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「超解像蛍光顕微鏡」の版間の差分
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====STED==== | ====STED==== | ||
===Localization Microscopy=== | ===Localization Microscopy=== | ||
[[Image:PALM図8.png|600px|thumb|'''図１ PALMの原理'''<br> | ====PALM==== | ||
②蛍光一分子画像の取得。主に全反射顕微鏡によって行うが共焦点顕微鏡の利用も可能である。得られる輝点は前述のとおり2次元のPSFに従った広がりを持っている。撮影後は視野内のオン状態のPSFPを全て退色させる（あるいは退色するまで撮影を続ける）。 | 光学顕微鏡の空間分解能は先述のとおり、2つの点光源を異なる点として区別する「2点分解能」で表現され、可視光では200-300 nm程度である。しかしながら、隣り合った2点が重ならないほど離れていれば、蛍光一分子のPSFを2次元のガウス関数でフィッティングする事で、条件によっては~1.5 nmの精度で位置を決定できる。この蛍光一分子の正確な位置解析は（FIONA；fluorescence imaging with one-nanometer accuracy）として知られる<ref><pubmed> 12791999 </pubmed></ref>。超解像顕微鏡法の一つであるLocalization microscopy（蛍光一分子局在化顕微鏡法）は、FIONAを利用し光学顕微鏡の分解能を超えた画像を取得する方法である。このアイディアは古くからあったが、実現はされなかった。例えばGFPを発現した細胞にFIONAをそのまま適用する事は以下の点で困難なためである。<br> | ||
③座標推定による分子の局在画像の構築。これは②の蛍光一分子画像をガウス関数でフィッティングして、蛍光分子の「座標」を推定する事である（注釈で式？）。さらに、推定座標の「不確かさ」も求められる（注釈で式？）。座標推定から構築した図-③で示されている点は図-②での相当する点に比べて小さくなるが、この点の輝度も2次元のガウス関数として表現される。ガウス関数の中心が上記のフィッティングにより推定された「座標」、標準偏差が「不確かさ」に相当する。また、一分子当たりの輝度の合計が等しくなるように規格化される。つまり、精度が高く推定された点は小さく明るい点、精度が低く推定された点は大きく広がった暗い点として局在画像では表現される事になる。 | １）発現しているGFPの数が多く、隣り合ったGFPのPSFが重なりあってしまう。<br> | ||
④上記①～③操作を全てのPSFPがなくなるまで繰り返した後に、③で得られた画像を全て足し合わせる事で、PALM画像を得る事ができる。 | ２）GFPを重なりが無い程度に発現させるのは非常に困難である。<br> | ||
３）仮に２）ができたとしても、細胞内に数個のGFPの位置を検出したところで分子の局在を知るには情報に乏しい。<br> | |||
蛍光一分子局在化法では、蛍光色素の蛍光能や蛍光色が切り替わる性質を利用してこれらの問題を巧妙に回避した。具体例として蛍光一分子局在化法の一つであるPALM(photoactivated localization microscopy)<ref><pubmed> 16902090 </pubmed></ref>の原理を図解した。PALMでは蛍光色素として、特定波長の刺激光照射により無蛍光から蛍光状態へと変化するPA-GFPや、蛍光色が緑色から赤色に変化するmEOSといった「光スイッチング蛍光タンパク質(Photo-Switchable Fluorescent Protein; PSFP)」を利用する。光スイッチングにより蛍光性が切り替わる確率は刺激光の強度と照射時間におおよそ比例するので、それらをコントロールすることで、PSFが重ならない程度にPSFPをスイッチングさせる事が可能になる(図-①)。この状態でFIONAを適用し、各一分子の位置解析を行う(図-②,③)。視野内のPSFPを退色させた後に、同じ事をPSFPが全てなくなるまで何度も繰り返す。これにより発現させた蛍光分子全ての詳細な局在画像（PALM画像）を得る事ができる。<br> | |||
[[Image:PALM図8.png|600px|thumb|'''図１ PALMの原理'''<br>①視野内の疎らなPSFPのオン。オン状態のPSFPの位置をグレーの◯で示した。<br> | |||
②蛍光一分子画像の取得。主に全反射顕微鏡によって行うが共焦点顕微鏡の利用も可能である。得られる輝点は前述のとおり2次元のPSFに従った広がりを持っている。撮影後は視野内のオン状態のPSFPを全て退色させる（あるいは退色するまで撮影を続ける）。<br> | |||
③座標推定による分子の局在画像の構築。これは②の蛍光一分子画像をガウス関数でフィッティングして、蛍光分子の「座標」を推定する事である（注釈で式？）。さらに、推定座標の「不確かさ」も求められる（注釈で式？）。座標推定から構築した図-③で示されている点は図-②での相当する点に比べて小さくなるが、この点の輝度も2次元のガウス関数として表現される。ガウス関数の中心が上記のフィッティングにより推定された「座標」、標準偏差が「不確かさ」に相当する。また、一分子当たりの輝度の合計が等しくなるように規格化される。つまり、精度が高く推定された点は小さく明るい点、精度が低く推定された点は大きく広がった暗い点として局在画像では表現される事になる。<br> | |||
④上記①～③操作を全てのPSFPがなくなるまで繰り返した後に、③で得られた画像を全て足し合わせる事で、PALM画像を得る事ができる。<br> | |||
PALM画像の輝度は蛍光分子がその位置で見つかる可能性に比例する。図では比較のために②で得られた画像の総和も示した。これは通常の顕微鏡観察画像に相当する。この例では②の総和では見られなかった「P A L M」の4文字が③の総和では確認できる。]] | |||
==注釈== | ==注釈== | ||