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高速液体クロマトグラフィーとは、物質が固定相（カラムの担体）とこれに接して流れる移動相（液体）との親和力の違いから一定の比率で分布し、その比率が物質によって異なる事を利用して分離する方法である。移動相を高圧で流すことで高い分離および感度を得ることができ、固定相、移動相、検出器の組み合わせにより様々な物質の分析を行うことが可能である。神経科学分野においても各種神経伝達物質やタンパク質、ペプチドの分析など、幅広く利用されている。 | 高速液体クロマトグラフィーとは、物質が固定相（カラムの担体）とこれに接して流れる移動相（液体）との親和力の違いから一定の比率で分布し、その比率が物質によって異なる事を利用して分離する方法である。移動相を高圧で流すことで高い分離および感度を得ることができ、固定相、移動相、検出器の組み合わせにより様々な物質の分析を行うことが可能である。神経科学分野においても各種神経伝達物質やタンパク質、ペプチドの分析など、幅広く利用されている。 | ||
[[ファイル:HPLC 図1.jpg|thumb|300px|right|図1. (A) HPLCの基本フローチャート. (B) プレカラム法の基本フローチャート. (C) ポストカラム法の基本フローチャート.]] | |||
==原理== | ==原理== | ||
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===高速液体クロマトグラフィーの基本構成=== | ===高速液体クロマトグラフィーの基本構成=== | ||
移動相として溶媒や緩衝溶液を送るポンプ、試料を注入するインジェクター（試料導入部）、物質を分離するためのカラム、検出器、データ処理装置（PC）から構成されている(図1-A)。 | 移動相として溶媒や緩衝溶液を送るポンプ、試料を注入するインジェクター（試料導入部）、物質を分離するためのカラム、検出器、データ処理装置（PC）から構成されている(図1-A)。 | ||
#ポンプ | #ポンプ | ||
#:移動相の制御に欠かせない装置である。メーカーによって多少異なる形をしているが基本的な構造は同じである。１台のポンプで１つの移動相が基本であるが、２つの電磁弁が付属していると２つの移動相を制御することができる。高速アミノ酸分析計（HITACHI）では電磁弁が５つ付属しており、１台のポンプで５種類の移動相を切り替えて１分析で約４０種類のアミノ酸を定量することができる。電磁弁以外では、リザーバ−切り替えバルブがあり同様に６種類の移動相を変えることが可能である。 | #:移動相の制御に欠かせない装置である。メーカーによって多少異なる形をしているが基本的な構造は同じである。１台のポンプで１つの移動相が基本であるが、２つの電磁弁が付属していると２つの移動相を制御することができる。高速アミノ酸分析計（HITACHI）では電磁弁が５つ付属しており、１台のポンプで５種類の移動相を切り替えて１分析で約４０種類のアミノ酸を定量することができる。電磁弁以外では、リザーバ−切り替えバルブがあり同様に６種類の移動相を変えることが可能である。 | ||
[[ファイル:HPLC 図2.jpg|thumb|300px|right|図2. (A) OPA化のアミノ基の反応． (B) 実験に用いたHPLCのフローチャート. (C)と(D)は、 OPA化アミノ酸のクロマトグラム. (C) 0.5~20pmol/uLのスタンダード. (D)脳組織をホモジネートしたサンプル. | |||
分析条件 | |||
装置：Shimadzu SCL-10Avpシステム, オートサンプラー：GILSON 232XLシステム，カラム：COSMOSIL 5C18-MS-II(4.6ID×150mm)， 流速：0.8ml/min， カラム温度：36℃， 励起波長：340nm, 蛍光波長：445nm． | |||
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#インジェクター | #インジェクター | ||
#:インジェクターには、マイクロシリンジを用いて手動でサンプルを注入するマニュアルインジェクターと、専用バイアル瓶に入れたサンプルをオートサンプラーと呼ばれる装置を用いて自動的に注入するオートインジェクターがある。各メーカーでシステムに合わせたオートサンプラーを開発しており、生体サンプルを取り扱うための冷却機能を備えた装置や誘導化するための反応型オートサンプラーがある。現在では、オートサンプラーを使用して分析する事が多い。 | #:インジェクターには、マイクロシリンジを用いて手動でサンプルを注入するマニュアルインジェクターと、専用バイアル瓶に入れたサンプルをオートサンプラーと呼ばれる装置を用いて自動的に注入するオートインジェクターがある。各メーカーでシステムに合わせたオートサンプラーを開発しており、生体サンプルを取り扱うための冷却機能を備えた装置や誘導化するための反応型オートサンプラーがある。現在では、オートサンプラーを使用して分析する事が多い。 | ||
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===測定方法=== | ===測定方法=== | ||
#プレカラム法とポストカラム法 | #プレカラム法とポストカラム法 | ||
#:HPLCで目的の物質がそのまま分析できない場合、感度を上げるために誘導化を行うことが多い。その誘導化の方法には、プレカラム法（図1-B）と ポストカラム法（図1-C）がある。プレカラム法は成分を分離する前に誘導化する方法であり、ポストカラム法はカラムで成分を分離してから誘導化する方法である。一般に感度を上げるためにプレカラム法で蛍光誘導化が行われる事が多い。蛍光誘導化（ラベル化）とは、蛍光を発しない物質を化学反応で蛍光を発する物質に変換すること、蛍光物質を化学的に結合させることである。測定する物質の種類にもよるが蛍光誘導化するとfmol~pmolまで測定可能になる。ポストカラム法では、分離後誘導化試薬と反応するため別途ポンプが必要となる。また、反応させるための反応コイルや反応カラムを使用することによってサンプルが拡散するため、ポストカラム法はプレカラム法に比べ特に溶出時間が遅くなり物質の感度が悪くなることがある。 | #:HPLCで目的の物質がそのまま分析できない場合、感度を上げるために誘導化を行うことが多い。その誘導化の方法には、プレカラム法（図1-B）と ポストカラム法（図1-C）がある。プレカラム法は成分を分離する前に誘導化する方法であり、ポストカラム法はカラムで成分を分離してから誘導化する方法である。一般に感度を上げるためにプレカラム法で蛍光誘導化が行われる事が多い。蛍光誘導化（ラベル化）とは、蛍光を発しない物質を化学反応で蛍光を発する物質に変換すること、蛍光物質を化学的に結合させることである。測定する物質の種類にもよるが蛍光誘導化するとfmol~pmolまで測定可能になる。ポストカラム法では、分離後誘導化試薬と反応するため別途ポンプが必要となる。また、反応させるための反応コイルや反応カラムを使用することによってサンプルが拡散するため、ポストカラム法はプレカラム法に比べ特に溶出時間が遅くなり物質の感度が悪くなることがある。 | ||
#アイソクラティック法とグラジエント法 | #アイソクラティック法とグラジエント法 | ||
#:目的物質を移動相の溶媒の性質を変えて分離条件良く分析する方法には、アイソクラティック （Isocratic）法とグラジエント（Gradient）法がある。アイソクラティック法では単一な移動相を用いシンプルな装置で分析する。移動相の組成は複雑で、緩衝溶液のほかに有機溶媒やイオンペア試薬の添加をすることが多い。一方のグラジエント法は、２種類以上の移動相を用いるためHPLCシステムが少々複雑になる。一般的には移動相として水系の緩衝溶液と有機溶媒の２つを用い、徐々に濃度勾配をつけて分離を行う。この方法で良い分離が得られない場合は、移動相の濃度をステップワイズに変えたり、これと直線的に変える方法を組み合わせるとよい。 | #:目的物質を移動相の溶媒の性質を変えて分離条件良く分析する方法には、アイソクラティック （Isocratic）法とグラジエント（Gradient）法がある。アイソクラティック法では単一な移動相を用いシンプルな装置で分析する。移動相の組成は複雑で、緩衝溶液のほかに有機溶媒やイオンペア試薬の添加をすることが多い。一方のグラジエント法は、２種類以上の移動相を用いるためHPLCシステムが少々複雑になる。一般的には移動相として水系の緩衝溶液と有機溶媒の２つを用い、徐々に濃度勾配をつけて分離を行う。この方法で良い分離が得られない場合は、移動相の濃度をステップワイズに変えたり、これと直線的に変える方法を組み合わせるとよい。 | ||
[[ファイル:HPLC 図3.jpg|thumb|300px|right|図 3. (A) HPLCのフローチャート, (B) 2pmol/μLのスタンダード, (C) 脳組織ホモジネートのサンプル. | |||
分析条件 | |||
装置：ポンプHITACHI L-2130，検出器：EICOM L7480とGL Sciences GL-7453A，カラムオーブン：EICOM CTC-100，デガッサー：EICOM DG-100，オートサンプラー：EICOM，ソフトウェア：PowerChrom EPC-500，トラップカラム：COSMOSIL Guard 5C18-MS-II(4.6ID×10mm), 分離用カラム：COSMOSIL 5C18-MS-II(4.6ID×150mm), 流速：1.1ml/min, カラム温度：36℃, 励起波長：340nm, 蛍光波長：440nm． | |||
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#イオンペア試薬 | #イオンペア試薬 | ||
#:イオンペア試薬は、陽イオンと陰イオンの２種類ある。目的の物質が正に電荷して陽イオン（＋）の場合はアルキルスルホン酸塩を、負に電荷して陰イオン（−）の場合は第４級アンモニウム塩を用いる。イオン性物質のサンプルは、イオンペア試薬とイオン結合して電気的に中性となり、さらにイオンペア試薬のアルキル鎖により逆相カラムに保持されて分離できるようになる。数種類のアルキル鎖の長さが異なる試薬があり、分離の度合いを見て選択する。 | #:イオンペア試薬は、陽イオンと陰イオンの２種類ある。目的の物質が正に電荷して陽イオン（＋）の場合はアルキルスルホン酸塩を、負に電荷して陰イオン（−）の場合は第４級アンモニウム塩を用いる。イオン性物質のサンプルは、イオンペア試薬とイオン結合して電気的に中性となり、さらにイオンペア試薬のアルキル鎖により逆相カラムに保持されて分離できるようになる。数種類のアルキル鎖の長さが異なる試薬があり、分離の度合いを見て選択する。 | ||
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#蛍光検出の原理 | #蛍光検出の原理 | ||
#:OPA法は、オルトフタルアルデヒド（o-Phthalaldehyde, OPA）、メルカプトエタノール、アミノ酸由来のアミノ基が環化反応し蛍光を発する物質になり、分析を可能にする方法である(図2-A)。OPA誘導体は、励起波長350±10 nm，蛍光波長450±10 nm程度で蛍光検出することができる。一般に誘導化する場合は過剰の試薬を加えなければならず、残った蛍光誘導化試薬が蛍光を発して分析する物質の妨害となり分析が困難になることがある。その点OPAは、環化反応しないと蛍光を発しないため残存する誘導化試薬を気にする必要がないのが利点である。一方OPA試薬の欠点として、蛍光の持続時間が短いこと、第２級アミンと反応しないためプロリンやハイドロキシプロリンの検出はできないことがあげられる。 | #:OPA法は、オルトフタルアルデヒド（o-Phthalaldehyde, OPA）、メルカプトエタノール、アミノ酸由来のアミノ基が環化反応し蛍光を発する物質になり、分析を可能にする方法である(図2-A)。OPA誘導体は、励起波長350±10 nm，蛍光波長450±10 nm程度で蛍光検出することができる。一般に誘導化する場合は過剰の試薬を加えなければならず、残った蛍光誘導化試薬が蛍光を発して分析する物質の妨害となり分析が困難になることがある。その点OPAは、環化反応しないと蛍光を発しないため残存する誘導化試薬を気にする必要がないのが利点である。一方OPA試薬の欠点として、蛍光の持続時間が短いこと、第２級アミンと反応しないためプロリンやハイドロキシプロリンの検出はできないことがあげられる。 | ||
#測定例１ （グラジエント法） | #測定例１ （グラジエント法） | ||
#:脳組織ホモジネートを用いて、興奮性アミノ酸であるグルタミン酸と抑制性アミノ酸であるGABAを測定した例を述べる。図2-Bに示したHPLCの構成で、グラジエント法を用いて分析した。移動相は２種類あり、移動相Aの組成は、100 mM リン酸緩衝液（pH 5.6）、移動相Bの組成は100％アセトニトリルでステップワイズに濃度を変え、25分間で1分析を行った（グラジエントの条件：0 min→1 min 15%, 1 min→4.5 min 16%, 4.5 min→8 min 21%, 8 min→11 min 24%, 11 min→13.5 min 31%, 13.5 min→16.5 min 35%, 16.5 min→25 min 15%）。蛍光誘導化試薬は、OPA試薬7.5 mgをメタノール300 μLで溶解した後、2メルカプトエタノールを7.5μLを加え、さらにミリQ水1200 μLを加えた。100 mMホウ酸緩衝液（pH 10.0）は、Na<sub>4</sub>B<sub>4</sub>O<sub>7</sub>･10H<sub>2</sub>O 1.905 gをミリQ水50 mLに溶解し調製した。試料の前処理として、摘出した脳組織にすみやかに5〜10倍量の0.2 M PCA(100 μM EDTA･2Na含有)を加え、超音波で30秒間ホモジナイズした。次に、除タンパクを完全にするため氷中で30分間放置した後、4 ℃で10,000 rpm × 15分間遠心し、上清を採取した。上清は20倍に希釈し、15 μLを HPLCサンプルとした。サンプルは、オートサンプラー内にてOPA試薬と反応し、HPLCで分析した。すなわち蛍光誘導化のため反応型のオートサンプラーのサンプルラックを12 ℃に冷却、蛍光誘導化試薬15 μL、サンプル15 μL、100 mM ホウ酸緩衝液（pH 10.0）20 μLを加え30 ℃で2分間インキュベートし、誘導体化されたサンプル35 μLをHPLCにインジェクションした。分析例として、図2に0.5~20 pmol/μLのスタンダード(C)と脳組織をホモジネートしたサンプル(D)を分析したクロマトグラフを示した。定量限界は、0.5 pmol/μLであった。このクロマト条件においては、脳内のグルタミン酸とGABAの濃度は充分な測定感度範囲に入り、その他の生体アミノ酸（アスパラギン酸、セリン、アスパラギン、アルギニン、グリシン、アラニン、タウリン）も同時一斉分析を行うことが可能である。 | #:脳組織ホモジネートを用いて、興奮性アミノ酸であるグルタミン酸と抑制性アミノ酸であるGABAを測定した例を述べる。図2-Bに示したHPLCの構成で、グラジエント法を用いて分析した。移動相は２種類あり、移動相Aの組成は、100 mM リン酸緩衝液（pH 5.6）、移動相Bの組成は100％アセトニトリルでステップワイズに濃度を変え、25分間で1分析を行った（グラジエントの条件：0 min→1 min 15%, 1 min→4.5 min 16%, 4.5 min→8 min 21%, 8 min→11 min 24%, 11 min→13.5 min 31%, 13.5 min→16.5 min 35%, 16.5 min→25 min 15%）。蛍光誘導化試薬は、OPA試薬7.5 mgをメタノール300 μLで溶解した後、2メルカプトエタノールを7.5μLを加え、さらにミリQ水1200 μLを加えた。100 mMホウ酸緩衝液（pH 10.0）は、Na<sub>4</sub>B<sub>4</sub>O<sub>7</sub>･10H<sub>2</sub>O 1.905 gをミリQ水50 mLに溶解し調製した。試料の前処理として、摘出した脳組織にすみやかに5〜10倍量の0.2 M PCA(100 μM EDTA･2Na含有)を加え、超音波で30秒間ホモジナイズした。次に、除タンパクを完全にするため氷中で30分間放置した後、4 ℃で10,000 rpm × 15分間遠心し、上清を採取した。上清は20倍に希釈し、15 μLを HPLCサンプルとした。サンプルは、オートサンプラー内にてOPA試薬と反応し、HPLCで分析した。すなわち蛍光誘導化のため反応型のオートサンプラーのサンプルラックを12 ℃に冷却、蛍光誘導化試薬15 μL、サンプル15 μL、100 mM ホウ酸緩衝液（pH 10.0）20 μLを加え30 ℃で2分間インキュベートし、誘導体化されたサンプル35 μLをHPLCにインジェクションした。分析例として、図2に0.5~20 pmol/μLのスタンダード(C)と脳組織をホモジネートしたサンプル(D)を分析したクロマトグラフを示した。定量限界は、0.5 pmol/μLであった。このクロマト条件においては、脳内のグルタミン酸とGABAの濃度は充分な測定感度範囲に入り、その他の生体アミノ酸（アスパラギン酸、セリン、アスパラギン、アルギニン、グリシン、アラニン、タウリン）も同時一斉分析を行うことが可能である。 | ||
[[ファイル:HPLC 図4.jpg|thumb|300px|right|図 4. (A) 標準物質の分析; 10-100 pg の範囲で定量性がある。(B) マウス線条体抽出物の分析; ドーパミン作動性ニューロンが多いことが分かる。(C) マウス小脳抽出物の分析; 線条体と全く異なる溶出パターンをすることが分かる。 | |||
分析条件 | |||
装置:エイコム社製システム（デガッサー：DG-300, ポンプ：EP-300, カラムオーブン：ATC-300, 検出器：ECD-300, EICOM), カラム:EICOMPAK SC-50DS (Φ3.0 x 150 mm, EICOM), 移動相: 83% 0.1 M 酢酸-クエン酸緩衝液(pH 3.5)/17 % methanol solution containing 190 mg/L SOS and 5 mg/L EDTA•2Na, 流速:0.5 mL/min, 作用電極: グラファイト電極(WE-3G, EICOM), 印加電圧:+750 mV vs. Ag/AgCl(RE-100, EICOM), 注入量:10 μL, 温度: 25℃ | |||
MHPG:3-Methoxy-4-hydroxyphenylglycol, NA:Noradrenaline, AD:Adrenaline, DOPAC:3,4-dihydroxy-phenylacetic acid, NM:Normethanephrine, DA:Dopamine, 5-HIAA:5-Hydroxyindoleacetic acid, ISO:Isoproterenol, HVA:Homovanillic acid, 3-MT:3-Methoxytyramine, 5-HT:5-Hydroxytryptamine | |||
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#測定例２ （スイッチングバルブ法） | #測定例２ （スイッチングバルブ法） | ||
#: 図3-Aに示したHPLCの構成で、アイソクラティック法を用いて脳組織のホモジネートを分析した。移動相は２種類あり、移動相Aにクエン酸−リン酸緩衝液 pH 5.8, 12%アセトニトリル、移動相Bにクエン酸−リン酸緩衝液 pH 6.2, 25%アセトニトリルを用い15分間で1分析を行った。スイッチングバルブは、インジェクションから1分30秒で切り替わり、12分後に元の流路に戻るセッティングをした。蛍光誘導化試薬は、OPA試薬5 mgをメタノール200 μLで溶解した後、2メルカプトエタノール5 μL、0.1 M Na<sub>2</sub>CO<sub>3</sub>溶液800 μL加え、調製した。試料の前処理は、測定例（1）と同様に行い、上清を1200倍に希釈して15 μLをHPLCサンプルにした。蛍光誘導化のため、オートサンプラーのサンプルラックを12 ℃に冷却、蛍光誘導化試薬15 μL、サンプル15 μLを加え30 ℃で2分間インキュベートし、誘導体化されたサンプル10 μLをインジェクションした。 | #: 図3-Aに示したHPLCの構成で、アイソクラティック法を用いて脳組織のホモジネートを分析した。移動相は２種類あり、移動相Aにクエン酸−リン酸緩衝液 pH 5.8, 12%アセトニトリル、移動相Bにクエン酸−リン酸緩衝液 pH 6.2, 25%アセトニトリルを用い15分間で1分析を行った。スイッチングバルブは、インジェクションから1分30秒で切り替わり、12分後に元の流路に戻るセッティングをした。蛍光誘導化試薬は、OPA試薬5 mgをメタノール200 μLで溶解した後、2メルカプトエタノール5 μL、0.1 M Na<sub>2</sub>CO<sub>3</sub>溶液800 μL加え、調製した。試料の前処理は、測定例（1）と同様に行い、上清を1200倍に希釈して15 μLをHPLCサンプルにした。蛍光誘導化のため、オートサンプラーのサンプルラックを12 ℃に冷却、蛍光誘導化試薬15 μL、サンプル15 μLを加え30 ℃で2分間インキュベートし、誘導体化されたサンプル10 μLをインジェクションした。 | ||