ゲノム編集のソースを表示

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<font size="+1">[https://researchmap.jp/koichitanaka 田中光一]</font><br>
''東京医科歯科大学難治疾患研究所''<br>
DOI：<selfdoi />　原稿受付日：2018年5月25日　原稿完成日：<br>
担当編集委員<br>
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{{box|text=　遺伝子は、生物の機能を規定する大きな要因の一つである。次世代シークエンサーの開発により、様々な生物種における遺伝子配列の情報や疾患に関与する遺伝子変異が明らかにされている。しかし、塩基配列を比較するだけでは、遺伝子の機能や疾患の病態を明らかにすることは難しい。ゲノム配列を自由に改変し、その影響を解析できて、初めて生命現象や疾患における遺伝子の役割を理解できる。ゲノム編集は、全ての生物・細胞の、全てのゲノム配列を自在に改変することである。この技術は、神経科学のみならず、多くの生命科学への応用が期待されている[1]。}}

== ゲノム編集とは ==
=== 原理 ===
　ゲノム編集は、狙ったゲノム部位にDNAの二本鎖切断を起こし、その後に誘導されるDNAの修復機構を利用し、標的ゲノムの破壊・塩基置換、標的ゲノム部位への外来遺伝子の挿入（ノックイン）などを可能にする技術である（図1）。細胞にはDNA二本鎖切断に対する2つの主要な修復機構が存在する。一つは、非相同末端結合(non-homologous end joining, NHEJ)であり、切断された末端同士を直接連結する。NHEJによる修復は、再連結の際、ヌクレオチドの欠失（数塩基から数百塩基）・挿入（数塩基から数十塩基）を高頻度で起こすため、修復の正確性は低い。従って、DNA二本鎖切断をタンパク質のコード領域に起こし、NHEJを利用しフレームシフトを起こすことにより遺伝子機能を破壊することができる。もう一つの修復機構である相同組換えは、外部から導入した鋳型DNAを利用して正確な修復を行う。鋳型DNAに塩基置換や他の遺伝子を挿入することにより、標的ゲノムの塩基置換や外来遺伝子のノックインをすることができる。さらに、ゲノム編集技術を用いると、同一染色体上の2箇所を切断することにより、大きな欠失や逆位、異なる染色体を切断することにより、染色体転座を起こすことができ、染色体の編集も可能である。NHEJによる修復は、細胞周期を通して作動するが、相同組換えによる修復はS期からG2期にしか起こらず頻度は低い。

=== ツール ===
　ゲノム編集にとって最も重要なステップは、ゲノム上の狙った塩基配列にDNA二本鎖切断を導入することである。そのために、ZFN（zinc-finger nuclease）、TALEN（transcription activator-like effector nuclease）、CRISPR/Cas9（clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR)/CRISPR-associated proteins(Cas)、以下CRISPR/Casと略）などの部位特異的ヌクレアーゼを用いる（図2）。1996年に報告されたZFNと2010年に報告されたTALENは、DNA二本鎖切断活性を持つFokIヌクレアーゼにDNA結合タンパク質のDNA結合ドメインを融合した一対の人工ヌクレアーゼを用い、狙った標的部位にDNA二本鎖切断を導入する。第一世代のZFNは、DNA結合ドメインとしてzinc fingerを持つ人工ヌクレアーゼで、1つのzinc fingerは3塩基を認識するので、3〜6個のzinc fingerを持つZFNは9〜18bp(base pair)に特異的に結合し、一対で18〜36bpの特異性でDNA二本鎖切断を導入する。第二世代のTALENは、DNA結合ドメインとして植物病原細菌のXanthomonas属が有するTALEを持つ人工ヌクレアーゼである。TALEのDNA結合ドメインは、1塩基を認識する34個のアミノ酸が一単位となり、それを15〜20単位持つTALENをセンス鎖、アンチセンス鎖それぞれに作製し、狙った標的部位にDNA二本鎖切断を導入する。第三世代のCRISPR/Casは、単独でDNA二本鎖切断活性を持つCasヌクレアーゼと標的配列特異的一本鎖ガイドRNAとの複合体を用い、狙った塩基配列にDNA二本鎖切断を導入する。この中で、2012年に発表されたCRISPR/Cas9は、その利便性、高効率、汎用性から、わずか1年の間に世界中で使われるゲノム編集の標準技術となった[2]。

== CRISPR/Casシステム ==
　CRISPR/Casシステムは、真正細菌や古細菌の獲得免疫系として発見された。この獲得免疫システムの標的は、細菌に感染するファージのDNAやRNAであり、異物として認識されたファージ由来のDNAやRNAは分解され除去される。CRISPR/Casシステムによる異物除去の過程は3つのステップ（adaptation, expression, interference）により行われる。侵入した外来DNAは、細菌内で断片化され、その一部が細菌のゲノム中のCRISPR領域に挿入される(adaptation)。次に外来DNAが侵入した際に、CRISPR領域が転写されてpre-CRISPR RNAが生じ、プロセシングを受けCRISPR RNA (crRNA：外来DNA断片と相補的配列を持つ)が生成される(expression)。プロセシングを受けたcrRNAはCasタンパク質と複合体を形成し、外来DNAやRNAと相補的に結合し、それらを切断する(interference)。CRISPR/Casシステムは、システムを構成しているCasタンパク質群の違いにより2つのクラスに分類される。クラス1のCRISPR/Casシステムには複数のCasが、クラス2のCRISPR/Casシステムには単一のCasが関与する。さらに作用機序の違いにより、クラス1はⅠ型、Ⅲ型、Ⅳ型に分類され、クラス2はⅡ型、Ⅴ型、Ⅵ型に分類される。Casタンパク質—crRNA複合体は、DNAだけではなくRNAも標的にし、DNAおよびRNAの編集が可能である。

=== DNAの編集 ===
==== CRISPR/Cas9システム ====
　CRISPR/Cas9システムは、クラス2のⅡ型に分類されるCRISPR/Casシステムであり、CRISPR RNA (crRNA：外来DNA断片と相補的配列を持つ)、trans-activating crRNA (tracrRNA：crRNAの外来DNAと相補的配列以外の部分に結合し、Cas9とcrRNAの複合体形成に必要である)、Cas9タンパク質の3種類の要素から成っている（図2c）。Streptococcus pyogenes株由来のCas9タンパク質は、標的ゲノム配列の下流にある3つの塩基；N(G, A, T, or C)GGをPMA配列(Proto-spacer Adjacent Motif)として認識し、その3塩期上流を切断する。現在普及しているシステムは、標的DNAに対して相補的配列を持つcrRNAの3’末端にtracrRNAを連結させたsingle guide RNA (sgRNA)とCas9を発現させることにより、ゲノムDNA上の狙った部位にDNA二本鎖切断を導入する。約100塩基のsgRNAのうち、DNA二本鎖切断の標的部位を規定するのは標的部位と相補的配列を持つ20塩基のみである。従って、CRISPR/Cas9システムをゲノム編集ツールとして利用する場合、標的ごとに変える必要があるのはわずか20塩基のみであり、それ以外の塩基配列およびCas9はすべて共通である。CRISPR/Cas9システムは、ガイドRNAの作製の簡便さ、ガイドRNAを増やすことにより複数遺伝子の同時編集が可能なことから、誰もが使うことのできるゲノム編集ツールとして急速に普及した。2012年の最初の発表以来、大腸菌、ヒト細胞からゼブラフィッシュに至る多くの細胞・生物種への応用が報告されている[3]。いまやヒトやサルを含むあらゆる動物個体、植物、微生物への利用が急速に広がっている。

　ゲノム編集ツールとしてのCRISPR/Cas9システムの大きな問題点は、「オフターゲット」と「PAM配列の制約」である。オフターゲットとは、標的でないゲノム部位のDNA配列を変えてしまうことである。オフターゲットの起こる頻度は、細胞種・標的遺伝子座・ガイドRNAなどにより大きく変化する。オフターゲットを回避する方法として、ダブルニッキング法が考案されている。天然型のCas9は2つのヌクレアーゼドメインを持っているが、その一方をアミノ酸置換により不活性化した一本鎖切断型Cas9（Cas9 nickase）を用いる方法が考案されている[4][5]。標的部位に近接したセンス鎖、アンチセンス鎖に1対のCRISPR/Cas9 nickaseが結合した際にのみDNA二本鎖切断が誘導されるので、オフターゲットの起こる頻度は少なくなる。最近、Cas9 nickaseを用いた標的部位でのゲノム編集効率は、天然型のCas9編集効率と同等かそれ以上であることが報告されている[6]。また、CRISPR/Cas9を用いて作製された遺伝子改変マウスにおけるオフターゲットの頻度は、全ゲノムレベルで解析した例が少なく確定的ではないが、当初報告されたよりは少ないと考えられている[7][8]。現在ゲノム編集で最もよく使われているSpCas9は化膿レンサ球菌由来であり、DNA二本鎖切断の部位を決めるには標的DNA配列の下流に隣接するNGGというPAM配列が必要である。このPAM配列の制約により、ゲノムの全ての場所を編集できないという制限があった。David Liuのグループは、PACE (phage-assisted continuous evolution)を利用して、NG、GAAおよびGATをPAMとするSpCas9変異体 (xCas9)の作成に成功した[9]。xCas9は哺乳類細胞において、最も広範なPAM配列を認識する制約の少ないCasである。さらに機序は不明であるが、xCas9はオフターゲットの頻度も抑制し、Cas9の主要な欠点であるオフターゲットとPAM配列の制約の２つを回避できる理想的なゲノム編集ツールである。

==== CRISPR/Cpf1システム ====
　Cpf1 (Cas12a)は、クラス2Ⅴ型のCRISPR/Casシステムに関わるDNAエンドヌクレアーゼであり、新たなゲノム編集ツールとして注目されている[10]。Cpf1はCas9とは異なる以下のような特徴を持っている。1)Cpf1はgRNAとしてcrRNAのみを必要とし、tracrRNAは必要ない。2)Cpf1はCas9と異なり、PAM配列としてTTTV (VはA, C, G)、TTCV, TCTV, CTTVを認識する。3)Cas9はDNA二本鎖を切断し平滑末端を形成するが、Cpf１は突出末端を形成する。CRISPR/Cpf1システムは、ヒト細胞株やマウス受精卵のゲノム編集に応用され、CRISPR/Cas9システムよりオフターゲットの頻度が少ないことが報告されている[11][12]。

==== CRISPR/dCAS9-BEシステム ====
　従来のゲノム編集は、標的のゲノム部位にDNAの二本鎖切断を起こし、その後に誘導されるDNAの修復機構を利用し、標的DNAを編集する。CRISPR/dCAS9-BEシステムは、DNAを切断することなく標的DNAの塩基を編集する方法である。ヌクレアーゼ活性を失活させたCas9(dCas9)に、脱アミノ化酵素であるシチジンデアミナーゼを融合させた塩基エディター(BE)を作成し、ガイドRNAにより狙ったゲノム部位に塩基エディターを働かせ、標的部位のシトシン(C)をチミン(T)（あるいはグアニン(G)をアデニン(A)）に置換する[13][14]。さらにDavid Liuのグループは、PACEを利用してDNAのAをG（あるいはTをC）に置換できる転移RNAのアデノシンデアミネース変異体（アデニン塩基エディター(ABE)）の作成に成功した[15]。dCas9と融合したBEあるいはABEを用いることにより、DNAの二本鎖切断を起こさずにDNAの4塩基全てを個別に置き換えられる。既知の遺伝性疾患の原因となる一塩基変異の約50%は、G-C塩基対からA-T塩基対への転移なので、CRISPR/dCas-ABEシステムは遺伝性疾患を根本的に治す可能性を持っている。

 === RNAの編集 ===
　CRISPR/Cas9システムやCRISPR/Cpf1システムの標的はDNAである。DNAと同様にRNAは生命現象において重要な役割を担っており、RNAを標的にした編集技術は、生命科学に大きな貢献をする。

==== CRISPR/Cas13(C2c2)システム ====
　Feng Zhangのグループは微生物ゲノムデータベースを探索し、クラス2タイプⅥ型CRISPR/CasシステムのCas13(C2c2)が、標的RNAに相補的なRNA依存性に一本鎖RNAを切断する酵素であることを見つけた[16]。Leptotrichia wadei由来のCas13a(LwaCas13a)をCRISPRシステムに組み込んだ系は、標的RNAを高効率かつ高い特異性でノックダウンすることができる[17]。CRISPR/Cas13aを用いた標的RNAのノックダウンはRNA干渉法(RNAi)に比べ、1)オフターゲットが少ない、2)長鎖ノンコーディングRNAの発現を抑制できる、などの利点がある。
さらに、失活させたCas13a(dCas13a)に蛍光タンパク質を融合させることにより、目的のRNAを可視化することができる[17]。最近、Cas13aより高効率かつ高い特異性で標的RNAをノックダウンすることができるCas13bが同定された[18]。Cas13は、pre-CRISPR RNAをプロセッシングしcrRNAを生成できる活性を持っており、多数の標的RNAを含んだpre-CRISPR RNAをガイドRNAとして用いることにより、一度に多くのRNAをノックダウンできる[17]。

==== CRISPR/dCas13-ADARシステム ====
　Feng Zhangのグループは、失活させたCas13b(dCas13b)にRNAデアミネース(RNAのアデニン(A)をイノシン(I)に変化させる酵素,ADAR)を融合させ、標的RNAを編集できる系を確立した(REPAIR, RNA Editing for Programmable A to I Replacement、図3)[18]。この系は、RNAの変異を正常に戻すことができる。さらに、RNAを標的にした編集はオフターゲットが起きてもその影響は一過性であり、遺伝子治療としては安全性が高い。

== CRISPR/Casシステムの神経科学への応用 ==
=== 細胞への応用[19] ===
　CRISPR/Casシステムを細胞に適用することにより、遺伝子の機能を欠損させたり亢進させたりすることが簡単にでき、様々な細胞機能に関与する遺伝子群をゲノムワイドに検索できる。
====ゲノム編集 ====
　神経細胞などの初代培養細胞は、一般的にCRISPR/Casシステムによるゲノム編集効率は低く、それぞれの細胞種による最適化が必要である。ES細胞やiPS細胞におけるCRISPR/Casシステムを用いたゲノム編集の効率化は、多くの実績がある。従って、ゲノム編集したES細胞やiPS細胞を用い、それらから分化させた神経細胞の機能を解析する方法も有効である。
　また、CRISPR/Casシステムの開発により、疾患原因遺伝子の変異以外は遺伝的に同一（isogenic）なiPS細胞を作成することが効率化された。iPS細胞におけるゲノム編集は、従来の相同組換えを用いた方法では変異導入効率が低く、クローン化に多大な労力が必要とされた。しかし、CRISPR/Casシステムの開発により、iPS細胞のゲノム編集がより効率化され、単純な遺伝子欠損に加え、疾患の原因と考えられる様々な変異（１塩基置換や大きな欠失など）を導入することが可能になった。従って、樹立された患者iPS細胞の疾患原因遺伝子の変異を正常に戻したり、健常人から樹立したiPS細胞に疾患の原因遺伝子変異を導入することによりisogenicな疾患モデル細胞を作成することが可能になった[20]。今後、isogenicなiPS細胞を用いることにより、疾患研究が加速すると期待される。

==== 転写制御 ====
　CRISPR/Casシステムは、RNA誘導型ヌクレアーゼであり、ガイドRNAが標的ゲノム部位にCasを誘導する。Casに点変異を入れ、ガイドRNAとは複合体を形成できるがヌクレアーゼ活性を持たないCas を作成することができる。この不活性型Cas(dCas9やdCpf1)に、様々な活性を持つ蛋白質を融合することにより、融合蛋白質を標的ゲノム部位に誘導することができる。転写活性化因子Vp64あるいは転写抑制因子KRABをdCas9やdCpf1と融合し、標的ゲノム部位と相補的配列を持つガイドRNAと伴に細胞に導入すると、標的遺伝子の転写を活性化あるいは抑制することができ、遺伝子の機能を解析することができる[21][22]。しかし、一つのdCasに対し一つの転写調節因子を結合させても遺伝子転写制御は不十分であり、通常は、dCasまたはガイドRNAに複数の転写調節因子を付加する系が使われている[23]。この系は、一つの細胞内の複数の遺伝子の転写を同時に制御することができる。