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「In situハイブリダイゼーション法」の版間の差分
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→酵素抗体法と蛍光抗体法
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[[image:In situハイブリダイゼーション法3.png|thumb| | [[image:In situハイブリダイゼーション法3.png|thumb|500px|'''図3．アルカリフォスファッターゼによる発色反応'''<br>BCIPがAPにより加水分解されてまず中間産物となり、さらに2量体になって青色色素を産生する。2量体化するときに、2個の水素イオンによりNBTは還元されて不溶性のNBTホルマザンを形成する。(tautomerism:ケト・エノール互変異性)<br>一方、Fast Red TRは、ナフトールAS-MXリン酸の存在下でAPにより赤色の沈殿物を生じる。Fast Red TRを蛍光性のAP基質であるHNPP (2-hydroxy-3-naphtoic acid-2’-phenylanilide phosphate)と共に用いると、還元されてできるHNPの組織への沈着が増し、HNPの蛍光がさらに長波長側シフトして (565~620nm) 強い橙蛍光を発する。[http://www.piercenet.com/browse.cfm?fldID=5A423056-5056-8A76-4E25-1E5F9C0596B2 発色反応、発色基質全般についての説明。]]] | ||
標識プローブのみでは発色することができないので、プローブの中に取り込まれている抗原に対する抗体を用いプローブの検出を行う．プローブをDIGで標識した場合、DIGに特異的に結合する一次抗体を用いて検出する。検出に用いる一次抗体には通常の抗体とは異なり、[[wikipedia:ja:アルカリホスファターゼ|アルカリホスファターゼ]]（alkaline phosphatase: AP）または[[wikipedia:Horseradish_peroxidase|西洋ワサビペルオキシダーゼ]]（horseradish peroxidase: HRP）などの酵素が結合（conjugate）している．例えば、抗体に結合されたAPの基質として、5-Bromo-4-Chloro-3'-Indolylphosphate p-Toluidine salt (BCIP）およびnitro-blue tetrazolium chloride (NBT)を用いた場合は、APがBCIPを脱リン酸化し、中間産物が遊離すると発色する（図3）。一方、抗体に蛍光色素が結合している場合には、[[wikipedia:ja:蛍光顕微鏡|蛍光顕微鏡]]や[[共焦点レーザー走査顕微鏡]]で検出する。 | 標識プローブのみでは発色することができないので、プローブの中に取り込まれている抗原に対する抗体を用いプローブの検出を行う．プローブをDIGで標識した場合、DIGに特異的に結合する一次抗体を用いて検出する。検出に用いる一次抗体には通常の抗体とは異なり、[[wikipedia:ja:アルカリホスファターゼ|アルカリホスファターゼ]]（alkaline phosphatase: AP）または[[wikipedia:Horseradish_peroxidase|西洋ワサビペルオキシダーゼ]]（horseradish peroxidase: HRP）などの酵素が結合（conjugate）している．例えば、抗体に結合されたAPの基質として、5-Bromo-4-Chloro-3'-Indolylphosphate p-Toluidine salt (BCIP）およびnitro-blue tetrazolium chloride (NBT)を用いた場合は、APがBCIPを脱リン酸化し、中間産物が遊離すると発色する（図3）。一方、抗体に蛍光色素が結合している場合には、[[wikipedia:ja:蛍光顕微鏡|蛍光顕微鏡]]や[[共焦点レーザー走査顕微鏡]]で検出する。 | ||