pubmed></ref> (1)。受容体型チロシンキナーゼと示唆されていたが、同定時にはリガンドは不明であった。Trkが神経系に高発現していることがわかり、1991年になってTrkA, B, Cが相次いでニューロトロフィンの受容体と同定された<ref name=Lamballe1991><pubmed>1844238</pubmed></ref> (2)。<u>（編集部コメント：高親和性ニューロトロフィン受容体と低親和性受容体の関連についてご言及いただいたうえ、どうして高親和性受容体と言われるようになったのかご説明下さい）</u><br />
<br />
<u>（査読者コメント：また、近年はゲノムやトランスクリプトームの研究が大きくなってきていて、TrkA, TrkB, TrkCに対応するNTRK, NTRK2, NTRK3という「遺伝子名」で見かけることも増えていると思います。これらの関係性を一目で見てわかるように4つのニューロトロフィンとの結合性を含めて簡単な表にするとわかりやすくなるのではないかと思います。<br />
TrkA NTRK NGF (弱）NT-3<br />
TrkB NTRK2 BDNF, NT-4 (弱）NT-3）</u><br />
<br />
<br />
[[ファイル:Takei Trk Fig1.png|サムネイル|'''図1. Trk受容体（A B C共通）の構造と活性化機構'''<br>2量体リガンド(NGF, BDNF, NT-3, NT-4)が各Trkに結合することによってTrkの2量体化が起こり、キナーゼドメインの活性によってお互いのチロシン残基をリン酸化する。C1,2:システインリッチクラスター、LRR1-3:ロイシンリッチリピート、Ig1,2:I イムノグロブリン様ドメイン。]]<br />
<br />
==分子構造==<br />
TrkはA,B,Cともアミノ酸約800個からなり、糖鎖付加を受けて分子量140-145kDaの成熟分子となる。EGF受容体やインシュリン受容体と同じく受容体型チロシンキナーゼであり、細胞内にキナーゼドメインを持つ。細胞外には2つのシステインリッチクラスターとそれに挟まれた3つのロイシンリッチリピート、さらに2つのイムノグロブリン様ドメインがある。2つ目のイムノグロブリン様ドメインにリガンドである各ニューロトロフィンが結合する。2量体リガンドが結合するとTrk自体も2量体化し、細胞内ドメインのチロシン残基を相互にリン酸化する。このリン酸化チロシンに種々の分子が結合し、細胞内にシグナルを伝達する（'''図1'''）<ref name=Barbacid1994><pubmed>7852993</pubmed></ref><ref name=Barbacid1995><pubmed>7486690</pubmed></ref> (3)。リガンド結合部位（'''図2'''）、キナーゼドメイン共に結晶構造解析がなされている。<br />
<br />
<u>（査読者：ここで、EGF受容体やインシュリン受容体以外に、例えばRORファミリーなど関連した受容体との関係、あるいは他の生物、特に無脊椎動物（Drosophilaなど）に見られる類似のレセプター型チロシンキナーゼとの関係が明示されると、分子構造の説明としての視点が広がると思います。）</u><br />
<br />
<br />
<br />
[[ファイル:1he7.pdb|サムネイル|200px|図2. ヒトTrkAリガンド結合部位の結晶構造<br><ref><pubmed> 11263982</pubmed></ref>による。]]<br />
<br />
Trkにはスプライスバリアントが複数存在するが、TrkB, TrkCにはキナーゼドメインを欠失した短いタイプ（truncated型）があり、このタイプの受容体はリガンドと結合はするが、シグナルを伝えることはできない。そのためドミナントネガティブとして働くが、それ以外の働きも示されている<ref name=Deinhardt2014><pubmed> 24668471 </pubmed></ref> (5)。<br />
<br />
==分布==<br />
TrkA,B,Cとも末梢神経系の神経細胞に広く発現している。脳内ではTrkB, Cは幅広く分布し、ほとんどの神経細胞に発現している。一方、TrkAの発現はほぼ前脳基底野のアセチルコリン作働性神経細胞に限られておりNGFの作用も限定されている。細胞内局在では末梢系では主に前シナプスに発現し、ニューロトロフィンの標的由来/逆行性作用を受けている。TrkAは中枢でも逆行性作用が主と考えられており前シナプスに発現しているのに対し、TrkBは主に後シナプスに発現して、前シナプスから活動依存的に放出されるBDNFを受容して機能している<ref name=Nawa2001><pubmed>11718853</pubmed></ref> (6)。<br />
<br />
<u>（査読者：<br />
（１）発現、分布、局在という単語の使い分けが曖昧と感じられる箇所がありますので、ご確認ください。<br />
「発現している」とした場合、一般には遺伝子の発現だと思われますが、TrkAはタンパク質ということで、この文章がタンパク質なのか、遺伝子なのか、曖昧だと思います。また、「細胞内局在では末梢系では主に前シナプスに発現し」という箇所ですが、この場合、細胞内局在と言っています。前シナプスの神経細胞で発現し、前シナプス部に局在するという表現だと思いますが、発現という単語を使用されることで、この辺が曖昧になっていると感じます。「TrkBは主に後シナプスに発現して、」という部分も、細胞での発現なのか、後シナプスでの細胞内局在に言及しているのか、曖昧だと思います。<br />
（２）前脳基底野ー＞前脳基底部）</u><br />
<br />
<br />
<br />
[[ファイル:Takei Trk Fig2.png|サムネイル|'''図3. Trk受容体による細胞内情報伝達'''<br>リン酸化したチロシン残基にアダプタータンパク質(Shc, FRS2)や酵素(PLC&gamma;)のSH2ドメインが結合し、シグナルが伝わる。]]<br />
<br />
== 生化学的機能 ==<br />
受容体型チロシンキナーゼに共通の仕組みとして、リガンドの結合によって受容体分子が２量体化し、キナーゼドメインによって相手側のチロシン残基がリン酸化される。リン酸化チロシンにアダプター分子が結合し、リン酸化カスケードが駆動され、様々なシグナルが細胞内に伝わる（'''図3'''）<ref name=Chao2003><pubmed>12671646</pubmed></ref><ref name=Huang2003><pubmed>12676795</pubmed></ref> (7,8)。Trkの特徴として、下流シグナルも含めて、活性化の時間経過がEGF受容体などに比べて長く持続することが知られている。TrkAではリン酸化したY496 (TrkBはY532、TrkCはY516)にShcあるいはFRS2が結合し、Ras-MAPK系とPI3K-Akt系が活性化される（'''図3'''）。<br />
<br />
<u>（査読者コメント：Y496などと言った場合、番号はヒトのものでしょうか。種を限定する必要があるかもです。）</u><br />
<br />
ShcあるいはFRS2を介してGrb2-Sosから、癌遺伝子rasの産物で、低分子GTP結合蛋白質であるRasを活性化する。さらにRaf、MEK (MAPキナーゼキナーゼ, MAPKKとも呼ばれる)を介しErk1,2 (Extracellular regulated kinase 1, 2、あるいはmitogen activated protein kinase (MAPK)とも呼ばれる)を活性化する経路であり、転写調節などメインとして多くの細胞応答を引き起こす。<br />
<u>（査読者コメント：「転写調節などメインとして」＞転写調節などを中心に）</u><br />
<br />
Grb2からGab1を介して、脂質キナーゼであるphosphatidilyinositol 3-OH kinase (PI3キナーゼ, PI3K)を活性化する。PI3Kはホスファチジルイノシトール4,5-ビスホスフェート (PIP2)からPIP3を産生し、PDK1-Aktを活性化するシグナルを伝える。アポトーシスの抑制に作用しているとともに、mTORを活性化し翻訳調節などの細胞内代謝を制御している。<br />
<br />
もう一つの経路はPLC&gamma;の系で、TrkAではリン酸化したY791(TrkBではY833、TrkCではY834)にホスホリパーゼC&gamma; (phospholipase C&gamma;)が自身のSH2ドメインを介して結合し活性化され、PIP2からIP3イノシトール３リン酸(IP3)とジアシルグリセロール(DG)を産生する。IP3は細胞内カルシウム貯蔵部位からカルシウムを放出させることによってカルシウムシグナルを駆動させ、ジアシルグリセロールはprotein kinase C (PKC)を活性化させる。どちらも細胞内情報系として様々な重要な働きをしている。<br />
<u>（査読者コメント：ここでは主に生化学的なシグナル伝達を中心に説明していますが、逆行性のNGF-TrkA輸送などのような影響もしばしば議論されていると思います。簡単でよいと思いますので、このような細胞生物学的な動的観点も追加することは可能でしょうか。）</u><br />
<br />
==生理的機能==<br />
Trkの生理的機能としてではなくニューロトロフィン(NGF, BDNF, NT-3)の生理作用として多くの総説があるので参照されたい<ref name=Bibel2000><pubmed>11114882</pubmed></ref><ref name=Park2013><pubmed>23254191</pubmed></ref><ref name=武井延之>'''武井延之、那波宏之 (2004)'''<br>ニューロトロフィンによる脳機能の調節―細胞応答から行動変容までー<br>生化学 76:111-123</ref> (9-11)。<br />
<u>（査読者コメント：「Trkの生理的機能としてではなくニューロトロフィン(NGF, BDNF, NT-3)の生理作用として多くの総説がある」で、NT-4を入れていないのは理由があるのでしょうか。）</u><br />
<br />
各種Trkの発現は末梢神経系に幅広く見られ、末梢神経細胞の分化、生存維持に必須の役割をはたしている。そのためTrkノックアウトマウスは生後まもなく死亡する。表現型としてはリガンドであるニューロトロフィンのノックアウトより重篤である。このため、中枢神経系で研究はコンディショナルノックアウトを用いる必要がある。中枢神経系での機能としては、BDNF-TrkB系が神経可塑性に特に重要であることが示されている。TrkB自体の関与としては、活動依存性に神経細胞の膜表面に移行して(やはり活動依存性に発現、放出が増強されるBDNFとともに)、神経活動とリンクして働くことがわかっている<ref name=Andreska2020><pubmed>32556728</pubmed></ref> (12)。またBDNF-TrkBは中枢性の摂食/代謝にも関与している<ref name=Takei2014><pubmed>25309497</pubmed></ref> (13)。TrkCは広く発現しているものの、NT-3の中枢作用はあまり認められていない。TrkCはシナプスオーガナイザーの働きがあることも報告されており<ref name=Naito2017><pubmed>27697534</pubmed></ref> (14)、Trkはニューロトロフィン受容体としての働き以外にも機能がある可能性もある。<br />
<u>(査読者コメント：「シナプスオーガナイザー」はわかりますが、説明せずに使っても理解しにくい読者が多い可能性があります。シナプス形成に関与するなどとした方が無難であると思います。）</u><br />
<br />
==疾患との関連==<br />
遺伝性感覚ニューロパチーの患者においてNTRK1(ヒトTrkAをコード)のloss of function変異を認めている<ref name=Indo1996><pubmed>8696348</pubmed></ref> (15)。感覚神経にTrkAが発現していることから関与が強く示唆されている。またNTRK2(TrkB)のloss of function変異では摂食異常、肥満、発達遅滞が認められいる<ref name=Yeo2004><pubmed>15494731</pubmed></ref> (16)。これも動物実験の結果と一致している<ref name=Takei2014><pubmed>25309497</pubmed></ref> (13)。疾患に関して近年最も注目を集めているのはNTRK融合遺伝子である。Trkのキナーゼドメインと他の分子との融合遺伝子が癌のドライバーとなることが多くの癌種で明らかになっている <ref name=Cocco2018><pubmed>30333516</pubmed></ref> (17)。Trk発見の経緯も癌における融合遺伝子によることから、驚くことではないが、シークエンス技術の向上により多く見出されるようになってきた。Trk阻害剤が抗癌剤として開発されており、日本でもエヌトレクチニブが抗癌剤として承認されている。（ちなみに副作用として認知障害や運動失調が報告されており、Trkの正常作用を考えるとうなずける。）<br />
<u>（査読者コメント：最後のちなみにの文章のカッコは必要でしょうか。）</u><br />
<br />
==阻害剤とアゴニスト==<br />
これまでTrk阻害剤としてK252aが広く使われていたが、K252aは実際はTrk特異性は高くなく、PKAやPKCを阻害するし、CaMKに対するIC50は一桁低い。抗癌剤として開発された阻害剤はTrkに作用する（はず）であるが、癌研究以外ではあまり使われていない。これらはキナーゼ阻害剤であるため、キナーゼの構造の似ている各Trkに対する特異性/選択性はない<ref name=Cocco2018><pubmed>30333516</pubmed></ref> (17)。各Trkの働きを個別に阻害するためにはTrk-Fc(あるいはTrk-IgG)と言われる各Trkの細胞外ドメインとIgGのFcドメインの融合タンパクが用いられる。<br />
<u>（査読者コメント：PKAやPKCという略号はわかりますが、わからない可能性もあるので、書き下していただいた方がよいかもしれません。<br />
（はず）：（はず）カッコをつけている意図はなんとなくわかりますが、なんとなくわかるというのは科学的な文章としてはあまりよくないと思います。カッコは必要でしょうか。<br />
融合タンパク＞融合タンパク質）</u><br />
<br />
<br />
<br />
アゴニスト、特にTrkBのアゴニストとして低分子の7,8-DHFやLM22A-4などが報告されている<ref name=Josephy-Hernandez2017><pubmed>27546056</pubmed></ref> (18)が、完全なコンセンサスが得られているとは言い難い。<br />
<br />
==リソース==<br />
=== 抗体 ===<br />
Trkに対する抗体が市販されている。免疫染色、ウエスタンブロット、免疫沈降などに利用可。またリン酸化Trkに対する抗体も市販されているが、リン酸化サイトは各Trk間（その他の受容体型チロシンキナーゼでも）で良く保存されているので、特異性には問題がある。<br />
=== cDNA ===<br />
研究者より入手可能。<br />
=== 遺伝子改変マウス ===<br />
各Trkのトランスジェニック、及びノックアウトマウスが作成されている。ノックアウトマウスに関してはジャクソン(http://jaxmice.jax.org/index.html) で全種購入可能。TrkBに関してはコンディショナルノックアウトも作成されている。またtruncated TrkBトランスジェニックマウスも報告されている。大抵のマウスは作成者より入手可能。<br />
=== Database ===<br />
NCBI等で検索可能。（例えばヒトtrkBのmRNAはNM_006180 NTRK2: neurotrophic tyrosine kinase, receptor, type 2と表示）<br />
（査読者コメント：cDNAとDatabaseは不要だと感じます。）<br />
<br />
==関連項目==<br />
* [[低親和性神経成長因子受容体]]<br />
* [[神経成長因子]]<br />
* [[脳由来神経栄養因子]]<br />
* [[ニューロトロフィン-3]]<br />
* [[ニューロトロフィン-4]]<br />
<br />
==参考文献==<br />
<references /></div>
Masahitoyamagata
https://bsd.neuroinf.jp/w/index.php?title=%E9%AB%98%E8%A6%AA%E5%92%8C%E6%80%A7%E3%83%8B%E3%83%A5%E3%83%BC%E3%83%AD%E3%83%88%E3%83%AD%E3%83%95%E3%82%A3%E3%83%B3%E5%8F%97%E5%AE%B9%E4%BD%93&diff=44509
高親和性ニューロトロフィン受容体
2020-08-08T15:08:47Z
<p>Masahitoyamagata: </p>
<hr />
<div><div align="right"> <br />
<font size="+1">[http://researchmap.jp/nobtak2010 武井 延之]</font><br><br />
''新潟大学 脳研究所 基礎神経科学部門 分子神経生物学分野''<br><br />
DOI：<selfdoi /> 原稿受付日：2020年8月7日 原稿完成日：2020年XX月XX日<br><br />
担当編集委員：[https://researchmap.jp/yamagatm 山形 方人]（ハーバード大学・脳科学センター）<br><br />
</div><br />
<br />
同義語：高親和性神経成長因子受容体<br><br />
類義語：Trk受容体<br><br />
英：high-affinity neurotrophin receptor<br />
<br />
{{box|text= 高親和性ニューロトロフィン受容体とはニューロトロフィンファミリー(神経成長因子 (nerve growth factor, NGF)、脳由来神経栄養因子 (brain-derived neurotrophic factor, BDNF)、ニューロトロフィン-3 (neurotrophin-3, NT-3）、ニューロトロフィン-4 (neurotrophin-4, NT-4)からなる)の受容体であり、TrkA, B, Cがある。低親和性神経栄養因子受容体（p75）が全てのニューロトロフィンと結合(Kd=10<sup>-9</sup>M)するのに対し、TrkAにはNGFが、TrkBにはBDNFとNT-4が、TrkCにはNT-3がそれぞれ高親和性(Kd=10<sup>-11</sup>M)に結合、作用する。またTrkA, BはNT-3とも低親和性に結合する。<u>（編集部コメント：対応する内容が本文に無いようです。機能などについてもご言及頂ければと思います。）</u>}}<br />
<br />
<u>（査読者コメント：（１）編集部コメントに賛同します。下記の「生理的機能」の内容を、一文でまとめたような文章を追加されるとよいと思います。例えば、神経細胞の分化、生存維持、神経可塑性などに関与する、とか。（２）最初にTrkA, B, Cとでてくるところは、TrkA, TrkB, TrkCとすると、それぞれの違いがよくわかると思います。）</u><br />
<br />
<br />
==高親和性ニューロトロフィン受容体とは==<br />
Trk（トラックと読む）は大腸癌で見出されたトロポミオシンと受容体型チロシンキナーゼ様の分子の融合遺伝子として同定された癌遺伝子trkの遺伝子産物で、tropomyosin receptor kinaseとして1986年にクローニングされていた<ref name=Martin-Zanca1986><pubmed>2869410</pubmed></ref> (1)。受容体型チロシンキナーゼと示唆されていたが、同定時にはリガンドは不明であった。Trkが神経系に高発現していることがわかり、1991年になってTrkA, B, Cが相次いでニューロトロフィンの受容体と同定された<ref name=Lamballe1991><pubmed>1844238</pubmed></ref> (2)。<u>（編集部コメント：高親和性ニューロトロフィン受容体と低親和性受容体の関連についてご言及いただいたうえ、どうして高親和性受容体と言われるようになったのかご説明下さい）</u><br />
<br />
<u>（査読者コメント：また、近年はゲノムやトランスクリプトームの研究が大きくなってきていて、TrkA, TrkB, TrkCに対応するNTRK, NTRK2, NTRK3という「遺伝子名」で見かけることも増えていると思います。これらの関係性を一目で見てわかるように4つのニューロトロフィンとの結合性を含めて簡単な表にするとわかりやすくなるのではないかと思います。<br />
TrkA NTRK NGF<br />
TrkB NTRK2 BDNF, NT-4 (弱）NT-3）</u><br />
<br />
<br />
[[ファイル:Takei Trk Fig1.png|サムネイル|'''図1. Trk受容体（A B C共通）の構造と活性化機構'''<br>2量体リガンド(NGF, BDNF, NT-3, NT-4)が各Trkに結合することによってTrkの2量体化が起こり、キナーゼドメインの活性によってお互いのチロシン残基をリン酸化する。C1,2:システインリッチクラスター、LRR1-3:ロイシンリッチリピート、Ig1,2:I イムノグロブリン様ドメイン。]]<br />
<br />
==分子構造==<br />
TrkはA,B,Cともアミノ酸約800個からなり、糖鎖付加を受けて分子量140-145kDaの成熟分子となる。EGF受容体やインシュリン受容体と同じく受容体型チロシンキナーゼであり、細胞内にキナーゼドメインを持つ。細胞外には2つのシステインリッチクラスターとそれに挟まれた3つのロイシンリッチリピート、さらに2つのイムノグロブリン様ドメインがある。2つ目のイムノグロブリン様ドメインにリガンドである各ニューロトロフィンが結合する。2量体リガンドが結合するとTrk自体も2量体化し、細胞内ドメインのチロシン残基を相互にリン酸化する。このリン酸化チロシンに種々の分子が結合し、細胞内にシグナルを伝達する（'''図1'''）<ref name=Barbacid1994><pubmed>7852993</pubmed></ref><ref name=Barbacid1995><pubmed>7486690</pubmed></ref> (3)。リガンド結合部位（'''図2'''）、キナーゼドメイン共に結晶構造解析がなされている。<br />
<br />
<u>（査読者：ここで、EGF受容体やインシュリン受容体以外に、例えばRORファミリーなど関連した受容体との関係、あるいは他の生物、特に無脊椎動物（Drosophilaなど）に見られる類似のレセプター型チロシンキナーゼとの関係が明示されると、分子構造の説明としての視点が広がると思います。）</u><br />
<br />
<br />
<br />
[[ファイル:1he7.pdb|サムネイル|200px|図2. ヒトTrkAリガンド結合部位の結晶構造<br><ref><pubmed> 11263982</pubmed></ref>による。]]<br />
<br />
Trkにはスプライスバリアントが複数存在するが、TrkB, TrkCにはキナーゼドメインを欠失した短いタイプ（truncated型）があり、このタイプの受容体はリガンドと結合はするが、シグナルを伝えることはできない。そのためドミナントネガティブとして働くが、それ以外の働きも示されている<ref name=Deinhardt2014><pubmed> 24668471 </pubmed></ref> (5)。<br />
<br />
==分布==<br />
TrkA,B,Cとも末梢神経系の神経細胞に広く発現している。脳内ではTrkB, Cは幅広く分布し、ほとんどの神経細胞に発現している。一方、TrkAの発現はほぼ前脳基底野のアセチルコリン作働性神経細胞に限られておりNGFの作用も限定されている。細胞内局在では末梢系では主に前シナプスに発現し、ニューロトロフィンの標的由来/逆行性作用を受けている。TrkAは中枢でも逆行性作用が主と考えられており前シナプスに発現しているのに対し、TrkBは主に後シナプスに発現して、前シナプスから活動依存的に放出されるBDNFを受容して機能している<ref name=Nawa2001><pubmed>11718853</pubmed></ref> (6)。<br />
<br />
<u>（査読者：<br />
（１）発現、分布、局在という単語の使い分けが曖昧と感じられる箇所がありますので、ご確認ください。<br />
「発現している」とした場合、一般には遺伝子の発現だと思われますが、TrkAはタンパク質ということで、この文章がタンパク質なのか、遺伝子なのか、曖昧だと思います。また、「細胞内局在では末梢系では主に前シナプスに発現し」という箇所ですが、この場合、細胞内局在と言っています。前シナプスの神経細胞で発現し、前シナプス部に局在するという表現だと思いますが、発現という単語を使用されることで、この辺が曖昧になっていると感じます。「TrkBは主に後シナプスに発現して、」という部分も、細胞での発現なのか、後シナプスでの細胞内局在に言及しているのか、曖昧だと思います。<br />
（２）前脳基底野ー＞前脳基底部）</u><br />
<br />
<br />
<br />
[[ファイル:Takei Trk Fig2.png|サムネイル|'''図3. Trk受容体による細胞内情報伝達'''<br>リン酸化したチロシン残基にアダプタータンパク質(Shc, FRS2)や酵素(PLC&gamma;)のSH2ドメインが結合し、シグナルが伝わる。]]<br />
<br />
== 生化学的機能 ==<br />
受容体型チロシンキナーゼに共通の仕組みとして、リガンドの結合によって受容体分子が２量体化し、キナーゼドメインによって相手側のチロシン残基がリン酸化される。リン酸化チロシンにアダプター分子が結合し、リン酸化カスケードが駆動され、様々なシグナルが細胞内に伝わる（'''図3'''）<ref name=Chao2003><pubmed>12671646</pubmed></ref><ref name=Huang2003><pubmed>12676795</pubmed></ref> (7,8)。Trkの特徴として、下流シグナルも含めて、活性化の時間経過がEGF受容体などに比べて長く持続することが知られている。TrkAではリン酸化したY496 (TrkBはY532、TrkCはY516)にShcあるいはFRS2が結合し、Ras-MAPK系とPI3K-Akt系が活性化される（'''図3'''）。<br />
<br />
<u>（査読者コメント：Y496などと言った場合、番号はヒトのものでしょうか。種を限定する必要があるかもです。）</u><br />
<br />
ShcあるいはFRS2を介してGrb2-Sosから、癌遺伝子rasの産物で、低分子GTP結合蛋白質であるRasを活性化する。さらにRaf、MEK (MAPキナーゼキナーゼ, MAPKKとも呼ばれる)を介しErk1,2 (Extracellular regulated kinase 1, 2、あるいはmitogen activated protein kinase (MAPK)とも呼ばれる)を活性化する経路であり、転写調節などメインとして多くの細胞応答を引き起こす。<br />
<u>（査読者コメント：「転写調節などメインとして」＞転写調節などを中心に）</u><br />
<br />
Grb2からGab1を介して、脂質キナーゼであるphosphatidilyinositol 3-OH kinase (PI3キナーゼ, PI3K)を活性化する。PI3Kはホスファチジルイノシトール4,5-ビスホスフェート (PIP2)からPIP3を産生し、PDK1-Aktを活性化するシグナルを伝える。アポトーシスの抑制に作用しているとともに、mTORを活性化し翻訳調節などの細胞内代謝を制御している。<br />
<br />
もう一つの経路はPLC&gamma;の系で、TrkAではリン酸化したY791(TrkBではY833、TrkCではY834)にホスホリパーゼC&gamma; (phospholipase C&gamma;)が自身のSH2ドメインを介して結合し活性化され、PIP2からIP3イノシトール３リン酸(IP3)とジアシルグリセロール(DG)を産生する。IP3は細胞内カルシウム貯蔵部位からカルシウムを放出させることによってカルシウムシグナルを駆動させ、ジアシルグリセロールはprotein kinase C (PKC)を活性化させる。どちらも細胞内情報系として様々な重要な働きをしている。<br />
<br />
==生理的機能==<br />
Trkの生理的機能としてではなくニューロトロフィン(NGF, BDNF, NT-3)の生理作用として多くの総説があるので参照されたい<ref name=Bibel2000><pubmed>11114882</pubmed></ref><ref name=Park2013><pubmed>23254191</pubmed></ref><ref name=武井延之>'''武井延之、那波宏之 (2004)'''<br>ニューロトロフィンによる脳機能の調節―細胞応答から行動変容までー<br>生化学 76:111-123</ref> (9-11)。<br />
<u>（査読者コメント：「Trkの生理的機能としてではなくニューロトロフィン(NGF, BDNF, NT-3)の生理作用として多くの総説がある」で、NT-4を入れていないのは理由があるのでしょうか。）</u><br />
<br />
各種Trkの発現は末梢神経系に幅広く見られ、末梢神経細胞の分化、生存維持に必須の役割をはたしている。そのためTrkノックアウトマウスは生後まもなく死亡する。表現型としてはリガンドであるニューロトロフィンのノックアウトより重篤である。このため、中枢神経系で研究はコンディショナルノックアウトを用いる必要がある。中枢神経系での機能としては、BDNF-TrkB系が神経可塑性に特に重要であることが示されている。TrkB自体の関与としては、活動依存性に神経細胞の膜表面に移行して(やはり活動依存性に発現、放出が増強されるBDNFとともに)、神経活動とリンクして働くことがわかっている<ref name=Andreska2020><pubmed>32556728</pubmed></ref> (12)。またBDNF-TrkBは中枢性の摂食/代謝にも関与している<ref name=Takei2014><pubmed>25309497</pubmed></ref> (13)。TrkCは広く発現しているものの、NT-3の中枢作用はあまり認められていない。TrkCはシナプスオーガナイザーの働きがあることも報告されており<ref name=Naito2017><pubmed>27697534</pubmed></ref> (14)、Trkはニューロトロフィン受容体としての働き以外にも機能がある可能性もある。<br />
<u>(査読者コメント：「シナプスオーガナイザー」はわかりますが、説明せずに使っても理解しにくい読者が多い可能性があります。シナプス形成に関与するなどとした方が無難であると思います。）</u><br />
<br />
==疾患との関連==<br />
遺伝性感覚ニューロパチーの患者においてNTRK1(ヒトTrkAをコード)のloss of function変異を認めている<ref name=Indo1996><pubmed>8696348</pubmed></ref> (15)。感覚神経にTrkAが発現していることから関与が強く示唆されている。またNTRK2(TrkB)のloss of function変異では摂食異常、肥満、発達遅滞が認められいる<ref name=Yeo2004><pubmed>15494731</pubmed></ref> (16)。これも動物実験の結果と一致している<ref name=Takei2014><pubmed>25309497</pubmed></ref> (13)。疾患に関して近年最も注目を集めているのはNTRK融合遺伝子である。Trkのキナーゼドメインと他の分子との融合遺伝子が癌のドライバーとなることが多くの癌種で明らかになっている <ref name=Cocco2018><pubmed>30333516</pubmed></ref> (17)。Trk発見の経緯も癌における融合遺伝子によることから、驚くことではないが、シークエンス技術の向上により多く見出されるようになってきた。Trk阻害剤が抗癌剤として開発されており、日本でもエヌトレクチニブが抗癌剤として承認されている。（ちなみに副作用として認知障害や運動失調が報告されており、Trkの正常作用を考えるとうなずける。）<br />
<u>（査読者コメント：最後のちなみにの文章のカッコは必要でしょうか。）</u><br />
<br />
==阻害剤とアゴニスト==<br />
これまでTrk阻害剤としてK252aが広く使われていたが、K252aは実際はTrk特異性は高くなく、PKAやPKCを阻害するし、CaMKに対するIC50は一桁低い。抗癌剤として開発された阻害剤はTrkに作用する（はず）であるが、癌研究以外ではあまり使われていない。これらはキナーゼ阻害剤であるため、キナーゼの構造の似ている各Trkに対する特異性/選択性はない<ref name=Cocco2018><pubmed>30333516</pubmed></ref> (17)。各Trkの働きを個別に阻害するためにはTrk-Fc(あるいはTrk-IgG)と言われる各Trkの細胞外ドメインとIgGのFcドメインの融合タンパクが用いられる。<br />
<u>（査読者コメント：PKAやPKCという略号はわかりますが、わからない可能性もあるので、書き下していただいた方がよいかもしれません。<br />
（はず）：（はず）カッコをつけている意図はなんとなくわかりますが、なんとなくわかるというのは科学的な文章としてはあまりよくないと思います。カッコは必要でしょうか。<br />
融合タンパク＞融合タンパク質）</u><br />
<br />
<br />
<br />
アゴニスト、特にTrkBのアゴニストとして低分子の7,8-DHFやLM22A-4などが報告されている<ref name=Josephy-Hernandez2017><pubmed>27546056</pubmed></ref> (18)が、完全なコンセンサスが得られているとは言い難い。<br />
<br />
==リソース==<br />
=== 抗体 ===<br />
Trkに対する抗体が市販されている。免疫染色、ウエスタンブロット、免疫沈降などに利用可。またリン酸化Trkに対する抗体も市販されているが、リン酸化サイトは各Trk間（その他の受容体型チロシンキナーゼでも）で良く保存されているので、特異性には問題がある。<br />
=== cDNA ===<br />
研究者より入手可能。<br />
=== 遺伝子改変マウス ===<br />
各Trkのトランスジェニック、及びノックアウトマウスが作成されている。ノックアウトマウスに関してはジャクソン(http://jaxmice.jax.org/index.html) で全種購入可能。TrkBに関してはコンディショナルノックアウトも作成されている。またtruncated TrkBトランスジェニックマウスも報告されている。大抵のマウスは作成者より入手可能。<br />
=== Database ===<br />
NCBI等で検索可能。（例えばヒトtrkBのmRNAはNM_006180 NTRK2: neurotrophic tyrosine kinase, receptor, type 2と表示）<br />
（査読者コメント：cDNAとDatabaseは不要だと感じます。）<br />
<br />
==関連項目==<br />
* [[低親和性神経成長因子受容体]]<br />
* [[神経成長因子]]<br />
* [[脳由来神経栄養因子]]<br />
* [[ニューロトロフィン-3]]<br />
* [[ニューロトロフィン-4]]<br />
<br />
==参考文献==<br />
<references /></div>
Masahitoyamagata
https://bsd.neuroinf.jp/w/index.php?title=%E9%AB%98%E8%A6%AA%E5%92%8C%E6%80%A7%E3%83%8B%E3%83%A5%E3%83%BC%E3%83%AD%E3%83%88%E3%83%AD%E3%83%95%E3%82%A3%E3%83%B3%E5%8F%97%E5%AE%B9%E4%BD%93&diff=44508
高親和性ニューロトロフィン受容体
2020-08-08T15:00:44Z
<p>Masahitoyamagata: </p>
<hr />
<div><div align="right"> <br />
<font size="+1">[http://researchmap.jp/nobtak2010 武井 延之]</font><br><br />
''新潟大学 脳研究所 基礎神経科学部門 分子神経生物学分野''<br><br />
DOI：<selfdoi /> 原稿受付日：2020年8月7日 原稿完成日：2020年XX月XX日<br><br />
担当編集委員：[https://researchmap.jp/yamagatm 山形 方人]（ハーバード大学・脳科学センター）<br><br />
</div><br />
<br />
同義語：高親和性神経成長因子受容体<br><br />
類義語：Trk受容体<br><br />
英：high-affinity neurotrophin receptor<br />
<br />
{{box|text= 高親和性ニューロトロフィン受容体とはニューロトロフィンファミリー(神経成長因子 (nerve growth factor, NGF)、脳由来神経栄養因子 (brain-derived neurotrophic factor, BDNF)、ニューロトロフィン-3 (neurotrophin-3, NT-3）、ニューロトロフィン-4 (neurotrophin-4, NT-4)からなる)の受容体であり、TrkA, B, Cがある。低親和性神経栄養因子受容体（p75）が全てのニューロトロフィンと結合(Kd=10<sup>-9</sup>M)するのに対し、TrkAにはNGFが、TrkBにはBDNFとNT-4が、TrkCにはNT-3がそれぞれ高親和性(Kd=10<sup>-11</sup>M)に結合、作用する。またTrkA, BはNT-3とも低親和性に結合する。<u>（編集部コメント：対応する内容が本文に無いようです。機能などについてもご言及頂ければと思います。）</u>}}<br />
<u>（査読者コメント：（１）編集部コメントに賛同します。下記の「生理的機能」の内容を、一文でまとめたような文章を追加されるとよいと思います。例えば、神経細胞の分化、生存維持、神経可塑性などに関与する、とか。（２）最初にTrkA, B, Cとでてくるところは、TrkA, TrkB, TrkCとすると、それぞれの違いがよくわかると思います。）</u><br />
<br />
<br />
==高親和性ニューロトロフィン受容体とは==<br />
Trk（トラックと読む）は大腸癌で見出されたトロポミオシンと受容体型チロシンキナーゼ様の分子の融合遺伝子として同定された癌遺伝子trkの遺伝子産物で、tropomyosin receptor kinaseとして1986年にクローニングされていた<ref name=Martin-Zanca1986><pubmed>2869410</pubmed></ref> (1)。受容体型チロシンキナーゼと示唆されていたが、同定時にはリガンドは不明であった。Trkが神経系に高発現していることがわかり、1991年になってTrkA, B, Cが相次いでニューロトロフィンの受容体と同定された<ref name=Lamballe1991><pubmed>1844238</pubmed></ref> (2)。<u>（編集部コメント：高親和性ニューロトロフィン受容体と低親和性受容体の関連についてご言及いただいたうえ、どうして高親和性受容体と言われるようになったのかご説明下さい）</u><br />
<u>（査読者コメント：また、近年はゲノムやトランスクリプトームの研究が大きくなってきていて、TrkA, TrkB, TrkCに対応するNTRK, NTRK2, NTRK3という「遺伝子名」で見かけることも増えていると思います。これらの関係性を一目で見てわかるように4つのニューロトロフィンとの結合性を含めて簡単な表にするとわかりやすくなるのではないかと思います。<br />
TrkA NTRK NGF<br />
TrkB NTRK2 BDNF, NT-4 (弱）NT-3）</u><br />
<br />
<br />
[[ファイル:Takei Trk Fig1.png|サムネイル|'''図1. Trk受容体（A B C共通）の構造と活性化機構'''<br>2量体リガンド(NGF, BDNF, NT-3, NT-4)が各Trkに結合することによってTrkの2量体化が起こり、キナーゼドメインの活性によってお互いのチロシン残基をリン酸化する。C1,2:システインリッチクラスター、LRR1-3:ロイシンリッチリピート、Ig1,2:I イムノグロブリン様ドメイン。]]<br />
<br />
==分子構造==<br />
TrkはA,B,Cともアミノ酸約800個からなり、糖鎖付加を受けて分子量140-145kDaの成熟分子となる。EGF受容体やインシュリン受容体と同じく受容体型チロシンキナーゼであり、細胞内にキナーゼドメインを持つ。細胞外には2つのシステインリッチクラスターとそれに挟まれた3つのロイシンリッチリピート、さらに2つのイムノグロブリン様ドメインがある。2つ目のイムノグロブリン様ドメインにリガンドである各ニューロトロフィンが結合する。2量体リガンドが結合するとTrk自体も2量体化し、細胞内ドメインのチロシン残基を相互にリン酸化する。このリン酸化チロシンに種々の分子が結合し、細胞内にシグナルを伝達する（'''図1'''）<ref name=Barbacid1994><pubmed>7852993</pubmed></ref><ref name=Barbacid1995><pubmed>7486690</pubmed></ref> (3)。リガンド結合部位（'''図2'''）、キナーゼドメイン共に結晶構造解析がなされている。<br />
<u>（査読者：ここで、EGF受容体やインシュリン受容体以外に、例えばRORファミリーなど関連した受容体との関係、あるいは他の生物、特に無脊椎動物（Drosophilaなど）に見られる類似のレセプター型チロシンキナーゼとの関係が明示されると、分子構造の説明としての視点が広がると思います。）</u><br />
<br />
<br />
<br />
[[ファイル:1he7.pdb|サムネイル|200px|図2. ヒトTrkAリガンド結合部位の結晶構造<br><ref><pubmed> 11263982</pubmed></ref>による。]]<br />
<br />
Trkにはスプライスバリアントが複数存在するが、TrkB, TrkCにはキナーゼドメインを欠失した短いタイプ（truncated型）があり、このタイプの受容体はリガンドと結合はするが、シグナルを伝えることはできない。そのためドミナントネガティブとして働くが、それ以外の働きも示されている<ref name=Deinhardt2014><pubmed> 24668471 </pubmed></ref> (5)。<br />
<br />
==分布==<br />
TrkA,B,Cとも末梢神経系の神経細胞に広く発現している。脳内ではTrkB, Cは幅広く分布し、ほとんどの神経細胞に発現している。一方、TrkAの発現はほぼ前脳基底野のアセチルコリン作働性神経細胞に限られておりNGFの作用も限定されている。細胞内局在では末梢系では主に前シナプスに発現し、ニューロトロフィンの標的由来/逆行性作用を受けている。TrkAは中枢でも逆行性作用が主と考えられており前シナプスに発現しているのに対し、TrkBは主に後シナプスに発現して、前シナプスから活動依存的に放出されるBDNFを受容して機能している<ref name=Nawa2001><pubmed>11718853</pubmed></ref> (6)。<br />
<u>（査読者：<br />
（１）発現、分布、局在という単語の使い分けが曖昧と感じられる箇所がありますので、ご確認ください。<br />
「発現している」とした場合、一般には遺伝子の発現だと思われますが、TrkAはタンパク質ということで、この文章がタンパク質なのか、遺伝子なのか、曖昧だと思います。また、「細胞内局在では末梢系では主に前シナプスに発現し」という箇所ですが、この場合、細胞内局在と言っています。前シナプスの神経細胞で発現し、前シナプス部に局在するという表現だと思いますが、発現という単語を使用されることで、この辺が曖昧になっていると感じます。「TrkBは主に後シナプスに発現して、」という部分も、細胞での発現なのか、後シナプスでの細胞内局在に言及しているのか、曖昧だと思います。<br />
（２）前脳基底野ー＞前脳基底部）</u><br />
<br />
<br />
<br />
[[ファイル:Takei Trk Fig2.png|サムネイル|'''図3. Trk受容体による細胞内情報伝達'''<br>リン酸化したチロシン残基にアダプタータンパク質(Shc, FRS2)や酵素(PLC&gamma;)のSH2ドメインが結合し、シグナルが伝わる。]]<br />
<br />
== 生化学的機能 ==<br />
受容体型チロシンキナーゼに共通の仕組みとして、リガンドの結合によって受容体分子が２量体化し、キナーゼドメインによって相手側のチロシン残基がリン酸化される。リン酸化チロシンにアダプター分子が結合し、リン酸化カスケードが駆動され、様々なシグナルが細胞内に伝わる（'''図3'''）<ref name=Chao2003><pubmed>12671646</pubmed></ref><ref name=Huang2003><pubmed>12676795</pubmed></ref> (7,8)。Trkの特徴として、下流シグナルも含めて、活性化の時間経過がEGF受容体などに比べて長く持続することが知られている。TrkAではリン酸化したY496 (TrkBはY532、TrkCはY516)にShcあるいはFRS2が結合し、Ras-MAPK系とPI3K-Akt系が活性化される（'''図3'''）。<br />
<u>（査読者コメント：Y496などと言った場合、ヒトのものでしょうか。種を限定する必要があるかもです。）</u><br />
<br />
ShcあるいはFRS2を介してGrb2-Sosから、癌遺伝子rasの産物で、低分子GTP結合蛋白質であるRasを活性化する。さらにRaf、MEK (MAPキナーゼキナーゼ, MAPKKとも呼ばれる)を介しErk1,2 (Extracellular regulated kinase 1, 2、あるいはmitogen activated protein kinase (MAPK)とも呼ばれる)を活性化する経路であり、転写調節などメインとして多くの細胞応答を引き起こす。<br />
<u>（査読者コメント：「転写調節などメインとして」＞転写調節などを中心に）</u><br />
<br />
Grb2からGab1を介して、脂質キナーゼであるphosphatidilyinositol 3-OH kinase (PI3キナーゼ, PI3K)を活性化する。PI3Kはホスファチジルイノシトール4,5-ビスホスフェート (PIP2)からPIP3を産生し、PDK1-Aktを活性化するシグナルを伝える。アポトーシスの抑制に作用しているとともに、mTORを活性化し翻訳調節などの細胞内代謝を制御している。<br />
<br />
もう一つの経路はPLC&gamma;の系で、TrkAではリン酸化したY791(TrkBではY833、TrkCではY834)にホスホリパーゼC&gamma; (phospholipase C&gamma;)が自身のSH2ドメインを介して結合し活性化され、PIP2からIP3イノシトール３リン酸(IP3)とジアシルグリセロール(DG)を産生する。IP3は細胞内カルシウム貯蔵部位からカルシウムを放出させることによってカルシウムシグナルを駆動させ、ジアシルグリセロールはprotein kinase C (PKC)を活性化させる。どちらも細胞内情報系として様々な重要な働きをしている。<br />
<br />
==生理的機能==<br />
Trkの生理的機能としてではなくニューロトロフィン(NGF, BDNF, NT-3)の生理作用として多くの総説があるので参照されたい<ref name=Bibel2000><pubmed>11114882</pubmed></ref><ref name=Park2013><pubmed>23254191</pubmed></ref><ref name=武井延之>'''武井延之、那波宏之 (2004)'''<br>ニューロトロフィンによる脳機能の調節―細胞応答から行動変容までー<br>生化学 76:111-123</ref> (9-11)。<br />
<u>（査読者コメント：「Trkの生理的機能としてではなくニューロトロフィン(NGF, BDNF, NT-3)の生理作用として多くの総説がある」で、NT-4を入れていないのは理由があるのでしょうか。）</u><br />
<br />
各種Trkの発現は末梢神経系に幅広く見られ、末梢神経細胞の分化、生存維持に必須の役割をはたしている。そのためTrkノックアウトマウスは生後まもなく死亡する。表現型としてはリガンドであるニューロトロフィンのノックアウトより重篤である。このため、中枢神経系で研究はコンディショナルノックアウトを用いる必要がある。中枢神経系での機能としては、BDNF-TrkB系が神経可塑性に特に重要であることが示されている。TrkB自体の関与としては、活動依存性に神経細胞の膜表面に移行して(やはり活動依存性に発現、放出が増強されるBDNFとともに)、神経活動とリンクして働くことがわかっている<ref name=Andreska2020><pubmed>32556728</pubmed></ref> (12)。またBDNF-TrkBは中枢性の摂食/代謝にも関与している<ref name=Takei2014><pubmed>25309497</pubmed></ref> (13)。TrkCは広く発現しているものの、NT-3の中枢作用はあまり認められていない。TrkCはシナプスオーガナイザーの働きがあることも報告されており<ref name=Naito2017><pubmed>27697534</pubmed></ref> (14)、Trkはニューロトロフィン受容体としての働き以外にも機能がある可能性もある。<br />
<br />
==疾患との関連==<br />
遺伝性感覚ニューロパチーの患者においてNTRK1(ヒトTrkAをコード)のloss of function変異を認めている<ref name=Indo1996><pubmed>8696348</pubmed></ref> (15)。感覚神経にTrkAが発現していることから関与が強く示唆されている。またNTRK2(TrkB)のloss of function変異では摂食異常、肥満、発達遅滞が認められいる<ref name=Yeo2004><pubmed>15494731</pubmed></ref> (16)。これも動物実験の結果と一致している<ref name=Takei2014><pubmed>25309497</pubmed></ref> (13)。疾患に関して近年最も注目を集めているのはNTRK融合遺伝子である。Trkのキナーゼドメインと他の分子との融合遺伝子が癌のドライバーとなることが多くの癌種で明らかになっている <ref name=Cocco2018><pubmed>30333516</pubmed></ref> (17)。Trk発見の経緯も癌における融合遺伝子によることから、驚くことではないが、シークエンス技術の向上により多く見出されるようになってきた。Trk阻害剤が抗癌剤として開発されており、日本でもエヌトレクチニブが抗癌剤として承認されている。（ちなみに副作用として認知障害や運動失調が報告されており、Trkの正常作用を考えるとうなずける。）<br />
<br />
==阻害剤とアゴニスト==<br />
これまでTrk阻害剤としてK252aが広く使われていたが、K252aは実際はTrk特異性は高くなく、PKAやPKCを阻害するし、CaMKに対するIC50は一桁低い。抗癌剤として開発された阻害剤はTrkに作用する（はず）であるが、癌研究以外ではあまり使われていない。これらはキナーゼ阻害剤であるため、キナーゼの構造の似ている各Trkに対する特異性/選択性はない<ref name=Cocco2018><pubmed>30333516</pubmed></ref> (17)。各Trkの働きを個別に阻害するためにはTrk-Fc(あるいはTrk-IgG)と言われる各Trkの細胞外ドメインとIgGのFcドメインの融合タンパクが用いられる。<br />
<u>（査読者コメント：PKAやPKCという略号はわかりますが、わからない可能性もあるので、書き下していただいた方がよいかもしれません。<br />
（はず）：（はず）カッコをつけている意図はなんとなくわかりますが、なんとなくわかるというのは科学的な文章としてはあまりよくないと思います。カッコは必要でしょうか。<br />
融合タンパク＞融合タンパク質）</u><br />
<br />
<br />
<br />
アゴニスト、特にTrkBのアゴニストとして低分子の7,8-DHFやLM22A-4などが報告されている<ref name=Josephy-Hernandez2017><pubmed>27546056</pubmed></ref> (18)が、完全なコンセンサスが得られているとは言い難い。<br />
<br />
==リソース==<br />
=== 抗体 ===<br />
Trkに対する抗体が市販されている。免疫染色、ウエスタンブロット、免疫沈降などに利用可。またリン酸化Trkに対する抗体も市販されているが、リン酸化サイトは各Trk間（その他の受容体型チロシンキナーゼでも）で良く保存されているので、特異性には問題がある。<br />
=== cDNA ===<br />
研究者より入手可能。<br />
=== 遺伝子改変マウス ===<br />
各Trkのトランスジェニック、及びノックアウトマウスが作成されている。ノックアウトマウスに関してはジャクソン(http://jaxmice.jax.org/index.html) で全種購入可能。TrkBに関してはコンディショナルノックアウトも作成されている。またtruncated TrkBトランスジェニックマウスも報告されている。大抵のマウスは作成者より入手可能。<br />
=== Database ===<br />
NCBI等で検索可能。（例えばヒトtrkBのmRNAはNM_006180 NTRK2: neurotrophic tyrosine kinase, receptor, type 2と表示）<br />
（査読者コメント：cDNAとDatabaseは不要だと感じます。）<br />
<br />
==関連項目==<br />
* [[低親和性神経成長因子受容体]]<br />
* [[神経成長因子]]<br />
* [[脳由来神経栄養因子]]<br />
* [[ニューロトロフィン-3]]<br />
* [[ニューロトロフィン-4]]<br />
<br />
==参考文献==<br />
<references /></div>
Masahitoyamagata
https://bsd.neuroinf.jp/w/index.php?title=%E7%A5%9E%E7%B5%8C%E7%AA%81%E8%B5%B7%E8%87%AA%E5%B7%B1%E5%9B%9E%E9%81%BF&diff=44315
神経突起自己回避
2020-07-17T23:30:11Z
<p>Masahitoyamagata: </p>
<hr />
<div><div align="right"> <br />
<font size="+1">[https://researchmap.jp/K1225/ 桑子 賢一郎]</font><br><br />
''島根大学医学部 神経・筋肉生理学''<br><br />
DOI：<selfdoi /> 原稿受付日：2020年7月14日 原稿完成日：2020年月日<br><br />
担当編集委員：[https://researchmap.jp/yamagatm 山形 方人]（ハーバード大学・脳科学センター）<br><br />
</div><br />
<br />
英語名：neuronal self-avoidance<br />
<br />
{{box|text= 神経突起の自己回避は、ニューロンの発生過程で、分岐した自己の神経突起どうしが交錯して絡み合うことを防ぐための機構である。細胞表面分子群を介した局所の反発作用によって自己の突起の交錯が回避される。この機構により、樹状突起や軸索は重複を最小限に抑えるようにできるだけ広がって与えられた空間を効率的にカバーする。例えば、樹状突起のこのような3次元構造は、入力回路との正しいシナプス接続や入力情報の階層的な処理において重要であるとされており神経回路形成の基礎となるシステムである。無脊椎動物・脊椎動物ともにみられる。}}<br />
'''査読：査読コメントです。<br />
執筆いただきありがとうございました。以下、コメントします。<br />
「神経突起の自己回避は、ニューロンの発生過程で、分岐した自己の神経突起どうしが交錯して絡み合うこ とを防ぐための機構である。」<br />
この記述ですが、わかっている人であれば、全く問題ないと思います。しかし、辞典という観点からいうと、少しわかりにくいかもと感じます。読者が最初に目にする文ですので、少しイメージが具体的につかめるようにすると、わかりやすくなると思います。<br />
「発生中の神経系では、多数のニューロンがそれぞれ複数の神経突起を伸長させ、分岐させていく。神経突起の自己回避は、１個のニューロンから伸長する神経突起どうしが交錯して絡み合わない現象である。（適宜、ご変更ください）」<br />
それと、文章全体を通して、あちこちで「機構」という単語が使われているのですが、「現象」という単語もあります。機構というと、現象を達成するための何らかの積極的な仕組み、仕掛けがあるという認識になると思うのです。もしかしたら、そのような仕組みは存在しなくて、デフォールトでそうなる現象という可能性もありますので、まず現象があって、その機構の存在が研究によって明らかになったということなのだと思います。それぞれの「機構」の使い方がそれでよいのか、ご確認していただければと思います。'''<br />
<br />
[[ファイル:Kuwako Fig1.jpg|サムネイル|'''図1. 神経突起の自己回避機構'''<br>'''(A)''' 細胞表面分子を介した反発作用によって自己の突起の交錯が回避される。この機構により、神経突起は重複を抑えてより広範囲を効率的にカバーする。<br>'''(B)''' それぞれのニューロンは自己回避機構によって神経突起の重なりを最小限に抑える。一方、細胞集団としては、タイリングによって周辺細胞と重ならずに領域を充填するパターンと、オーバーラップするパターンがある。]]<br />
== 神経突起自己回避とは ==<br />
神経突起自己回避の概念は、ヒル（''Hirudo medicinalis''）の機械感覚ニューロンの軸索の詳細な観察をもとに提唱された<ref><pubmed>5711143</pubmed></ref>［1］。すなわち、同じ機械感覚ニューロン由来の分岐した軸索はほとんどオーバーラップせずに空間を埋めるのに対し、異なるニューロン由来の軸索は頻繁に重なり合う。この観察から、神経突起は互いに “自己”か“非自己”を認識して自己を避ける機構が存在する可能性が示唆され、この機構は“Self-avoidance”と名付けられた<ref>'''Kramer, A.P. (1982).'''<br>The development of neuronal arborizations in the leech.<br>Neuronal Development: Cellular Approaches in invertebrates, pp882-85</ref>［2］ <ref><pubmed>6317810</pubmed></ref>［3］('''図1''')。<br />
<br />
一方、領域内でそれぞれのニューロンの神経突起が互いに“非自己”を避けて伸展して隙間なく空間を埋めていく機構を“タイリング(Tiling)”と呼ぶ。ショウジョウバエ感覚ニューロンとマウス網膜スターバーストアマクリン細胞は、いずれも自己回避機構によりほとんど交錯しない樹状突起構造をつくるが、周囲の細胞との関係では、ショウジョウバエ感覚ニューロンはタイリングによって互いを避けながら空間を埋めていくのに対し、スターバーストアマクリン細胞は周囲とオーバーラップして網膜内の空間を埋める('''図1''')。<br />
<br />
'''タイリングは「機構」なのか、「現象」なのか？'''<br />
<br />
神経突起自己回避は、神経突起上の特定の細胞表面分子の結合を介して起こる。細胞表面分子の下流シグナルによって細胞骨格が制御されて、神経突起の伸展停止あるいは退縮が起き、結果として局所で自己の神経突起どうしの反発が起こる<ref><pubmed>29972794</pubmed></ref> ［4］。これまでに、無脊椎・脊椎動物の様々なニューロンで神経突起の自己回避を制御する細胞表面分子が多数同定されており、それらを欠失させると反発作用が消失して神経突起の著しい交錯がみられるようになる('''図2''')。したがって、神経突起は積極的に自己の接触を回避しなければ正しい空間配置を確立できないと考えられる。<br />
<br />
'''ここで、交錯して絡み合うのがデフォールトであって、「神経突起の自己回避」機構が存在しなければならない理由など簡単に説明していただけると助かるかもしれません。例えば、神経突起は同じホモフィリックな接着分子を持つので、接着、束になってしまうというようなことです。'''<br />
<br />
神経突起の適切な空間配置は、回路接続や情報処理機能に重要であることから、神経突起自己回避は回路形成の基礎となる非常に重要な機構であるといえる。<br />
<br />
'''ここで、神経突起自己回避についての総説の文献２，３件引用されると、辞典としての便宜性が高まると思います。適宜、削除、追加してください。例えば、<br />
Grueber WB, Sagasti A. Self-avoidance and tiling: Mechanisms of dendrite and axon spacing. Cold Spring Harb Perspect Biol. 2010 Sep;2(9):a001750. doi: 10.1101/cshperspect.a001750. Epub 2010 Jun 23. PMID: 20573716; PMCID: PMC2926746.<br />
Lefebvre JL, Sanes JR, Kay JN. Development of dendritic form and function. Annu Rev Cell Dev Biol. 2015;31:741-77. doi: 10.1146/annurev-cellbio-100913-013020. Epub 2015 Sep 29. PMID: 26422333.'''<br />
<br />
== モデル解析ニューロン ==<br />
<br />
'''「モデル解析ニューロン」とは、おそらく「神経突起の自己回避」ということが先にあって、それを研究するモデルとして御説明されたようなニューロンが研究されたという意味だと思われますが、少しわかりにくいかもしれません。というより、私はむしろ「神経突起の自己回避」現象が明確に観察できる典型例として、実験システムとして研究されてきたような気がします。例えば、解析モデルとなるニューロン、神経突起自己回避が観察できるニューロンといった説明的なタイトルにした方がよいと思います。個人的にはモデルニューロン、モデルとして解析という表現がやや気になるのですが（研究している人にとってはモデルではない？）、これは好みの問題だと思います。ご検討いただければと思います。'''<br />
<br />
[[ファイル:Kurako Fig2.jpg|サムネイル|'''図2. 神経突起自己回避の解析モデルニューロン'''<br>ショウジョウバエ感覚ニューロン'''(A)'''、マウス網膜アマクリン細胞'''(B)'''、マウス小脳プルキンエ細胞'''(C)'''は高度に分岐した樹状突起をもつがそれらはなるべく交錯を回避した構造をとる。様々の細胞表面分子、あるいはその制御因子の欠失によって著しい自己交錯が起こる。]]<br />
初期の形態学的な研究では、ヒルの感覚ニューロンやネコの網膜ニューロンがモデルとして解析された。その後、遺伝学や分子生物学的解析法の発展に伴い、神経突起自己回避の研究も分子機構に迫る研究が展開され、現在に至っている。<br />
<br />
無脊椎動物では神経突起自己回避の研究のほとんどは、ショウジョウバエの''dendritic arborization'' (''da'') 感覚ニューロンと線虫のPVD侵害受容感覚ニューロンをモデルとして、遺伝学を駆使した変異体解析が行われてきた。<br />
<br />
一方、脊椎動物では、マウスの網膜ニューロン、特に網膜神経節細胞とアマクリン細胞の樹状突起を中心に多くの研究が行われてきた。最近は、高度に分岐した単層平面構造の樹状突起をもつ小脳プルキンエ細胞での研究も進められている。いずれのモデルニューロンも自己回避機構によって大きく広がった樹状突起が空間を効率的にカバーする構造をとる。これら以外のニューロンも基本的に自己の神経突起の接触を回避した構造をもつことから、神経突起の自己回避は保存された普遍的なシステムであると考えられる。<br />
<br />
== 制御する分子群 ==<br />
[[ファイル:Kurako Fig3.jpg|サムネイル|'''図3. DSCAM1とプロトカドヘリン'''<br>'''(A)''' ショウジョウバエDSCAM1は、選択的スプライシングによって19008種類の細胞外領域バリアントが存在する。エクソン4は免疫グロブリン2（Ig2）ドメインを、エクソン6とエクソン9はそれぞれIg3とIg7をコードする。そして、エクソン4、6、9はそれぞれ12、48、33のアイソフォームがある。多くのバリアントが産生されるが、同一のアイソフォームどうしが特異的に結合する。<br>'''(B)''' マウスプロトカドヘリン（Pcdh）は、Pcdh&alpha;とPcdh&beta;、Pcdh&gamma;が遺伝子クラスターを形成しており、細胞外領域の異なるプロトカドヘリン分子が全部で58種類存在する。プロトカドヘリンのバリアントは異なるプロモーター選択によって産生される。]]<br />
これまでにショウジョウバエや線虫、マウスなどのモデル生物において、神経突起の自己回避を直接制御する多くの細胞表面分子が同定されている。なかでも、ショウジョウバエのDSCAM1とマウスのプロトカドヘリンは、多様な細胞外ドメインからなる多くのアイソフォームをもつ巨大ファミリー分子で、これらが神経突起表面でのアイソフォームどうしのマッチングによって “自己”あるいは“非自己”を認識し、そして、同じアイソフォームの同種親和性結合を介して自己の突起の反発を引き起こす。<br />
<br />
'''図３のDSCAM1の結合の図ですが、同じ細胞の表面上で結合するcis相互作用のような印象を受けるのですが、transで相互作用するのが神経突起自己回避のメカニズムだと思います。また、プロトカドヘリンについては、クラスター型プロトカドヘリンと正確に記載するべきだと思います。'''<br />
=== ショウジョウバエ ===<br />
==== DSCAM1 ====<br />
同種親和性結合能をもつ進化的に保存された細胞接着因子で、細胞外領域には10個の免疫グロブリン領域と6個のフィブロネクチンリピートが存在する。選択的スプライシングによって、細胞外領域には19,008種類のバリアントが存在し、1つのDscam1遺伝子から合計で38,016種類のアイソフォームがつくられる<ref><pubmed>10892653</pubmed></ref>［5］('''図3''')。DSCAM1は同じアイソフォーム同士が細胞外領域で特異的に結合し、その結果、細胞内領域を介したシグナルにより反発作用を生じる。それぞれのニューロンはランダムにDscam1アイソフォームを発現しているが、同じ細胞由来の突起どうしでは同じアイソフォームが発現しており、それらの同種親和性結合によって反発作用が生じて神経突起の自己回避が起こる<ref><pubmed>15339666</pubmed></ref>［6］<ref><pubmed>17889655</pubmed></ref>［7］。<br />
<br />
ショウジョウバエ感覚ニューロンや中枢キノコ体ニューロンでDscam1を欠失させると、同じニューロン由来の神経突起の自己交錯が著しく増加する('''図2''')<ref><pubmed>15339649</pubmed></ref>［8］<ref><pubmed>17481395</pubmed></ref>［9］<ref><pubmed>17482551</pubmed></ref>［10］<ref><pubmed>17481394</pubmed></ref>［11］。ただし、神経突起の自己回避に必要なのはDSCAM1アイソフォームの多様性ではなくあくまで同一アイソフォームによる結合であり、アイソフォームの多様性は自己と非自己の識別に関わるとされている<ref><pubmed>19794492</pubmed></ref>［12］。<br />
<br />
==== インテグリン-ラミニン ====<br />
ショウジョウバエ感覚ニューロンで発現する細胞接着因子インテグリンと上皮から分泌されるラミニンが結合することで樹状突起の自己回避が起こる<ref name=ref22243747 ><pubmed>22243747</pubmed></ref>［13］<ref name=ref22243748 ><pubmed>22243748</pubmed></ref>［14］。<br />
<br />
'''細胞接着分子とした方がよいと思います。Cell adhesion moleculeは英語で普通に使いますが、Cell adhesion factorとはあまり言わないです。'''<br />
<br />
==== Sema2b-PlexinB ====<br />
上皮から分泌されるSema2bとショウジョウバエ感覚ニューロンで発現するPlexinBが結合し、このSema2B-PlexinBシグナルがリン酸化酵素Tricornered <ref><pubmed>15479641</pubmed></ref>［15］を活性化することで樹状突起の自己回避が起こる<ref name=ref26853303><pubmed>26853303</pubmed></ref>［16］。さらにPlexinBはインテグリン&beta;サブユニット<ref name=ref22243747 ></ref>［13］<ref name=ref22243748 ></ref>［14］や細胞内のtarget of rapamycin complex2<ref><pubmed> 19875983</pubmed></ref>［17］とも相互作用することで樹状突起自己回避に関わると考えられる<ref name=ref26853303></ref>［16］。<br />
<br />
==== その他 ====<br />
カドへリンファミリーに属する接着因子Flamingoはその細胞内領域にLIMドメインタンパク質であるEspinasが結合することで反発作用を生み、感覚ニューロンの樹状突起の自己回避を促す<ref><pubmed> 21937715</pubmed></ref>［18］。細胞膜貫通タンパク質であるTurtleの変異体ショウジョウバエは感覚ニューロンの樹状突起自己回避に異常が起こる<ref><pubmed>19783736</pubmed></ref>［19］。Turtleによる樹状突起自己回避は、その細胞内領域を必要としないことからTurtleはリガンドあるいは共受容体として機能することで反発作用を生むと考えられる。がん抑制因子Hippoの変異体ショウジョウバエも感覚ニューロンの樹状突起自己回避に異常が起こることから、自己の樹状突起どうしの反発を引き起こす細胞内シグナルとしてはたらいていると考えられる<ref><pubmed>16906135</pubmed></ref>［20］。ただし、Hippoと樹状突起自己回避を制御する細胞表面分子との関係はわかっていない。<br />
<br />
'''接着因子は、接着分子とした方がよいと思います。がん抑制因子Hippoの変異体ショウジョウバエー＞ショウジョウバエ変異体？変異ショウジョウバエ？<br />
がん抑制因子より、リン酸化酵素Hippoとした方が適切な情報を伝えることができると思います。'''<br />
<br />
=== 線虫 ===<br />
==== SAX-7/MNR-1/DMA-1 ====<br />
皮下組織由来のリガンドSAX-7とMNR-1の複合体がPVD侵害受容ニューロンで発現する受容体DMA-1に結合することで樹状突起の自己回避が起こる<ref><pubmed>24120131</pubmed></ref> ［21］<ref><pubmed>24120132</pubmed></ref>［22］。<br />
==== UNC-6/UNC-40/UNC-5 ====<br />
UNC-6(ネトリン)-UNC-40(DCC)シグナルは細胞表面のUNC-5を介してその下流のUNC-34、WSP-1, UNC-73, MIG-10、Arp2/3複合体によるアクチン骨格制御を促すことでPVD侵害受容ニューロンの樹状突起自己回避を促進する<ref><pubmed>22426253</pubmed></ref>［23］<ref><pubmed>31220078</pubmed></ref>［24］。<br />
==== その他 ====<br />
カドへリンファミリーFlamingo <ref><pubmed>32631831</pubmed></ref>［25］やWnt分泌因子MIG-14/Wntless <ref><pubmed>29673481</pubmed></ref>［26］、前駆体タンパク質変換酵素KPC-1/Furin <ref><pubmed>25232734</pubmed></ref>［27］もPVD侵害受容ニューロンの樹状突起に関わることが報告されている。<br />
<br />
=== マウス ===<br />
==== DSCAM ====<br />
ショウジョウバエDSCAM1とは異なり、アイソフォームは２種類しか存在しない。マウス網膜の研究から、脊椎動物のDSCAMは網膜神経節細胞およびアマクリン細胞の、ファミリー分子DSCAML1は桿体細胞の樹状突起の自己回避に関わる。DSCAMおよびDSCAML1は、直接反発作用を生むのではなく、カドへリンなどの他の分子を介した細胞接着を阻害することで神経突起の過度の接触を防いでいると考えられる<ref><pubmed>19945391</pubmed></ref>［28］<ref><pubmed>30297418</pubmed></ref>［29］。<br />
<br />
'''DSCAMとDSCAML1の２つは、アイソフォームではなく、異なる遺伝子です。したがって、「遺伝子はDSCAMとDSCAML1は2つで、ショウジョウバエDSCAM1のように多様な選択的スプライシングはそれぞれについて観察されていないので、分子種としては2種類となり多様性がない。（適宜変更してください）」となります。'''<br />
==== プロトカドヘリン ==== <br />
ショウジョウバエDSCAM1と同じく、アイソフォーム特異的に同種親和性結合能をもつ細胞接着因子である<ref><pubmed>20679223</pubmed></ref>［30］。マウスでは、Pcdh&alpha;、Pcdh&beta;、Pcdh&gamma;の3つのプロトカドへリンクラスターがあり、プロモーター選択に基づいてそれぞれの遺伝子座から14、22、22種類のアイソフォームが産生されるため、合計で58種類のバリアントが存在する('''図3''')。Pcdh&gamma;クラスターをすべて欠失させたノックアウトマウスでは網膜スターバーストアマクリン細胞や小脳プルキンエ細胞で樹状突起の自己回避に著しい異常が生じる<ref><pubmed>22842903</pubmed></ref> ［31］('''図2''')。プロトカドへリンによる樹状突起自己回避は、ショウジョウバエDSCAM1と同じく、自己の細胞で発現する同一アイソフォーム同士の結合で生じる反発作用によって起こる。<br />
'''細胞接着分子とした方がよいと思います。クラスター型プロトカドヘリン（非クラスター型プロトカドヘリンに対して）と正確に記入した方がよいです。'''<br />
<br />
==== Slit-Robo2 ====<br />
小脳プルキンエ細胞の樹状突起自己回避において、プロトカドへリンとは独立してはたらく反発性のリガンドー受容体である。Slit2およびRobo2はどちらもプルキンエ細胞で発現し、樹状突起の細胞膜上に局在するSlit2とその受容体であるRobo2が結合すると反発シグナルが生じるとされる<ref><pubmed>22842903</pubmed></ref> ［32］。リン酸化酵素LKB1-SIK経路を介してRobo2が樹状突起に選択的に運ばれることがプルキンエ細胞の樹状突起自己回避に必須である<ref><pubmed>30208308</pubmed></ref>［33］。<br />
<br />
==== Semaphorin6A-PlexinA2/A4 ==== <br />
Semaphorin6Aとその受容体であるPlexinA2/A4の結合によって、網膜スターバーストアマクリン細胞の樹状突起の自己回避が制御されている<ref><pubmed>22593055</pubmed></ref>［34］<ref><pubmed>24179230</pubmed></ref>［35］。<br />
<br />
==参考文献==<br />
<references /></div>
Masahitoyamagata
https://bsd.neuroinf.jp/w/index.php?title=%E7%A5%9E%E7%B5%8C%E7%AA%81%E8%B5%B7%E8%87%AA%E5%B7%B1%E5%9B%9E%E9%81%BF&diff=44314
神経突起自己回避
2020-07-17T23:25:15Z
<p>Masahitoyamagata: </p>
<hr />
<div><div align="right"> <br />
<font size="+1">[https://researchmap.jp/K1225/ 桑子 賢一郎]</font><br><br />
''島根大学医学部 神経・筋肉生理学''<br><br />
DOI：<selfdoi /> 原稿受付日：2020年7月14日 原稿完成日：2020年月日<br><br />
担当編集委員：[https://researchmap.jp/yamagatm 山形 方人]（ハーバード大学・脳科学センター）<br><br />
</div><br />
<br />
英語名：neuronal self-avoidance<br />
<br />
{{box|text= 神経突起の自己回避は、ニューロンの発生過程で、分岐した自己の神経突起どうしが交錯して絡み合うことを防ぐための機構である。細胞表面分子群を介した局所の反発作用によって自己の突起の交錯が回避される。この機構により、樹状突起や軸索は重複を最小限に抑えるようにできるだけ広がって与えられた空間を効率的にカバーする。例えば、樹状突起のこのような3次元構造は、入力回路との正しいシナプス接続や入力情報の階層的な処理において重要であるとされており神経回路形成の基礎となるシステムである。無脊椎動物・脊椎動物ともにみられる。}}<br />
'''査読：査読コメントです。<br />
執筆いただきありがとうございました。以下、コメントします。<br />
「神経突起の自己回避は、ニューロンの発生過程で、分岐した自己の神経突起どうしが交錯して絡み合うこ とを防ぐための機構である。」<br />
この記述ですが、わかっている人であれば、全く問題ないと思います。しかし、辞典という観点からいうと、少しわかりにくいかもと感じます。読者が最初に目にする文ですので、少しイメージが具体的につかめるようにすると、わかりやすくなると思います。<br />
「発生中の神経系では、多数のニューロンがそれぞれ複数の神経突起を伸長させ、分岐させていく。神経突起の自己回避は、１個のニューロンから伸長する神経突起どうしが交錯して絡み合わない現象である。（適宜、ご変更ください）」<br />
それと、文章全体を通して、あちこちで「機構」という単語が使われているのですが、「現象」という単語もあります。機構というと、現象を達成するための何らかの積極的な仕組み、仕掛けがあるという認識になると思うのです。もしかしたら、そのような仕組みは存在しなくて、デフォールトでそうなる現象という可能性もありますので、まず現象があって、その機構の存在が研究によって明らかになったということなのだと思います。それぞれの「機構」の使い方がそれでよいのか、ご確認していただければと思います。'''<br />
<br />
[[ファイル:Kuwako Fig1.jpg|サムネイル|'''図1. 神経突起の自己回避機構'''<br>'''(A)''' 細胞表面分子を介した反発作用によって自己の突起の交錯が回避される。この機構により、神経突起は重複を抑えてより広範囲を効率的にカバーする。<br>'''(B)''' それぞれのニューロンは自己回避機構によって神経突起の重なりを最小限に抑える。一方、細胞集団としては、タイリングによって周辺細胞と重ならずに領域を充填するパターンと、オーバーラップするパターンがある。]]<br />
== 神経突起自己回避とは ==<br />
神経突起自己回避の概念は、ヒル（''Hirudo medicinalis''）の機械感覚ニューロンの軸索の詳細な観察をもとに提唱された<ref><pubmed>5711143</pubmed></ref>［1］。すなわち、同じ機械感覚ニューロン由来の分岐した軸索はほとんどオーバーラップせずに空間を埋めるのに対し、異なるニューロン由来の軸索は頻繁に重なり合う。この観察から、神経突起は互いに “自己”か“非自己”を認識して自己を避ける機構が存在する可能性が示唆され、この機構は“Self-avoidance”と名付けられた<ref>'''Kramer, A.P. (1982).'''<br>The development of neuronal arborizations in the leech.<br>Neuronal Development: Cellular Approaches in invertebrates, pp882-85</ref>［2］ <ref><pubmed>6317810</pubmed></ref>［3］('''図1''')。<br />
<br />
一方、領域内でそれぞれのニューロンの神経突起が互いに“非自己”を避けて伸展して隙間なく空間を埋めていく機構を“タイリング(Tiling)”と呼ぶ。ショウジョウバエ感覚ニューロンとマウス網膜スターバーストアマクリン細胞は、いずれも自己回避機構によりほとんど交錯しない樹状突起構造をつくるが、周囲の細胞との関係では、ショウジョウバエ感覚ニューロンはタイリングによって互いを避けながら空間を埋めていくのに対し、スターバーストアマクリン細胞は周囲とオーバーラップして網膜内の空間を埋める('''図1''')。<br />
<br />
'''タイリングは「機構」なのか、「現象」なのか？'''<br />
<br />
神経突起自己回避は、神経突起上の特定の細胞表面分子の結合を介して起こる。細胞表面分子の下流シグナルによって細胞骨格が制御されて、神経突起の伸展停止あるいは退縮が起き、結果として局所で自己の神経突起どうしの反発が起こる<ref><pubmed>29972794</pubmed></ref> ［4］。これまでに、無脊椎・脊椎動物の様々なニューロンで神経突起の自己回避を制御する細胞表面分子が多数同定されており、それらを欠失させると反発作用が消失して神経突起の著しい交錯がみられるようになる('''図2''')。したがって、神経突起は積極的に自己の接触を回避しなければ正しい空間配置を確立できないと考えられる。<br />
<br />
'''ここで、交錯して絡み合うのがデフォールトであって、「神経突起の自己回避」機構が存在しなければならない理由など簡単に説明していただけると助かるかもしれません。例えば、神経突起は同じホモフィリックな接着分子を持つので、接着、束になってしまうというようなことです。'''<br />
<br />
神経突起の適切な空間配置は、回路接続や情報処理機能に重要であることから、神経突起自己回避は回路形成の基礎となる非常に重要な機構であるといえる。<br />
<br />
'''ここで、神経突起自己回避についての総説の文献２，３件引用されると、辞典としての便宜性が高まると思います。適宜、削除、追加してください。例えば、<br />
Grueber WB, Sagasti A. Self-avoidance and tiling: Mechanisms of dendrite and axon spacing. Cold Spring Harb Perspect Biol. 2010 Sep;2(9):a001750. doi: 10.1101/cshperspect.a001750. Epub 2010 Jun 23. PMID: 20573716; PMCID: PMC2926746.<br />
Lefebvre JL, Sanes JR, Kay JN. Development of dendritic form and function. Annu Rev Cell Dev Biol. 2015;31:741-77. doi: 10.1146/annurev-cellbio-100913-013020. Epub 2015 Sep 29. PMID: 26422333.'''<br />
<br />
== モデル解析ニューロン ==<br />
<br />
'''「モデル解析ニューロン」とは、おそらく「神経突起の自己回避」ということが先にあって、それを研究するモデルとして御説明されたようなニューロンが研究されたという意味だと思われますが、少しわかりにくいかもしれません。というより、私はむしろ「神経突起の自己回避」現象が明確に観察できる典型例として、実験システムとして研究されてきたような気がします。例えば、解析モデルとなるニューロン、神経突起自己回避が観察できるニューロンといった説明的なタイトルにした方がよいと思います。個人的にはモデルニューロン、モデルとして解析という表現がやや気になるのですが（研究している人にとってはモデルではない？）、これは好みの問題だと思います。'''<br />
<br />
[[ファイル:Kurako Fig2.jpg|サムネイル|'''図2. 神経突起自己回避の解析モデルニューロン'''<br>ショウジョウバエ感覚ニューロン'''(A)'''、マウス網膜アマクリン細胞'''(B)'''、マウス小脳プルキンエ細胞'''(C)'''は高度に分岐した樹状突起をもつがそれらはなるべく交錯を回避した構造をとる。様々の細胞表面分子、あるいはその制御因子の欠失によって著しい自己交錯が起こる。]]<br />
初期の形態学的な研究では、ヒルの感覚ニューロンやネコの網膜ニューロンがモデルとして解析された。その後、遺伝学や分子生物学的解析法の発展に伴い、神経突起自己回避の研究も分子機構に迫る研究が展開され、現在に至っている。<br />
<br />
無脊椎動物では神経突起自己回避の研究のほとんどは、ショウジョウバエの''dendritic arborization'' (''da'') 感覚ニューロンと線虫のPVD侵害受容感覚ニューロンをモデルとして、遺伝学を駆使した変異体解析が行われてきた。<br />
<br />
一方、脊椎動物では、マウスの網膜ニューロン、特に網膜神経節細胞とアマクリン細胞の樹状突起を中心に多くの研究が行われてきた。最近は、高度に分岐した単層平面構造の樹状突起をもつ小脳プルキンエ細胞での研究も進められている。いずれのモデルニューロンも自己回避機構によって大きく広がった樹状突起が空間を効率的にカバーする構造をとる。これら以外のニューロンも基本的に自己の神経突起の接触を回避した構造をもつことから、神経突起の自己回避は保存された普遍的なシステムであると考えられる。<br />
<br />
== 制御する分子群 ==<br />
[[ファイル:Kurako Fig3.jpg|サムネイル|'''図3. DSCAM1とプロトカドヘリン'''<br>'''(A)''' ショウジョウバエDSCAM1は、選択的スプライシングによって19008種類の細胞外領域バリアントが存在する。エクソン4は免疫グロブリン2（Ig2）ドメインを、エクソン6とエクソン9はそれぞれIg3とIg7をコードする。そして、エクソン4、6、9はそれぞれ12、48、33のアイソフォームがある。多くのバリアントが産生されるが、同一のアイソフォームどうしが特異的に結合する。<br>'''(B)''' マウスプロトカドヘリン（Pcdh）は、Pcdh&alpha;とPcdh&beta;、Pcdh&gamma;が遺伝子クラスターを形成しており、細胞外領域の異なるプロトカドヘリン分子が全部で58種類存在する。プロトカドヘリンのバリアントは異なるプロモーター選択によって産生される。]]<br />
これまでにショウジョウバエや線虫、マウスなどのモデル生物において、神経突起の自己回避を直接制御する多くの細胞表面分子が同定されている。なかでも、ショウジョウバエのDSCAM1とマウスのプロトカドヘリンは、多様な細胞外ドメインからなる多くのアイソフォームをもつ巨大ファミリー分子で、これらが神経突起表面でのアイソフォームどうしのマッチングによって “自己”あるいは“非自己”を認識し、そして、同じアイソフォームの同種親和性結合を介して自己の突起の反発を引き起こす。<br />
<br />
'''図３のDSCAM1の接着の図ですが、同じ細胞の表面上で接着するcisのような印象を受けるのですが、transで相互作用するのが神経突起自己回避のメカニズムだと思います。また、プロトカドヘリンについては、クラスター型プロトカドヘリンと正確に記載するべきだと思います。'''<br />
=== ショウジョウバエ ===<br />
==== DSCAM1 ====<br />
同種親和性結合能をもつ進化的に保存された細胞接着因子で、細胞外領域には10個の免疫グロブリン領域と6個のフィブロネクチンリピートが存在する。選択的スプライシングによって、細胞外領域には19,008種類のバリアントが存在し、1つのDscam1遺伝子から合計で38,016種類のアイソフォームがつくられる<ref><pubmed>10892653</pubmed></ref>［5］('''図3''')。DSCAM1は同じアイソフォーム同士が細胞外領域で特異的に結合し、その結果、細胞内領域を介したシグナルにより反発作用を生じる。それぞれのニューロンはランダムにDscam1アイソフォームを発現しているが、同じ細胞由来の突起どうしでは同じアイソフォームが発現しており、それらの同種親和性結合によって反発作用が生じて神経突起の自己回避が起こる<ref><pubmed>15339666</pubmed></ref>［6］<ref><pubmed>17889655</pubmed></ref>［7］。<br />
<br />
ショウジョウバエ感覚ニューロンや中枢キノコ体ニューロンでDscam1を欠失させると、同じニューロン由来の神経突起の自己交錯が著しく増加する('''図2''')<ref><pubmed>15339649</pubmed></ref>［8］<ref><pubmed>17481395</pubmed></ref>［9］<ref><pubmed>17482551</pubmed></ref>［10］<ref><pubmed>17481394</pubmed></ref>［11］。ただし、神経突起の自己回避に必要なのはDSCAM1アイソフォームの多様性ではなくあくまで同一アイソフォームによる結合であり、アイソフォームの多様性は自己と非自己の識別に関わるとされている<ref><pubmed>19794492</pubmed></ref>［12］。<br />
<br />
==== インテグリン-ラミニン ====<br />
ショウジョウバエ感覚ニューロンで発現する細胞接着因子インテグリンと上皮から分泌されるラミニンが結合することで樹状突起の自己回避が起こる<ref name=ref22243747 ><pubmed>22243747</pubmed></ref>［13］<ref name=ref22243748 ><pubmed>22243748</pubmed></ref>［14］。<br />
<br />
'''細胞接着分子とした方がよいと思います。Cell adhesion moleculeは英語で普通に使いますが、Cell adhesion factorとはあまり言わないです。'''<br />
<br />
==== Sema2b-PlexinB ====<br />
上皮から分泌されるSema2bとショウジョウバエ感覚ニューロンで発現するPlexinBが結合し、このSema2B-PlexinBシグナルがリン酸化酵素Tricornered <ref><pubmed>15479641</pubmed></ref>［15］を活性化することで樹状突起の自己回避が起こる<ref name=ref26853303><pubmed>26853303</pubmed></ref>［16］。さらにPlexinBはインテグリン&beta;サブユニット<ref name=ref22243747 ></ref>［13］<ref name=ref22243748 ></ref>［14］や細胞内のtarget of rapamycin complex2<ref><pubmed> 19875983</pubmed></ref>［17］とも相互作用することで樹状突起自己回避に関わると考えられる<ref name=ref26853303></ref>［16］。<br />
<br />
==== その他 ====<br />
カドへリンファミリーに属する接着因子Flamingoはその細胞内領域にLIMドメインタンパク質であるEspinasが結合することで反発作用を生み、感覚ニューロンの樹状突起の自己回避を促す<ref><pubmed> 21937715</pubmed></ref>［18］。細胞膜貫通タンパク質であるTurtleの変異体ショウジョウバエは感覚ニューロンの樹状突起自己回避に異常が起こる<ref><pubmed>19783736</pubmed></ref>［19］。Turtleによる樹状突起自己回避は、その細胞内領域を必要としないことからTurtleはリガンドあるいは共受容体として機能することで反発作用を生むと考えられる。がん抑制因子Hippoの変異体ショウジョウバエも感覚ニューロンの樹状突起自己回避に異常が起こることから、自己の樹状突起どうしの反発を引き起こす細胞内シグナルとしてはたらいていると考えられる<ref><pubmed>16906135</pubmed></ref>［20］。ただし、Hippoと樹状突起自己回避を制御する細胞表面分子との関係はわかっていない。<br />
<br />
'''接着因子は、接着分子とした方がよいと思います。<br />
がん抑制因子Hippoの変異体ショウジョウバエー＞ショウジョウバエ変異体？変異ショウジョウバエ？<br />
がん抑制因子より、リン酸化酵素Hippoとした方が適切な情報を伝えることができると思います。'''<br />
<br />
=== 線虫 ===<br />
==== SAX-7/MNR-1/DMA-1 ====<br />
皮下組織由来のリガンドSAX-7とMNR-1の複合体がPVD侵害受容ニューロンで発現する受容体DMA-1に結合することで樹状突起の自己回避が起こる<ref><pubmed>24120131</pubmed></ref> ［21］<ref><pubmed>24120132</pubmed></ref>［22］。<br />
==== UNC-6/UNC-40/UNC-5 ====<br />
UNC-6(ネトリン)-UNC-40(DCC)シグナルは細胞表面のUNC-5を介してその下流のUNC-34、WSP-1, UNC-73, MIG-10、Arp2/3複合体によるアクチン骨格制御を促すことでPVD侵害受容ニューロンの樹状突起自己回避を促進する<ref><pubmed>22426253</pubmed></ref>［23］<ref><pubmed>31220078</pubmed></ref>［24］。<br />
==== その他 ====<br />
カドへリンファミリーFlamingo <ref><pubmed>32631831</pubmed></ref>［25］やWnt分泌因子MIG-14/Wntless <ref><pubmed>29673481</pubmed></ref>［26］、前駆体タンパク質変換酵素KPC-1/Furin <ref><pubmed>25232734</pubmed></ref>［27］もPVD侵害受容ニューロンの樹状突起に関わることが報告されている。<br />
<br />
=== マウス ===<br />
==== DSCAM ====<br />
ショウジョウバエDSCAM1とは異なり、アイソフォームは２種類しか存在しない。マウス網膜の研究から、脊椎動物のDSCAMは網膜神経節細胞およびアマクリン細胞の、ファミリー分子DSCAML1は桿体細胞の樹状突起の自己回避に関わる。DSCAMおよびDSCAML1は、直接反発作用を生むのではなく、カドへリンなどの他の分子を介した細胞接着を阻害することで神経突起の過度の接触を防いでいると考えられる<ref><pubmed>19945391</pubmed></ref>［28］<ref><pubmed>30297418</pubmed></ref>［29］。<br />
<br />
'''DSCAMとDSCAML1の２つは、アイソフォームではなく、異なる遺伝子です。したがって、「遺伝子はDSCAMとDSCAML1は2つで、ショウジョウバエDSCAM1のように多様な選択的スプライシングはそれぞれについて観察されていないので、分子種としては2種類となり多様性がない。（適宜変更してください）」となります。'''<br />
==== プロトカドヘリン ==== <br />
ショウジョウバエDSCAM1と同じく、アイソフォーム特異的に同種親和性結合能をもつ細胞接着因子である<ref><pubmed>20679223</pubmed></ref>［30］。マウスでは、Pcdh&alpha;、Pcdh&beta;、Pcdh&gamma;の3つのプロトカドへリンクラスターがあり、プロモーター選択に基づいてそれぞれの遺伝子座から14、22、22種類のアイソフォームが産生されるため、合計で58種類のバリアントが存在する('''図3''')。Pcdh&gamma;クラスターをすべて欠失させたノックアウトマウスでは網膜スターバーストアマクリン細胞や小脳プルキンエ細胞で樹状突起の自己回避に著しい異常が生じる<ref><pubmed>22842903</pubmed></ref> ［31］('''図2''')。プロトカドへリンによる樹状突起自己回避は、ショウジョウバエDSCAM1と同じく、自己の細胞で発現する同一アイソフォーム同士の結合で生じる反発作用によって起こる。<br />
'''細胞接着分子とした方がよいと思います。クラスター型プロトカドヘリン（非クラスター型プロトカドヘリンに対して）と正確に記入した方がよいです。'''<br />
<br />
==== Slit-Robo2 ====<br />
小脳プルキンエ細胞の樹状突起自己回避において、プロトカドへリンとは独立してはたらく反発性のリガンドー受容体である。Slit2およびRobo2はどちらもプルキンエ細胞で発現し、樹状突起の細胞膜上に局在するSlit2とその受容体であるRobo2が結合すると反発シグナルが生じるとされる<ref><pubmed>22842903</pubmed></ref> ［32］。リン酸化酵素LKB1-SIK経路を介してRobo2が樹状突起に選択的に運ばれることがプルキンエ細胞の樹状突起自己回避に必須である<ref><pubmed>30208308</pubmed></ref>［33］。<br />
<br />
==== Semaphorin6A-PlexinA2/A4 ==== <br />
Semaphorin6Aとその受容体であるPlexinA2/A4の結合によって、網膜スターバーストアマクリン細胞の樹状突起の自己回避が制御されている<ref><pubmed>22593055</pubmed></ref>［34］<ref><pubmed>24179230</pubmed></ref>［35］。<br />
<br />
==参考文献==<br />
<references /></div>
Masahitoyamagata
https://bsd.neuroinf.jp/w/index.php?title=%E7%A5%9E%E7%B5%8C%E7%AA%81%E8%B5%B7%E8%87%AA%E5%B7%B1%E5%9B%9E%E9%81%BF&diff=44313
神経突起自己回避
2020-07-17T23:20:06Z
<p>Masahitoyamagata: </p>
<hr />
<div><div align="right"> <br />
<font size="+1">[https://researchmap.jp/K1225/ 桑子 賢一郎]</font><br><br />
''島根大学医学部 神経・筋肉生理学''<br><br />
DOI：<selfdoi /> 原稿受付日：2020年7月14日 原稿完成日：2020年月日<br><br />
担当編集委員：[https://researchmap.jp/yamagatm 山形 方人]（ハーバード大学・脳科学センター）<br><br />
</div><br />
<br />
英語名：neuronal self-avoidance<br />
<br />
{{box|text= 神経突起の自己回避は、ニューロンの発生過程で、分岐した自己の神経突起どうしが交錯して絡み合うことを防ぐための機構である。細胞表面分子群を介した局所の反発作用によって自己の突起の交錯が回避される。この機構により、樹状突起や軸索は重複を最小限に抑えるようにできるだけ広がって与えられた空間を効率的にカバーする。例えば、樹状突起のこのような3次元構造は、入力回路との正しいシナプス接続や入力情報の階層的な処理において重要であるとされており神経回路形成の基礎となるシステムである。無脊椎動物・脊椎動物ともにみられる。}}<br />
'''''査読：査読コメントです。<br />
執筆いただきありがとうございました。以下、コメントします。<br />
「神経突起の自己回避は、ニューロンの発生過程で、分岐した自己の神経突起どうしが交錯して絡み合うこ とを防ぐための機構である。」<br />
この記述ですが、わかっている人であれば、全く問題ないと思います。しかし、辞典という観点からいうと、少しわかりにくいかもと感じます。読者が最初に目にする文ですので、少しイメージが具体的につかめるようにすると、わかりやすくなると思います。<br />
「発生中の神経系では、多数のニューロンがそれぞれ複数の神経突起を伸長させ、分岐させていく。神経突起の自己回避は、１個のニューロンから伸長する神経突起どうしが交錯して絡み合わない現象である。（適宜、ご変更ください）」<br />
それと、文章全体を通して、あちこちで「機構」という単語が使われているのですが、「現象」という単語もあります。機構というと、現象を達成するための何らかの積極的な仕組み、仕掛けがあるという認識になると思うのです。もしかしたら、そのような仕組みは存在しなくて、デフォールトでそうなる現象という可能性もありますので、まず現象があって、その機構の存在が研究によって明らかになったということなのだと思います。それぞれの「機構」の使い方がそれでよいのか、ご確認していただければと思います。'''''<br />
<br />
[[ファイル:Kuwako Fig1.jpg|サムネイル|'''図1. 神経突起の自己回避機構'''<br>'''(A)''' 細胞表面分子を介した反発作用によって自己の突起の交錯が回避される。この機構により、神経突起は重複を抑えてより広範囲を効率的にカバーする。<br>'''(B)''' それぞれのニューロンは自己回避機構によって神経突起の重なりを最小限に抑える。一方、細胞集団としては、タイリングによって周辺細胞と重ならずに領域を充填するパターンと、オーバーラップするパターンがある。]]<br />
== 神経突起自己回避とは ==<br />
神経突起自己回避の概念は、ヒル（''Hirudo medicinalis''）の機械感覚ニューロンの軸索の詳細な観察をもとに提唱された<ref><pubmed>5711143</pubmed></ref>［1］。すなわち、同じ機械感覚ニューロン由来の分岐した軸索はほとんどオーバーラップせずに空間を埋めるのに対し、異なるニューロン由来の軸索は頻繁に重なり合う。この観察から、神経突起は互いに “自己”か“非自己”を認識して自己を避ける機構が存在する可能性が示唆され、この機構は“Self-avoidance”と名付けられた<ref>'''Kramer, A.P. (1982).'''<br>The development of neuronal arborizations in the leech.<br>Neuronal Development: Cellular Approaches in invertebrates, pp882-85</ref>［2］ <ref><pubmed>6317810</pubmed></ref>［3］('''図1''')。<br />
<br />
一方、領域内でそれぞれのニューロンの神経突起が互いに“非自己”を避けて伸展して隙間なく空間を埋めていく機構を“タイリング(Tiling)”と呼ぶ。ショウジョウバエ感覚ニューロンとマウス網膜スターバーストアマクリン細胞は、いずれも自己回避機構によりほとんど交錯しない樹状突起構造をつくるが、周囲の細胞との関係では、ショウジョウバエ感覚ニューロンはタイリングによって互いを避けながら空間を埋めていくのに対し、スターバーストアマクリン細胞は周囲とオーバーラップして網膜内の空間を埋める('''図1''')。<br />
'''''タイリングは「機構」なのか、「現象」なのか？''''' <br />
<br />
神経突起自己回避は、神経突起上の特定の細胞表面分子の結合を介して起こる。細胞表面分子の下流シグナルによって細胞骨格が制御されて、神経突起の伸展停止あるいは退縮が起き、結果として局所で自己の神経突起どうしの反発が起こる<ref><pubmed>29972794</pubmed></ref> ［4］。これまでに、無脊椎・脊椎動物の様々なニューロンで神経突起の自己回避を制御する細胞表面分子が多数同定されており、それらを欠失させると反発作用が消失して神経突起の著しい交錯がみられるようになる('''図2''')。したがって、神経突起は積極的に自己の接触を回避しなければ正しい空間配置を確立できないと考えられる。<br />
'''''ここで、交錯して絡み合うのがデフォールトであって、「神経突起の自己回避」機構が存在しなければならない理由など簡単に説明していただけると助かるかもしれません。例えば、神経突起は同じホモフィリックな接着分子を持つので、接着、束になってしまうというようなことです。'''''<br />
<br />
神経突起の適切な空間配置は、回路接続や情報処理機能に重要であることから、神経突起自己回避は回路形成の基礎となる非常に重要な機構であるといえる。<br />
'''''ここで、神経突起自己回避についての総説の文献２，３件引用されると、辞典としての便宜性が高まると思います。適宜、削除、追加してください。<br />
Grueber WB, Sagasti A. Self-avoidance and tiling: Mechanisms of dendrite and axon spacing. Cold Spring Harb Perspect Biol. 2010 Sep;2(9):a001750. doi: 10.1101/cshperspect.a001750. Epub 2010 Jun 23. PMID: 20573716; PMCID: PMC2926746.<br />
Lefebvre JL, Sanes JR, Kay JN. Development of dendritic form and function. Annu Rev Cell Dev Biol. 2015;31:741-77. doi: 10.1146/annurev-cellbio-100913-013020. Epub 2015 Sep 29. PMID: 26422333.'''''<br />
<br />
== モデル解析ニューロン ==<br />
'''''「モデル解析ニューロン」とは、おそらく「神経突起の自己回避」ということが先にあって、それを研究するモデルとして御説明されたようなニューロンが研究されたという意味だと思われますが、少しわかりにくいかもしれません。というより、私はむしろ「神経突起の自己回避」現象が明確に観察できる典型例として、実験システムとして研究されてきたような気がします。例えば、解析モデルとなるニューロン、神経突起自己回避が観察できるニューロンといった説明的なタイトルにした方がよいと思います。個人的にはモデルニューロン、モデルとして解析という表現がやや気になるのですが（研究している人にとってはモデルではない？）、これは好みの問題だと思います。'''''<br />
<br />
[[ファイル:Kurako Fig2.jpg|サムネイル|'''図2. 神経突起自己回避の解析モデルニューロン'''<br>ショウジョウバエ感覚ニューロン'''(A)'''、マウス網膜アマクリン細胞'''(B)'''、マウス小脳プルキンエ細胞'''(C)'''は高度に分岐した樹状突起をもつがそれらはなるべく交錯を回避した構造をとる。様々の細胞表面分子、あるいはその制御因子の欠失によって著しい自己交錯が起こる。]]<br />
初期の形態学的な研究では、ヒルの感覚ニューロンやネコの網膜ニューロンがモデルとして解析された。その後、遺伝学や分子生物学的解析法の発展に伴い、神経突起自己回避の研究も分子機構に迫る研究が展開され、現在に至っている。<br />
<br />
無脊椎動物では神経突起自己回避の研究のほとんどは、ショウジョウバエの''dendritic arborization'' (''da'') 感覚ニューロンと線虫のPVD侵害受容感覚ニューロンをモデルとして、遺伝学を駆使した変異体解析が行われてきた。<br />
<br />
一方、脊椎動物では、マウスの網膜ニューロン、特に網膜神経節細胞とアマクリン細胞の樹状突起を中心に多くの研究が行われてきた。最近は、高度に分岐した単層平面構造の樹状突起をもつ小脳プルキンエ細胞での研究も進められている。いずれのモデルニューロンも自己回避機構によって大きく広がった樹状突起が空間を効率的にカバーする構造をとる。これら以外のニューロンも基本的に自己の神経突起の接触を回避した構造をもつことから、神経突起の自己回避は保存された普遍的なシステムであると考えられる。<br />
<br />
== 制御する分子群 ==<br />
[[ファイル:Kurako Fig3.jpg|サムネイル|'''図3. DSCAM1とプロトカドヘリン'''<br>'''(A)''' ショウジョウバエDSCAM1は、選択的スプライシングによって19008種類の細胞外領域バリアントが存在する。エクソン4は免疫グロブリン2（Ig2）ドメインを、エクソン6とエクソン9はそれぞれIg3とIg7をコードする。そして、エクソン4、6、9はそれぞれ12、48、33のアイソフォームがある。多くのバリアントが産生されるが、同一のアイソフォームどうしが特異的に結合する。<br>'''(B)''' マウスプロトカドヘリン（Pcdh）は、Pcdh&alpha;とPcdh&beta;、Pcdh&gamma;が遺伝子クラスターを形成しており、細胞外領域の異なるプロトカドヘリン分子が全部で58種類存在する。プロトカドヘリンのバリアントは異なるプロモーター選択によって産生される。]]<br />
これまでにショウジョウバエや線虫、マウスなどのモデル生物において、神経突起の自己回避を直接制御する多くの細胞表面分子が同定されている。なかでも、ショウジョウバエのDSCAM1とマウスのプロトカドヘリンは、多様な細胞外ドメインからなる多くのアイソフォームをもつ巨大ファミリー分子で、これらが神経突起表面でのアイソフォームどうしのマッチングによって “自己”あるいは“非自己”を認識し、そして、同じアイソフォームの同種親和性結合を介して自己の突起の反発を引き起こす。<br />
'''''図３のDSCAM1の接着の図ですが、同じ細胞の表面上で接着するcisのような印象を受けるのですが、transで相互作用するのが神経突起自己回避のメカニズムだと思います。また、プロトカドヘリンについては、クラスター型プロトカドヘリンと正確に記載するべきだと思います。'''''<br />
=== ショウジョウバエ ===<br />
==== DSCAM1 ====<br />
同種親和性結合能をもつ進化的に保存された細胞接着因子で、細胞外領域には10個の免疫グロブリン領域と6個のフィブロネクチンリピートが存在する。選択的スプライシングによって、細胞外領域には19,008種類のバリアントが存在し、1つのDscam1遺伝子から合計で38,016種類のアイソフォームがつくられる<ref><pubmed>10892653</pubmed></ref>［5］('''図3''')。DSCAM1は同じアイソフォーム同士が細胞外領域で特異的に結合し、その結果、細胞内領域を介したシグナルにより反発作用を生じる。それぞれのニューロンはランダムにDscam1アイソフォームを発現しているが、同じ細胞由来の突起どうしでは同じアイソフォームが発現しており、それらの同種親和性結合によって反発作用が生じて神経突起の自己回避が起こる<ref><pubmed>15339666</pubmed></ref>［6］<ref><pubmed>17889655</pubmed></ref>［7］。<br />
<br />
ショウジョウバエ感覚ニューロンや中枢キノコ体ニューロンでDscam1を欠失させると、同じニューロン由来の神経突起の自己交錯が著しく増加する('''図2''')<ref><pubmed>15339649</pubmed></ref>［8］<ref><pubmed>17481395</pubmed></ref>［9］<ref><pubmed>17482551</pubmed></ref>［10］<ref><pubmed>17481394</pubmed></ref>［11］。ただし、神経突起の自己回避に必要なのはDSCAM1アイソフォームの多様性ではなくあくまで同一アイソフォームによる結合であり、アイソフォームの多様性は自己と非自己の識別に関わるとされている<ref><pubmed>19794492</pubmed></ref>［12］。<br />
<br />
==== インテグリン-ラミニン ====<br />
ショウジョウバエ感覚ニューロンで発現する細胞接着因子インテグリンと上皮から分泌されるラミニンが結合することで樹状突起の自己回避が起こる<ref name=ref22243747 ><pubmed>22243747</pubmed></ref>［13］<ref name=ref22243748 ><pubmed>22243748</pubmed></ref>［14］。<br />
'''''細胞接着分子とした方がよいと思います。Cell adhesion moleculeは英語で普通に使いますが、Cell adhesion factorとはあまり言わないです。'''''<br />
<br />
==== Sema2b-PlexinB ====<br />
上皮から分泌されるSema2bとショウジョウバエ感覚ニューロンで発現するPlexinBが結合し、このSema2B-PlexinBシグナルがリン酸化酵素Tricornered <ref><pubmed>15479641</pubmed></ref>［15］を活性化することで樹状突起の自己回避が起こる<ref name=ref26853303><pubmed>26853303</pubmed></ref>［16］。さらにPlexinBはインテグリン&beta;サブユニット<ref name=ref22243747 ></ref>［13］<ref name=ref22243748 ></ref>［14］や細胞内のtarget of rapamycin complex2<ref><pubmed> 19875983</pubmed></ref>［17］とも相互作用することで樹状突起自己回避に関わると考えられる<ref name=ref26853303></ref>［16］。<br />
<br />
==== その他 ====<br />
カドへリンファミリーに属する接着因子Flamingoはその細胞内領域にLIMドメインタンパク質であるEspinasが結合することで反発作用を生み、感覚ニューロンの樹状突起の自己回避を促す<ref><pubmed> 21937715</pubmed></ref>［18］。細胞膜貫通タンパク質であるTurtleの変異体ショウジョウバエは感覚ニューロンの樹状突起自己回避に異常が起こる<ref><pubmed>19783736</pubmed></ref>［19］。Turtleによる樹状突起自己回避は、その細胞内領域を必要としないことからTurtleはリガンドあるいは共受容体として機能することで反発作用を生むと考えられる。がん抑制因子Hippoの変異体ショウジョウバエも感覚ニューロンの樹状突起自己回避に異常が起こることから、自己の樹状突起どうしの反発を引き起こす細胞内シグナルとしてはたらいていると考えられる<ref><pubmed>16906135</pubmed></ref>［20］。ただし、Hippoと樹状突起自己回避を制御する細胞表面分子との関係はわかっていない。<br />
'''''接着因子は、接着分子とした方がよいと思います。<br />
がん抑制因子Hippoの変異体ショウジョウバエー＞ショウジョウバエ変異体？変異ショウジョウバエ？<br />
がん抑制因子より、リン酸化酵素Hippoとした方が適切な情報を伝えることができると思います。'''''<br />
<br />
=== 線虫 ===<br />
==== SAX-7/MNR-1/DMA-1 ====<br />
皮下組織由来のリガンドSAX-7とMNR-1の複合体がPVD侵害受容ニューロンで発現する受容体DMA-1に結合することで樹状突起の自己回避が起こる<ref><pubmed>24120131</pubmed></ref> ［21］<ref><pubmed>24120132</pubmed></ref>［22］。<br />
==== UNC-6/UNC-40/UNC-5 ====<br />
UNC-6(ネトリン)-UNC-40(DCC)シグナルは細胞表面のUNC-5を介してその下流のUNC-34、WSP-1, UNC-73, MIG-10、Arp2/3複合体によるアクチン骨格制御を促すことでPVD侵害受容ニューロンの樹状突起自己回避を促進する<ref><pubmed>22426253</pubmed></ref>［23］<ref><pubmed>31220078</pubmed></ref>［24］。<br />
==== その他 ====<br />
カドへリンファミリーFlamingo <ref><pubmed>32631831</pubmed></ref>［25］やWnt分泌因子MIG-14/Wntless <ref><pubmed>29673481</pubmed></ref>［26］、前駆体タンパク質変換酵素KPC-1/Furin <ref><pubmed>25232734</pubmed></ref>［27］もPVD侵害受容ニューロンの樹状突起に関わることが報告されている。<br />
<br />
=== マウス ===<br />
==== DSCAM ====<br />
ショウジョウバエDSCAM1とは異なり、アイソフォームは２種類しか存在しない。マウス網膜の研究から、脊椎動物のDSCAMは網膜神経節細胞およびアマクリン細胞の、ファミリー分子DSCAML1は桿体細胞の樹状突起の自己回避に関わる。DSCAMおよびDSCAML1は、直接反発作用を生むのではなく、カドへリンなどの他の分子を介した細胞接着を阻害することで神経突起の過度の接触を防いでいると考えられる<ref><pubmed>19945391</pubmed></ref>［28］<ref><pubmed>30297418</pubmed></ref>［29］。<br />
'''''DSCAMとDSCAML1の２つは、アイソフォームではなく、異なる遺伝子です。したがって、「遺伝子はDSCAMとDSCAML1は2つで、ショウジョウバエDSCAM1のように多様な選択的スプライシングはそれぞれについて観察されていないので、分子種としては2種類となり多様性がない。（適宜変更してください）」となります。'''''<br />
==== プロトカドヘリン ==== <br />
ショウジョウバエDSCAM1と同じく、アイソフォーム特異的に同種親和性結合能をもつ細胞接着因子である<ref><pubmed>20679223</pubmed></ref>［30］。マウスでは、Pcdh&alpha;、Pcdh&beta;、Pcdh&gamma;の3つのプロトカドへリンクラスターがあり、プロモーター選択に基づいてそれぞれの遺伝子座から14、22、22種類のアイソフォームが産生されるため、合計で58種類のバリアントが存在する('''図3''')。Pcdh&gamma;クラスターをすべて欠失させたノックアウトマウスでは網膜スターバーストアマクリン細胞や小脳プルキンエ細胞で樹状突起の自己回避に著しい異常が生じる<ref><pubmed>22842903</pubmed></ref> ［31］('''図2''')。プロトカドへリンによる樹状突起自己回避は、ショウジョウバエDSCAM1と同じく、自己の細胞で発現する同一アイソフォーム同士の結合で生じる反発作用によって起こる。<br />
'''''細胞接着分子とした方がよいと思います。クラスター型プロトカドヘリン（非クラスター型プロトカドヘリンに対して）と正確に記入した方がよいです。'''''<br />
<br />
==== Slit-Robo2 ====<br />
小脳プルキンエ細胞の樹状突起自己回避において、プロトカドへリンとは独立してはたらく反発性のリガンドー受容体である。Slit2およびRobo2はどちらもプルキンエ細胞で発現し、樹状突起の細胞膜上に局在するSlit2とその受容体であるRobo2が結合すると反発シグナルが生じるとされる<ref><pubmed>22842903</pubmed></ref> ［32］。リン酸化酵素LKB1-SIK経路を介してRobo2が樹状突起に選択的に運ばれることがプルキンエ細胞の樹状突起自己回避に必須である<ref><pubmed>30208308</pubmed></ref>［33］。<br />
<br />
==== Semaphorin6A-PlexinA2/A4 ==== <br />
Semaphorin6Aとその受容体であるPlexinA2/A4の結合によって、網膜スターバーストアマクリン細胞の樹状突起の自己回避が制御されている<ref><pubmed>22593055</pubmed></ref>［34］<ref><pubmed>24179230</pubmed></ref>［35］。<br />
<br />
==参考文献==<br />
<references /></div>
Masahitoyamagata