「ディファレンシャルディスプレイ」の版間の差分

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英語名：differential display　英略語：DDRT-PCR, DD-PCR
[[ファイル:Example.jpg]]英語名：differential display　英略語：DDRT-PCR, DD-PCR


　ディファレンシャルディスプレイ（別名、ディファレンシャルディスプレイRT-PCR (DDRT-PCR, DD-PCR)）とは、[[wikipedia:ja:遺伝子|遺伝子]]発現の量の差異を[[wikipedia:ja:PCR|PCR]]法により解析する方法の一種である。ここで、ディスプレイ(display)とは、目的遺伝子をゲル上で視覚的に表示するとの意であり、多数のRNA試料を同時に比較して、様々な発現パターンを示すcDNAを包括的に同定しその発現量を比較できることから、ゲノム科学における遺伝子発現解析 に有力な手法である<ref name=Liang_Pardee_Science><pubmed>1354393</pubmed></ref><ref name=Liang_Biotech><pubmed>12188186</pubmed></ref><ref>'''野島博'''<br>最新生命科学キーワードブック<br>羊土社: 2007</ref>。  
　ディファレンシャルディスプレイ（別名、ディファレンシャルディスプレイRT-PCR (DDRT-PCR, DD-PCR)）とは、[[wikipedia:ja:遺伝子|遺伝子]]発現の量の差異を[[wikipedia:ja:PCR|PCR]]法により解析する方法の一種である。ここで、ディスプレイ(display)とは、目的遺伝子をゲル上で視覚的に表示するとの意であり、多数のRNA試料を同時に比較して、様々な発現パターンを示すcDNAを包括的に同定しその発現量を比較できることから、ゲノム科学における遺伝子発現解析 に有力な手法である<ref name=Liang_Pardee_Science><pubmed>1354393</pubmed></ref><ref name=Liang_Biotech><pubmed>12188186</pubmed></ref><ref>'''野島博'''<br>最新生命科学キーワードブック<br>羊土社: 2007</ref>。  
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　以下、通常のRNA試料を対象としたディファレンシャルディスプレイ法について説明する。
　以下、通常のRNA試料を対象としたディファレンシャルディスプレイ法について説明する。


　細胞中で発現したmRNAすべて（total RNA）を逆転写しtotal cDNAを得た後、これを鋳型にして複数のプライマーミックスを用いたPCRを行う。ここで、特異性を持たせずできるだけ多くの種類の遺伝子を増幅するよう設定した複数のプライマーを用いることにより、非常に多数のバンドが得られる。 得られたバンドの強弱を遺伝子発現の強度の指標とし、特定の物質添加の有無などさまざまな操作•環境の違いによりその細胞のどの遺伝子が変化しているかを見出す。以下に手順を記述する[[Image:Differentialdisplay.jpg|ディファレンシャルディスプレイ法]] 。
　細胞中で発現したmRNAすべて（total RNA）を逆転写しtotal cDNAを得た後、これを鋳型にして複数のプライマーミックスを用いたPCRを行う。ここで、特異性を持たせずできるだけ多くの種類の遺伝子を増幅するよう設定した複数のプライマーを用いることにより、非常に多数のバンドが得られる。 得られたバンドの強弱を遺伝子発現の強度の指標とし、特定の物質添加の有無などさまざまな操作•環境の違いによりその細胞のどの遺伝子が変化しているかを見出す。以下に手順を記述する[[Image:Differentialdisplay.png[[ファイル:]]|thumb|ディファレンシャルディスプレイ法]] 。


① アンカープライマーによるmRNAの選択的逆転写（第1鎖合成） 比較したい２種類（またはそれ以上）の細胞からそれぞれ抽出したmRNAを、ポリ(A)鎖と結合するアンカープライマー(anchor primer)と逆転写酵素を用いた逆転写反応によってcDNAに変換する。アンカープライマーとしはT(チミジン)12個からなるオリゴヌクレオチドの3’端に１個の任意の塩基を付加したものを用いる。１つの細胞で発現する約15,000種類の遺伝子すべての発現を網羅して探索するために、4種類のアンカープライマーと20種類の混成プライマー(10mer)を用いてPCRを行う。 <br> <br>
① アンカープライマーによるmRNAの選択的逆転写（第1鎖合成） 比較したい２種類（またはそれ以上）の細胞からそれぞれ抽出したmRNAを、ポリ(A)鎖と結合するアンカープライマー(anchor primer)と逆転写酵素を用いた逆転写反応によってcDNAに変換する。アンカープライマーとしはT(チミジン)12個からなるオリゴヌクレオチドの3’端に１個の任意の塩基を付加したものを用いる。１つの細胞で発現する約15,000種類の遺伝子すべての発現を網羅して探索するために、4種類のアンカープライマーと20種類の混成プライマー(10mer)を用いてPCRを行う。 <br> <br>
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③ 電気泳動(もしくは蛍光イメージアナライザー等)による発現の分類 反応生成物をポリアクリルアミド電気泳動で展開すると、複数のcDNA断片からなるフィンガープリントが得られる。この中から、強度に変化のある、または特異的な泳動パターンを示すバンドの切り出しを行う。 <br> <br>
③ 電気泳動(もしくは蛍光イメージアナライザー等)による発現の分類 反応生成物をポリアクリルアミド電気泳動で展開すると、複数のcDNA断片からなるフィンガープリントが得られる。この中から、強度に変化のある、または特異的な泳動パターンを示すバンドの切り出しを行う。 <br> <br>


④ バンドの再増幅およびクローン化 ゲルからサンプルを回収し、それを基質としてPCRを繰り返し行い、再現性を高めて、cDNAクローンを回収する。 <br> <references /> <br> <br><br>
④ バンドの再増幅およびクローン化 ゲルからサンプルを回収し、それを基質としてPCRを繰り返し行い、再現性を高めて、cDNAクローンを回収する。  


'''参考文献'''
== 参考文献 ==
 
<references />  
1. P Liang, A B Pardee Differential display of eukaryotic messenger RNA by means of the polymerase chain reaction. Science: 1992, 257(5072); 967–71
 
2. P Liang A decade of differential display. Biotechniques: 2002, 33(2); 338–46
 
3. 野島博 最新生命科学キーワードブック 羊土社 (2007).
 
4. H Gomi, W Sun, C E Finch, S Itohara, K Yoshimi, R F Thompson Learning induces a CDC2-related protein kinase, KKIAMRE. J. Neurosci.: 1999, 19(21), 9530–37
 
5.　T Ito, K Kito, N Adachi, Y Mitsui, H Hagiwara, Y Sakaki Fluorescent differential display: arbitrarily primed RT-PCR fingerprinting on an automated DNA sequencer. FEBS Lett.: 1994, 351(2), 231-36 5.
 
6. 伊藤隆司 Differential Display. 実験医学別冊　新遺伝子工学ハンドブック改訂第4版羊土社: 2003, 60-4 （なお、第５版から本項目は削除されている）
 
7. Wikipedia. Differential display. http://en.wikipedia.org/wiki/Differential_display
 
8.　長谷俊治、高尾敏文、高木淳一編　 タンパク質をみるー構造と挙動　化学同人: 2009
 
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（執筆者：岸本泰司、桐野　豊、担当編集委員：）
（執筆者：岸本泰司、桐野　豊、担当編集委員：）
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