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[[ | [[Image:In situハイブリダイゼーション法1A.png|thumb|350px|'''図1A．ISHの実験例'''<br>組織切片ISH（トリ胚網膜、opsin 5、青い点状のシグナルがmRNA発現細胞、右はセンスプローブによる陰性コントロール）<br>発色基質：NBT, BCIP]] | ||
[[ | [[Image:In situハイブリダイゼーション法1B.png|thumb|350px|'''図1B．ISHの実験例'''<br>ホールマウントISH (WISH)<br> | ||
マウス胚WISHとWISH後の切片化（Wnt1、青線で切片化、シグナルは矢印[脊索]、凍結切片、未封入）]] | マウス胚WISHとWISH後の切片化（Wnt1、青線で切片化、シグナルは矢印[脊索]、凍結切片、未封入）]] | ||
[[ | [[Image:In situハイブリダイゼーション法1C.png|thumb|350px|'''図1C．ISHの実験例'''<br>組織切片蛍光ISH＋抗体染色<br>トリ胚網膜、opsin 5 mRNA （緑）、Islet1蛋白質（マゼンダCy3、上）・GAD65/67蛋白質（マゼンタCy3、下）、核(DAPI)[青]）<br>ISHはFluorescein-tyramide法]] | ||
[[ | [[Image:In situハイブリダイゼーション法1D.png|thumb|350px|'''図1D．ISHの実験例'''<br>マイクロRNAのWISH（マウス胚、miR-1）<br>発色基質: NBT, BCIP]] | ||
[[Image:In situハイブリダイゼーション法2.png|thumb|300px|'''図2．組織切片を用いたin situハイブリダイゼーション法の工程''']] | |||
In situとは”原位置で”という意味で、in situハイブリダイゼーション(in situ hybridization: ISH)とは原位置でのハイブリダイゼーション（後述）ということである。ISH法には、染色体ISHと組織切片ISH、ホールマウントISH (whole-mount ISH: WISH) がある。染色体ISH法は、染色体における目的遺伝子の遺伝子座を明らかにし、染色体異常を検出することができる。組織ISH法は、組織切片を用いて遺伝子発現の第一段階であるmRNAの局在を細胞レベルで明らかにする。病理組織からウイルスゲノムを検出し、ウイルス感染の診断に用いられることもある。また、胚や器官の一部などを丸ごと用いるISH法を、ホールマウントISH（WISH）という。実験例を図1に示す。遺伝子発現部位の三次元的な情報を得た後で、細胞レベルで遺伝子発現部位を同定しなければならない場合は、WISH後の胚などの組織切片を作製する。図2に、組織切片を用いたin situハイブリダイゼーション法の工程を模式的に示す。ISHは、細胞内mRNAの局在を明らかにする実験であるので、分解されやすいRNAをいかに分解させずに実験を行うかが重要である。 | In situとは”原位置で”という意味で、in situハイブリダイゼーション(in situ hybridization: ISH)とは原位置でのハイブリダイゼーション（後述）ということである。ISH法には、染色体ISHと組織切片ISH、ホールマウントISH (whole-mount ISH: WISH) がある。染色体ISH法は、染色体における目的遺伝子の遺伝子座を明らかにし、染色体異常を検出することができる。組織ISH法は、組織切片を用いて遺伝子発現の第一段階であるmRNAの局在を細胞レベルで明らかにする。病理組織からウイルスゲノムを検出し、ウイルス感染の診断に用いられることもある。また、胚や器官の一部などを丸ごと用いるISH法を、ホールマウントISH（WISH）という。実験例を図1に示す。遺伝子発現部位の三次元的な情報を得た後で、細胞レベルで遺伝子発現部位を同定しなければならない場合は、WISH後の胚などの組織切片を作製する。図2に、組織切片を用いたin situハイブリダイゼーション法の工程を模式的に示す。ISHは、細胞内mRNAの局在を明らかにする実験であるので、分解されやすいRNAをいかに分解させずに実験を行うかが重要である。 | ||
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====酵素抗体法と蛍光抗体法==== | ====酵素抗体法と蛍光抗体法==== | ||
[[image:In situハイブリダイゼーション法3.png|thumb|300px|'''図3．アルカリフォスファッターゼによる発色反応'''<br> | [[image:In situハイブリダイゼーション法3.png|thumb|300px|'''図3．アルカリフォスファッターゼによる発色反応'''<br>BCIPがAPにより加水分解されてまず中間産物となり、さらに2量体になって青色色素を産生する。2量体化するときに、2個の水素イオンによりNBTは還元されて不溶性のNBTホルマザンを形成する。(tautomerism:ケト・エノール互変異性)<br>一方、Fast Red TRは、ナフトールAS-MXリン酸の存在下でAPにより赤色の沈殿物を生じる。Fast Red TRを蛍光性のAP基質であるHNPP (2-hydroxy-3-naphtoic acid-2’-phenylanilide phosphate)と共に用いると、還元されてできるHNPの組織への沈着が増し、HNPの蛍光がさらに長波長側シフトして (565~620nm) 強い橙蛍光を発する。<ref>[http://www.piercenet.com/browse.cfm?fldID=5A423056-5056-8A76-4E25-1E5F9C0596B2/ 発色反応、発色基質全般]</ref>]] | ||
標識プローブのみでは発色することができないので、プローブの中に取り込まれている抗原に対する抗体を用いプローブの検出を行う．プローブをDIGで標識した場合、DIGに特異的に結合する一次抗体を用いて検出する。検出に用いる一次抗体には通常の抗体とは異なり、アルカリフォスファターゼ（alkaline phosphatase: AP）またはホースラディシュペルオキシダーゼ（horseradish peroxidase: HRP）などの酵素が結合（conjugate）している．例えば、抗体に結合されたAPの基質として、BCIP (X-リン酸と呼ぶ)（5-Bromo-4-Chloro-3'-Indolylphosphate p-Toluidine salt）およびNBT(nitro-blue tetrazolium chloride)を用いた場合は、酵素がXの結合を切断し、Xが遊離すると発色する（図3）。一方、抗体に蛍光色素が結合している場合には、蛍光顕微鏡や共焦点レーザー走査顕微鏡で検出する。 | 標識プローブのみでは発色することができないので、プローブの中に取り込まれている抗原に対する抗体を用いプローブの検出を行う．プローブをDIGで標識した場合、DIGに特異的に結合する一次抗体を用いて検出する。検出に用いる一次抗体には通常の抗体とは異なり、アルカリフォスファターゼ（alkaline phosphatase: AP）またはホースラディシュペルオキシダーゼ（horseradish peroxidase: HRP）などの酵素が結合（conjugate）している．例えば、抗体に結合されたAPの基質として、BCIP (X-リン酸と呼ぶ)（5-Bromo-4-Chloro-3'-Indolylphosphate p-Toluidine salt）およびNBT(nitro-blue tetrazolium chloride)を用いた場合は、酵素がXの結合を切断し、Xが遊離すると発色する（図3）。一方、抗体に蛍光色素が結合している場合には、蛍光顕微鏡や共焦点レーザー走査顕微鏡で検出する。 | ||
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== ISHデータベース == | == ISHデータベース == | ||
Allen Brain | Allen Brain Atlasは、マイクロソフト社創設者の一人であるPaul G. Allenの出資によって2003年に設立されたAllen Institute for Brain ScienceのISHデータベースである。2006年12月発表のNature の記事によると、まず約2万の遺伝子のマウス成体脳における組織切片ISHのデータが公開された。現在、マウス脳に加えて、ヒト脳、発生期マウス脳、発生期ヒト脳、マウス脳神経回路、ヒト以外の霊長類脳、マウス脊髄、ヒト神経膠芽腫に関するISHデータベースが公開されている。 | ||
== 外部リンク == | |||
*[http://www.brain-map.org/ Allen Brain Atlas] | |||
== 参考文献 == | == 参考文献 == | ||
<references /> | |||
１．野地澄晴編、免疫染色&in situハイブリダイゼーション、羊土社、東京、2006. | １．野地澄晴編、免疫染色&in situハイブリダイゼーション、羊土社、東京、2006. | ||