IPS細胞

英語名：induced pluripotent stem cells、英語略名：iPS cells, iPSCs、日本語名：人工多能性幹細胞

　iPS細胞（人工多能性幹細胞）とは、本来、分化多能性を喪失している体細胞に特定の遺伝子を導入することによって、人為的に誘導される多能性幹細胞株の総称である。胚盤胞と呼ばれる初期胚の内部細胞塊から樹立されたES細胞（胚性幹細胞）と類似の特徴を示し、分化多能性（pluripotency）の定義である三胚葉（外胚葉、中胚葉、内胚葉）や生殖細胞への分化能を保持したまま、培養下で半永久的に自己複製（self-renewal）する。2006年に京都大学の高橋和利博士と山中伸弥博士によって最初の報告がなされて以降、様々な動物種、細胞種を起源とするiPS細胞が樹立されている。ヒトにおいても個々人の生検試料からiPS細胞を作成することが可能であることから、疾患特異的iPS細胞を利用した病態解明や薬剤スクリーニングのほか、免疫拒絶を回避した再生医療への応用が期待されている。

iPS細胞樹立の経緯

体細胞を初期化する因子の存在

　iPS細胞樹立の以前から、卵子やES細胞には体細胞を初期化（リプログラミング）する因子が含まれていることが知られていた。まず、体細胞核移植（somatic cell nuclear transfer, SCNT）の研究において、卵子の細胞質内部に体細胞を移植することによりクローン動物やクローンES細胞の作成が可能であることが示された。有名な例としては、Ian Wilmut博士らによるクローン羊のドリーや若山照彦博士(当時、ハワイ大学)らによるクローンマウスのキュムリーナが挙げられる。一方、京都大学の多田高博士らは、ES細胞と体細胞を電気刺激により細胞融合させる一連の研究により、融合細胞はES細胞と同様の細胞特性を示すこと、体細胞側のゲノムDNAがES細胞様のエピジェネティック状態に転換されることが明らかとなった。とりわけ、ES細胞は培養下で容易かつ半永久的に増幅可能であることから、これらの発見はその後の初期化因子の探索において非常に大きな僥倖となった。

初期化因子の探索

　上述の背景のもと、山中伸弥博士（当時、奈良先端科学技術大学院大学）はES細胞の分化多能性維持機構の解明を第一の目的とし、ES細胞で特異的に発現する遺伝子群の同定を行った。公共のデータベースを利用したin silicoのスクリーニングによってES細胞特異的な遺伝子群が同定され、ECAT(ES cell associated transcript)と命名された。ECATの中にはEsg1/ECAT2/Dppa5やOct4等の既知のES細胞マーカー遺伝子のほか、ECAT1やTdrd12/ECAT8等の新規遺伝子も含まれていた。「ES細胞で特異的に発現している遺伝子≒ES細胞において機能的に重要な遺伝子」との仮説から各ECATのノックアウトや強制発現実験が試みられ、ホメオボックス転写因子であるNanog/ECAT4は多能性ネットワークの構築と維持における中心であること、恒常活性化型Rasタンパク質であるERas/ECAT5は増殖と造腫瘍性を担うこと等が示された。 また、iPS細胞を選択するために最初に利用されたFbx15/ECAT3も、このスクリーニングによって同定された遺伝子の一つである。 

iPS細胞樹立の成功

　続いて、山中博士らは「ES細胞において機能的に重要な遺伝子≒体細胞の初期化を誘導する遺伝子」という仮説に基づき、ECATおよびES細胞の自己複製を支持する遺伝子（STAT3やβ-catenin等）を体細胞であるマウス胎仔繊維芽細胞（MEF）に導入する実験を試みた。初期化因子候補としては計24の遺伝子が絞り込まれ、上述のFbx15遺伝子座にネオマイシン耐性遺伝子が挿入されたノックインマウスの細胞が利用された。このマウスの体細胞はECATであるFbx15を発現していないため、G418（ネオマイシン耐性遺伝子によって不活性化される抗生物質）を添加すると細胞は死滅する。一方、ES細胞等の多能性幹細胞では、Fbx15の発現と一致してネオマイシン耐性遺伝子を発現することからG418に対して耐性となる。このシステムを用いて各候補遺伝子が1種類ずつ導入されたが、この場合にはG418耐性のES細胞様コロニーは観察されなかった。ところが、24種類全ての候補遺伝子を同時に導入した場合、ES細胞に類似したG418耐性細胞コロニーが出現することが明らかとなった。その後、24遺伝子から1遺伝子を差し引いた23遺伝子を導入する実験により、最終的にES細胞様コロニーの誘導には4種類の遺伝子（Oct4、Sox2、Klf4、c-Myc）の組合せで十分であることが判明した。得られた細胞はES細胞マーカー遺伝子を発現しているほか、胚葉体形成培養や皮下移植によるテラトーマ形成実験により三胚葉に分化する能力を有することが確認され、iPS細胞と名付けられた。また、iPS細胞を誘導する遺伝子セットは通称「山中4因子」とも呼ばれる。

初期化レベルにみられる多様性とその向上

　iPS細胞の誘導法の発見に付随して、体細胞の初期化レベルには多様性があることが明らかとなった。まず、山中4因子が同定される過程において、Sox2を除いた3遺伝子（Oct4、Klf4、c-Myc）の導入によってもG418耐性コロニーが得られていた。しかし、この細胞はES細胞マーカー遺伝子を一部しか発現しておらず、また造腫瘍性は有するものの分化能は獲得していなかった。一方、Fbx15の発現に基づいて誘導されたiPS細胞は確かに分化多能性を獲得してはいるが、キメラマウスは胎性致死であり、遺伝子発現においてもECAT1の発現が認められない等とES細胞とは明らかに異なっていた。しかし、iPS細胞選択の指標をFbx15からNanogやOct4の発現に変更することによって、キメラマウスの出生および生殖系列に寄与するiPS細胞が樹立できるようになった。Fbx15の発現に基づく初期化レベルの低いiPS細胞は「第一世代」、Oct4やNanogの発現に基づく初期化レベルの高いiPS細胞は「第二世代」と呼ばれる。

iPS細胞の特徴

iPS細胞の細胞特性

　iPS細胞の一般的な細胞特性として、ES細胞を規定する特性である自己複製能、分化多能性、造腫瘍性、活発な増殖能を備えている。後述の通り、培養下においてiPS細胞を様々な細胞系譜へと分化誘導することも可能である。多能性幹細胞が有する分化多能性を表す一つの基準として、ナイーブ状態（naive state）とプライムド状態（primed state）の区分がある。ナイーブ状態は胚盤胞の内部細胞塊の起源をより強く反映していると考えられ、マウスやラットのES細胞はこちらに分類される。形態的にはドーム状のコロニーを形成し、LIFとBMP4依存的に自己複製する。ナイーブ状態の中でも、非常に高いキメラ形成能および生殖系列への寄与を示す細胞はグラウンドステート（ground state）にあるとも表現される。一方、プライムド状態は胚盤胞より発生が進んだエピブラストの起源に相当すると考えられ、ウサギや霊長類のES細胞が含まれる。 自己複製にはFGF2とActivin Aを必要とし、扁平なコロニーを形成して増殖する。iPS細胞の多能性状態（ナイーブまたはプライムド）は基本的に同種のES細胞と相同であるが、これは種の相違によって規定されているものではなく、各々の細胞株として反映する発生段階の差に起因すると考えられる。

iPS細胞の利点

　iPS細胞に先んじてSCNTやES細胞培養が確立されていたにも関わらずヒトiPS細胞の作成が求められた背景には、ヒト初期胚の研究利用をとりまく様々な課題や制限の存在があった。まず、ヒトES細胞の樹立には「生命の萌芽」と位置付けられるヒト受精卵の破壊が伴うことから、倫理的な問題となっていた。また、細胞移植治療への応用を鑑みた際、ES細胞はレシピエントとは他人の細胞であることから、そのままでは免疫拒絶反応が惹起されてしまう。一方、SCNT研究の場面においては、ヒト卵の入手と使用に関わる数的・倫理的制限に加えて胚操作上の技術的困難が挙げられた。これに対し、iPS細胞は初期胚ではなく体細胞起源であることから、ヒト胚の利用に関する倫理的問題の範疇には当てはまらず、細胞ソースの調達における数的制限もない。また、技術的にも非常に容易である。さらに、ES細胞が未だ樹立されていない動物種のiPS細胞も樹立可能であることから、母体への侵襲や胚操作の実施が難しい動物種からでも多能性幹細胞が得られる利点も大きい。基礎生物学的な観点からみると、特定の起源細胞と初期化因子を出発点に研究を開始することができることから、iPS細胞誘導は体細胞初期化の分子機構を解明するためのシステムとして簡便かつ強力な実験系であるといえる。

iPS細胞の樹立方法

 動物種

　マウスにおけるiPS細胞の樹立が報告された翌年、ヒトiPS細胞の樹立が報告された。その後、ラット、ウサギ、ブタ、ウマ、ウシ、ヒツジ、イヌのほか、非ヒト霊長類であるマーモセット、アカゲザル、カニクイザルにおいてもiPS細胞が樹立されている。また、絶滅危惧種であるシロサイやマンドリルのiPS細胞樹立の報告もあり、希少な遺伝子資源の保存といった観点からも注目されている。

細胞種

　最初のマウスiPS細胞の樹立には胎仔の繊維芽細胞および成体の尾繊維芽細胞が、最初のヒトiPS細胞の樹立には胎児、新生児、成人の繊維芽細胞が用いられた。その後、胃上皮細胞、肝実質細胞、ケラチノサイト、毛乳頭細胞、色素細胞、血管内皮細胞、血液細胞、羊膜細胞、神経幹細胞、歯髄幹細胞、脂肪幹細胞、間葉系幹細胞等からの樹立が相次いで報告されている。

遺伝子導入方法

　当初、遺伝子導入のベクターとしてはレトロウイルスやレンチウイルスが利用された。しかし、どちらのウイルスも導入細胞のゲノムDNAに組み込まれることから、挿入変異や近傍の遺伝子の発現に及ぼす影響といった予期しない異常が生じる危険性を包含している。また、レトロウイルスベクターは多能性幹細胞において強力なサイレンシングを受けるが、初期化レベルが低いiPS細胞では発現が持続していることや、分化後においても導入遺伝子の活性化が起こりうることから、腫瘍形成等のリスクが伴う。そこで、iPS細胞樹立後に導入遺伝子を除去する手法として、Cre-loxPシステムの利用やトランスポゾンの特性を利用したピギーバック（piggyBac）が開発された。一方、はじめからゲノムに組み込まれないベクターとして、アデノウイルスやセンダイウイルス、プラスミドDNAを用いた誘導法も利用されている。さらに、ベクターを介さずに直接、組換えタンパク質や合成RNA、miRNAを導入してiPS細胞を作成する方法についても報告がなされている。

iPS細胞を誘導する因子

　前述の通り、最初のiPS細胞はOct4、Sox2、Klf4、c-Mycの4種類の遺伝子（山中4因子）を導入することによって作成されたが、間もなく、誘導効率は低下するもののc-Mycを除いたOct4、Sox2、Klf4のみ（山中3因子）によってもiPS細胞が樹立可能であることが示された。ヒトの場合もマウスと同じ遺伝子セットでiPS細胞の誘導が可能であるが、山中博士らとほぼ同時にヒトiPS細胞について報告したJames Thomson博士らはOCT4、SOX2、NANOG、LIN28の組合せを用いている。最も広範に用いられている遺伝子セットはプロトタイプである山中4因子であるが、神経幹細胞の場合はOct4単独の導入によってiPS細胞が誘導しうるように、細胞種によっては少ない因子・異なる組合せでのiPS細胞誘導も可能である。iPS細胞の誘導効率や初期化レベルを向上させる要素として、Esrrb、Nr5a2、Tbx3、L-Myc、Glis1等の因子やmiRNA-290クラスターの導入、Ink4/Arf、p53、p21、Baxの抑制が報告されている。一方、遺伝子導入ではなく低分子化合物を併用したiPS細胞誘導についても多数の報告がある。ES細胞の自己複製を亢進・維持する低分子化合物としてFGF受容体阻害剤（SU5402）、MEK阻害剤（PD1843352またはPD0325901）、GSK3阻害剤（CHIR99021）が知られており、3種の混合は「3i」、後者2種の混合は「2i」と俗称される。これらの阻害剤やTGFβ受容体阻害剤（SB431542）の添加によって。また、エピジェネティック変化を促すものとして、ヒストン脱アセチル化酵素阻害剤（バルプロ酸や酪酸）、G9a阻害剤（BIX01294）、DNAメチル化阻害剤（5-アザシチジンやRG108）等の効果についても。

iPS細胞から特定の細胞系譜への分化誘導

　中島君よろしく！

医療応用の可能性

iPS細胞の安全性

　ヒトにおけるiPS細胞の移植医療への応用を目指すに際し、安全性の評価と確保は急務である。実際、iPS細胞には様々な。がん遺伝子であるc-Mycを導入したiPS細胞は、キメラマウスおよびその子孫において高頻度にがんを誘発した。また、原因は不明であるが、成体の肝実質細胞由来のiPS細胞から作出したキメラマウスは周産期の死亡率が高いということも報告されている。慶應義塾大学の三浦恭子博士らは、様々なマウスiPS細胞から分化誘導した神経幹細胞（Neurosphere）を免疫不全マウス成体脳へと移植し、腫瘍形成の有無について検証を行った。その結果、iPS細胞由来の神経幹細胞移植における造腫瘍性は、iPS細胞樹立過程におけるc-Mycの導入や薬剤選択の有無ではなく、iPS細胞の由来と相関（胎仔由来では低頻度、成体由来では高頻度）することを明らかにしている。

細胞移植治療への挑戦

　一方、細胞移植治療に向けたより実践的な基礎研究も活発に進められている。iPS細胞を用いた最初の自家移植治療モデルとして、Rudolf Jaenisch博士らは鎌状赤血球貧血症マウスからiPS細胞を作成して疾患原因遺伝子の修復を施し、そこから分化誘導した造血幹細胞による自家移植治療の実例を示した。慶應義塾大学の岡野栄之博士のグループでは、マウスおよびヒトiPS細胞から分化誘導したNeurosphereを脊髄損傷モデルマウスに移植することで下肢運動機能の改善が認められることを報告している。細胞移植治療が見込まれる。また、最近ではiPS細胞を介さずに任意の細胞種を直接誘導する「ダイレクトリプログラミング」の研究も盛んに進められており、iPS細胞以外の選択肢も並行して開発されることが期待される。

iPS細胞がもたらす新たな課題

　上述の通り、iPS細胞の誕生はES細胞やSCNT技術が抱える様々な倫理的および技術的課題を回避する新たな方法論を提起した。しかし、iPS細胞によって全ての課題が克服されたわけではなく、新たな課題をも生み出している。その一つに、ヒトiPS細胞を用いた生殖細胞への分化誘導が挙げられる。現時点では、培養下で多能性幹細胞から機能的な精子と卵を分化誘導する手法は確立されていない。しかし、将来的にこれが実現した場合、iPS細胞を介して同一人物や同性の精子と卵の受精といったことも可能となる。日本においては「ヒトiPS細胞またはヒト組織幹細胞からの生殖細胞の作成を行う研究に関する指針（2010年に公布・施行）」によって、培養下で誘導した生殖細胞の受精とヒト胚の作製を禁止している。しかし、こうした規制状況は国によって大きく異なる。既成の規制や指針以前に、生殖倫理の観点や法的な議論が必要である。また、iPS細胞は血液や毛根といった僅かな細胞ソースからでも誘導が可能であるから、「ヒト細胞の管理」に対する厳密なシステム整備・意識改革が求められる。

参考文献

同義語：人工多能性幹細胞、iPS細胞

関連用語：ES細胞、胚性幹細胞、分化多能性、ダイレクトリプログラミング

（執筆者：今村公紀、中島龍介、岡野栄之、担当編集委員：岡野栄之）