「シングルセルRNAシーケンシング」の版間の差分

英：single cell RNA sequencing, scRNA-seq

シングルセルRNAシーケンシング(single cell RNA sequencing, 以下scRNA-seq)は、[[次世代シーケンシング]] （next generation sequencing、以下NGS）技術を使用して個々の細胞が発現しているmRNA全体、つまり[[トランスクリプトーム]]を質的、量的に網羅的に調べ、細胞ごとの違いを高解像度で検出、分類することで、細胞の分類を行うことができる分子生物学的、コンピュータ生物学的技術である。また、刺激、発生など細胞の状況に応じて、個々の細胞のトランスクリプトームの情報を得ることで、病態や細胞系譜などの解析も可能である。特に多様な神経細胞が存在する神経系では、この方法により、神経細胞や非神経細胞の分類や状態についての知見が深まり、更に新しいマーカーや機能遺伝子の発見などが系統的かつ網羅的に行われるようになった。}}

トランスクリプトーム（transcriptome）は、細胞中に存在する全ての転写産物（タンパク質をコードするmRNA、タンパク質をコードしない[[ノンコーディングRNA]]、[[マイクロRNA]]など）の総体である<ref><pubmed>19015660</pubmed></ref><ref><pubmed>31341269 </pubmed></ref>。トランスクリプトームは、[[ゲノム]]とは異なり、同一の個体でも、組織ごとに、更には発生段階や細胞外環境や刺激によって変化する。トランスクリプトームは、同質あるいは異質の多数の細胞集団（組織、培養細胞）からRNA抽出後、cDNAに変換し、それを1990年代に出現した[[DNAマイクロアレイ]]のように数多くの既知mRNAを識別する技術によって解析されるようになった。その後、NGSの利用により、希少mRNAやノンコーディングRNAを含めた未知の転写産物の高感度検出が可能になるとともに、[[スプライシング]]で成熟していく過程のmRNAなど、転写産物の種類だけでなく、転写産物の構造的差異（スプライシングバリアント、SNPs、変異など）の解析もできるようになった。加えて、ヒトやモデル実験生物（[[マウス]]、[[ゼブラフィッシュ]]、[[ショウジョウバエ]]、[[センチュウ]]など）だけでなく、多種多様な生物のトランスクリプトームの把握も可能になった。ここでは、このような多数の細胞集団、つまり個体や特定の組織全体ではなく、細胞1つの持つトランスクリプトームを解析する方法（scRNA-seq）とそのscRNA-seqデータを利用することで得られる情報について概説する。

• その後、5’末端側も含めた完全長cDNAを増幅するscRNA-seqのプロトコールが考案された。特に、SMART-seq（Switch mechanism at the 5' End of RNA Templates）<ref><pubmed>22820318</pubmed></ref>およびその改良されたプロトコールであるSMART-seq2<ref><pubmed>24056875</pubmed></ref> <ref><pubmed>24385147</pubmed></ref>の使用例が多い（既に、SMART-seq3という改良プロトコールもある<ref><pubmed>32518404</pubmed></ref>が、以下SMART-seqと呼ぶ）。また、類似法としてSTRT（single-cell tagged reverse transcription）<ref><pubmed>21543516</pubmed></ref>がある。更に、MARS-seq（Massively parallel single-cell RNA-seq）<ref><pubmed>24531970 </pubmed></ref>、CEL-seq（Cell Expression by Linear amplification and Sequencing）<ref><pubmed>22939981</pubmed></ref>、CEL-seq2<ref><pubmed> 27121950 </pubmed></ref>では、[[T7 RNAポリメラーゼ]]による[[in vitro転写]]を用いることにより、PCRで顕著な増幅バイアスを減少させようとしている。

これらの方法のうち、SMART-seqは、マイクロピペットによる捕獲、セルソーター、[[レーザー捕獲]]などを用いるマルチウェル法、あるいは半導体集積回路製作技術で作った流体集積回路を利用するFluidigm C1の装置[https://jp.fluidigm.com]と組み合わせることで利用される機会が多い<ref><pubmed>30405621</pubmed></ref>[https://doi.org/10.1101/742304]。このSMART-seqプロトコールの特徴は、全長トランスクリプトームを得ることができることであり、mRNAのスプライシングバリアントなどのアイソフォーム、アリルごとの発現情報が得られるSNPs、変異の検出にも利用できる。また、それぞれ細胞ごとの反応を独立した場所で行うため、別の細胞の反応と混じる可能性がない。更に小さなウェルを用いるSeq-Wellも同様である<ref><pubmed>28192419</pubmed></ref>[。これらの点が、次に説明するDropletを使用して3’末端のみを標的にしたscRNA-seqに比べた場合の長所であるが、その高コスト（1細胞あたり数十ドル）と処理可能な細胞数の少なさが短所である。

DropSeqのセットアップはDolomite Bio ([https://www.dolomite-bio.com])、inDropは1 Cellbio社から販売されている[https://1cell-bio.com]。しかし、特に重要なのは10x Genomics社が同様の原理を用いた「Chromium」と命名された機器と試薬のシステムを市販することで、多くの研究者に利用できることになったことである[https://www.10xgenomics.com/jp/]。Svenssonらによる最近のデータベース[https://doi.org/10.1101/742304], [http://www.nxn.se/single-cell-studies/gui]では、scRNA-seqを用いた論文で用いられた方法について調査しているが、この数年、10x Genomics社Chromiumを用いた論文が飛躍的に増加し、scRNA-seqの方法として一般的になりつつあることがわかる（現在、10x Genomics社とBioRad社の間で関連特許をめぐる係争がある。）。このシステムは市販であるので導入が容易であり、DropSeqやinDropsに比べ多くの転写産物の高感度検出が可能であるが、ランニングコストは高い<ref><pubmed>30472192</pubmed></ref>。なお、3’エンドリード法だけでなく、N末端側に位置する抗体の可変領域などの検出には5’エンドリード法が利用されることがある。

[[ファイル:ScRNAseqFig1.jpg|サムネイル|250px|'''図1．Droplet使用の3’エンドリード法 '''<br>組織から解離させた細胞それぞれを、マイクロ流体力学を利用した装置で、バーコードプライマーが結合したゲルビーズとともにオイルドロップレットに封じ込める（本文参照）]]

ここでは主流になっている10x Genomics社のChromiumを用いた方法とSMART-seqなどを用いた方法に共通する方法の実際について俯瞰する。scRNA-seqの利用には、4つのステップがある（図２）<ref><pubmed>30089861</pubmed></ref>。１）個体や組織を採集し、そこから細胞あるいは細胞核を個別にすること。２）ChromiumやSMART-seqなどによる個々の細胞からのライブラリーの作製とNGS。３）前処理（preprocessing、得られた配列の整理）。４）ダウンストリーム解析（生物学的な情報を得るコンピューター生物学）。これらのうち、２）の段階については、上に記述したように市販の機器や試薬を利用する機会が多くなっているので、そのためのマニュアル等が参考になるはずである。

  [[ファイル:ScRNAseqFig2b.jpg|サムネイル|250px|'''図２．scRNA-seqの実際のステップ '''<br>細胞の単離、ライブラリ作製とNGS、データの前処理から次元圧縮、ダウンストリーム解析。図の一部は2016 DBCLS TogoTV、あるいはR-studio/Seuratを用いて10x Genomics社のPBMCデータ（[https://support.10xgenomics.com/single-cell-gene-expression/datasets]から執筆者が作製。]]

血液細胞のように浮遊した細胞ではない場合、物理的あるいは酵素処理などによって解離することで、生組織から状態の良いバラバラになった細胞を調製する必要がある。神経系組織の酵素処理には、パパインを用いる方法が広く用いられている。ここで、しばしば問題となるのが、酵素処理のため短時間加温することで、発現量が変化する遺伝子が存在することである<ref><pubmed>27090946</pubmed></ref>。例えば、脳の[[ミクログリア]]の解析には、低温下で組織をホモゲナイズするなどの工夫が必要であった<ref><pubmed>30471926</pubmed></ref>。また、このような現象を抑制するために、酵素処理時に転写阻害剤である[[アクチノマイシン]]で処理したり<ref><pubmed>29024657</pubmed></ref>、ヒマラヤ氷河から得られた細菌Bacillus licheniformisから得られた低温プロテアーゼを用いる方法も報告されている<ref><pubmed>28851704</pubmed></ref>。また、細胞解離後に、メタノールで固定しscRNA-seqに使用することも可能である<ref><pubmed>28526029</pubmed></ref>。

なお、ヒト組織や希少生物などから生細胞を得ることは困難なことが多い。この場合、scRNA-seqの変法として、凍結した組織から、各細胞由来の核を調製し、核内のmRNAを分析するsnRNA-seq (single-nucleus RNA-seq)が利用されている。ただ、snRNA-seqでは、FACSなどによる特定細胞集団の同定が困難であることが多く、細胞質を持つ生細胞を利用した場合より検出できる遺伝子数が少なく同等な結果が必ずしも得られない<ref><pubmed>24248345</pubmed></ref><ref><pubmed>26890679</pubmed></ref>  <ref><pubmed>27471252</pubmed></ref><ref><pubmed>28846088</pubmed></ref><<ref><pubmed>29220646</pubmed></ref><ref><pubmed>28846088</pubmed></ref><ref><pubmed>30586455</pubmed></ref><ref><pubmed>28729663</pubmed></ref><ref><pubmed>31728515</pubmed></ref><ref><pubmed>32341560</pubmed></ref> <ref><pubmed>32518403</pubmed></ref>。一方で、snRNA-seqでは、組織をそのまま凍結することから開始するので、上述したscRNA-seqの内在的な問題である酵素処理や加温などを避けることができる。更に、大きな細胞はマイクロ流体力学の流路で詰まりやすいなど、細胞の大きさに伴うバイアスを減らすことができるといったメリットもある。こうしたプロトコールの一部は、protocols.ioのHuman Cell Atlasのグループ[https://www.protocols.io/groups/hca]で公開されている。

 

更に、RNAを分析するscRNA-seqではないが、遺伝子発現との関係が想定される[[オープンクロマチン]]領域を[[トランスポゾン]]を用いることで個々の細胞レベルで選択的に検出するsingle cell ATAC-seq (Assay for Transposase-Accessible Chromatin)やsnATAC-seq <ref><pubmed>26083756</pubmed></ref>, <ref><pubmed>29434377</pubmed></ref><ref><pubmed>25953818</pubmed></ref>, single cell THS-seq (transposome hypersensitive-site) <ref><pubmed>29227469</pubmed></ref>、や[[DNAメチル化]]領域を観察するsnmC-seqのような方法も利用されている<ref><pubmed>28798132</pubmed></ref><ref><pubmed>30237449</pubmed></ref>。

10x Genomics社のChromium、Illumina社のNGSを利用した場合、Cell Ranger(Linux上で作動)を用いて、各生物種ごとのレファレンス配列リスト（[https://www.ncbi.nlm.nih.gov/grc]）やEggNOG ([http://eggnogdb.embl.de])などを利用し、細胞とトランスクリプトームの対応マトリックスを作製する。その後のデータの処理についても、10x Genomics社がソフトウェアLoupeを提供している。しかしながら、その後のダウンストリーム解析を考慮して、[[R言語]], [[Python]], MATLABなどのデータ解析のための汎用プログラミング言語やコードで扱えるオブジェクトに変換するのが通常である。ここでは、scRNA-seqデータ解析のために最もよく利用されているR言語を用いたパッケージ「Seurat」<ref><pubmed> 29608179 </pubmed></ref> <ref><pubmed> 31178118 </pubmed></ref>を中心に紹介したい。また、その一部はUniversity of WashingtonのCole Trapnell研究室で開発したMonocle3でも可能である（[https://cole-trapnell-lab.github.io/monocle3/]）。Pythonを利用したものでは、ドイツ・ミュンヘンInstitute of Computational Biologyの Fabian Theisらが開発しているScanpyが有名である<ref><pubmed> 29409532</pubmed></ref>。

New York UniversityのRahul Satija研究室が開発しているSeuratは、scRNA-seqデータ解析のために広く利用されているRパッケージであり、2020年秋現在、その最新バージョンはSeurat4のβバージョンが公開されている。論文の正式発表前から、サポート情報提供やコード修正なども頻繁に行っており、Satija研究室のウェッブサイト（ [http://satijalab.org/Seurat]）、Github([https://github.com/satijalab/Seurat])、更にTwitterアカウント（@satijalab）などで最新情報を得ることできる。

最初に行うのは、scRNA-seqデータの品質管理である。ここでは、質の低い細胞のデータ（転写産物の種類が少なく、ミトコンドリア由来の転写産物が多い）を取り除く。また、複数の試料を組み合わせる場合には、バッチごとの違いについて検討する<ref><pubmed>29608177</pubmed></ref>。現実には、実験ごとのバッチの違いによる影響がscRNA-seqの最も大きい問題であり、実験のデザインを工夫する必要がある。また、Dropletを使用するscRNA-seqでしばしば問題になるのが、Dropletに２つ以上の細胞が封じ込められ、それらが同一のCell barcodeを持ってしまうアーティファクトである。通常Doubletと呼ばれるこの問題はダウンストリーム解析を混乱させるので、細胞単離の段階から注意する必要があるが、細胞集団に特徴的なマーカー遺伝子が知られていればscRNA-seqデータ取得後にも、データ処理で検討することは可能である。この問題を解決する新たなアプローチも試みられている<ref><pubmed>30954476</pubmed></ref> <ref><pubmed>31836005</pubmed></ref><ref><pubmed>31856883</pubmed></ref> [https://doi.org/10.1101/2019.12.17.879304][https://doi.org/10.1101/699637]。

このようなノーマライゼーションの過程を経て、scRNA-seqのデータ解析において、最初に行うのが、[[次元圧縮]] (dimensionality reduction)である<ref><pubmed>30617341</pubmed></ref><ref><pubmed>31780648</pubmed></ref>。PCA (Principal component analysis, 主成分分析)、UMAP（Uniform Manifold Approximation and Projection, 均一マニフォールド近似と投影）、Diffusion maps,  t-SNE(t-distributed Stochastic Neighbor Embedding , t分布型確率的近傍埋込み)などの手法が用いられる。 特に、t-SNE[http://www.jmlr.org/papers/v9/vandermaaten08a.html]とUMAPは、高次元データを低次元の点の集合として可視化することで、それぞれの細胞の持つトランスクリプトームの類似度についての直観的な表示が可能でありしばしば用いられる（図３）。次に、[[Louvainアルゴリズム]]などでクラスタリング（コミュニティ分割）を行いグラフ上に表示できる（図３の色分け）。こうして、違ったタイプの細胞の集合が別のクラスターとして表示される。一般にUMAPの方がクラスタリングが明確になる傾向があるので、最近はUMAPを利用することが多くなってきている

  [[ファイル:ScRNAseqFig3.jpg|サムネイル|250px|'''図３．tSNEとUMAPによる同じデータの可視化'''<br>ニワトリ網膜の視細胞のデータを用いて作製[A]。]]

。クラスタリングにより、異なった細胞集団の存在が認識されると、それぞれのクラスターに特徴的に発現している遺伝子を具体的に探索し、細胞集団の持つバイオマーカーによって、そのクラスターの同定が可能になる。例えば、既に神経細胞とグリア細胞に特異的に発現する典型的マーカーはよく知られており、それぞれのクラスターの識別は容易である。更に、神経細胞のタイプを区別できるマーカーや、外部刺激によって遺伝子発現が変化した神経細胞の状態は、In situ hybridizationや免疫組織化学などにより確認できる。このようなクラスターごとに発現が異なる遺伝子（差次的発現遺伝子）を見つけるためには（Differential expression analysis, DE analysis）、SeuratのFindMarkersコマンド中でも利用可能である専用コード（MAST <ref><pubmed>26653891</pubmed></ref>、DESeq2 <ref><pubmed>25516281</pubmed></ref>など）を用いることができる。scRNA-seqの解析に必要なコードは、scRNA-tools [https://www.scrna-tools.org], Awesome single cell [https://github.com/seandavi/awesome-single-cell], Bioconductor[https://www.bioconductor.org]で紹介されており、ほとんどがダウンロード可能である。また、最新の情報については、bioRxivなどのプレプリントサーバで公開されていることが多く、scRNA-seqのデータ（下記参考）とともに、オープンサイエンス実践の好例となっている。細胞ごとの差次的発現遺伝子の可視化には、ドットプロット（dot plot）、ヴァイオリンプロット（violin plot）、リッジプロット（Ridge plot, joy plot）、次元圧縮の可視化図に重ねる布置プロット（feature plot）などが頻繁に用いられる（図４）。

[[ファイル:ScRNAseqFig4.jpg|サムネイル|250px|'''図３．scRNA-seqデータの可視化の例 '''<br>A. ドットプロット。B.ヴァイオリンプロット。C. 次元圧縮と重ねた布置プロット。ニワトリ網膜の視細胞のデータを用いて作製[A]。]]

実験的なノイズとは別に生物学的に意味のある遺伝子発現の変動には、位置情報、[[細胞周期]]、[[概日リズム]]、発現変動が大きい破裂型プロモーターの作動などの理由で変動が見られるものもある<ref><pubmed> 31217225 </pubmed></ref><ref><pubmed> 26000846</pubmed></ref>。特に、刺激・薬剤処理やさまざまな病態の進行や治療に伴う細胞の変化、発生途上の細胞系譜や細胞分化といった細胞の遷移状態の解析（[[偽時系列解析]]Pseudo-time analysis ）には、scRNA-seqデータを用いることが効果的である<ref><pubmed>29576429</pubmed></ref><ref><pubmed>28813177</pubmed></ref><ref><pubmed>29565398</pubmed></ref>。これらの分析のためには[[軌道推定]]（Trajectory inference）の解析手法が用いられる。しばしば用いられるMonocle3 <ref><pubmed>30787437</pubmed></ref>など、多くのコードを収集しているGithubのサイトがある [https://github.com/dynverse/dynmethods][https://github.com/agitter/single-cell-pseudotime]。RNA velocityといった転写産物のスプライシングの状態から細胞の分化状態を推定する方法もある<ref><pubmed>30089906</pubmed></ref>。しかし、これらの方法は、あくまで発生途上の[[細胞系譜]]や細胞分化の推定に過ぎない。細胞系譜を更に確実に観察しつつ、scRNA-seqを行うことで、細胞タイプの系統関係を調べる方法として、CRISPR-Cas9を用いた[[ゲノム編集]]による記録法を導入したscGESTALT<ref><pubmed>29608178</pubmed></ref>、ScarTrace<ref><pubmed>29590089</pubmed></ref> 、LINNAEUS<ref><pubmed>29644996</pubmed></ref>がある。

• [[大脳皮質]]には、[[錐体細胞]]や[[非錐体細胞]]などの神経細胞や様々なグリア細胞などが見られ、古くから神経細胞タイプの識別が行われてきた。初期のscRNA-seq技術でも、マウス皮質の小規模な細胞数を分類した研究で、これまで知られていた主要な細胞タイプとは違うタイプが見つかりその有効性が示された<ref><pubmed>25700174</pubmed></ref>。その後のDroplet使用の3’エンドリード法を利用した多数の細胞数の解析で、更に多数の神経細胞のタイプが見つかっている<ref><pubmed>32839617</pubmed></ref><ref><pubmed>28846088</pubmed></ref><ref><pubmed>30096299</pubmed></ref><ref><pubmed>30096314</pubmed></ref><ref><pubmed>30382198</pubmed></ref><ref><pubmed>29320739</pubmed></ref><ref><pubmed>28846088</pubmed></ref>[https://doi.org/10.1101/2020.03.14.991018][https://doi.org/10.1101/2020.06.04.105700]。特に、GABA作動性介在神経細胞タイプの多様性とその発生<ref><pubmed>28942923</pubmed></ref><ref><pubmed>28134272</pubmed></ref><ref><pubmed>29472441</pubmed></ref><ref><pubmed>29513653</pubmed></ref>についての情報は重要であろう。また、初期の発生過程<ref><pubmed>26940868</pubmed></ref><ref><pubmed>30485812</pubmed></ref><pubmed>31073041</pubmed></ref><ref><pubmed>30635555</pubmed></ref><ref><pubmed>30625322</pubmed></ref>、老化<ref><pubmed>31551601</pubmed></ref><の理解が、scRNA-Seq技術を利用することで進んでいる。更に、[[神経活動]]によって変化するトランスクリプトームの変化も細胞ごとに調査され興味深い<ref><pubmed>29230054</pubmed></ref> 。 ヒトを含めた霊長類の大脳についても発達段階を含めてscRNA-seqが適用されてきている<ref><pubmed>26060301</pubmed></ref><ref><pubmed>27339989</pubmed></ref><ref><pubmed>29539641</pubmed></ref><ref><pubmed>29217575</pubmed></ref><ref><pubmed>28846088</pubmed></ref><ref><pubmed>29227469</pubmed></ref><ref><pubmed>31303374</pubmed></ref><ref><pubmed>29867213</pubmed></ref><ref><pubmed>31435019</pubmed></ref><ref><pubmed>32424074</pubmed></ref> [https://doi.org/10.1101/709501[https://doi.org/10.1101/2020.03.31.016972][https://doi.org/10.1101/2020.04.23.056390]。ヒトや霊長類に特徴的とされる[[島]]のvon Economo神経細胞（紡錘細胞）のような希少な神経細胞のscRNA-seqにも成功している<ref><pubmed>32127543</pubmed></ref>。

NGSを用いることで、どんな生物種にも適用可能なscRNA-seqは、既に多様な生物の神経系の細胞の理解、更には種間の相同性や差異の研究に利用されており、神経系の進化を細胞レベルで考察するのに有用であろう（例、センチュウ<ref><pubmed> 28818938 </pubmed></ref>、ショウジョウバエ  <ref><pubmed>29909982</pubmed></ref><ref><pubmed>29149607</pubmed></ref><ref><pubmed>30703584</pubmed></ref><ref><pubmed>29909983</pubmed></ref>、カタユウレイボヤCiona intestinalis <ref><pubmed>30069052</pubmed></ref><ref><pubmed>30228204</pubmed></ref>、ゼブラフィッシュ<ref><pubmed>31018142</pubmed></ref><ref><pubmed>30929901</pubmed></ref>、アカミミガメTrachemys scripta elegans、トカゲPogona vitticeps, pv<ref><pubmed>29724907</pubmed></ref>、ニワトリ[A]、霊長類<ref><pubmed>30730291</pubmed></ref><ref><pubmed>31619793</pubmed></ref>[https://doi.org/10.1101/2020.03.31.016972]）。ただ、遺伝子やトランスクリプトームの研究が進んでいる生物種では比較的容易であるが、遺伝子のアノテーションが十分でない生物種を用いる場合、scRNA-seqのデータ解析は困難を伴うので、NCBIのTaxonomy[https://www.ncbi.nlm.nih.gov/taxonomy]やEggNOG [http://eggnogdb.embl.de] <ref><pubmed>30418610</pubmed></ref>などを利用する。また種を超えた細胞タイプの相同性の理解には様々な工夫が必要である<ref><pubmed>31552245</pubmed></ref><ref><pubmed>30712875</pubmed></ref>

獲得されたscRNA-seqのデータは様々な目的で利用できるので、データベース化し利用できるようにする必要がある。神経系のトランスクリプトーム一般のデータベースが多数公開されており<ref><pubmed>29437890</pubmed></ref>、scRNA-seqのデータも基本的にNCBIのGene Expression Omnibus[https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/]に登録されている。また、オープンサイエンス推進のためにcommon coordinate framework (CCF) やcentral annotation platform (CAP)という概念のもと、特にscRNA-seqを意識したものとして、米国のBRAIN Initiative Cell Census Consortium<ref><pubmed>29096072</pubmed></ref> 、Human Cell Atlas ProjectのHuman Cell Atlas Data Portal [https://data.humancellatlas.org]、アレン脳研究所のAllen Brain Atlas [https://portal.brain-map.org]、ブロード研究所のSingle Cell Portal [https://singlecell.broadinstitute.org/]などのデータベースが稼働している。また、異なった方法や実験で得られたscRNA-seqのデータを体系的に比較することも重要であり、Seurat 3.0以降に組み込まれたMMN (Mutual Nearest Neighbors)、LIGER<ref><pubmed>31178122</pubmed></ref> 、Harmony<ref><pubmed>31740819</pubmed></ref>  、MetaNeighber<ref><pubmed>29491377</pubmed></ref>のようなアルゴリズムが開発されている。

多数の細胞を扱うscRNA-seqの弱点は、組織から細胞や細胞核を解離する必要があるので、その細胞が存在していた解剖学的あるいは空間的な位置の情報を消去してしまうということである。組織切片におけるタンパク質などの分布は免疫組織化学、mRNAの分布はin situ hybridizationで検出することができるが、数多くのmRNAの分布を情報処理技術と組み合わせ一気に同定する方法がscRNA-seqと同様に開発されてきている。Slide-seq<ref><pubmed>30923225</pubmed></ref>[ https://doi.org/10.1101/2020.03.12.989806]、osmFISH<ref><pubmed>30377364</pubmed></ref>、STARmap (spatially-resolved transcript amplicon readout mapping), <ref><pubmed>29930089</pubmed></ref>、seqFISH　　<ref><pubmed>27764670</pubmed></ref>、pciSeq(probabilistic cell typing by in situ sequencing)、DSP(Digital Spatial Profiling) <ref><pubmed>32393914</pubmed></ref>、Expansion sequencing[http://doi.org/10.1101/2020.05.13.094268]

、更に10x Genomics社が市販するVisiumなどがある。現状では、大きな組織の空間トランスクリプトミクスは、空間解像度が細胞レベルにいたっておらず、技術普及の観点からも課題が多い。しかし、そのデータを解析するためのアルゴリズム<ref><pubmed>29553578</pubmed></ref><ref><pubmed>29553579</pubmed></ref><ref><pubmed>32350282</pubmed></ref> [https://doi.org/10.1101/757096][ https://doi.org/10.1101/701680] [https://doi.org/10.1101/431957]や、更にMerFish <ref><pubmed>25858977</pubmed></ref>、corrFISH　　<ref><pubmed>27271198</pubmed></ref>のように、subcellularレベルで多数のmRNAを検出する方法が開発されてきており<ref><pubmed>25549890</pubmed></ref>、scRNA-seqと組み合わせることで、その弱点を補う空間トランスクリプトミクスにも利用され始め<ref><pubmed>30385464</pubmed></ref>[https://doi.org/10.1101/2020.06.04.105700]、今後の発展が期待される。