「シングルセルRNAシーケンシング」の版間の差分

シングルセルRNAシーケンシング(single cell RNA sequencing, 以下scRNA-seq)は、次世代シーケンシング （next generation sequencing、以下NGS）技術を使用して個々の細胞が発現しているmRNA全体、つまりトランスクリプトームを質的、量的に網羅的に調べ、細胞ごとの違いを高解像度で検出、分類することで、細胞の分類を行うことができる分子生物学的、コンピュータ生物学的技術である。また、刺激、発生など細胞の状況に応じて、個々の細胞のトランスクリプトームの情報を得ることで、病態や細胞系譜などの解析も可能である。特に多様なニューロンが存在する神経系では、この方法により、神経細胞の分類や状態についての知見が深まり、更に新しいバイオマーカー(biomarker)の同定などが網羅的に行われるようになった。

==トランスクリプトーム==

==scRNA-seqの背景と開発史==

1つの細胞の持つ生体物質を解明し、定量しようとする試みは古くからあった。1960年代になると、フローサイトメトリーを利用した蛍光活性化セルソーティング（Fluorescence-activated cell sorting, FACS）が発明され、標識抗体などのプローブと組み合わせることで、多数の細胞集団の中で１つの細胞が持っている分子の種類や量についての断片的な研究が可能になり、この方法は現在でも利用されている<ref><pubmed>22271369 </pubmed></ref>。その後、免疫組織化学やin situ hybridizationなどにより、タンパク質やmRNAの種類や量が観察できるようになり、組織中に存在するそれぞれの細胞の同定などに活用されてきている。

==scRNA-seqの現在==

それ以来、完全長cDNAを増幅したり、細胞ごとに異なる分子識別子（unique molecular identifiers: UMI）を持つcDNAを増幅させるscRNA-seqが考案され始め、2013年には、このような１細胞のシーケンシング技術が、Nature Methods誌のMethod of the Year に選ばれた https://www.nature.com/collections/mysbdwgfll。たとえば、SMART-seq（Switch mechanism at the 5' End of RNA Templates）<ref><pubmed>22820318</pubmed></ref>およびその改良されたプロトコルであるSMART-seq2 <ref><pubmed> 24056875 </pubmed></ref> <ref><pubmed>24385147</pubmed></ref>は、完全長cDNA合成のためのプロトコルである。また、MARS-seq（Massively parallel single-cell RNA-seq）<ref><pubmed> 24531970 </pubmed></ref>、STRT（single-cell tagged reverse transcription）<ref><pubmed>21543516</pubmed></ref> <ref><pubmed>24363023</pubmed></ref>、CEL-seq（Cell Expression by Linear amplification and Sequencing）<ref><pubmed>22939981</pubmed></ref>、CEL-seq2<ref><pubmed> 27121950 </pubmed></ref>などが報告されてきた。特にSMART-seq（SMART-seq2）は、微小管によるマニュアル捕獲、限界希釈、セルソーター、レーザー捕獲法などを用いる多穴プレート法、更に半導体集積回路製作技術で作った流体集積回路を利用するFluidigm C1の装置https://jp.fluidigm.comと組み合わせることで利用される機会が多い。このプロトコールの特徴は、全長トランスクリプトームを得ることができることであり、mRNAのスプライシングバリアントなどのアイソフォーム、SNPs、変異の検出にも利用できる点で次に説明するUMIを用いる方法に比べて利点があるが、そのコストと処理可能な細胞数の点で弱点がある。

しかしながら、更に、重要なscRNA-seqの方法論についての進歩は、2015年、Harvard Medical Schoolの独立した２つのグループが、inDropそしてDrop-seqという類似した2つの高スループットな方法を開発したことであろう<ref><pubmed>26000487</pubmed></ref> <ref><pubmed>26000488</pubmed></ref>。これらの方法では、マイクロ流体力学 (Microfluidics) 、 UMIとしてDNAバーコーディング (DNA barcoding) 、そしてNGSを利用することで、自動化とサンプル調製の容易さから、1つの細胞あたりに要するコストを大幅に低下させることに成功した（Drop-seqは発表時で、１細胞あたり6セント）。つまり、細胞1つずつをマイクロ流体力学によるエマルジョン技術を利用した装置に流入させ、その１細胞を試薬を封入した1つのDroplet（油滴）に自動的に閉じ込める。そのDroplet中には、DropletごとにUMIとして異なったDNAバーコードを持つゲルビーズが入っており、それを足場にcDNA合成反応を実施することで、同じ細胞に含まれていたmRNAが同じUMIを持つcDNAとして合成され、Dropletを破壊した後も、そのmRNA/cDNAが由来した細胞を識別できるということを利用している（図１）。このようにして増幅したUMI付きｃDNAをNGSで配列決定することによりscRNA-seqが可能になる。なお、DropSeqはコストが低いが、細胞の取得率と検出感度が低い弱点がある。inDropはDropSeqより細胞取得率が高く、パラメータを調整することで低レベルで発現される遺伝子の検出に有利である。

inDropの方法は、1 Cellbio社から販売されているhttps://1cell-bio.com。しかし、特に重要なのは10xGenomics社が同様の原理を用いた「Chromium」と命名された機器と試薬のシステムを市販することで、多くの研究者に利用できることになったことであるhttps://www.10xgenomics.com/jp/。Svenssonらによる最近のデータベースhttps://www.biorxiv.org/content/10.1101/742304v2, https://www.nxn.se/single-cell-studies/guiでは、scRNA-seqを用いた論文で用いられた方法について網羅的に調査しているが、この数年、10xGenomics社のChromiumを用いた方法が飛躍的に増加し、ほぼ寡占状態になりつつあることがわかる（現在、10XGenomics社とBioRad社の間で関連特許をめぐる係争がある。）。このシステムは市販であるので導入が容易であり、inDropやDropSeqに比べ、多くの転写産物の高感度検出が可能であるが、ランニングコストが高い。

ここでは主流になっている10xGenomics社のChromiumを用いた方法とSMART-seqなどを用いた方法に共通する方法の実際について議論する。シングルセルRNAシーケンシングの利用には、4つのステップがある。１）細胞をバラバラに単離すること。２）ライブラリーの作製とNGSシーケンシング。３）前処理（preprocessing、得られた配列の整理）。４）ダウンストリーム分析（生物学的な情報を得る）。これらのうち、２）の段階については、上に記述したように市販の機器や試薬を利用することが多くなっているので、各社のマニュアル等を参考にするのが現実的である。

===組織からの細胞の分離===

血液細胞のように浮遊した細胞ではない場合、物理的あるいは酵素処理などによって、生組織から状態の良い細胞をdissociationする必要がある。神経系組織の酵素処理には、パパインを用いる方法が広く用いられている。ただ、しばしば問題となるのが、酵素処理のため短時間加温することで、発現量が変化する遺伝子が存在することである。例えば、脳のミクログリアの解析には、低温下で組織をホモゲナイズするなどの工夫が必要であった<ref><pubmed>30471926</pubmed></ref>。また、酵素処理時に転写阻害剤であるアクチノマイシンで処理することで、このような現象を抑制できる<ref><pubmed>29024657</pubmed></ref>。更に、ヒマラヤ氷河から得られた細菌Bacillus licheniformisから得られた低温プロテアーゼを用いる方法も報告されている<ref><pubmed>28851704</pubmed></ref>。なお、ヒト組織などから生細胞を得ることは困難なことが多い。この場合、凍結した組織から、各細胞由来の核を調製し、核内のmRNAを分析するアプローチもあり、細胞質を持つ生細胞を利用した場合より感度は劣るが、目的によっては利用可能である<ref><pubmed>30586455</pubmed></ref>。

更に、RNAを分析するscRNA-seqではないが、シングルセルgenome-seqの変法として、シングルセルの遺伝子発現を推定する方法として、トランスポゾンを用いることでゲノムのオープンクロマチン領域を選択的に検出し、ライブラリーを作製しシーケンスするsingle cell ATAC-seq (Assay for Transposase-Accessible Chromatin)がある<ref><pubmed>26083756</pubmed></ref>。

血液細胞のように浮遊した細胞ではない場合、物理的あるいは酵素処理などによって、生組織から状態の良い細胞をdissociationする必要がある。神経系組織の酵素処理には、パパインを用いる方法が広く用いられている。ただ、しばしば問題となるのが、酵素処理のため短時間加温することで、発現量が変化する遺伝子が存在することである。例えば、脳のミクログリアの解析には、低温下で組織をホモゲナイズするなどの工夫が必要であった<ref><pubmed>30471926</pubmed></ref>。また、酵素処理時に転写阻害剤であるアクチノマイシンで処理することで、このような現象を抑制できる<ref><pubmed>29024657</pubmed></ref>。更に、ヒマラヤ氷河から得られた細菌Bacillus licheniformisから得られた低温プロテアーゼを用いる方法も報告されている<ref><pubmed>28851704</pubmed></ref>。なお、ヒト組織などから生細胞を得ることは困難なことが多い。この場合、凍結した組織から、各細胞由来の核を調製し、核内のmRNAを分析するアプローチもあり、細胞質を持つ生細胞を利用した場合より感度は劣るが、目的によっては利用可能である<ref><pubmed>30586455</pubmed></ref>。

更に、RNAを分析するscRNA-seqではないが、シングルセルgenome-seqの変法として、シングルセルの遺伝子発現を推定する方法として、トランスポゾンを用いることでゲノムのオープンクロマチン領域を選択的に検出し、ライブラリーを作製しシーケンスするsingle cell ATAC-seq (Assay for Transposase-Accessible Chromatin)がある<ref><pubmed>26083756</pubmed></ref>。

===ダウンストリーム解析===

クラスタリングにより、異なった細胞集団の存在が認識されると、それぞれのクラスターに特徴的に発現している遺伝子を具体的に探索し、細胞集団の持つバイオマーカーによって、そのクラスターの同定が可能になる。例えば、既にニューロンとグリア細胞に特異的に発現する典型的マーカーはよく知られており、それぞれのクラスターの識別は容易である。更に、ニューロンのタイプごとに区別されるマーカーは、In situ hybridizationや免疫組織化学などにより確認できる。このようなクラスターごとに発現が異なる遺伝子（差次的発現遺伝子）を見つけるためには、Seuratのコードや他のダウンストリーム解析のためのコード（MAST <ref><pubmed>26653891</pubmed></ref>など）を用いることができる。scRNA-seqの解析に必要な様々なコードは、scRNA-tools <ref>https://www.scrna-tools.org</ref>やBioconductor<ref> https://www.bioconductor.org</ref>で紹介されており、ダウンロードも可能である。また、最新の情報については、bioRxivなどのプレプリントサーバで公開されていることが多い。細胞ごとの差次的発現遺伝子の可視化には、ドットプロットやヴァイオリンプロットなどが頻繁に用いられる（図４）。

https://github.com/dynverse/dynmethods

解剖学的な視点から言えば、すべてのニューロンの存在する位置は異なるので、すべてのニューロンは異なるという見方もできる。しかし、これは極論であり、従来の神経科学では、ニューロンの多様性は、それぞれのニューロンの解剖学的な位置、発現している分子、電気生理学、結合性、形態、神経伝達物質、神経伝達物質受容体とシグナル伝達によって識別されてきた。こうしたニューロンの多様性を便宜的に記述するのに、タイプ（type）、クラス（class）、サブクラス（subclass）、サブタイプ（subtype） というような用語が用いられてきた。しかし、本稿では混乱を防ぐため、Masland（2004）の提唱に従い、「クラス」と「タイプ」という単語を用いることとする。タイプは、これ以上分類することができないとされる階層である。例えば、大脳皮質の錐体細胞、網膜神経節細胞といった大雑把な識別は「クラス」と呼ぶ。大脳皮質の錐体細胞というクラスは、層や領野によって「タイプ」が異なるし、網膜神経節細胞には視覚情報によって応答が異なる「タイプ」が存在する。この分類は、免疫組織化学、形態、電気生理学などの技術により識別可能である暫定的なものに過ぎない。本稿で解説するscRNA-seqの技術は、その網羅性からそれぞれのニューロンについてこれまでにないビッグデータを提供することで、このニューロンのタイプの理解に確実な根拠を与えつつある。

===展望===

データベース