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[http://researchmap.jp/ohuchihideyo 大内淑代]<[[br]]>

''岡山大学大学院医歯薬学総合研究科細胞組織学分野''

DOI：<selfdoi />　原稿受付日：2012年7月12日　原稿完成日：2013年3月25日

担当編集委員：[http://researchmap.jp/noriko1128 大隅典子]（東北大学大学院医学系研究科附属創生応用医学研究センター脳神経科学コアセンター発生発達神経科学分野）

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[[Image:In situハイブリダイゼーション法1A.png|thumb|300px|'''図1A．ISHの実験例''' 組織切片ISH（トリ胚網膜、opsin 5、青い点状のシグナルがmRNA発現細胞、右はセンスプローブによる陰性コントロール） 発色基質：NBT, BCIP]]

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英：''in situ'' hybridization　独：''In situ''-Hybridisierung　仏：hybridation in situ

{{box|text=

''In situ''とは”原位置で”という意味で、''in situ''ハイブリダイゼーション(''in situ'' hybridization: ISH)とは原位置でのハイブリダイゼーション（後述）ということである。ISH法には、[[wikipedia:ja:染色体|染色体]]ISHと組織切片ISH、ホールマウントISH (whole-mount ISH: WISH) がある<ref>'''野地澄晴編''' 免疫染色&''in situ''ハイブリダイゼーション ''羊土社''、東京、2006</ref><ref>'''D.G. Wilkinson''' In Situ Hybridization, A Practical Approach, 2nd Edition ''Oxford University Press'', Oxford, 1999</ref>。染色体ISH法は、染色体における目的遺伝子の[[wikipedia:ja:遺伝子座|遺伝子座]]を明らかにし、染色体異常を検出することができる。組織ISH法は、組織切片を用いて遺伝子発現の第一段階である[[wikipedia:ja:mRNA|mRNA]]の局在を細胞レベルで明らかにする。[[wikipedia:ja:病理|病理]]組織から[[wikipedia:ja:ウイルス|ウイルス]][[wikipedia:ja:ゲノム|ゲノム]]を検出し、ウイルス感染の診断に用いられることもある。また、胚や器官の一部などを丸ごと用いるISH法を、ホールマウントISH（WISH）という。実験例を図1に示す。遺伝子発現部位の三次元的な情報を得た後で、細胞レベルで遺伝子発現部位を同定しなければならない場合は、WISH後の胚などの組織切片を作製する。図2に、組織切片を用いた''in situ''ハイブリダイゼーション法の工程を模式的に示す。ISHは、細胞内mRNAの局在を明らかにする実験であるので、分解されやすいRNAをいかに分解させずに実験を行うかが重要である。

}}

== ''In situ''ハイブリダイゼーション法の各工程 ==

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=== 組織の固定 ===

ISH法では細胞が死んだ状態でmRNAを検出する。細胞が死んでしまうと、mRNAは急速に分解され消滅してしまう。そのため、''in situ''ハイブリダイゼーション法を用いる場合は、細胞内のmRNAの分解を防ぎ、できるだけ生きていた状態を維持しておく必要がある。細胞や組織などをなるべく自然の状態に保存することを[[wikipedia:ja:固定|固定]]とよんでいるが、''in situ''ハイブリダイゼーション法の場合はmRNAの固定が非常に重要である。''In situ''ハイブリダイゼーション法では、用時調製した4%[[wikipedia:ja:パラホルムアルデヒド|パラホルムアルデヒド]]液を用いて[[wikipedia:ja:還流固定|還流固定]]し、[[wikipedia:ja:臓器|臓器]]等を取り出して短時間、低温でさらに[[wikipedia:ja:浸漬固定|浸漬固定]]~~することが多い。新鮮迅速凍結切片を用いてISHを行うこともある。組織切片はスライドガラスに貼付けたもの、あるいは浮遊切片~~<ref><pubmed> 21037591</pubmed></ref>を用いる。

ISH法では細胞が死んだ状態でmRNAを検出する。細胞が死んでしまうと、mRNAは急速に分解され消滅してしまう。そのため、''in situ''ハイブリダイゼーション法を用いる場合は、細胞内のmRNAの分解を防ぎ、できるだけ生きていた状態を維持しておく必要がある。細胞や組織などをなるべく自然の状態に保存することを[[wikipedia:ja:固定|固定]]とよんでいるが、''in situ''ハイブリダイゼーション法の場合はmRNAの固定が非常に重要である。''In situ''ハイブリダイゼーション法では、用時調製した4%[[wikipedia:ja:パラホルムアルデヒド|パラホルムアルデヒド]]液を用いて[[wikipedia:ja:還流固定|還流固定]]し、[[wikipedia:ja:臓器|臓器]]等を取り出して短時間、低温でさらに[[wikipedia:ja:浸漬固定|浸漬固定]]することが多い。新鮮迅速凍結切片を用いてISHを行うこともある。組織切片はスライドガラスに貼付けたもの、あるいは浮遊[[切片]]<ref><[[pubmed]]> 21037591</pubmed></ref>を用いる。

=== 前処理 ===

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== 2色ISH法、蛍光ISH法、抗体染色との2重染色 ==

　発色法では、アルカリフォスファターゼ (AP) の基質を変えることにより、2つの遺伝子の発現を同時に検出できる。すなわち、調べたい2つの遺伝子のRNAプローブをDIGまたはフルオレセインで標識し、混合プローブでハイブリダイゼーションさせる。まずAP標識抗フルオレセイン抗体で反応させ、洗浄、発色まで行う（基質は[[wikipedia:ja:Fast Red|Fast Red]]）。その後、酸処理（0.1M[[~~wikipedia:ja:グリシン|~~グリシン]]-HCl、pH2.2）および後固定を行って1色めのアルカリフォスファターゼを失活させる。その後、AP標識抗DIG抗体で反応させ、洗浄、発色を行う（基質NBT/BCIP）。または、DIGまたはフルオレセインで標識した2つのRNAプローブでハイブリダイゼーションさせて洗浄、HRP標識抗DIG抗体で反応させ、HRPの基質ジアミノベンジジン(Diaminobenzidine: DAB)を用いてまず発色させる。次に、AP標識抗フルオレセイン抗体で反応させ、その後APの基質（NBT, BCIP）を用いて発色させる。

　発色法では、アルカリフォスファターゼ (AP) の基質を変えることにより、2つの遺伝子の発現を同時に検出できる。すなわち、調べたい2つの遺伝子のRNAプローブをDIGまたはフルオレセインで標識し、混合プローブでハイブリダイゼーションさせる。まずAP標識抗フルオレセイン抗体で反応させ、洗浄、発色まで行う（基質は[[wikipedia:ja:Fast Red|Fast Red]]）。その後、酸処理（0.1M[[グリシン]]-HCl、pH2.2）および後固定を行って1色めのアルカリフォスファターゼを失活させる。その後、AP標識抗DIG抗体で反応させ、洗浄、発色を行う（基質NBT/BCIP）。または、DIGまたはフルオレセインで標識した2つのRNAプローブでハイブリダイゼーションさせて洗浄、HRP標識抗DIG抗体で反応させ、HRPの基質ジアミノベンジジン(Diaminobenzidine: DAB)を用いてまず発色させる。次に、AP標識抗フルオレセイン抗体で反応させ、その後APの基質（NBT, BCIP）を用いて発色させる。

　蛍光ISH法では、HRP標識の抗体に対して、[[wikipedia:ja:tyramide|tyramide]]を結合させた低分子(ビオチンやフルオレセインなど)を反応させシグナルを増強させる方法 (tyramide signal amplification: TSA) を用いる。すなわちtyramideは、ペルオキシダーゼ活性によってラジカル化し組織（タンパク質のTyr, Trp残基など）に低分子ごと集積する。集積した低分子を、蛍光物質の場合はそのまま蛍光顕微鏡等で検出でき、そうでなければその低分子に対する蛍光標識抗体または[[wikipedia:ja:ストレプトアビジン|ストレプトアビジン]]を反応させて間接的に検出することもできる。細胞レベルでmRNAの共在性を証明するためには蛍光ISH法は必須であり、AP反応系Fast Red/[[wikipedia:ja:HNPP|HNPP]]と組み合わせることで2重蛍光ISH法を行うことができる。抗体染色との2重染色では、以上のISH工程をタンパク質分解酵素なしで行ってそのあと通常の間接蛍光抗体染色を行う、あるいは先にビオチン化抗体と蛍光標識アビジンを用いてRNAseフリーで抗体染色を行い、その後AP反応系Fast Red/HNPPによるISH法を行うなどの方法がある。さらなる多重蛍光ISH法については、hybridization chain reaction法がある。

　蛍光ISH法では、HRP標識の抗体に対して、[[wikipedia:ja:tyramide|tyramide]]を結合させた低分子(ビオチンやフルオレセインなど)を反応させシグナルを増強させる方法 (tyramide signal amplification: TSA) を用いる。すなわちtyramideは、ペルオキシダーゼ活性によってラジカル化し組織（タンパク質のTyr, Trp残基など）に低分子ごと集積する。集積した低分子を、蛍光物質の場合はそのまま蛍光顕微鏡等で検出でき、そうでなければその低分子に対する蛍光標識抗体または[[wikipedia:ja:ストレプトアビジン|ストレプトアビジン]]を反応させて間接的に検出することもできる。細胞レベルでmRNAの共在性を証明するためには蛍光ISH法は必須であり、AP反応系Fast Red/[[wikipedia:ja:HNPP|HNPP]]と組み合わせることで2重蛍光ISH法を行うことができる。[[抗体染色]]との2重染色では、以上のISH工程をタンパク質分解酵素なしで行ってそのあと通常の間接蛍光抗体染色を行う、あるいは先にビオチン化抗体と蛍光標識アビジンを用いてRNAseフリーで抗体染色を行い、その後AP反応系Fast Red/HNPPによるISH法を行うなどの方法がある。さらなる多重蛍光ISH法については、hybridization chain reaction法がある。

== マイクロRNAを検出するISH法 ==

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== ISHデータベース ==

Allen Brain Atlasは、[[wikipedia:ja:マイクロソフト社|マイクロソフト社]]創設者の一人である[[wikipedia:Paul G. Allen|Paul G. Allen]]の出資によって2003年に設立された[[wikipedia:ja:Allen Institute for Brain Science|Allen Institute for Brain Science]]のISHデータベースである。2006年12月発表のNature の記事によると、まず約2万の遺伝子のマウス成体脳における組織切片ISHのデータが公開された<ref><pubmed> 17151600</pubmed></ref>。現在、[[マウス]][[脳]]に加えて、[[wikipedia:ja:ヒト脳|ヒト脳]]、発生期マウス脳、発生期ヒト脳、マウス脳神経回路、ヒト以外の[[wikipedia:ja:霊長類|霊長類]]脳、マウス[[脊髄]]~~、ヒト~~[[神経膠芽腫]]に関するISHデータベースが公開されている。

Allen Brain Atlasは、[[wikipedia:ja:マイクロソフト社|マイクロソフト社]]創設者の一人である[[wikipedia:Paul G. Allen|Paul G. Allen]]の出資によって2003年に設立された[[wikipedia:ja:Allen Institute for Brain Science|Allen Institute for Brain Science]]のISHデータベースである。2006年12月発表のNature の記事によると、まず約2万の遺伝子のマウス成体脳における組織切片ISHのデータが公開された<ref><pubmed> 17151600</pubmed></ref>。現在、[[マウス]][[脳]]に加えて、[[wikipedia:ja:ヒト脳|ヒト脳]]、発生期マウス脳、発生期ヒト脳、マウス脳神経回路、ヒト以外の[[wikipedia:ja:霊長類|霊長類]]脳、マウス[[脊髄]]、[[ヒト]][[神経膠芽腫]]に関するISHデータベースが公開されている。

==関連項目==

*[[免疫組織化学]]

== 外部リンク ==

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== 参考文献 ==

~~（執筆者：大内淑代　担当編集委員：大隅典子）~~

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+<font size="+1">[http://researchmap.jp/ohuchihideyo 大内 淑代]</font><[[br]]>
+''岡山大学 大学院医歯薬学総合研究科細胞組織学分野''<br>
+DOI：<selfdoi />　原稿受付日：2012年7月12日　原稿完成日：2013年3月25日<br>
+担当編集委員：[http://researchmap.jp/noriko1128 大隅 典子]（東北大学 大学院医学系研究科 附属創生応用医学研究センター 脳神経科学コアセンター 発生発達神経科学分野）<br>
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 [[Image:In situハイブリダイゼーション法1A.png|thumb|300px|'''図1A．ISHの実験例'''<br>組織切片ISH（トリ胚網膜、opsin 5、青い点状のシグナルがmRNA発現細胞、右はセンスプローブによる陰性コントロール）<br>発色基質：NBT, BCIP]]
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 英：''in situ'' hybridization　独：''In situ''-Hybridisierung　仏：hybridation in situ
+{{box|text=
 　''In situ''とは”原位置で”という意味で、''in situ''ハイブリダイゼーション(''in situ'' hybridization: ISH)とは原位置でのハイブリダイゼーション（後述）ということである。ISH法には、[[wikipedia:ja:染色体|染色体]]ISHと組織切片ISH、ホールマウントISH (whole-mount ISH: WISH) がある<ref>'''野地澄晴編'''<br>免疫染色&''in situ''ハイブリダイゼーション<br>''羊土社''、東京、2006</ref><ref>'''D.G. Wilkinson'''<br>In Situ Hybridization, A Practical Approach, 2nd Edition<br>''Oxford University Press'', Oxford, 1999</ref>。染色体ISH法は、染色体における目的遺伝子の[[wikipedia:ja:遺伝子座|遺伝子座]]を明らかにし、染色体異常を検出することができる。組織ISH法は、組織切片を用いて遺伝子発現の第一段階である[[wikipedia:ja:mRNA|mRNA]]の局在を細胞レベルで明らかにする。[[wikipedia:ja:病理|病理]]組織から[[wikipedia:ja:ウイルス|ウイルス]][[wikipedia:ja:ゲノム|ゲノム]]を検出し、ウイルス感染の診断に用いられることもある。また、胚や器官の一部などを丸ごと用いるISH法を、ホールマウントISH（WISH）という。実験例を図1に示す。遺伝子発現部位の三次元的な情報を得た後で、細胞レベルで遺伝子発現部位を同定しなければならない場合は、WISH後の胚などの組織切片を作製する。図2に、組織切片を用いた''in situ''ハイブリダイゼーション法の工程を模式的に示す。ISHは、細胞内mRNAの局在を明らかにする実験であるので、分解されやすいRNAをいかに分解させずに実験を行うかが重要である。
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 == ''In situ''ハイブリダイゼーション法の各工程 ==
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 === 組織の固定 ===
-　ISH法では細胞が死んだ状態でmRNAを検出する。細胞が死んでしまうと、mRNAは急速に分解され消滅してしまう。そのため、''in situ''ハイブリダイゼーション法を用いる場合は、細胞内のmRNAの分解を防ぎ、できるだけ生きていた状態を維持しておく必要がある。細胞や組織などをなるべく自然の状態に保存することを[[wikipedia:ja:固定|固定]]とよんでいるが、''in situ''ハイブリダイゼーション法の場合はmRNAの固定が非常に重要である。''In situ''ハイブリダイゼーション法では、用時調製した4%[[wikipedia:ja:パラホルムアルデヒド|パラホルムアルデヒド]]液を用いて[[wikipedia:ja:還流固定|還流固定]]し、[[wikipedia:ja:臓器|臓器]]等を取り出して短時間、低温でさらに[[wikipedia:ja:浸漬固定|浸漬固定]]することが多い。新鮮迅速凍結切片を用いてISHを行うこともある。組織切片はスライドガラスに貼付けたもの、あるいは浮遊切片<ref><pubmed> 21037591</pubmed></ref>を用いる。
+　ISH法では細胞が死んだ状態でmRNAを検出する。細胞が死んでしまうと、mRNAは急速に分解され消滅してしまう。そのため、''in situ''ハイブリダイゼーション法を用いる場合は、細胞内のmRNAの分解を防ぎ、できるだけ生きていた状態を維持しておく必要がある。細胞や組織などをなるべく自然の状態に保存することを[[wikipedia:ja:固定|固定]]とよんでいるが、''in situ''ハイブリダイゼーション法の場合はmRNAの固定が非常に重要である。''In situ''ハイブリダイゼーション法では、用時調製した4%[[wikipedia:ja:パラホルムアルデヒド|パラホルムアルデヒド]]液を用いて[[wikipedia:ja:還流固定|還流固定]]し、[[wikipedia:ja:臓器|臓器]]等を取り出して短時間、低温でさらに[[wikipedia:ja:浸漬固定|浸漬固定]]することが多い。新鮮迅速凍結切片を用いてISHを行うこともある。組織切片はスライドガラスに貼付けたもの、あるいは浮遊[[切片]]<ref><[[pubmed]]> 21037591</pubmed></ref>を用いる。
 === 前処理 ===
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 == 2色ISH法、蛍光ISH法、抗体染色との2重染色 ==
-　発色法では、アルカリフォスファターゼ (AP) の基質を変えることにより、2つの遺伝子の発現を同時に検出できる。すなわち、調べたい2つの遺伝子のRNAプローブをDIGまたはフルオレセインで標識し、混合プローブでハイブリダイゼーションさせる。まずAP標識抗フルオレセイン抗体で反応させ、洗浄、発色まで行う（基質は[[wikipedia:ja:Fast Red|Fast Red]]）。その後、酸処理（0.1M[[wikipedia:ja:グリシン|グリシン]]-HCl、pH2.2）および後固定を行って1色めのアルカリフォスファターゼを失活させる。その後、AP標識抗DIG抗体で反応させ、洗浄、発色を行う（基質NBT/BCIP）。または、DIGまたはフルオレセインで標識した2つのRNAプローブでハイブリダイゼーションさせて洗浄、HRP標識抗DIG抗体で反応させ、HRPの基質ジアミノベンジジン(Diaminobenzidine: DAB)を用いてまず発色させる。次に、AP標識抗フルオレセイン抗体で反応させ、その後APの基質（NBT, BCIP）を用いて発色させる。
+　発色法では、アルカリフォスファターゼ (AP) の基質を変えることにより、2つの遺伝子の発現を同時に検出できる。すなわち、調べたい2つの遺伝子のRNAプローブをDIGまたはフルオレセインで標識し、混合プローブでハイブリダイゼーションさせる。まずAP標識抗フルオレセイン抗体で反応させ、洗浄、発色まで行う（基質は[[wikipedia:ja:Fast Red|Fast Red]]）。その後、酸処理（0.1M[[グリシン]]-HCl、pH2.2）および後固定を行って1色めのアルカリフォスファターゼを失活させる。その後、AP標識抗DIG抗体で反応させ、洗浄、発色を行う（基質NBT/BCIP）。または、DIGまたはフルオレセインで標識した2つのRNAプローブでハイブリダイゼーションさせて洗浄、HRP標識抗DIG抗体で反応させ、HRPの基質ジアミノベンジジン(Diaminobenzidine: DAB)を用いてまず発色させる。次に、AP標識抗フルオレセイン抗体で反応させ、その後APの基質（NBT, BCIP）を用いて発色させる。
-　蛍光ISH法では、HRP標識の抗体に対して、[[wikipedia:ja:tyramide|tyramide]]を結合させた低分子(ビオチンやフルオレセインなど)を反応させシグナルを増強させる方法 (tyramide signal amplification: TSA) を用いる。すなわちtyramideは、ペルオキシダーゼ活性によってラジカル化し組織（タンパク質のTyr, Trp残基など）に低分子ごと集積する。集積した低分子を、蛍光物質の場合はそのまま蛍光顕微鏡等で検出でき、そうでなければその低分子に対する蛍光標識抗体または[[wikipedia:ja:ストレプトアビジン|ストレプトアビジン]]を反応させて間接的に検出することもできる。細胞レベルでmRNAの共在性を証明するためには蛍光ISH法は必須であり、AP反応系Fast Red/[[wikipedia:ja:HNPP|HNPP]]と組み合わせることで2重蛍光ISH法を行うことができる。抗体染色との2重染色では、以上のISH工程をタンパク質分解酵素なしで行ってそのあと通常の間接蛍光抗体染色を行う、あるいは先にビオチン化抗体と蛍光標識アビジンを用いてRNAseフリーで抗体染色を行い、その後AP反応系Fast Red/HNPPによるISH法を行うなどの方法がある。さらなる多重蛍光ISH法については、hybridization chain reaction法がある。
+　蛍光ISH法では、HRP標識の抗体に対して、[[wikipedia:ja:tyramide|tyramide]]を結合させた低分子(ビオチンやフルオレセインなど)を反応させシグナルを増強させる方法 (tyramide signal amplification: TSA) を用いる。すなわちtyramideは、ペルオキシダーゼ活性によってラジカル化し組織（タンパク質のTyr, Trp残基など）に低分子ごと集積する。集積した低分子を、蛍光物質の場合はそのまま蛍光顕微鏡等で検出でき、そうでなければその低分子に対する蛍光標識抗体または[[wikipedia:ja:ストレプトアビジン|ストレプトアビジン]]を反応させて間接的に検出することもできる。細胞レベルでmRNAの共在性を証明するためには蛍光ISH法は必須であり、AP反応系Fast Red/[[wikipedia:ja:HNPP|HNPP]]と組み合わせることで2重蛍光ISH法を行うことができる。[[抗体染色]]との2重染色では、以上のISH工程をタンパク質分解酵素なしで行ってそのあと通常の間接蛍光抗体染色を行う、あるいは先にビオチン化抗体と蛍光標識アビジンを用いてRNAseフリーで抗体染色を行い、その後AP反応系Fast Red/HNPPによるISH法を行うなどの方法がある。さらなる多重蛍光ISH法については、hybridization chain reaction法がある。
 == マイクロRNAを検出するISH法 ==
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 == ISHデータベース ==
-　Allen Brain Atlasは、[[wikipedia:ja:マイクロソフト社|マイクロソフト社]]創設者の一人である[[wikipedia:Paul G. Allen|Paul G. Allen]]の出資によって2003年に設立された[[wikipedia:ja:Allen Institute for Brain Science|Allen Institute for Brain Science]]のISHデータベースである。2006年12月発表のNature の記事によると、まず約2万の遺伝子のマウス成体脳における組織切片ISHのデータが公開された<ref><pubmed>    17151600</pubmed></ref>。現在、[[マウス]][[脳]]に加えて、[[wikipedia:ja:ヒト脳|ヒト脳]]、発生期マウス脳、発生期ヒト脳、マウス脳神経回路、ヒト以外の[[wikipedia:ja:霊長類|霊長類]]脳、マウス[[脊髄]]、ヒト[[神経膠芽腫]]に関するISHデータベースが公開されている。
+　Allen Brain Atlasは、[[wikipedia:ja:マイクロソフト社|マイクロソフト社]]創設者の一人である[[wikipedia:Paul G. Allen|Paul G. Allen]]の出資によって2003年に設立された[[wikipedia:ja:Allen Institute for Brain Science|Allen Institute for Brain Science]]のISHデータベースである。2006年12月発表のNature の記事によると、まず約2万の遺伝子のマウス成体脳における組織切片ISHのデータが公開された<ref><pubmed>    17151600</pubmed></ref>。現在、[[マウス]][[脳]]に加えて、[[wikipedia:ja:ヒト脳|ヒト脳]]、発生期マウス脳、発生期ヒト脳、マウス脳神経回路、ヒト以外の[[wikipedia:ja:霊長類|霊長類]]脳、マウス[[脊髄]]、[[ヒト]][[神経膠芽腫]]に関するISHデータベースが公開されている。
+==関連項目==
+*[[免疫組織化学]]
 == 外部リンク ==
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 == 参考文献 ==
 <references />
-（執筆者：大内淑代　担当編集委員：大隅典子）