「ディファレンシャルディスプレイ」の版間の差分
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英：differential display 英略語：DDRT-PCR, DD-PCR 仏：l'affichage différentiel | |||
ディファレンシャルディスプレイ（別名、ディファレンシャルディスプレイRT-PCR (DDRT-PCR, DD-PCR)）とは、[[wikipedia:ja:遺伝子|遺伝子]]発現の量の差異を[[wikipedia:ja:PCR|PCR]]法により解析する方法の一種である。ここで、ディスプレイ(display)とは、目的遺伝子を[[wikipedia:ja:ゲル|ゲル]]上で視覚的に表示するとの意であり、多数のRNA試料を同時に比較して、様々な発現パターンを示すcDNAを包括的に同定しその発現量を比較できることから、ゲノム科学における遺伝子発現解析 に有力な手法である<ref name=Liang_Pardee_Science><pubmed>1354393</pubmed></ref><ref name=Liang_Biotech><pubmed>12188186</pubmed></ref><ref>'''野島博'''<br>最新生命科学キーワードブック<br>羊土社: 2007</ref>。 | ディファレンシャルディスプレイ（別名、ディファレンシャルディスプレイRT-PCR (DDRT-PCR, DD-PCR)）とは、[[wikipedia:ja:遺伝子|遺伝子]]発現の量の差異を[[wikipedia:ja:PCR|PCR]]法により解析する方法の一種である。ここで、ディスプレイ(display)とは、目的遺伝子を[[wikipedia:ja:ゲル|ゲル]]上で視覚的に表示するとの意であり、多数のRNA試料を同時に比較して、様々な発現パターンを示すcDNAを包括的に同定しその発現量を比較できることから、ゲノム科学における遺伝子発現解析 に有力な手法である<ref name=Liang_Pardee_Science><pubmed>1354393</pubmed></ref><ref name=Liang_Biotech><pubmed>12188186</pubmed></ref><ref>'''野島博'''<br>最新生命科学キーワードブック<br>羊土社: 2007</ref>。 | ||
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以下、通常のRNA試料を対象としたディファレンシャルディスプレイ法について説明する[[Image:Differentialdisplay.png|thumb|400px|ディファレンシャルディスプレイ法]]。 | 以下、通常のRNA試料を対象としたディファレンシャルディスプレイ法について説明する[[Image:Differentialdisplay.png|thumb|400px|ディファレンシャルディスプレイ法]]。 | ||
細胞中で発現したmRNAすべてを[[wikipedia:ja:逆転写|逆転写]]しcDNAを得た後、これを[[wikipedia:ja:鋳型|鋳型]]にして複数の混合[[wikipedia:ja:プライマー|プライマー]] | 細胞中で発現したmRNAすべてを[[wikipedia:ja:逆転写|逆転写]]しcDNAを得た後、これを[[wikipedia:ja:鋳型|鋳型]]にして複数の混合[[wikipedia:ja:プライマー|プライマー]]を用いたPCRを行う。ここで、特異性を持たせずできるだけ多くの種類の遺伝子を増幅するよう設定した複数のプライマーを用いることにより、非常に多数のバンドが得られる。１つの細胞で発現する約15,000種類の遺伝子すべての発現を網羅して探索するために、4種類のアンカープライマーと20種類の混成プライマー(10mer)を用いてPCRを行う。得られたバンドの強弱を遺伝子発現の強度の指標とし、特定の物質添加の有無などさまざまな操作・環境の違いによりその細胞のどの遺伝子が変化しているかを見出す。 | ||
# アンカープライマーによるmRNAの選択的逆転写（第1鎖合成） | # アンカープライマーによるmRNAの選択的逆転写（第1鎖合成） | ||
#:比較したい２種類（またはそれ以上）の細胞からそれぞれ抽出したmRNAを、ポリ(A)鎖と結合するアンカープライマーと逆転写酵素を用いた逆転写反応によってcDNAに変換する。アンカープライマーとしはT(チミジン)12個からなる[[wikipedia:ja:オリゴヌクレオチド|オリゴヌクレオチド]] | #:比較したい２種類（またはそれ以上）の細胞からそれぞれ抽出したmRNAを、ポリ(A)鎖と結合するアンカープライマーと逆転写酵素を用いた逆転写反応によってcDNAに変換する。アンカープライマーとしはT(チミジン)12個からなる[[wikipedia:ja:オリゴヌクレオチド|オリゴヌクレオチド]]の3’端に1個の任意の塩基を付加したものを用いる。 | ||
# 任意プライマーによるmRNAの選択的第2鎖合成とPCRによる増幅 | # 任意プライマーによるmRNAの選択的第2鎖合成とPCRによる増幅 | ||
#:次に、合成されたcDNAを鋳型に、アンカープライマーと任意の混成塩基配列を持つ（通常10merの）オリゴヌクレオチド群をプライマーとしてPCRを行う。これによって任意の共通塩基配列をもつ複数のcDNA断片を、同時にPCR増幅する。この結果、両端をアンカープライマーと任意プライマーの配列で置換された分子が生じる。 | #:次に、合成されたcDNAを鋳型に、アンカープライマーと任意の混成塩基配列を持つ（通常10merの）オリゴヌクレオチド群をプライマーとしてPCRを行う。これによって任意の共通塩基配列をもつ複数のcDNA断片を、同時にPCR増幅する。この結果、両端をアンカープライマーと任意プライマーの配列で置換された分子が生じる。 | ||