「超解像蛍光顕微鏡」の版間の差分

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===Localization Microscopy===

[[Image:PALM図8.png|400px|thumb|'''図１　PALMの原理''' '''~~①光刺激による疎らなPSFPのオンへのスイッチング~~'''　~~実際はここでは画像は撮影されないが理解のために蛍光状態がオフからオンに切り替わったPSFPの視野内での位置を灰色の◯で示した。~~

[[Image:PALM図8.png|400px|thumb|'''図１　PALMの原理''' '''①光刺激による疎らなPSFPのオン'''　実際には画像は撮影されないが蛍光状態がオフからオンに切り替わったPSFPの視野内での位置を灰色の◯で示した。

'''②蛍光観察による蛍光一分子画像の取得'''　蛍光観察はPALMでは主に全反射顕微鏡によって行う。得られる輝点は前述のとおり2次元のPSFに従った広がりを持つ。撮影後はいちど視野内にあるオンのPSFPを全て退色させる（あるいは退色するまで撮影を続ける）。

'''②蛍光観察による蛍光一分子画像の取得'''　蛍光観察は主に全反射顕微鏡によって行う。得られる輝点は前述のとおり2次元のPSFに従った広がりを持つ。撮影後はいちど視野内にあるオンのPSFPを全て退色させる（あるいは退色するまで撮影を続ける）。

'''③座標推定による分子の局在画像の構築'''　②の蛍光一分子画像を2次元のガウス関数で解析する事で、視野内での蛍光分子の「座標」を推定する<ref group="注">フィッティング式、必要なら最後でOK</ref>。また推定座標の「不確かさ」も同時に求められる。座標推定から構築した点は②の元の点に比べて小さくなるが、極小の一点として表されるわけではなく、この点もまた2次元のガウス関数の輝度分布として表わされる。この2次元のガウス関数の中心は解析により推定された「座標」、標準偏差が「不確かさ」になる<ref group="注">2次元のガウス関数、必要なら最後に</ref>。また各一分子の輝度の合計が等しくなるように規格化される。この結果、精度が高く推定された点は小さな明るい点として、精度が低く推定された点は大きな暗い点として局在画像上で表わされる。

'''④1-Nサイクルの積分によるPALM画像の構築'''　上記①～③操作を全てのPSFPがなくなるまで（Nサイクル）繰り返した後に、③で得られた画像を全て足し合わせる事でPALM画像が得られる<ref group="注">実際は全ての点をPALM画像に入れるのではなく、推定座標の「不確かさ」が大きな点はPALM画像には含めないという"足切り"操作が行われる。</ref>。最終的に得られたPALM画像の輝度は「蛍光分子がその位置で見つかる可能性」に比例する。]]

~~光学顕微鏡の空間分解能は先述のとおり2つの点光源を異なる点として区別する「2点分解能」で表現され、可視光では200-300~~ nm程度である。しかしながら隣り合った2点が重ならないほど離れていれば、蛍光一分子のPSFを2次元のガウス関数で解析する事で最大1 nm程度の精度で位置を決定できる。この蛍光一分子の正確な位置解析は（FIONA；fluorescence imaging with one-nanometer accuracy）として知られる<ref><pubmed> 12791999 </pubmed></ref>。超解像顕微鏡法の一つであるLocalization microscopy（蛍光一分子局在化顕微鏡法）は、FIONAを利用し光学顕微鏡の分解能を超えた画像を取得する方法である。このような考えに基づいて超解像を達成するというアイディアは古くからあったが<ref><pubmed> 19859146 </pubmed></ref>、理想的なサンプルを準備するのが困難なため実現はされなかった。例えば単純にGFP融合タンパク質を発現した細胞にFIONAを適用するのは、多くの場合で以下の問題が生じる。

光学顕微鏡の空間分解能は先述のとおり2つの点光源を異なる点として区別する「2点分解能」で表現され、可視光では250 nm程度である。しかしながら隣り合った2点が重ならないほど離れていれば、蛍光一分子のPSFを2次元のガウス関数で解析する事で最大1 nm程度の精度で位置を決定できる。この蛍光一分子の正確な位置解析は（FIONA；fluorescence imaging with one-nanometer accuracy）として知られる<ref><pubmed> 12791999 </pubmed></ref>。超解像顕微鏡法の一つであるLocalization microscopy（蛍光一分子局在化顕微鏡法）は、FIONAを利用し光学顕微鏡の分解能を超えた画像を取得する方法である。このようなアイディアは古くから提案されていたが<ref><pubmed> 19859146 </pubmed></ref>、理想的なサンプルを作成するのが困難なため実現はされなかった。例えばGFPを何らかの興味のあるタンパク質と融合させ、それを発現した細胞を想定する。この細胞にFIONAを適用しようとすると、ほぼ確実に以下の問題が生じる。

~~１）通常の条件では、発現しているGFPの数が多いため隣り合ったGFPのPSFが重なりあってしまいFIONAを適用できない。~~

１）発現しているGFPの数が多いため、隣り合ったGFPのPSFが重なりあってしまいFIONAを適用できない。

~~２）この状況を回避するためにPSFの重なりが無い程度に一つの細胞にGFPを極少なく発現させる事は困難である。~~

２）上記の状況を回避するためにPSFの重なりが無い程度に一つの細胞にGFPを極少なく発現させる事は困難である。

~~３）仮に２）が達成できたとしても数個のGFPの詳細位置がわかるだけであり、分子の局在情報として不十分である。~~

３）上記が仮に達成できたとしても数個のGFPの詳細位置がわかるだけであり、分子の局在情報としては不十分である。

これらの問題を巧妙に回避するために蛍光一分子局在化顕微鏡法では、蛍光色素の蛍光状態（蛍光能）や蛍光色が切り替わる性質を巧みに利用している。それぞれについて以下の項目で紹介する

これらの問題を巧妙に回避するために蛍光一分子局在化顕微鏡法では、ある種の蛍光色素が特定条件下で蛍光状態(オン・オフ)や蛍光色が切り替わる性質を巧みに利用している。それぞれについて以下の項目で紹介する。

====PALM,FPALM====

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==注釈==

==関連項目==

*[[光]]

*[[蛍光イメージング]]

*[[蛍光一分子観察]]

*[[全反射顕微鏡]]

*[[蛍光タンパク質]]

*[[ケージド蛍光分子]]

*[[ヤブロンスキーダイアグラム(Jablonski diagram)]]

==参考文献==

「超解像蛍光顕微鏡」の版間の差分

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