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細胞膜で受容されたシグナルを核に伝達するのは、Gli（ショウジョウバエではCubitus interruptus; Ci）と呼ばれるZnフィンガー型[[転写因子]]であり、脊椎動物に存在する３種類のGli（Gli1-3）<ref name=ref31><pubmed>21801010</pubmed></ref> のうちShhのシグナルを1次的に伝達するのはGli2,3である。Gli2,3は繊毛内でSmoと何らかの相互作用をすることにより、シグナルを繊毛から核へと伝達する<ref name=ref32><pubmed>16254602</pubmed></ref> 。Gli2/3は転写活性領域と抑制領域を併せ持つ転写因子で、Shhシグナルが存在しないときには翻訳されたポリペプチドが恒常的に分解（ユビキチン化）されてアミノ末端側だけの断片として存在し、転写抑制因子として働く。Gli2/3のユビキチン化は、まず[[PKA]]（[[プロテインキナーゼA]]）と[[Glycogen synthase kinase 3|Glycogen Synthase Kinase 3]]β（[[GSK3β]]）によって[[セリン]]残基がリン酸化され、それを、 βTrCP（E3ユビキチンリガーゼ）と[[足場タンパク質]]Cullin3を含むSCF βTrCP複合体がターゲットすることによって進む<ref><pubmed>16705181</pubmed></ref><ref name=ref34><pubmed>16611981</pubmed></ref><ref><pubmed>16651270</pubmed></ref> 。 | 細胞膜で受容されたシグナルを核に伝達するのは、Gli（ショウジョウバエではCubitus interruptus; Ci）と呼ばれるZnフィンガー型[[転写因子]]であり、脊椎動物に存在する３種類のGli（Gli1-3）<ref name=ref31><pubmed>21801010</pubmed></ref> のうちShhのシグナルを1次的に伝達するのはGli2,3である。Gli2,3は繊毛内でSmoと何らかの相互作用をすることにより、シグナルを繊毛から核へと伝達する<ref name=ref32><pubmed>16254602</pubmed></ref> 。Gli2/3は転写活性領域と抑制領域を併せ持つ転写因子で、Shhシグナルが存在しないときには翻訳されたポリペプチドが恒常的に分解（ユビキチン化）されてアミノ末端側だけの断片として存在し、転写抑制因子として働く。Gli2/3のユビキチン化は、まず[[PKA]]（[[プロテインキナーゼA]]）と[[Glycogen synthase kinase 3|Glycogen Synthase Kinase 3]]β（[[GSK3β]]）によって[[セリン]]残基がリン酸化され、それを、 βTrCP（E3ユビキチンリガーゼ）と[[足場タンパク質]]Cullin3を含むSCF βTrCP複合体がターゲットすることによって進む<ref><pubmed>16705181</pubmed></ref><ref name=ref34><pubmed>16611981</pubmed></ref><ref><pubmed>16651270</pubmed></ref> 。 | ||
いったんShhシグナルが細胞に導入されるとPKAが不活化され<ref><pubmed>24336288</pubmed></ref><ref name=ref37><pubmed>27799542</pubmed></ref> 、Gli2/3のユビキチン分解が抑制されて全長型Gli2/3は繊毛内に移動する<ref name=ref32><pubmed>16254602</pubmed></ref><ref><pubmed>20154143</pubmed></ref> 。その後、核に移動して遺伝子発現を誘導する<ref name=ref39><pubmed>23799571</pubmed></ref> 。この際にはGli2/3に対してSPOPと呼ばれるユビキチンリガーゼによるユビキチン化が起こってタンパク質自体の安定性が変化する<ref name=ref40><pubmed>20360384</pubmed></ref><ref><pubmed>20463034</pubmed></ref> ほか、さまざまな修飾（リン酸化、[[アセチル化]]、SUMO化）も関与してその転写活性を制御する<ref name=ref40><pubmed>20360384</pubmed></ref><ref><pubmed>20711444</pubmed></ref><ref><pubmed>23762415</pubmed></ref><ref><pubmed>24373970</pubmed></ref> 。Gliタンパク質の[[DNA]]結合配列にはGACCACCCAという配列が提唱されてきた<ref><pubmed>9118802</pubmed></ref> が、最近、解離定数（結合のアフィニティー）が異なる別の配列も見つかっている<ref><pubmed>23153497</pubmed></ref> 。 | いったんShhシグナルが細胞に導入されるとPKAが不活化され<ref name=ref36><pubmed>24336288</pubmed></ref><ref name=ref37><pubmed>27799542</pubmed></ref> 、Gli2/3のユビキチン分解が抑制されて全長型Gli2/3は繊毛内に移動する<ref name=ref32><pubmed>16254602</pubmed></ref><ref><pubmed>20154143</pubmed></ref> 。その後、核に移動して遺伝子発現を誘導する<ref name=ref39><pubmed>23799571</pubmed></ref> 。この際にはGli2/3に対してSPOPと呼ばれるユビキチンリガーゼによるユビキチン化が起こってタンパク質自体の安定性が変化する<ref name=ref40><pubmed>20360384</pubmed></ref><ref><pubmed>20463034</pubmed></ref> ほか、さまざまな修飾（リン酸化、[[アセチル化]]、SUMO化）も関与してその転写活性を制御する<ref name=ref40><pubmed>20360384</pubmed></ref><ref><pubmed>20711444</pubmed></ref><ref><pubmed>23762415</pubmed></ref><ref><pubmed>24373970</pubmed></ref> 。Gliタンパク質の[[DNA]]結合配列にはGACCACCCAという配列が提唱されてきた<ref name=ref45><pubmed>9118802</pubmed></ref> が、最近、解離定数（結合のアフィニティー）が異なる別の配列も見つかっている<ref><pubmed>23153497</pubmed></ref> 。 | ||
Gli1-3は多くの臓器に発現しているためにそれらの遺伝子変異マウスの表現型も多様であり<ref><pubmed>9731531</pubmed></ref> 、神経系で強い表現型が現れるものもある。Gli2変異マウスでは、Shhシグナルの影響を受ける[[底板]]とV3[[介在神経]]領域の[[分化]]が抑制され、パターン形成に異常が生じて出生直後に死亡する<ref><pubmed>9636069</pubmed></ref> 。一方、Gli3変異マウスでは、主に脳領域でShhシグナルがむしろ亢進した表現型になるため<ref><pubmed>8387379</pubmed></ref><ref><pubmed>11017169</pubmed></ref> 、Gli3が主に転写抑制型として働くことが示唆される。Gli1単独の変異マウスでは神経系では大きな表現型が見つかっていないが、Gli2変異による表現型をGli1のノックインによって相補することができるため、Gli2の転写活性型と同様の働きをしていると考えられる<ref><pubmed>10725236</pubmed></ref><ref><pubmed>11748151</pubmed></ref> 。 | Gli1-3は多くの臓器に発現しているためにそれらの遺伝子変異マウスの表現型も多様であり<ref><pubmed>9731531</pubmed></ref> 、神経系で強い表現型が現れるものもある。Gli2変異マウスでは、Shhシグナルの影響を受ける[[底板]]とV3[[介在神経]]領域の[[分化]]が抑制され、パターン形成に異常が生じて出生直後に死亡する<ref><pubmed>9636069</pubmed></ref> 。一方、Gli3変異マウスでは、主に脳領域でShhシグナルがむしろ亢進した表現型になるため<ref><pubmed>8387379</pubmed></ref><ref><pubmed>11017169</pubmed></ref> 、Gli3が主に転写抑制型として働くことが示唆される。Gli1単独の変異マウスでは神経系では大きな表現型が見つかっていないが、Gli2変異による表現型をGli1のノックインによって相補することができるため、Gli2の転写活性型と同様の働きをしていると考えられる<ref><pubmed>10725236</pubmed></ref><ref><pubmed>11748151</pubmed></ref> 。 | ||
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先に述べたようにShhシグナルには細胞膜上に形成される１次繊毛の存在が必須である。１次繊毛に形成不全が生じるとShhシグナルが細胞に導入されず、結果として[[神経管]]はShh遺伝子変異マウスに類似した表現型になる<ref name=ref39><pubmed>23799571</pubmed></ref> 。また、Gli3の不活性型を生じるプロセシングにはPKAが必要であり、PKA遺伝子のノックアウトはShhシグナルの異常亢進を反映した表現型となる<ref><pubmed>11886853</pubmed></ref> 。 | 先に述べたようにShhシグナルには細胞膜上に形成される１次繊毛の存在が必須である。１次繊毛に形成不全が生じるとShhシグナルが細胞に導入されず、結果として[[神経管]]はShh遺伝子変異マウスに類似した表現型になる<ref name=ref39><pubmed>23799571</pubmed></ref> 。また、Gli3の不活性型を生じるプロセシングにはPKAが必要であり、PKA遺伝子のノックアウトはShhシグナルの異常亢進を反映した表現型となる<ref><pubmed>11886853</pubmed></ref> 。 | ||
Shh-Ptc-Smo-Gliを主軸とするShhシグナルを制御する調節因子の存在も知られている。SuFu（Suppressor of Fused）は[[cAMP]]依存的にGli2/3と結合して、タンパク質の安定化と抑制型を産出する<ref name=ref40><pubmed>20360384</pubmed></ref> 。そのほかにGPR161（Gタンパク質共役受容体）のように繊毛に局在してそのcAMP濃度を上昇させ、Shhシグナルを負に制御する因子の存在も知られている<ref><pubmed>16459298</pubmed></ref><ref><pubmed>20956384</pubmed></ref><ref><pubmed>23332756</pubmed></ref> 。さらに最近、Shhが細胞に到達すると[[カルシウムイオン]]がTRPチャネルを介して繊毛内に流入し、アデニルシクラーゼ（AC5/6）の活性が阻害されることによって繊毛内のcAMP濃度が低下し、結果的にGliが活性化されるという現象が報告された<ref><pubmed>24336288</pubmed></ref><ref name=ref37><pubmed>27799542</pubmed></ref> 。これらをはじめとして、20種類程度のタンパク質がShhシグナルの伝達を正または負に制御している<ref><pubmed>17662951</pubmed></ref> 。調節因子が多数存在する理由としては、Shhの活性が細胞依存的であることや、Shhは[[細胞増殖]]も制御するために細胞ががん化する危険があり、シグナル活性を厳密に制御する必要があることなどが考えられる<ref name=ref39><pubmed>23799571</pubmed></ref> 。 | Shh-Ptc-Smo-Gliを主軸とするShhシグナルを制御する調節因子の存在も知られている。SuFu（Suppressor of Fused）は[[cAMP]]依存的にGli2/3と結合して、タンパク質の安定化と抑制型を産出する<ref name=ref40><pubmed>20360384</pubmed></ref> 。そのほかにGPR161（Gタンパク質共役受容体）のように繊毛に局在してそのcAMP濃度を上昇させ、Shhシグナルを負に制御する因子の存在も知られている<ref><pubmed>16459298</pubmed></ref><ref><pubmed>20956384</pubmed></ref><ref><pubmed>23332756</pubmed></ref> 。さらに最近、Shhが細胞に到達すると[[カルシウムイオン]]がTRPチャネルを介して繊毛内に流入し、アデニルシクラーゼ（AC5/6）の活性が阻害されることによって繊毛内のcAMP濃度が低下し、結果的にGliが活性化されるという現象が報告された<ref name=ref36><pubmed>24336288</pubmed></ref><ref name=ref37><pubmed>27799542</pubmed></ref> 。これらをはじめとして、20種類程度のタンパク質がShhシグナルの伝達を正または負に制御している<ref><pubmed>17662951</pubmed></ref> 。調節因子が多数存在する理由としては、Shhの活性が細胞依存的であることや、Shhは[[細胞増殖]]も制御するために細胞ががん化する危険があり、シグナル活性を厳密に制御する必要があることなどが考えられる<ref name=ref39><pubmed>23799571</pubmed></ref> 。 | ||
=== ほかの経路 === | === ほかの経路 === | ||
Shhは交連神経細胞のガイダンスに必須である<ref><pubmed>15746914</pubmed></ref><ref><pubmed>19447091</pubmed></ref><ref><pubmed>12679031</pubmed></ref> 。Shhは神経のガイダンス因子として知られるNetrinと協調して働き、交連神経が脊髄正中（midline）を交差するのに必要である<ref><pubmed>12679031</pubmed></ref> 。このガイダンスにはPtc/SmoではなくHIP（hedgehog interacting protein）がShhの受容体になっており<ref | Shhは交連神経細胞のガイダンスに必須である<ref name=ref58><pubmed>15746914</pubmed></ref><ref name=ref59><pubmed>19447091</pubmed></ref><ref name=ref60><pubmed>12679031</pubmed></ref>。Shhは神経のガイダンス因子として知られるNetrinと協調して働き、交連神経が脊髄正中（midline）を交差するのに必要である<ref name=ref60><pubmed>12679031</pubmed></ref>。このガイダンスにはPtc/SmoではなくHIP（hedgehog interacting protein）がShhの受容体になっており<ref name=ref58 /> 、さらに細胞内ではSFKというキナーゼが活性化されている<ref name=ref59 /> 。また、繊維芽細胞の化学遊走にもShhが関与しているという報告があり、さらにこの現象においてはSmoが繊毛に局在しなくても細胞内シグナルが惹起されるため、従来とは異なるメカニズムが示唆されている<ref><pubmed>22912493</pubmed></ref> 。 | ||
==神経系での機能== | ==神経系での機能== | ||
| 56行目: | 56行目: | ||
細胞レベルでの解析においてShhシグナルに反応する細胞は少なく、よく使われるのはマウスの繊維芽細胞NIH3T3細胞<ref><pubmed>25833741</pubmed></ref> やヒト角化細胞<ref><pubmed>16880536</pubmed></ref> 、ニワトリやマウスの神経前駆細胞（[[胚性幹細胞]]から分化させたものや胚から単離したもの）である<ref><pubmed>26972603</pubmed></ref><ref><pubmed>25026549</pubmed></ref> 。Shhシグナルを受容する１次繊毛は、[[細胞周期]]のG0/G1期にのみ生じるため、特にNIH3T3でShhシグナルの実験を行う際にはあらかじめ血清飢餓状態にしてG0/G1期の細胞を多数得ることが重要である。細胞において実験的にShhシグナルを活性化する場合、大腸菌で作成した（つまりコレステロール修飾がされていない）リコンビナントタンパク質も活性は持っている<ref><pubmed>26972603</pubmed></ref><ref><pubmed>10564658</pubmed></ref><ref><pubmed>18046410</pubmed></ref> 。化合物としては、purmorphamineとSAGがSmoを標的とし<ref><pubmed>16408082</pubmed></ref> 、Shhのアゴニストとして用いられている。一方、cyclopamineとSANT-1は同じくSmoを標的とし、その活性を阻害することによりShhシグナルの[[アンタゴニスト]]として働くChen, 2002 #47;Dixit, 2013 #49}。 | 細胞レベルでの解析においてShhシグナルに反応する細胞は少なく、よく使われるのはマウスの繊維芽細胞NIH3T3細胞<ref><pubmed>25833741</pubmed></ref> やヒト角化細胞<ref><pubmed>16880536</pubmed></ref> 、ニワトリやマウスの神経前駆細胞（[[胚性幹細胞]]から分化させたものや胚から単離したもの）である<ref><pubmed>26972603</pubmed></ref><ref><pubmed>25026549</pubmed></ref> 。Shhシグナルを受容する１次繊毛は、[[細胞周期]]のG0/G1期にのみ生じるため、特にNIH3T3でShhシグナルの実験を行う際にはあらかじめ血清飢餓状態にしてG0/G1期の細胞を多数得ることが重要である。細胞において実験的にShhシグナルを活性化する場合、大腸菌で作成した（つまりコレステロール修飾がされていない）リコンビナントタンパク質も活性は持っている<ref><pubmed>26972603</pubmed></ref><ref><pubmed>10564658</pubmed></ref><ref><pubmed>18046410</pubmed></ref> 。化合物としては、purmorphamineとSAGがSmoを標的とし<ref><pubmed>16408082</pubmed></ref> 、Shhのアゴニストとして用いられている。一方、cyclopamineとSANT-1は同じくSmoを標的とし、その活性を阻害することによりShhシグナルの[[アンタゴニスト]]として働くChen, 2002 #47;Dixit, 2013 #49}。 | ||
Shhシグナルの強度を計測する方法としては、luciferaseまたはGFPのレポーターコンストラクトが多用され<ref><pubmed>9118802</pubmed></ref><ref><pubmed>22265416</pubmed></ref> 、ほかの方法として、定量PCRを用いてShhシグナルのターゲット遺伝子であるGli1やPtc1の発現量を解析してもよい<ref><pubmed>25833741</pubmed></ref><ref><pubmed>18046410</pubmed></ref> 。NIH3T3では、Shhシグナルの添加時間とともにGli1やPtc1の発現量が増加する<ref><pubmed>25833741</pubmed></ref> 。一方、神経前駆細胞内ではShhシグナルは数時間以内にいったん活性化し、その後、負のフィードバックが起こって鎮静化する<ref><pubmed>18046410</pubmed></ref><ref><pubmed>22265416</pubmed></ref><ref><pubmed>20532235</pubmed></ref> 。この負のフィードバックが起きるメカニズムとしては、Ptcが細胞膜上に多数存在するようになってShhタンパク質が枯渇するというもの<ref><pubmed>18046410</pubmed></ref> や、活性型Gliタンパク質が不活性型に比べて不安定であるというもの<ref name=ref40><pubmed>20360384</pubmed></ref> などがあるが、全容はまだ明らかになっていない。 | Shhシグナルの強度を計測する方法としては、luciferaseまたはGFPのレポーターコンストラクトが多用され<ref name=ref45><pubmed>9118802</pubmed></ref><ref><pubmed>22265416</pubmed></ref> 、ほかの方法として、定量PCRを用いてShhシグナルのターゲット遺伝子であるGli1やPtc1の発現量を解析してもよい<ref><pubmed>25833741</pubmed></ref><ref><pubmed>18046410</pubmed></ref> 。NIH3T3では、Shhシグナルの添加時間とともにGli1やPtc1の発現量が増加する<ref><pubmed>25833741</pubmed></ref> 。一方、神経前駆細胞内ではShhシグナルは数時間以内にいったん活性化し、その後、負のフィードバックが起こって鎮静化する<ref><pubmed>18046410</pubmed></ref><ref><pubmed>22265416</pubmed></ref><ref><pubmed>20532235</pubmed></ref> 。この負のフィードバックが起きるメカニズムとしては、Ptcが細胞膜上に多数存在するようになってShhタンパク質が枯渇するというもの<ref><pubmed>18046410</pubmed></ref> や、活性型Gliタンパク質が不活性型に比べて不安定であるというもの<ref name=ref40><pubmed>20360384</pubmed></ref> などがあるが、全容はまだ明らかになっていない。 | ||
==疾患との関わり== | ==疾患との関わり== | ||