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ノザンブロットとは、分子生物学研究においてRNAの量やサイズを検出する手法である。ノザンブロッティングともいう。類似した手法として、[[DNA]]を検出する[[サザンブロット]]、タンパク質を検出するウエスタンブロットがある。 | |||
ノザンブロットを行うには、まず細胞、組織から[[wj:リボ核酸|total RNA]]を抽出する必要がある<ref>'''Alberts, B., Johnson, A., Lewis, J. Raff, M., Roberts, K., Walter, P.''' <br>Molecular Biology of the Cell, 5th ed. <br>Garland Science, Taylor & Francis Group, NY, pp 538–539, 2008</ref><ref><pubmed > 9299493 </pubmed></ref><ref>'''Trayhurn, P.'''<br>Northern Blotting.<br>''Pro. Nutrition Soc''. 1996, 55:583–589</ref>。[[wj:oligo (dT)カラム|oligo (dT)カラム]]等を用いてtotal RNAの中からpoly(A)tailを持った[[wj:伝令RNA|mRNA]]を精製してもよい<ref><pubmed> 8245974 </pubmed></ref><ref><pubmed> 1709098 </pubmed></ref>。抽出したRNAは、[[wj:アガロースゲル電気泳動|アガロースゲル]]を用いた電気泳動でRNAサイズ依存的に分離する。次に、ゲル上に展開したRNAを拡散もしくは吸引によってメンブレンへ転写（ブロット）する。RNAを含む[[核酸]]は負の電荷を持つため、ここで用いるメンブレンには正電荷を持つナイロンメンブレンやニトロセルロースメンブレンを用いる。次に、検出したいRNA配列に相補的な核酸（DNA, RNA, オリゴヌクレオチド）を標識しプローブとして用いる（核酸プローブ）。標識には放射性同位体<sup>32</sup>Pを用いることが多いが、最近は[[wj:ジゴキシゲニン|ジゴキシゲニン]] (DIG)や[[wj:ビオチン|ビオチン]]を用いた標識法 (non-RI法)も利用されている。核酸プローブをメンブレン上に転写されたRNAにハイブリダイズさせることで、目的のRNAの量、およびサイズを検出する。核酸プローブの標識に放射性同位体<sup>32</sup>Pを用いた場合はX線フィルムで、ジゴキシゲニンやビオチンを用いた場合は[[wj:抗体|抗体]]を用いてメンブレンにハイブリダイズした核酸プローブの量と位置を検出する。 | |||
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2015年5月8日 (金) 08:56時点における版
東京大学大学院薬学系研究科 遺伝学教室 千原崇裕、三浦 正幸
英語名：northern blot, northern blotting
ノザンブロットとは、分子生物学研究においてRNAの量やサイズを検出する手法である。
ノザンブロットとは、分子生物学研究においてRNAの量やサイズを検出する手法である。ノザンブロッティングともいう。類似した手法として、DNAを検出するサザンブロット、タンパク質を検出するウエスタンブロットがある。
ノザンブロットを行うには、まず細胞、組織からtotal RNAを抽出する必要がある[1][2][3]。oligo (dT)カラム等を用いてtotal RNAの中からpoly(A)tailを持ったmRNAを精製してもよい[4][5]。抽出したRNAは、アガロースゲルを用いた電気泳動でRNAサイズ依存的に分離する。次に、ゲル上に展開したRNAを拡散もしくは吸引によってメンブレンへ転写（ブロット）する。RNAを含む核酸は負の電荷を持つため、ここで用いるメンブレンには正電荷を持つナイロンメンブレンやニトロセルロースメンブレンを用いる。次に、検出したいRNA配列に相補的な核酸（DNA, RNA, オリゴヌクレオチド）を標識しプローブとして用いる（核酸プローブ）。標識には放射性同位体32Pを用いることが多いが、最近はジゴキシゲニン (DIG)やビオチンを用いた標識法 (non-RI法)も利用されている。核酸プローブをメンブレン上に転写されたRNAにハイブリダイズさせることで、目的のRNAの量、およびサイズを検出する。核酸プローブの標識に放射性同位体32Pを用いた場合はX線フィルムで、ジゴキシゲニンやビオチンを用いた場合は抗体を用いてメンブレンにハイブリダイズした核酸プローブの量と位置を検出する。
参考文献
- ↑ Alberts, B., Johnson, A., Lewis, J. Raff, M., Roberts, K., Walter, P.
Molecular Biology of the Cell, 5th ed.
Garland Science, Taylor & Francis Group, NY, pp 538–539, 2008 - ↑
Kevil, C.G., Walsh, L., Laroux, F.S., Kalogeris, T., Grisham, M.B., & Alexander, J.S. (1997).
An improved, rapid Northern protocol. Biochemical and biophysical research communications, 238(2), 277-9. [PubMed:9299493] [WorldCat] [DOI] - ↑ Trayhurn, P.
Northern Blotting.
Pro. Nutrition Soc. 1996, 55:583–589 - ↑
Durand, G.M., & Zukin, R.S. (1993).
Developmental regulation of mRNAs encoding rat brain kainate/AMPA receptors: a northern analysis study. Journal of neurochemistry, 61(6), 2239-46. [PubMed:8245974] [WorldCat] [DOI] - ↑
Mori, H., Takeda-Yoshikawa, Y., Hara-Nishimura, I., & Nishimura, M. (1991).
Pumpkin malate synthase. Cloning and sequencing of the cDNA and northern blot analysis. European journal of biochemistry, 197(2), 331-6. [PubMed:1709098] [WorldCat] [DOI]