16,040
回編集
「ディファレンシャルディスプレイ」の版間の差分
細
→方法と手順
細編集の要約なし |
細 (→方法と手順) |
||
| 23行目: | 23行目: | ||
#アンカープライマーによるmRNAの選択的逆転写（第1鎖合成） | #アンカープライマーによるmRNAの選択的逆転写（第1鎖合成） | ||
#:比較したい２種類（またはそれ以上）の細胞からそれぞれ抽出したmRNAを、ポリ(A)鎖と結合するアンカープライマーと逆転写酵素を用いた逆転写反応によってcDNAに変換する。アンカープライマーとしはT（チミジン）12個からなる[[wikipedia:ja:オリゴヌクレオチド|オリゴヌクレオチド]]の3’端に、A,G,Cのうちの1種のヌクレオチド1個を付加したものを用いる（T<sub>12</sub>N, N=A, G, or | #:比較したい２種類（またはそれ以上）の細胞からそれぞれ抽出したmRNAを、ポリ(A)鎖と結合するアンカープライマーと逆転写酵素を用いた逆転写反応によってcDNAに変換する。アンカープライマーとしはT（チミジン）12個からなる[[wikipedia:ja:オリゴヌクレオチド|オリゴヌクレオチド]]の3’端に、A,G,Cのうちの1種のヌクレオチド1個を付加したものを用いる（T<sub>12</sub>N, N=A, G, or C）。時にT<sub>11</sub>MN（但し、M=A, G, Cの混合、N=A, G, CまたはT）を用いることもある。 | ||
#任意プライマーによるcDNAの選択的第2鎖合成とPCRによる増幅 | #任意プライマーによるcDNAの選択的第2鎖合成とPCRによる増幅 | ||
#:次に、合成されたcDNAを鋳型に、アンカープライマーと任意の混成塩基配列を持つ（通常10merの）オリゴヌクレオチド群をプライマーとしてPCRを行う。これによって任意の共通塩基配列をもつ複数のcDNA断片を、同時にPCR増幅する。この結果、両端をアンカープライマーと任意プライマーの配列で置換された分子が生じる。 | #:次に、合成されたcDNAを鋳型に、アンカープライマーと任意の混成塩基配列を持つ（通常10merの）オリゴヌクレオチド群をプライマーとしてPCRを行う。これによって任意の共通塩基配列をもつ複数のcDNA断片を、同時にPCR増幅する。この結果、両端をアンカープライマーと任意プライマーの配列で置換された分子が生じる。 | ||
#電気泳動（もしくは蛍光イメージアナライザー等）による発現の分類 | #電気泳動（もしくは蛍光イメージアナライザー等）による発現の分類 | ||
#:反応生成物をポリアクリルアミド電気泳動で展開すると、複数のcDNA断片からなるフィンガープリントが得られる。この中から、強度に変化のある、または特異的な泳動パターンを示すバンドの切り出しを行う。 | #:反応生成物をポリアクリルアミド電気泳動で展開すると、複数のcDNA断片からなるフィンガープリントが得られる。この中から、強度に変化のある、または特異的な泳動パターンを示すバンドの切り出しを行う。 | ||
#バンドの再増幅およびクローン化 | #バンドの再増幅およびクローン化 | ||