In situハイブリダイゼーション法 - 版の履歴

2021年12月15日 (水) 11:38にWikiSysopによる

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	<div align="right">		<div align="right">
	<font size="+1">[http://researchmap.jp/ohuchihideyo 大内淑代]</font><br>		<font size="+1">[http://researchmap.jp/ohuchihideyo 大内淑代]</font><[[br]]>
	''岡山大学大学院医歯薬学総合研究科細胞組織学分野''<br>		''岡山大学大学院医歯薬学総合研究科細胞組織学分野''<br>
	DOI：<selfdoi />　原稿受付日：2012年7月12日　原稿完成日：2013年3月25日<br>		DOI：<selfdoi />　原稿受付日：2012年7月12日　原稿完成日：2013年3月25日<br>
28行目:		28行目:
	=== 組織の固定 ===		=== 組織の固定 ===

	ISH法では細胞が死んだ状態でmRNAを検出する。細胞が死んでしまうと、mRNAは急速に分解され消滅してしまう。そのため、''in situ''ハイブリダイゼーション法を用いる場合は、細胞内のmRNAの分解を防ぎ、できるだけ生きていた状態を維持しておく必要がある。細胞や組織などをなるべく自然の状態に保存することを[[wikipedia:ja:固定\|固定]]とよんでいるが、''in situ''ハイブリダイゼーション法の場合はmRNAの固定が非常に重要である。''In situ''ハイブリダイゼーション法では、用時調製した4%[[wikipedia:ja:パラホルムアルデヒド\|パラホルムアルデヒド]]液を用いて[[wikipedia:ja:還流固定\|還流固定]]し、[[wikipedia:ja:臓器\|臓器]]等を取り出して短時間、低温でさらに[[wikipedia:ja:浸漬固定\|浸漬固定]]~~することが多い。新鮮迅速凍結切片を用いてISHを行うこともある。組織切片はスライドガラスに貼付けたもの、あるいは浮遊切片~~<ref><pubmed> 21037591</pubmed></ref>を用いる。		ISH法では細胞が死んだ状態でmRNAを検出する。細胞が死んでしまうと、mRNAは急速に分解され消滅してしまう。そのため、''in situ''ハイブリダイゼーション法を用いる場合は、細胞内のmRNAの分解を防ぎ、できるだけ生きていた状態を維持しておく必要がある。細胞や組織などをなるべく自然の状態に保存することを[[wikipedia:ja:固定\|固定]]とよんでいるが、''in situ''ハイブリダイゼーション法の場合はmRNAの固定が非常に重要である。''In situ''ハイブリダイゼーション法では、用時調製した4%[[wikipedia:ja:パラホルムアルデヒド\|パラホルムアルデヒド]]液を用いて[[wikipedia:ja:還流固定\|還流固定]]し、[[wikipedia:ja:臓器\|臓器]]等を取り出して短時間、低温でさらに[[wikipedia:ja:浸漬固定\|浸漬固定]]することが多い。新鮮迅速凍結切片を用いてISHを行うこともある。組織切片はスライドガラスに貼付けたもの、あるいは浮遊[[切片]]<ref><[[pubmed]]> 21037591</pubmed></ref>を用いる。

	=== 前処理 ===		=== 前処理 ===
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	== ISHデータベース ==		== ISHデータベース ==

	Allen Brain Atlasは、[[wikipedia:ja:マイクロソフト社\|マイクロソフト社]]創設者の一人である[[wikipedia:Paul G. Allen\|Paul G. Allen]]の出資によって2003年に設立された[[wikipedia:ja:Allen Institute for Brain Science\|Allen Institute for Brain Science]]のISHデータベースである。2006年12月発表のNature の記事によると、まず約2万の遺伝子のマウス成体脳における組織切片ISHのデータが公開された<ref><pubmed> 17151600</pubmed></ref>。現在、[[マウス]][[脳]]に加えて、[[wikipedia:ja:ヒト脳\|ヒト脳]]、発生期マウス脳、発生期ヒト脳、マウス脳神経回路、ヒト以外の[[wikipedia:ja:霊長類\|霊長類]]脳、マウス[[脊髄]]~~、ヒト~~[[神経膠芽腫]]に関するISHデータベースが公開されている。		Allen Brain Atlasは、[[wikipedia:ja:マイクロソフト社\|マイクロソフト社]]創設者の一人である[[wikipedia:Paul G. Allen\|Paul G. Allen]]の出資によって2003年に設立された[[wikipedia:ja:Allen Institute for Brain Science\|Allen Institute for Brain Science]]のISHデータベースである。2006年12月発表のNature の記事によると、まず約2万の遺伝子のマウス成体脳における組織切片ISHのデータが公開された<ref><pubmed> 17151600</pubmed></ref>。現在、[[マウス]][[脳]]に加えて、[[wikipedia:ja:ヒト脳\|ヒト脳]]、発生期マウス脳、発生期ヒト脳、マウス脳神経回路、ヒト以外の[[wikipedia:ja:霊長類\|霊長類]]脳、マウス[[脊髄]]、[[ヒト]][[神経膠芽腫]]に関するISHデータベースが公開されている。

	==関連項目==		==関連項目==

WikiSysop: /* 2色ISH法、蛍光ISH法、抗体染色との2重染色 */

2016-03-30T00:31:22Z

2色ISH法、蛍光ISH法、抗体染色との2重染色

← 古い版		2016年3月30日 (水) 09:31時点における版
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	== 2色ISH法、蛍光ISH法、抗体染色との2重染色 ==		== 2色ISH法、蛍光ISH法、抗体染色との2重染色 ==

	発色法では、アルカリフォスファターゼ (AP) の基質を変えることにより、2つの遺伝子の発現を同時に検出できる。すなわち、調べたい2つの遺伝子のRNAプローブをDIGまたはフルオレセインで標識し、混合プローブでハイブリダイゼーションさせる。まずAP標識抗フルオレセイン抗体で反応させ、洗浄、発色まで行う（基質は[[wikipedia:ja:Fast Red\|Fast Red]]）。その後、酸処理（0.1M[[~~wikipedia:ja:グリシン\|~~グリシン]]-HCl、pH2.2）および後固定を行って1色めのアルカリフォスファターゼを失活させる。その後、AP標識抗DIG抗体で反応させ、洗浄、発色を行う（基質NBT/BCIP）。または、DIGまたはフルオレセインで標識した2つのRNAプローブでハイブリダイゼーションさせて洗浄、HRP標識抗DIG抗体で反応させ、HRPの基質ジアミノベンジジン(Diaminobenzidine: DAB)を用いてまず発色させる。次に、AP標識抗フルオレセイン抗体で反応させ、その後APの基質（NBT, BCIP）を用いて発色させる。		発色法では、アルカリフォスファターゼ (AP) の基質を変えることにより、2つの遺伝子の発現を同時に検出できる。すなわち、調べたい2つの遺伝子のRNAプローブをDIGまたはフルオレセインで標識し、混合プローブでハイブリダイゼーションさせる。まずAP標識抗フルオレセイン抗体で反応させ、洗浄、発色まで行う（基質は[[wikipedia:ja:Fast Red\|Fast Red]]）。その後、酸処理（0.1M[[グリシン]]-HCl、pH2.2）および後固定を行って1色めのアルカリフォスファターゼを失活させる。その後、AP標識抗DIG抗体で反応させ、洗浄、発色を行う（基質NBT/BCIP）。または、DIGまたはフルオレセインで標識した2つのRNAプローブでハイブリダイゼーションさせて洗浄、HRP標識抗DIG抗体で反応させ、HRPの基質ジアミノベンジジン(Diaminobenzidine: DAB)を用いてまず発色させる。次に、AP標識抗フルオレセイン抗体で反応させ、その後APの基質（NBT, BCIP）を用いて発色させる。

	蛍光ISH法では、HRP標識の抗体に対して、[[wikipedia:ja:tyramide\|tyramide]]を結合させた低分子(ビオチンやフルオレセインなど)を反応させシグナルを増強させる方法 (tyramide signal amplification: TSA) を用いる。すなわちtyramideは、ペルオキシダーゼ活性によってラジカル化し組織（タンパク質のTyr, Trp残基など）に低分子ごと集積する。集積した低分子を、蛍光物質の場合はそのまま蛍光顕微鏡等で検出でき、そうでなければその低分子に対する蛍光標識抗体または[[wikipedia:ja:ストレプトアビジン\|ストレプトアビジン]]を反応させて間接的に検出することもできる。細胞レベルでmRNAの共在性を証明するためには蛍光ISH法は必須であり、AP反応系Fast Red/[[wikipedia:ja:HNPP\|HNPP]]と組み合わせることで2重蛍光ISH法を行うことができる。抗体染色との2重染色では、以上のISH工程をタンパク質分解酵素なしで行ってそのあと通常の間接蛍光抗体染色を行う、あるいは先にビオチン化抗体と蛍光標識アビジンを用いてRNAseフリーで抗体染色を行い、その後AP反応系Fast Red/HNPPによるISH法を行うなどの方法がある。さらなる多重蛍光ISH法については、hybridization chain reaction法がある。		蛍光ISH法では、HRP標識の抗体に対して、[[wikipedia:ja:tyramide\|tyramide]]を結合させた低分子(ビオチンやフルオレセインなど)を反応させシグナルを増強させる方法 (tyramide signal amplification: TSA) を用いる。すなわちtyramideは、ペルオキシダーゼ活性によってラジカル化し組織（タンパク質のTyr, Trp残基など）に低分子ごと集積する。集積した低分子を、蛍光物質の場合はそのまま蛍光顕微鏡等で検出でき、そうでなければその低分子に対する蛍光標識抗体または[[wikipedia:ja:ストレプトアビジン\|ストレプトアビジン]]を反応させて間接的に検出することもできる。細胞レベルでmRNAの共在性を証明するためには蛍光ISH法は必須であり、AP反応系Fast Red/[[wikipedia:ja:HNPP\|HNPP]]と組み合わせることで2重蛍光ISH法を行うことができる。[[抗体染色]]との2重染色では、以上のISH工程をタンパク質分解酵素なしで行ってそのあと通常の間接蛍光抗体染色を行う、あるいは先にビオチン化抗体と蛍光標識アビジンを用いてRNAseフリーで抗体染色を行い、その後AP反応系Fast Red/HNPPによるISH法を行うなどの方法がある。さらなる多重蛍光ISH法については、hybridization chain reaction法がある。

	== マイクロRNAを検出するISH法 ==		== マイクロRNAを検出するISH法 ==

WikiSysop: /* 外部リンク */

2014-07-27T11:50:10Z

外部リンク

← 古い版		2014年7月27日 (日) 20:50時点における版
91行目:		91行目:

	Allen Brain Atlasは、[[wikipedia:ja:マイクロソフト社\|マイクロソフト社]]創設者の一人である[[wikipedia:Paul G. Allen\|Paul G. Allen]]の出資によって2003年に設立された[[wikipedia:ja:Allen Institute for Brain Science\|Allen Institute for Brain Science]]のISHデータベースである。2006年12月発表のNature の記事によると、まず約2万の遺伝子のマウス成体脳における組織切片ISHのデータが公開された<ref><pubmed> 17151600</pubmed></ref>。現在、[[マウス]][[脳]]に加えて、[[wikipedia:ja:ヒト脳\|ヒト脳]]、発生期マウス脳、発生期ヒト脳、マウス脳神経回路、ヒト以外の[[wikipedia:ja:霊長類\|霊長類]]脳、マウス[[脊髄]]、ヒト[[神経膠芽腫]]に関するISHデータベースが公開されている。		Allen Brain Atlasは、[[wikipedia:ja:マイクロソフト社\|マイクロソフト社]]創設者の一人である[[wikipedia:Paul G. Allen\|Paul G. Allen]]の出資によって2003年に設立された[[wikipedia:ja:Allen Institute for Brain Science\|Allen Institute for Brain Science]]のISHデータベースである。2006年12月発表のNature の記事によると、まず約2万の遺伝子のマウス成体脳における組織切片ISHのデータが公開された<ref><pubmed> 17151600</pubmed></ref>。現在、[[マウス]][[脳]]に加えて、[[wikipedia:ja:ヒト脳\|ヒト脳]]、発生期マウス脳、発生期ヒト脳、マウス脳神経回路、ヒト以外の[[wikipedia:ja:霊長類\|霊長類]]脳、マウス[[脊髄]]、ヒト[[神経膠芽腫]]に関するISHデータベースが公開されている。

			==関連項目==
			*[[免疫組織化学]]

	== 外部リンク ==		== 外部リンク ==

2014年6月17日 (火) 08:03にTfuruyaによる

2014-06-17T08:03:47Z

← 古い版		2014年6月17日 (火) 17:03時点における版
2行目:		2行目:
	<font size="+1">[http://researchmap.jp/ohuchihideyo 大内淑代]</font><br>		<font size="+1">[http://researchmap.jp/ohuchihideyo 大内淑代]</font><br>
	''岡山大学大学院医歯薬学総合研究科細胞組織学分野''<br>		''岡山大学大学院医歯薬学総合研究科細胞組織学分野''<br>
	~~DOI XXXX~~/~~XXXX　原稿受付日：2012年7月12日　原稿完成日：2013年3月25日~~<br>		DOI：<selfdoi />　原稿受付日：2012年7月12日　原稿完成日：2013年3月25日<br>
	担当編集委員：[http://researchmap.jp/noriko1128 大隅典子]（東北大学大学院医学系研究科附属創生応用医学研究センター脳神経科学コアセンター発生発達神経科学分野）<br>		担当編集委員：[http://researchmap.jp/noriko1128 大隅典子]（東北大学大学院医学系研究科附属創生応用医学研究センター脳神経科学コアセンター発生発達神経科学分野）<br>
	</div>		</div>

2013年6月21日 (金) 04:32にTfuruyaによる

2013-06-21T04:32:18Z

@@ 1行目: / 1行目: @@
 [[Image:In situハイブリダイゼーション法1A.png|thumb|300px|'''図1A．ISHの実験例'''<br>組織切片ISH（トリ胚網膜、opsin 5、青い点状のシグナルがmRNA発現細胞、右はセンスプローブによる陰性コントロール）<br>発色基質：NBT, BCIP]]
@@ 12行目: / 19行目: @@
 英：''in situ'' hybridization　独：''In situ''-Hybridisierung　仏：hybridation in situ
 　''In situ''とは”原位置で”という意味で、''in situ''ハイブリダイゼーション(''in situ'' hybridization: ISH)とは原位置でのハイブリダイゼーション（後述）ということである。ISH法には、[[wikipedia:ja:染色体|染色体]]ISHと組織切片ISH、ホールマウントISH (whole-mount ISH: WISH) がある<ref>'''野地澄晴編'''<br>免疫染色&''in situ''ハイブリダイゼーション<br>''羊土社''、東京、2006</ref><ref>'''D.G. Wilkinson'''<br>In Situ Hybridization, A Practical Approach, 2nd Edition<br>''Oxford University Press'', Oxford, 1999</ref>。染色体ISH法は、染色体における目的遺伝子の[[wikipedia:ja:遺伝子座|遺伝子座]]を明らかにし、染色体異常を検出することができる。組織ISH法は、組織切片を用いて遺伝子発現の第一段階である[[wikipedia:ja:mRNA|mRNA]]の局在を細胞レベルで明らかにする。[[wikipedia:ja:病理|病理]]組織から[[wikipedia:ja:ウイルス|ウイルス]][[wikipedia:ja:ゲノム|ゲノム]]を検出し、ウイルス感染の診断に用いられることもある。また、胚や器官の一部などを丸ごと用いるISH法を、ホールマウントISH（WISH）という。実験例を図1に示す。遺伝子発現部位の三次元的な情報を得た後で、細胞レベルで遺伝子発現部位を同定しなければならない場合は、WISH後の胚などの組織切片を作製する。図2に、組織切片を用いた''in situ''ハイブリダイゼーション法の工程を模式的に示す。ISHは、細胞内mRNAの局在を明らかにする実験であるので、分解されやすいRNAをいかに分解させずに実験を行うかが重要である。
 == ''In situ''ハイブリダイゼーション法の各工程 ==
@@ 94行目: / 103行目: @@
 == 参考文献 ==
 <references />

WikiSysop: /* 酵素抗体法と蛍光抗体法 */

2012-10-28T00:54:46Z

酵素抗体法と蛍光抗体法

← 古い版		2012年10月28日 (日) 09:54時点における版
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	====酵素抗体法と蛍光抗体法====		====酵素抗体法と蛍光抗体法====

	[[image:In situハイブリダイゼーション法3.png\|thumb\|~~600px~~\|'''図3．アルカリフォスファッターゼによる発色反応'''<br>BCIPがAPにより加水分解されてまず中間産物となり、さらに2量体になって青色色素を産生する。2量体化するときに、2個の水素イオンによりNBTは還元されて不溶性のNBTホルマザンを形成する。(tautomerism:ケト・エノール互変異性)<br>一方、Fast Red TRは、ナフトールAS-MXリン酸の存在下でAPにより赤色の沈殿物を生じる。Fast Red TRを蛍光性のAP基質であるHNPP (2-hydroxy-3-naphtoic acid-2’-phenylanilide phosphate)と共に用いると、還元されてできるHNPの組織への沈着が増し、HNPの蛍光がさらに長波長側シフトして (565~620nm) 強い橙蛍光を発する。[http://www.piercenet.com/browse.cfm?fldID=5A423056-5056-8A76-4E25-1E5F9C0596B2 発色反応、発色基質全般についての説明。]]]		[[image:In situハイブリダイゼーション法3.png\|thumb\|500px\|'''図3．アルカリフォスファッターゼによる発色反応'''<br>BCIPがAPにより加水分解されてまず中間産物となり、さらに2量体になって青色色素を産生する。2量体化するときに、2個の水素イオンによりNBTは還元されて不溶性のNBTホルマザンを形成する。(tautomerism:ケト・エノール互変異性)<br>一方、Fast Red TRは、ナフトールAS-MXリン酸の存在下でAPにより赤色の沈殿物を生じる。Fast Red TRを蛍光性のAP基質であるHNPP (2-hydroxy-3-naphtoic acid-2’-phenylanilide phosphate)と共に用いると、還元されてできるHNPの組織への沈着が増し、HNPの蛍光がさらに長波長側シフトして (565~620nm) 強い橙蛍光を発する。[http://www.piercenet.com/browse.cfm?fldID=5A423056-5056-8A76-4E25-1E5F9C0596B2 発色反応、発色基質全般についての説明。]]]

	標識プローブのみでは発色することができないので、プローブの中に取り込まれている抗原に対する抗体を用いプローブの検出を行う．プローブをDIGで標識した場合、DIGに特異的に結合する一次抗体を用いて検出する。検出に用いる一次抗体には通常の抗体とは異なり、[[wikipedia:ja:アルカリホスファターゼ\|アルカリホスファターゼ]]（alkaline phosphatase: AP）または[[wikipedia:Horseradish_peroxidase\|西洋ワサビペルオキシダーゼ]]（horseradish peroxidase: HRP）などの酵素が結合（conjugate）している．例えば、抗体に結合されたAPの基質として、5-Bromo-4-Chloro-3'-Indolylphosphate p-Toluidine salt (BCIP）およびnitro-blue tetrazolium chloride (NBT)を用いた場合は、APがBCIPを脱リン酸化し、中間産物が遊離すると発色する（図3）。一方、抗体に蛍光色素が結合している場合には、[[wikipedia:ja:蛍光顕微鏡\|蛍光顕微鏡]]や[[共焦点レーザー走査顕微鏡]]で検出する。		標識プローブのみでは発色することができないので、プローブの中に取り込まれている抗原に対する抗体を用いプローブの検出を行う．プローブをDIGで標識した場合、DIGに特異的に結合する一次抗体を用いて検出する。検出に用いる一次抗体には通常の抗体とは異なり、[[wikipedia:ja:アルカリホスファターゼ\|アルカリホスファターゼ]]（alkaline phosphatase: AP）または[[wikipedia:Horseradish_peroxidase\|西洋ワサビペルオキシダーゼ]]（horseradish peroxidase: HRP）などの酵素が結合（conjugate）している．例えば、抗体に結合されたAPの基質として、5-Bromo-4-Chloro-3'-Indolylphosphate p-Toluidine salt (BCIP）およびnitro-blue tetrazolium chloride (NBT)を用いた場合は、APがBCIPを脱リン酸化し、中間産物が遊離すると発色する（図3）。一方、抗体に蛍光色素が結合している場合には、[[wikipedia:ja:蛍光顕微鏡\|蛍光顕微鏡]]や[[共焦点レーザー走査顕微鏡]]で検出する。

2012年10月28日 (日) 00:50にWikiSysopによる

2012-10-28T00:50:33Z

← 古い版		2012年10月28日 (日) 09:50時点における版
12行目:		12行目:
	英：''in situ'' hybridization　独：''In situ''-Hybridisierung　仏：hybridation in situ		英：''in situ'' hybridization　独：''In situ''-Hybridisierung　仏：hybridation in situ

	''In situ''とは”原位置で”という意味で、''in situ''ハイブリダイゼーション(''in situ'' hybridization: ISH)とは原位置でのハイブリダイゼーション（後述）ということである。ISH法には、[[wikipedia:ja:染色体\|染色体]]ISHと組織切片ISH、ホールマウントISH (whole-mount ISH: WISH) ~~がある。染色体ISH法は、染色体における目的遺伝子の~~[[wikipedia:ja:遺伝子座\|遺伝子座]]を明らかにし、染色体異常を検出することができる。組織ISH法は、組織切片を用いて遺伝子発現の第一段階である[[wikipedia:ja:mRNA\|mRNA]]の局在を細胞レベルで明らかにする。[[wikipedia:ja:病理\|病理]]組織から[[wikipedia:ja:ウイルス\|ウイルス]][[wikipedia:ja:ゲノム\|ゲノム]]を検出し、ウイルス感染の診断に用いられることもある。また、胚や器官の一部などを丸ごと用いるISH法を、ホールマウントISH（WISH）という。実験例を図1に示す。遺伝子発現部位の三次元的な情報を得た後で、細胞レベルで遺伝子発現部位を同定しなければならない場合は、WISH後の胚などの組織切片を作製する。図2に、組織切片を用いた''in situ''ハイブリダイゼーション法の工程を模式的に示す。ISHは、細胞内mRNAの局在を明らかにする実験であるので、分解されやすいRNAをいかに分解させずに実験を行うかが重要である。		''In situ''とは”原位置で”という意味で、''in situ''ハイブリダイゼーション(''in situ'' hybridization: ISH)とは原位置でのハイブリダイゼーション（後述）ということである。ISH法には、[[wikipedia:ja:染色体\|染色体]]ISHと組織切片ISH、ホールマウントISH (whole-mount ISH: WISH) がある<ref>'''野地澄晴編'''<br>免疫染色&''in situ''ハイブリダイゼーション<br>''羊土社''、東京、2006</ref><ref>'''D.G. Wilkinson'''<br>In Situ Hybridization, A Practical Approach, 2nd Edition<br>''Oxford University Press'', Oxford, 1999</ref>。染色体ISH法は、染色体における目的遺伝子の[[wikipedia:ja:遺伝子座\|遺伝子座]]を明らかにし、染色体異常を検出することができる。組織ISH法は、組織切片を用いて遺伝子発現の第一段階である[[wikipedia:ja:mRNA\|mRNA]]の局在を細胞レベルで明らかにする。[[wikipedia:ja:病理\|病理]]組織から[[wikipedia:ja:ウイルス\|ウイルス]][[wikipedia:ja:ゲノム\|ゲノム]]を検出し、ウイルス感染の診断に用いられることもある。また、胚や器官の一部などを丸ごと用いるISH法を、ホールマウントISH（WISH）という。実験例を図1に示す。遺伝子発現部位の三次元的な情報を得た後で、細胞レベルで遺伝子発現部位を同定しなければならない場合は、WISH後の胚などの組織切片を作製する。図2に、組織切片を用いた''in situ''ハイブリダイゼーション法の工程を模式的に示す。ISHは、細胞内mRNAの局在を明らかにする実験であるので、分解されやすいRNAをいかに分解させずに実験を行うかが重要である。

	== ''In situ''ハイブリダイゼーション法の各工程 ==		== ''In situ''ハイブリダイゼーション法の各工程 ==
19行目:		19行目:
	=== 組織の固定 ===		=== 組織の固定 ===

	ISH法では細胞が死んだ状態でmRNAを検出する。細胞が死んでしまうと、mRNAは急速に分解され消滅してしまう。そのため、''in situ''ハイブリダイゼーション法を用いる場合は、細胞内のmRNAの分解を防ぎ、できるだけ生きていた状態を維持しておく必要がある。細胞や組織などをなるべく自然の状態に保存することを[[wikipedia:ja:固定\|固定]]とよんでいるが、''in situ''ハイブリダイゼーション法の場合はmRNAの固定が非常に重要である。''In situ''ハイブリダイゼーション法では、用時調製した4%[[wikipedia:ja:パラホルムアルデヒド\|パラホルムアルデヒド]]液を用いて[[wikipedia:ja:還流固定\|還流固定]]し、[[wikipedia:ja:臓器\|臓器]]等を取り出して短時間、低温でさらに[[wikipedia:ja:浸漬固定\|浸漬固定]]~~することが多い。新鮮迅速凍結切片を用いてISHを行うこともある。組織切片はスライドガラスに貼付けたもの、あるいは浮遊切片を用いる。~~		ISH法では細胞が死んだ状態でmRNAを検出する。細胞が死んでしまうと、mRNAは急速に分解され消滅してしまう。そのため、''in situ''ハイブリダイゼーション法を用いる場合は、細胞内のmRNAの分解を防ぎ、できるだけ生きていた状態を維持しておく必要がある。細胞や組織などをなるべく自然の状態に保存することを[[wikipedia:ja:固定\|固定]]とよんでいるが、''in situ''ハイブリダイゼーション法の場合はmRNAの固定が非常に重要である。''In situ''ハイブリダイゼーション法では、用時調製した4%[[wikipedia:ja:パラホルムアルデヒド\|パラホルムアルデヒド]]液を用いて[[wikipedia:ja:還流固定\|還流固定]]し、[[wikipedia:ja:臓器\|臓器]]等を取り出して短時間、低温でさらに[[wikipedia:ja:浸漬固定\|浸漬固定]]することが多い。新鮮迅速凍結切片を用いてISHを行うこともある。組織切片はスライドガラスに貼付けたもの、あるいは浮遊切片<ref><pubmed> 21037591</pubmed></ref>を用いる。

	=== 前処理 ===		=== 前処理 ===
93行目:		93行目:

	== 参考文献 ==		== 参考文献 ==

	~~野地澄晴編、免疫染色&''in situ''ハイブリダイゼーション、羊土社、東京、2006.~~

	~~In Situ Hybridization, A Practical Approach, 2nd Edition, Edited by D.G. Wilkinson, Oxford University Press, Oxford, 1999.~~

	~~Choi HM, Chang JY, Trinh le A, Padilla JE, Fraser SE, Pierce NA.　Programmable ''in situ'' amplification for multiplexed imaging of mRNA expression.　Nat Biotechnol.　2010 Nov;28(11):1208-1212.~~

	<references />		<references />


	（執筆者：大内淑代　担当編集委員：大隅典子）		（執筆者：大内淑代　担当編集委員：大隅典子）

WikiSysop: /* 外部リンク */

2012-10-28T00:43:04Z

外部リンク

← 古い版		2012年10月28日 (日) 09:43時点における版
85行目:		85行目:
	== 外部リンク ==		== 外部リンク ==
	* [http://www.brain-map.org/ Allen Brain Atlas]		* [http://www.brain-map.org/ Allen Brain Atlas]
	* [https://e-labdoc.roche.com/LFR_PublicDocs/ras/11209256910_en_15.pdf ~~ジゴキシゲニン~~]		* [https://e-labdoc.roche.com/LFR_PublicDocs/ras/11209256910_en_15.pdf Roche社のジゴキシゲニンの説明。]
	* [https://e-labdoc.roche.com/LFR_PublicDocs/ras/11758888001_en_07.pdf ~~発色基質（HNPP~~, Fast ~~Red）~~]		* [https://e-labdoc.roche.com/LFR_PublicDocs/ras/11758888001_en_07.pdf Roche社の発色基質（HNPP, Fast Red）の説明。]
	* [http://www.perkinelmer.co.jp/products_ls/resrch/pdf/BRO_TSA_TSAPlus.pdf ~~チラミドを用いたISHとシグナル増強（CARD）~~]		* [http://www.perkinelmer.co.jp/products_ls/resrch/pdf/BRO_TSA_TSAPlus.pdf Perkin-Elmer社のチラミドを用いたISHとシグナル増強（CARD）の説明。]
	* [http://www.cosmobio.co.jp/product/bunshiseibutsu/mirna/mirna_5/exq_20101007.asp?entry_id=6535 ~~マイクロRNAのISH~~ (locked nucleic acid)]		* [http://www.cosmobio.co.jp/product/bunshiseibutsu/mirna/mirna_5/exq_20101007.asp?entry_id=6535 コスモバイオ社のマイクロRNAのISH (locked nucleic acid)の説明。]
	* [http://www.nibb.ac.jp/brish/index.html 基礎生物学研究所山森研究室（渡我部昭哉博士作成）ホームページ BraInSitu] - 脳の組織切片ISH法（特に浮遊法）について詳細なプロトコールが紹介されている。		* [http://www.nibb.ac.jp/brish/index.html 基礎生物学研究所山森研究室（渡我部昭哉博士作成）ホームページ BraInSitu] - 脳の組織切片ISH法（特に浮遊法）について詳細なプロトコールが紹介されている。
			* [http://www.piercenet.com/browse.cfm?fldID=5A423056-5056-8A76-4E25-1E5F9C0596B2 Pierce社の発色反応、発色基質全般についての説明。]

	== 参考文献 ==		== 参考文献 ==

WikiSysop: /* 酵素抗体法と蛍光抗体法 */

2012-10-28T00:40:25Z

酵素抗体法と蛍光抗体法

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	====酵素抗体法と蛍光抗体法====		====酵素抗体法と蛍光抗体法====

	[[image:In situハイブリダイゼーション法3.png\|thumb\|600px\|'''図3．アルカリフォスファッターゼによる発色反応'''<br>BCIPがAPにより加水分解されてまず中間産物となり、さらに2量体になって青色色素を産生する。2量体化するときに、2個の水素イオンによりNBTは還元されて不溶性のNBTホルマザンを形成する。(tautomerism:ケト・エノール互変異性)<br>一方、Fast Red TRは、ナフトールAS-MXリン酸の存在下でAPにより赤色の沈殿物を生じる。Fast Red TRを蛍光性のAP基質であるHNPP (2-hydroxy-3-naphtoic acid-2’-phenylanilide phosphate)と共に用いると、還元されてできるHNPの組織への沈着が増し、HNPの蛍光がさらに長波長側シフトして (565~620nm) 強い橙蛍光を発する。~~<ref>~~[http://www.piercenet.com/browse.cfm?fldID=5A423056-5056-8A76-4E25-1E5F9C0596B2 ~~発色反応、発色基質全般~~]~~</ref>~~]]		[[image:In situハイブリダイゼーション法3.png\|thumb\|600px\|'''図3．アルカリフォスファッターゼによる発色反応'''<br>BCIPがAPにより加水分解されてまず中間産物となり、さらに2量体になって青色色素を産生する。2量体化するときに、2個の水素イオンによりNBTは還元されて不溶性のNBTホルマザンを形成する。(tautomerism:ケト・エノール互変異性)<br>一方、Fast Red TRは、ナフトールAS-MXリン酸の存在下でAPにより赤色の沈殿物を生じる。Fast Red TRを蛍光性のAP基質であるHNPP (2-hydroxy-3-naphtoic acid-2’-phenylanilide phosphate)と共に用いると、還元されてできるHNPの組織への沈着が増し、HNPの蛍光がさらに長波長側シフトして (565~620nm) 強い橙蛍光を発する。[http://www.piercenet.com/browse.cfm?fldID=5A423056-5056-8A76-4E25-1E5F9C0596B2 発色反応、発色基質全般についての説明。]]]

	標識プローブのみでは発色することができないので、プローブの中に取り込まれている抗原に対する抗体を用いプローブの検出を行う．プローブをDIGで標識した場合、DIGに特異的に結合する一次抗体を用いて検出する。検出に用いる一次抗体には通常の抗体とは異なり、[[wikipedia:ja:アルカリホスファターゼ\|アルカリホスファターゼ]]（alkaline phosphatase: AP）または[[wikipedia:Horseradish_peroxidase\|西洋ワサビペルオキシダーゼ]]（horseradish peroxidase: HRP）などの酵素が結合（conjugate）している．例えば、抗体に結合されたAPの基質として、5-Bromo-4-Chloro-3'-Indolylphosphate p-Toluidine salt (BCIP）およびnitro-blue tetrazolium chloride (NBT)を用いた場合は、APがBCIPを脱リン酸化し、中間産物が遊離すると発色する（図3）。一方、抗体に蛍光色素が結合している場合には、[[wikipedia:ja:蛍光顕微鏡\|蛍光顕微鏡]]や[[共焦点レーザー走査顕微鏡]]で検出する。		標識プローブのみでは発色することができないので、プローブの中に取り込まれている抗原に対する抗体を用いプローブの検出を行う．プローブをDIGで標識した場合、DIGに特異的に結合する一次抗体を用いて検出する。検出に用いる一次抗体には通常の抗体とは異なり、[[wikipedia:ja:アルカリホスファターゼ\|アルカリホスファターゼ]]（alkaline phosphatase: AP）または[[wikipedia:Horseradish_peroxidase\|西洋ワサビペルオキシダーゼ]]（horseradish peroxidase: HRP）などの酵素が結合（conjugate）している．例えば、抗体に結合されたAPの基質として、5-Bromo-4-Chloro-3'-Indolylphosphate p-Toluidine salt (BCIP）およびnitro-blue tetrazolium chloride (NBT)を用いた場合は、APがBCIPを脱リン酸化し、中間産物が遊離すると発色する（図3）。一方、抗体に蛍光色素が結合している場合には、[[wikipedia:ja:蛍光顕微鏡\|蛍光顕微鏡]]や[[共焦点レーザー走査顕微鏡]]で検出する。