「ナノボディ」の版間の差分

 

英：nanobody　独：Nanobody, Nanoantikörper 仏：nanobody　中：纳米抗体 西：nanoanticuerpo

最も一般的な免疫グロブリンIgGは重鎖と軽鎖からなっているが、ラクダ科や軟骨魚は重鎖のみでできた免疫グロブリンも持っている。この'重鎖抗体は可変領域のみで抗原と結合でき、この小さな単一ドメインはナノボディ（またはVHH）と呼ばれる。ナノボディは、それぞれアミノ酸配列が厳密に定義され、通常の抗体と同じように、免疫沈降法などの生化学的解析や免疫組織化学などに利用できる。また、細胞内でも抗原と結合できる細胞内抗体などとして機能的に発現させることで、さまざまな神経細胞を含めた細胞生物学的分析に応用可能である。診断や抗体医薬への利用も期待される。}}

ウサギ、マウスなどに見られる一般的な[[wj:抗体]]は重鎖と軽鎖からなる複合体であり、研究、診断、治療などには、IgG、IgMなどの免疫グロブリンとその誘導体（Fab断片など）が広く用いられている（図１）。最も一般的な抗体分子IgGは、別々の[[wj:可変領域]]（Variable region）ドメインを持った重鎖と軽鎖からなるヘテロダイマーが１つの抗原を認識し、重鎖の[[wj:定常領域]]（Constant region）ドメインを介したジスルフィド結合で、もう一つの同じ重鎖と軽鎖 のヘテロダイマーと一緒になって、IgG1の場合、分子量150kDaほどのY字型のヘテロテトラマーとなっている。また目的に応じて、 抗原との結合能を維持した小型抗体分子、例えばFab（1つの軽鎖および半分の重鎖） のようなプロテアーゼ断片や、重鎖と軽鎖の可変領域ドメインを組換えDNA技術で人工的に接続することで一本鎖の可変断片からなる'''単鎖抗体'''（single chain antibody、single chain variable fragment (scFV)）がしばしば利用されてきた<ref><pubmed>8114766</pubmed></ref> <ref><pubmed>23908655 </pubmed> </ref>。   

一方、1993年、ヒトコブラクダCamelus dromedariusは、 例外的に軽鎖がない重鎖のみでできた特殊な抗体（'''重鎖抗体''' Heavy chain antibodies ）も持っていることが、Hamers-Castermanらによって報告された<ref><pubmed>8502296</pubmed></ref><ref><pubmed>23495938</pubmed></ref>。 これは、現存するラクダ科（ヒトコブラクダ、フタコブラクダ、リャマ/グアナコ、アルパカ/ビクーニャ）の動物に共通して見られる抗体である。その後、 軟骨魚（サメ、ギンザメなど）でも類似した重鎖抗体の存在が確認された<ref><pubmed>19997068</pubmed></ref>。

サメで見られる重鎖抗体は、'''IgNAR''' (new antigen receptor)と呼ばれ、１つの可変領域のドメイン（vNARと呼ばれる）が抗原と結合することができる。一方、ラクダ科の重鎖抗体では、その１つの可変領域ドメインはVHHと呼ばれる。他のポリペプチドの存在なしで抗原と結合する単鎖抗体であるVHHは、その分子量が通常のIgGの10分の1ほどの12-15kDaであり、nm単位の大きさであることから「ナノボディNanobody」と一般的に呼ばれている<ref><pubmed>23495938</pubmed></ref> <ref><pubmed>29209322 </pubmed></ref>。  

[[ファイル:nanobody2.jpg ‎|サムネイル|300px|'''図2．リャマ由来のGFPナノボディ'''<br>RCSBのPDBで3OGO, http://www.rcsb.org/structure/3OGO]]

[[ファイル:nanobody3.jpg ‎|サムネイル|750px|'''図3．リャマ由来のGFPナノボディのアミノ酸配列’’’<br>R1からFR4というフレームワーク領域(Framework regions）の中に超可変領域である相補性決定領域（Complementary determining regions）と呼ばれる３つのCDR1-3が見られる]]

ナノボディは、通常120アミノ酸残基のポリペプチドである。基本的には、典型的な免疫グロブリンの可変領域の配列と類似しており、FR1からFR4というフレームワーク領域(Framework regions）の中に超可変領域である相補性決定領域（Complementary determining regions）と呼ばれる３つのCDR1-3が見られる（図３）。

しかしながら、通常の免疫グロブリンの可変領域とは異なる特徴が見られ、それがナノボディの長所ともなっている。第１に、通常の免疫グロブリンに比べて、FR2領域に親水性のアミノ酸残基が多く、ナノボディの水溶性の性質や安定性を高めている<ref><pubmed>7831284</pubmed></ref>。第２に、 通常の免疫グロブリンの6つのCDR（重鎖3つ、軽鎖3つ）の代わりに3つのCDRのみで抗原と結合する。その結果、認識に必要な構造（[[パラトープ]]paratope）が凸型で小さいので、通常の免疫グロブリンが入り込めないような抗原の構造（[[エピトープ]]epitope）を認識できる可能性がある<ref><pubmed>16537393</pubmed></ref>。第３に、通常の抗体より長いCDR1, CDR3ループを持つために、結合の親和性や特異性を高めることが可能となっている。これらの水溶性、構造的なコンパクトさ、そして超可変領域の配列の多様性が、ナノボディの利点となると考えられる。

多くの種類のナノボディは、目的別に発現ベクターにクローニングした後、 哺乳類細胞だけなく、 細菌、酵母、植物でも産生させることができる。哺乳類細胞では、抗体が本来利用される細胞外だけでなく、細胞内部でも発現させることが可能である（イントラボディ、下記参考）。ただし、ナノボディの配列はそれぞれ異なり、特徴的なジスルフィド結合の生成が結合力あるコンフォメーションを取るために必要な場合、細胞内や細菌などではうまくいかない可能性はある。ナノボディには90℃という高温でも失活しないものもあるように<ref><pubmed>10209277</pubmed></ref><ref><pubmed>24739391</pubmed></ref>、一般に安定性は高いが、これもそれぞれのナノボディの特性による。

一般的な方法としては、重鎖抗体を産生する動物を飼育し、それを抗原で免疫することである。 比較的小型のリャマ Lama glamaのほかに、アルパカVicugna pacos、ヒトコブラクダCamelus dromedarius、ネコザメ Heterodontus francisci が免疫に利用されている。次に免疫動物から血液を採集し、その中にあるB細胞から、可変領域を含むcDNAライブラリーを作製、そのライブラリーを固定化した抗原を使った[[ファージディスプレイ]]などのパニングでスクリーニングすることで、cDNA配列を単離し、抗原に結合するナノボディ配列を知ることができる<ref><pubmed>24577359</pubmed></ref><ref><pubmed>19554288</pubmed></ref>。   

このスクリーニングを効果的に行うための工夫が多数開発されてきている<ref><pubmed>29477934</pubmed></ref>。ファージディスプレイの担体の工夫、グラム陽性バクテリア表面へのディスプレイ、酵母へのディスプレイ、[[mRNAディスプレイ]]、[[リボソームディスプレイ]]、細胞内での[[２ハイブリッドスクリーニング]]などが用いられてきている。

特に、最近、これらの方法を組み合わせることで、効率的に行う戦略が考案されている。Fridyらは、免疫動物の結合抗体を精製しその質量スペクトルの結果とファージディスプレイのハイスループットな配列決定を組み合わせる方法で、多数の蛍光タンパク質に結合するナノボディを報告した<ref><pubmed>25362362</pubmed></ref>  。Zimmermann は、リボソームディスプレイ、ファージディスプレイ、ELISAを組み合わせることで、短期間にナノボディ配列を得る戦略を報告している<ref><pubmed>29792401</pubmed></ref>。また、McMahon らは、酵母ディスプレイを用いて、免疫動物を用いない合成ライブラリーをスクリーニングすることで親和性の高いナノボディ配列を得ることができることを示している<ref><pubmed>29434346</pubmed></ref> 。このような非免疫ライブラリーや合成ライブラリーを用いる方法については、まだ適用例が少なく、標準的な方法とされるものが存在しないというのが実情であろう。また、ある程度の抗原親和性を示すナノボディの配列を調整することで、[[親和性の成熟]]affinity maturationを行うこともできる<ref><pubmed>15777944</pubmed></ref> 。  

免疫組織化学に最もよく用いられているのは、ナノボディをタンパク質として精製後、色素分子などを化学的にカップリングするという方法である。このような試薬は市販もされている（例、ChromoTek社<ref>https://www.chromotek.com/</ref> ）。最近、2次抗体の活性を持つナノボディが報告されている<ref><pubmed>29263082</pubmed></ref> 。ナノボディの多くは、大腸菌で活性あるものを大量産生、精製することができるので、一度、配列がわかれば、動物を使用する必要がなくなる。

化学的なカップリングなので、カップリングする分子を工夫することで、目的に合わせて様々なものを作製できる可能性がある<ref><pubmed>28883823 </pubmed></ref> 。一方、 アミノ酸残基を修飾するカップリング反応により抗原結合能を失うことも想定されるが、修飾するアミノ酸残基の位置を制御することは可能である<ref><pubmed>26633879</pubmed></ref> 。ナノボディは小さく、通常の抗体では入り込めない箇所に結合することで、[[高解像度顕微鏡]]においても、アーチファクトが減少し、有用なツールになると考えられている<ref><pubmed>23845946</pubmed></ref> 。

化学的カップリング反応は、しばしばナノボディの活性を消失させるが、実験的にも条件決定など必ずしも容易ではない。この問題を克服するために開発されたプラットフォームがRANbody（Receptor-and-Nanobody)である<ref><pubmed>29440485</pubmed></ref>。RANbodyは、ナノボディを酵素（改良型[[wj:西洋ワサビペルオキシダーゼ]HRP）、抗原性のあるニワトリ抗体IgY、多重エピトープタグなどと融合させたものである。プラスミドを293T細胞などの動物細胞に導入するだけで、培地中に放出されるので容易に利用できる。HRPは大腸菌の中で活性のある酵素として発現させることができない。その一つの解決策として、アスコルビン酸オキシダーゼAPEX2との融合タンパク質を大腸菌で発現させて用いることができるが、APEX2はHRPに比べて活性が弱い<ref><pubmed>29915061</pubmed></ref><ref><pubmed>25419960</pubmed></ref> 。

免疫沈降法（プルダウンPulldown）では、ナノボディをアガロースや磁気ビーズなどの担体にカップリングすることで得られた担体が市販されているので利用できる。また、多くのナノボディは大量に精製できるので、通常の抗体などのアフィニティクロマトグラフィ担体を作製するのと同じように利用可能である。例えば、GSTなどとの融合タンパク質は、GSTを結合するグルタチン結合ゲルに容易に結合するので、免疫沈降法に有用である<ref><pubmed>18936248</pubmed></ref> <ref><pubmed>17951627</pubmed></ref> <ref><pubmed>25964651</pubmed></ref> 。

====intrabody, Chromobody====

ナノボディの特徴は、組み換えタンパク質として、細胞内で機能的に発現することができることである。この方法は、一般に'''イントラボディ'''Intrabody（細胞内ボディ、細胞内抗体）と呼ばれる。

'''クロモボディ'''Chromobodyは、ナノボディをGFPなどの蛍光タンパク質と結合することで、標的分子に結合し、標的分子の染色や追跡が可能になる方法である。例えば、アクチンに対するナノボディをGFPと融合させ、それを細胞内で発現させれば、アクチンがナノボディを介してGFPで標識される。この融合する蛍光タンパク質を[[STORM]], PALMなどの[[高解像度顕微鏡]]に利用できる分子種とすれば、高解像度のバイオイメージングが可能である<ref><pubmed>22543348</pubmed></ref><ref><pubmed>17060912</pubmed></ref><ref><pubmed>28883823</pubmed></ref>。   

更には、活性型と非活性型のβ2-adrenoceptorの[[wj:コンフォメーション]] を識別できるナノボディ<ref><pubmed>23515162</pubmed></ref> を使って、分子の特殊なコンフォメーションを観察ができる。また、GFPナノボディのあるものは、GFPを2つに分割した断片と再構成したGFPを区別できる<ref><pubmed>29440485</pubmed></ref>。リン酸化、アセチル化などの[[wj:翻訳後修飾]]（Post-translational modificiation, PTM) された抗原を認識するナノボディは、翻訳後修飾のセンサーとして利用されてきている<ref><pubmed>23942372</pubmed></ref>。

また、[[ユビキチン系]]を利用することで、標的タンパク質を特異的に分解することも可能である<ref><pubmed>22157958</pubmed></ref>。  

免疫グロブリンに由来するナノボディ以外に、免疫グロブリン以外に見られるタンパク質のドメインを用いて、新たな'''組み換え結合体'''を作製する方法もあり、原理的にはこのような組み換え結合体はナノボディと同様な利用法が可能である<ref><pubmed>26056137</pubmed></ref><ref><pubmed>28249355</pubmed></ref> 。

細胞接着分子[[wj:フィブロネクチン]中の代表的なモチーフであるtype IIIリピートは、免疫グロブリンドメインと構造が類似しており、これを他の分子に結合する免疫グロブリンのように改変することが可能であり、この方法は、'''モノボディ'''（monobody）と名付けられている<ref><pubmed>22198408</pubmed></ref> （Koide e tal., 2013)。 ジスルフィド結合によって構造が左右されないので、 細胞内での還元状態の環境でも利用できる。例えば、Arnoldのグループによって開発された'''FingR'''は、[[PSD95]]や[[ゲフィリン]]といったシナプスタンパク質を認識することができる<ref><pubmed>23791193</pubmed></ref> 。

免疫グロブリンを利用しない組み換え結合体には、このほかにも、アンキリンリピートを利用した'''DARPin'''（Designed ankyrin repeat proteins)などの方法がある<ref><pubmed>26056137</pubmed></ref><ref><pubmed>25562645</pubmed></ref>。DARPinの場合、パラトープが凸型の構造を取ることで隠れた構造を認識しやすいナノボディとは対照的に認識に関わる構造が凹型になりやすい。

近年、生物医学系の研究では、論文発表された実験結果の一部が容易に再現できないとされる問題がしばしば指摘されている。抗体の利用は、この再現性問題のもっとも重要な要因の１つであるとされる<ref><pubmed>25993940</pubmed></ref><ref><pubmed>12949777</pubmed></ref><ref><pubmed>29688318</pubmed></ref>。  例えば、ウサギなどのポリクローン抗体は、多数の異なる抗体分子を含んだポリクローン抗体という性格上、免疫した動物などバッチごとの差が大きい。また、[[wj:モノクローン抗体]]は、ハイブリドーマを増殖させることで、永遠に同じものを得ることができるはずであるが、市販抗体は予期せず販売中止になったり、ハイブリドーマ細胞は極低温で維持しなくてはならず、災害や研究者の都合により失われてしまうこともある。ナノボディは、アミノ酸配列で定義されるので質は同じであり、DNAという形で安価で長期保存が可能である。また DNAが失われても、アミノ酸配列から容易に再生できるので、抗体の利用周辺の再現性問題の解決の一助として注目されている。

抗体同様に診断への利用とともに、[[抗体医薬]]として、感染症、がん、神経系疾患の治療薬などへの利用が期待される<ref><pubmed>29209322</pubmed></ref> 。 特に、Ablynx社が開発した 後天性血栓性血小板減少性紫斑病を対象とした抗VonWillebrand因子ナノボディであるcaplacizumabは、 III相試験で良好な結果が得られており、まもなく発売予定であるとみられる<ref>http://www.ablynx.com/rd-portfolio/overview/</ref>。