脳科学辞典 - 利用者の投稿記録 [ja]

機能欠失実験

2016-04-28T03:12:20Z

Takahirohirabayashi:

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<font size="+1">[http://researchmap.jp/read0204069 平林敬浩]、[http://researchmap.jp/read0076409 八木健]</font><br>
''大阪大学大学院生命機能研究科''<br>
DOI：<selfdoi />　原稿受付日：2013年2月12日　原稿完成日：2013年月日<br>
担当編集委員：[http://researchmap.jp/read0080380 上口裕之]（独立行政法人理化学研究所脳科学総合研究センター）<br>
</div>

英語名：loss of function

{{box|text=
　ある[[wikipedia:ja:遺伝子|遺伝子]]の機能を調べる際にその遺伝子の発現量や分子機能を減弱させることで機能を類推する実験手法。逆に遺伝子の機能や発現量を増強させる実験は[[機能獲得実験]]と呼ばれる。
}}

== 機能欠失実験とは ==

　ある遺伝子の生理機能を解析する際、動物個体や細胞でその遺伝子の機能を減弱させて得られた変化を基に機能を類推する実験手法を機能欠失実験という。機能欠失実験には発現量の減少または分子機能を失わせる方法がある。

== 発現量の減少 ==

=== 遺伝子破壊（遺伝子ノックアウト） ===

　目的とする遺伝子そのものを破壊することで目的遺伝子の発現あるいは機能を完全に抑制させる。

==== ジーンターゲティング====

　目的の遺伝子に任意の変異を導入する手法をジーンターゲティングという。本法による遺伝子破壊を動物個体レベルで行うためには[[ES細胞]]が必要であったため[[マウス]]でのみ可能であったが[[ラット]]でもES細胞が樹立されジーンターゲティングによる遺伝子ノックアウトが可能になった<ref><pubmed> 19109898 </pubmed></ref>。また、ES細胞の代わりにiPS細胞を用いたジーンターゲティングも行われるようになった。

==== 人工ヌクレアーゼ====
[[Image:Takahirohirabayashi fig 1.jpg|thumb|right|300px|'''図1．人工ヌクレアーゼの構造''']]
[[Image:Takahirohirabayashi fig 2.jpg|thumb|right|300px|'''図2．DNA切断に伴う塩基対の欠失・挿入''']]

　[[wikipedia:ja:人工ヌクレアーゼ|人工ヌクレアーゼ]]は、任意の塩基配列に結合するようにデザインされたDNA結合ドメインとDNA切断酵素の切断ドメインを連結させたタンパク質であり、任意の塩基配列を切断すること可能な酵素である（図1）。この人工ヌクレアーゼにはDNA配列を認識し、切断するという原理は共通だが、ジンクフィンガーのDNA結合ドメインを利用してDNA配列を認識する[[wikipedia:Zinc Finger nuclease|Zinc Finger nuclease]] (ZFN), [[wikipedia:TALEs|TALEs]]のDNA結合ドメインを利用しDNA配列を認識する[[wikipedia:TALEN|TALEN]] の2種類が主に使用されている。

　これら人工ヌクレアーゼを導入した細胞内では特定の[[wikipedia:ja:DNA|DNA]]がdouble-strand breakするが、これを修復するためにNHEJ ([[wikipedia:Non-Homologous End Joining|Non-Homologous End Joining]]機構が働く。この際、高頻度で[[wikipedia:ja:塩基対|塩基対]]の欠失、挿入などの[[wikipedia:ja:修復エラー|修復エラー]]が生じ、結果的に[[wikipedia:ja:フレームシフト|フレームシフト]]を起こすことで遺伝子がノックアウトされる（図2）。この手法はES細胞を必要としないため、これまでES細胞が樹立されておらずジーンターゲティングによる遺伝子ノックアウトが不可能であった動物種でも使用できる。

==== CRISPR/Cas9====

[[Image:機能欠失実験図３.jpg|thumb|right|300px|'''図３．CRISPR/Cas9によるDNA切断機構　''']]
　CRISPR/Cas(clustered regularly interspaced short palindromic repeats / CRISPR-associated protein)システムは、バクテリアが有するウイルスなど対する免疫機構である。ウイルスやプラスミドなどの外来DNA断片が侵入してくると、バクテリアは自身のゲノム中のCRISPR座位と呼ばれる遺伝子領域に取り込み、これを鋳型にした短差CRISPR RNA (crRNA)を合成する。このcrRNAはトランス活性化型crRNA (tracrRNA)およびCas9ヌクレアーゼと複合体を形成して、標的配列のDNAを切断する。この機構により再び侵入してきた外来DNAを切断することが出来る（図3A）<ref><pubmed> 20056882 </pubmed></ref><ref><pubmed> 21455174 </pubmed></ref>。

　近年、このCRISPR/Cas9システムを応用してゲノムDNA上の任意の塩基配列を切断できる技術が開発された<ref><pubmed> 23287718 </pubmed></ref>。この方法では切断したい任意の塩基配列を持つcrRNAとtracrRNAを1分子のガイドRNA (gRNA)として、Cas9のmRNAまたはタンパク質と共に細胞に導入することで任意の塩基配列を切断すること可能である（図3B）。切断されたDNAは上述の人工ヌクレアーゼと同様に高頻度で塩基対の欠失、挿入などの修復エラーが生じるため、結果的に遺伝子がノックアウトされる遺伝子がノックアウトされる（図2）。本法はZFNやTALENと同じくES細胞が樹立していない動物種でも使用でき、さらにこれらに比して標的配列デザインの容易性などから頻用されている。

=== 遺伝子発現量減少（遺伝子ノックダウン） ===

　特定の遺伝子の発現量を減少させるが遺伝子ノックアウトとは異なり、完全に発現が失われるわけではないので、遺伝子ノックアウトでは動物個体が目的の時期より以前に死に至るため解析が困難な場合などに有効な手法である。

==== ジーンターゲティングによる遺伝子発現量減少 ====

　ジーンターゲティングによる遺伝子ノックアウトが遺伝子中の[[wikipedia:ja:翻訳|翻訳]]領域を破壊するのに対し、遺伝子ノックダウンでは遺伝子中の[[wikipedia:ja:polyA付加配列|polyA付加配列]]など[[wikipedia:ja:発現制御|発現制御]]領域を欠損、あるいは変異を導入することでおこなわれる。本法も動物個体レベルで行うためにはES細胞が必要であるため、適用できる動物種に限りがある。

==== アンチセンスオリゴヌクレオチド====

　標的とする遺伝子のmRNA配列に対し相補的な塩基配列を持つ短い[[wikipedia:ja:核酸|核酸]]（[[wikipedia:ja:アンチセンスオリゴヌクレオチド|アンチセンスオリゴヌクレオチド]]）を細胞外から導入すると、目的のmRNAと結合しその翻訳を阻害しその発現を抑制する。このアンチセンスオリゴヌクレオチドは細胞内で不安定であるためリン酸基の酸素の一つが[[wikipedia:ja:チオール|チオール]](-SH)化(-SH)した[[wikipedia:ja:ホスホロチオエート結合オリゴ|ホスホロチオエート結合オリゴ]] (s-oligo)や、RNAオリゴヌクレオチドのリボースを[[wikipedia:ja:モルフォリノ環|モルフォリノ環]]、リン酸基を[[wikipedia:ja:ホスホロジアミダイト|ホスホロジアミダイト]]へ、[[wikipedia:ja:ウラシル|ウラシル]]を[[wikipedia:ja:チミン|チミン]]にそれぞれ置換し、安定性の向上、細胞毒性の軽減させたモルフォリノアンチセンスオリゴ<ref><pubmed> 17493584 </pubmed></ref>などが開発されてきた。しかし、現在では遺伝子発現抑制効果が高い2本鎖RNAによる[[RNA干渉]]を利用した方法に移行している。

==== RNA干渉====

　RNA干渉とは21-23塩基からなる対からなる[[short interfering RNA]]（[[siRNA]]）と呼ばれる2本鎖RNAが相補的な配列を持つ生体内のmRNAと結合し、そのmRNAを分解する現象である<ref><pubmed> 11373684 </pubmed></ref>。この現象はウイルスなどに対する生体防御機構と考えられているが、近年ではこの現象を利用して特定の遺伝子発現の抑制を誘導する実験系が種々の動植物で確立され、さらにこれらを応用した疾患に対する治療法が開発されている。siRNAそのものを細胞内へ導入し、遺伝子発現抑制を誘導するためには大量のsiRNAが必要であることやその効果が一過性であることから、近年ではこのsiRNAを発現する[[wikipedia:ja:ベクター|ベクター]]として導入する方法が多く用いられている。

== 機能の減弱 ==

[[Image:機能欠失実験図４.jpg|thumb|right|300px|'''図４．機能ドメイン欠失変異体発現による機能の減弱　''']]
　機能を減弱させた変異体を発現することで内在性の正常遺伝子に対して優位に働き正常な機能を減弱させることができる。この変異を[[wikipedia:ja:ドミナントネガティブ体|ドミナントネガティブ体]]とよぶ。機能を減弱させる変異体には酵素活性部位などの機能ドメインを欠失させたものが使用される。
例えば受容体の場合、受容体の細胞内領域にシグナルを伝達するドメインを欠いた変異体を過剰発現させると、リガンドがその変異体にも結合するため結果としてその受容体が介するシグナルは減弱する（図４）。

[[Image:機能欠失実験図５.jpg|thumb|right|300px|'''図５．アミノ酸置換変異基質の発現によるリン酸化酵素の機能減弱　''']]
　また、目的のタンパク質が持つアミノ酸が[[リン酸化]]されることでその機能が増強する場合、そのアミノ酸をリン酸化を受けない他のアミノ酸に置換した変異体を発現することで目的タンパク質のリン酸化による機能の増強を抑制することができる。一般的には[[wikipedia:ja:セリン|セリン]]、[[wikipedia:ja:スレオニン|スレオニン]]は[[wikipedia:ja:アラニン|アラニン]]、[[wikipedia:ja:チロシン|チロシン]]は[[wikipedia:ja:フェニルアラニン|フェニルアラニン]]、のように類似構造のアミノ酸に置換する。

==関連項目==
*[[機能獲得実験]]
*[[標的遺伝子組換え]]

== 参考文献 ==

<references />

機能欠失実験

2016-04-28T03:10:41Z

Takahirohirabayashi:

2016-04-18T05:04:37Z

Takahirohirabayashi:

2016-04-14T07:11:10Z

Takahirohirabayashi:

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<font size="+1">[http://researchmap.jp/read0204069 平林敬浩]、[http://researchmap.jp/read0076409 八木健]</font><br>
''大阪大学大学院生命機能研究科''<br>
DOI：<selfdoi />　原稿受付日：2013年2月12日　原稿完成日：2013年月日<br>
担当編集委員：[http://researchmap.jp/read0080380 上口裕之]（独立行政法人理化学研究所脳科学総合研究センター）<br>
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英語名：gain of function

{{box|text=
　ある[[wikipedia:ja:遺伝子|遺伝子]]の機能を調べる際にその遺伝子の機能や発現量を増強させることで機能を類推する実験手法を機能獲得実験という。
}}

== 機能獲得実験とは ==

　ある遺伝子の機能を調べる際にその遺伝子の機能・発現量を増強させて得られた表現型から機能解析する実験手法。逆に遺伝子の機能や発現量を減弱させる実験は[[機能欠失実験]]と呼ばれる。また、機能欠失実験によって得られた表現型を機能獲得実験により正常な表現型に回復させる実験を特にrescue実験と呼ぶ

== 遺伝子導入による発現量の増加 ==

　動物個体あるいは細胞に外来遺伝子を導入することで任意の遺伝子

　発現量を増加させることができる。外来遺伝子を導入した動物個体は[[トランスジェニック動物]]と呼ばれ現在ではあらゆる動物種で作製が可能となっている。

=== 導入する遺伝子 ===
[[Image:機能獲得実験.jpg|thumb|300px|'''図1．発現量を増加させる外来遺伝子の構造''']]

　この外来遺伝子は遺伝子発現制御するプロモーター配列の下流に目的の遺伝子、さらに[[wikipedia:ja:polyA付加配列|polyA付加配列]]という構造をもつものが一般的である（図1）。この外来遺伝子を構築する際、どのプロモーター配列を選択するかにより目的遺伝子の発現部位、発現時期、発現量が決まる。

=== 導入方法 ===

　現在では遺伝子の導入方法として主に以下の方法が用いられている。

*リン酸カルシウム法<br>　導入する遺伝子 (DNA)と[[wikipedia:ja:リン酸カルシウム|リン酸カルシウム]]を混和することで形成された不溶性複合体を細胞表面に吸着させ、細胞の[[wikipedia:ja:食作用|食作用]]などを利用して細胞内に遺伝子を導入する方法。操作が簡便で特殊な装置を必要としない。
*リポフェクション法<br>　正に荷電している[[wikipedia:ja:脂質|脂質]]からなる[[wikipedia:ja:脂質二重膜小胞|脂質二重膜小胞]]（[[wikipedia:ja:リポソーム|リポソーム]]）と負に荷電している遺伝子は電気的に複合体を形成する。これらを負に荷電している[[細胞膜]]と融合、あるいは細胞の食作用などにより細胞に取り込まれる。リン酸カルシウム法と同様に特殊な装置を必要とぜず、また各社から試薬が市販されているため[[細胞株|培養細胞]]では広く用いられている。
*エレクトロポレーション法<br>　高電圧パルスを細胞に与えることで細胞膜構造に小孔をあけ、遺伝子を導入する方法。遺伝子導入効率は比較的高い反面、細胞生存率は低い。
*パーティクルガン法<br>　[[wikipedia:ja:金|金]]などの高比重かつ化学的に安定な金属粒子を導入したい遺伝子でコーティングしたものを高圧ガスで射出し細胞内に物理的に導入する方法。ジーンガンとも呼ばれる。
*ウイルスベクター法<br>　目的の遺伝子を組み込んだウイルスを細胞に感染させることで遺伝子を導入する方法。現在では主に、[[wikipedia:ja:アデノウイルスベクター|アデノウイルスベクター]]、[[wikipedia:ja:アデノ随伴ウイルスベクター|アデノ随伴ウイルスベクター]]の他、感染した細胞内で逆転写されて細胞ゲノムにに組み込まれる[[wikipedia:ja:レトロウイルスベクター|レトロウイルスベクター]]、[[wikipedia:ja:レンチウイルスベクター|レンチウイルスベクター]]などが使用されている。
*マイクロインジェクション法<br>　微細なガラス管をを介し細胞に直接遺伝子を導入する方法。個々の細胞に対して操作が必要であるため対象とする細胞数に制限が生じるが、導入効率が高いためトランスジェニック動物作製時においては本法で受精卵に遺伝子を導入するのが一般的である。

== 機能の増強 ==

=== アミノ酸置換による疑似リン酸化 ===

　目的のタンパク質が持つアミノ酸がリン酸化されることでその機能が増強する場合、そのアミノ酸を[[グルタミン酸]], または[[wikipedia:ja:アスパラギン酸|アスパラギン酸]]に置換した変異体を発現することで恒常的なリン酸化状態を擬似的に再現できる場合がある。これはリン酸化アミノ酸が水溶液中では負電荷をもつが、グルタミン酸、アスパラギン酸などの酸性アミノ酸も負電荷をもつためである。例えば、[[リン酸化酵素]][[MAP kinase kinase]] (MKK)はSer218およびSer222は上流の[[Raf1]]/[[MAP KKK]]によりリン酸化されることで活性化するが、これらのセリン残基をグルタミン酸に置換したMAPKK変異体は恒常的に活性を持つ<ref><pubmed> 7936666 </pubmed></ref>。

=== 局在の変化 ===

　目的のタンパク質が局在の変化がその機能が増強する場合、そのタンパク質の局在を強制的に変化させる変異を導入することで機能を増強することが出来る。リン酸化酵素[[AKT]]は細胞膜へ移行することで活性化すると考えられているが[[ミリストイル化]]配列を付加したAKTは恒常的に活性化する<ref><pubmed> 10467260 </pubmed></ref>

=== 阻害ドメインの欠失 ===

[[Image:機能獲得実験図２.jpg|thumb|450px|'''図２．(A) CaMKIIの構造　AID:自己抑制ドメイン　CaM-BD:'Ca2+/カルモジュリン結合ドメイン　(B) CaMKIIの活性化　(C) 活性化型CaMKII ]]

　ある種の酵素はそのタンパク質内に自身の活性を抑制する自己阻害ドメイン (autoinhibitory domain)を持ち、酵素活性の制御をしている。
カルシウムカルモジュリン依存性タンパク質キナーゼII (CaMKII)はキナーゼドメイン、自己阻害ドメイン (AID)とCa2+/カルモジュリン結合ドメイン (CaM-BD)で構成される調節ドメインからなり（図2A）、カルシウムカルモジュリン (Ca2+/CaM)複合体の非存在下では、自己抑制ドメイン（autoinhibitory domain）により活性が抑制されている。Ca2+/カルモジュリン結合ドメインにCa2+/カルモジュリンが結合するとタンパク質立体構造が変化し、自己抑制が解除されて活性化する（図2B）<ref><pubmed> 21884935 </pubmed></ref>。

<ref><pubmed> 1651329 </pubmed></ref>

==関連項目==
*[[機能欠失実験]]
*[[遺伝子導入]]
*[[ウイルスベクター]]
*[[トランスジェニック動物]]

== 参考文献 ==

<references />