「In situハイブリダイゼーション法」の版間の差分

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 === プローブの調製 ===
-　目的のmRNAを検出するために、そのmRNAと特異的にハイブリダイズする、つまり、目的のmRNAと相補的な配列をもったRNAまたはDNAプローブが必要である。プローブとして、<br>
+　目的のmRNAを検出するために、そのmRNAと特異的にハイブリダイズする、つまり、目的のmRNAと相補的な配列をもったRNAまたはDNAプローブが必要である。プローブとして、
 A. 化学合成したDNAを用いるオリゴヌクレオチドプローブ<br>
 B. DNA合成酵素によりin vitroで合成したDNAプローブ<br>
 C. RNA合成酵素によりin vitroで合成したRNAプローブ<br>
-の3種類がよく用いられている。DNAオリゴプローブは、DNA合成装置で合成する。B, Cにおいては、プローブ合成のための鋳型DNAが必要である。RNA-RNAハイブリッドが3者の中で最も安定であり、現在RNAプローブを用いる方法が一般的である。合成したRNAが分解されないように細心の注意を払う。他にlocked nucleic acid (LNA)（後述）やペプチド核酸をプローブとして用いる方法がある。プローブを可視化のために標識する方法には主に次の2つの方法がある。<br>
+の3種類がよく用いられている。DNAオリゴプローブは、DNA合成装置で合成する。B, Cにおいては、プローブ合成のための鋳型DNAが必要である。RNA-RNAハイブリッドが3者の中で最も安定であり、現在RNAプローブを用いる方法が一般的である。合成したRNAが分解されないように細心の注意を払う。他にlocked nucleic acid (LNA)（後述）やペプチド核酸をプローブとして用いる方法がある。プローブを可視化のために標識する方法には主に次の2つの方法がある。
 a. 酵素抗体法または蛍光抗体法：適当な抗原（ジゴキシゲニンdigoxigenin [DIG], フルオレセインfluorescein, ビオチン biotinなど）の結合したヌクレオチドを用いてプローブを標識し、その抗原に対する抗体を用いて発色または蛍光により可視化する。<br>
 b. 放射性同位元素（radioisotope: RI）を用いて、オートラジオグラフィー法により可視化する。
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 　DNAの二重らせん構造は、塩基対A：Tに形成される2つの水素結合と塩基対G：Cに形成される3つの水素結合により安定に保たれている。この二本鎖を一本鎖にする方法の1つとして、熱変性がある。二重らせんDNA溶液の温度を高くしながら、DNA溶液の260 nmの吸光度A260を測定すると、しだいにA260は高くなる。これはDNAの二重らせんが壊れ、一本鎖になるためで、この温度による吸光度の変化を表す曲線をDNAの融解曲線とよんでいる。この現象は、らせんが消失して塩基間の相互作用が少なくなるため、塩基の光吸収の効率が変化し（深色効果）、各塩基の分子吸光係数が高くなるために生じる。温度の低い時のDNAをヘリックス100％とし、高温での吸光度が一定になる状態でヘリックス0％と仮定すると、ヘリックス50％になる温度（融解温度melting temperature: Tm）を決定することができる。
-　Tmは二重らせんの安定度の目安になる。非常に安定ならせんであれば、Tmは80〜90℃になる。逆に不安定であれば、30〜40℃になる。TmはGC塩基対の含量、核酸の長さ、核酸の塩基対のミスマッチなどに依存し、DNA溶液のイオン強度（塩濃度）や組成により変化する。Tmに関する経験的な式は、例えば、RNA-RNAハイブリッドの場合、<br>
+　Tmは二重らせんの安定度の目安になる。非常に安定ならせんであれば、Tmは80〜90℃になる。逆に不安定であれば、30〜40℃になる。TmはGC塩基対の含量、核酸の長さ、核酸の塩基対のミスマッチなどに依存し、DNA溶液のイオン強度（塩濃度）や組成により変化する。Tmに関する経験的な式は、例えば、RNA-RNAハイブリッドの場合、
-Tm＝79.8＋18.5（logM）＋0.584（%G＋C）＋0.118 × 10-2(%G+C)2−0.35（%formamide）− 820/l<br>
+Tm＝79.8＋18.5（logM）＋0.584（%G＋C）＋0.118 × 10<sup>-2</sup>(%G+C)<sup>2</sup>−0.35（%formamide）− 820/l<br>
 　ここで、Mは1価の正イオンのモル濃度、％G＋CはGC含量、％formamideはホルムアミド濃度、lはプローブの長さ（bp）である。
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 １．野地澄晴編、免疫染色&in situハイブリダイゼーション、羊土社、東京、2006.
 ２．In Situ Hybridization, A Practical Approach, 2nd Edition, Edited by D.G. Wilkinson, Oxford University Press, Oxford, 1999.
 ３．DIG
 https://e-labdoc.roche.com/LFR_PublicDocs/ras/11209256910_en_15.pdf
 ４．発色反応、発色基質全般
 http://www.piercenet.com/browse.cfm?fldID=5A423056-5056-8A76-4E25-1E5F9C0596B2
 ５．発色基質（HNPP, Fast Red）
 https://e-labdoc.roche.com/LFR_PublicDocs/ras/11758888001_en_07.pdf
 ６．チラミドを用いたISHとシグナル増強（CARD）
 http://www.perkinelmer.co.jp/products_ls/resrch/pdf/BRO_TSA_TSAPlus.pdf
 ７．Choi HM, Chang JY, Trinh le A, Padilla JE, Fraser SE, Pierce NA.　Programmable in situ amplification for multiplexed imaging of mRNA expression.　Nat Biotechnol.　2010 Nov;28(11):1208-1212.
 ８．マイクロRNAのISH (locked nucleic acid)
 http://www.cosmobio.co.jp/product/bunshiseibutsu/mirna/mirna_5/exq_20101007.asp?entry_id=6535
 ９．アレン　ブレイン　アトラス
 Lein ES et al. Genome-wide atlas of gene expression in the adult mouse brain. Nature. 2007 Jan 11;445(7124):168-176.
 . 基礎生物学研究所山森研究室（渡我部昭哉博士作成）ホームページBraInSitu (http://www.nibb.ac.jp/brish/index.html) ：脳の組織切片ISH法（特に浮遊法）について詳細なプロトコールが紹介されている。
 （執筆者：大内淑代　担当編集委員：大隅典子）

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