「ミカエリス・メンテンの式」の版間の差分

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同義語: S-vプロット、ミハエリス・メンテンプロット、ミヒャエリス・メンテンプロット  
同義語: S-vプロット、ミハエリス・メンテンプロット、ミヒャエリス・メンテンプロット  


酵素は生体内の各種の化学反応を円滑に行わせるための生体触媒であり、脳内においても情報伝達やエネルギー代謝など、あらゆる生化学反応に関わっている。従って、脳神経系を理解する上で、個々の酵素の性質を明らかにすることは極めて重要である。1992年にジーンターゲッティングの手法を用いて、空間記憶に関わる酵素としてCaMキナーゼⅡが初めて特定された<ref><pubmed>1378648</pubmed></ref>, <ref><pubmed>1321493</pubmed></ref>が、この輝かしい研究成果も、それを遡ること10年以上に渡る本酵素に関する地道で精力的な研究の積み重ね<ref><pubmed>12045104</pubmed></ref>があったればこそのものであろう。酵素の生化学的研究をおこなうにあたっては、酵素の性質を定量的に扱うことが大前提となるが、そのような場合の理論的基盤となるものが、以下に述べるミカエリス・メンテンの式である。本稿ではミカエリス・メンテンの式と、それを拡張したブリッグス・ホールデンの式の誘導について述べた後、これらの式による解析から得られる各種速度論的パラメータの求め方や意味について概説する。また、酵素阻害剤の理論的取り扱いについても代表的な例について簡単に解説し、最後に脳科学に関連の深い酵素に関する若干の研究例を紹介する。  
酵素は生体内の各種の化学反応を円滑に行わせるための生体触媒であり、脳内においても情報伝達や物質代謝など、あらゆる生化学反応に関わっている。従って、脳神経系を理解する上で、個々の酵素の性質を明らかにすることは極めて重要である。1992年にジーンターゲティングの手法を用いて、空間記憶に関わる酵素としてCaMキナーゼⅡが初めて特定された<ref><pubmed>1378648</pubmed></ref>, <ref><pubmed>1321493</pubmed></ref>が、この輝かしい研究成果も、それを遡ること10年以上に渡る本酵素に関する地道で精力的な研究の積み重ね<ref><pubmed>12045104</pubmed></ref>があったればこそのものであろう。酵素の生化学的研究をおこなうにあたっては、酵素の性質を定量的に扱うことが大前提となるが、そのような場合の理論的基盤となるものが、以下に述べるミカエリス・メンテンの式である。本稿ではミカエリス・メンテンの式と、それを拡張したブリッグス・ホールデンの式の誘導について述べた後、これらの式による解析から得られる各種速度論的パラメータの求め方や意味について概説する。また、酵素阻害剤の理論的取り扱いについても代表的な例について簡単に解説し、最後に脳科学に関連の深い酵素に関する若干の研究例を紹介する。  


== ミカエリス・メンテンの式  ==
== ミカエリス・メンテンの式  ==
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     <math> E + S \overset{k_1}{\underset{k_2}{\rightleftarrows}} ES \xrightarrow{k_3} E + P</math>     (1)  
     <math> E + S \overset{k_1}{\underset{k_2}{\rightleftarrows}} ES \xrightarrow{k_3} E + P</math>     (1)  


 ここに<span class="texhtml">''E''</span>は酵素、<span class="texhtml">''S''</span>は基質、<span class="texhtml">''P''</span>は生成物を表す。この時、<span class="texhtml">''K''<sub>1</sub></span>、<span class="texhtml">''K''<sub>2</sub></span>は<span class="texhtml">''K''<sub>3</sub></span>に比べて十分に大きく、<span class="texhtml">''E''''S''</span>、<span class="texhtml">''E''</span><span class="texhtml">''S''</span>は[[wikipedia:ja:平衡状態|平衡状態]]にあって、<span class="texhtml">''K''<sub>3</sub></span>を[[wikipedia:ja:速度定数|速度定数]]とする過程が全体の酵素反応の[[wikipedia:ja:律速段階|律速段階]]であると仮定すれば、ES complexの[[wikipedia:ja:解離定数|解離平衡定数]]<span class="texhtml">''K''<sub>''d''</sub></span>は  
 ここに<span class="texhtml">''E''</span>は酵素、<span class="texhtml">''S''</span>は基質、<span class="texhtml">''P''</span>は生成物を表す。この時、<span class="texhtml">''k''<sub>1</sub></span>、<span class="texhtml">''k''<sub>2</sub></span>は<span class="texhtml">''k''<sub>3</sub></span>に比べて十分に大きく、<span class="texhtml">''ES''</span>、''E''、''S''は[[wikipedia:ja:平衡状態|平衡状態]]にあって、''k''<sub>3</sub>を[[wikipedia:ja:速度定数|速度定数]]とする過程が全体の酵素反応の[[wikipedia:ja:律速段階|律速段階]]であると仮定すれば、ES complexの[[wikipedia:ja:解離定数|解離平衡定数]]''K''<sub>''d''</sub>は


<br>      <math> K_d = \frac{[E][S]}{[ES]} = \frac{k_2}{k_1}</math>     (2)  
<br>      <math> K_d = \frac{[E][S]}{[ES]} = \frac{k_2}{k_1}</math>     (2)  
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<br>      <math> v = k_3[ES] = \frac{k_3[E_0][S]}{K_d +[S]}</math>     (6)  
<br>      <math> v = k_3[ES] = \frac{k_3[E_0][S]}{K_d +[S]}</math>     (6)  


<br>  ここで<span class="texhtml">''v'' = ''k''<sub>3</sub>[''E''<sub>0</sub>] = ''V''<sub>''m''''a''''x''</sub></span>、<span class="texhtml">''k''<sub>''d''</sub> = ''k''<sub>''m''</sub></span>とおくと  
<br>  ここで<span class="texhtml">''v'' = ''k''<sub>3</sub>[''E''<sub>0</sub>] = ''V''<sub>''max''</sub></span>、<span class="texhtml">''K''<sub>''d''</sub> = ''K''<sub>''m''</sub></span>とおくと  


<br>      <math>v = k_3[ES] = \frac{V_{max}[S]}{K_m +[S]}</math>     (7)  
<br>      <math>v = k_3[ES] = \frac{V_{max}[S]}{K_m +[S]}</math>     (7)  


 この(7)式をミカエリス・メンテンの式と呼び、1913年にドイツの学術雑誌に発表された<ref><pubmed>21888353</pubmed></ref>。ちなみにM. L. Mentenは当時としては珍しい女性研究者である<ref>''' 鈴木紘一、笠井献一、宗川吉汪 監訳<br>ホートン生化学 第4版<br>''東京化学同人 (東京)'':2008</ref>。ミカエリス定数<span class="texhtml">''K''<sub>''m''</sub></span>は基質濃度無限大の時の最大反応速度<span class="texhtml">''V''<sub>''m''''a''''x''</sub></span>の1/2の速度を与える時の基質濃度に一致する。<span class="texhtml">''K''<sub>''m''</sub></span>はES complexの解離平衡定数<span class="texhtml">''K''<sub>''d''</sub></span>であるから、酵素と基質の親和性の尺度となり、値が小さいほど酵素と基質の親和性が強い。  
 この(7)式をミカエリス・メンテンの式と呼び、1913年にドイツの学術雑誌に発表された<ref><pubmed>21888353</pubmed></ref>。ちなみにM. L. Mentenは当時としては珍しい女性研究者である<ref>''' 鈴木紘一、笠井献一、宗川吉汪 監訳<br>ホートン生化学 第4版<br>''東京化学同人 (東京)'':2008</ref>。ミカエリス定数<span class="texhtml">''K''<sub>''m''</sub></span>は基質濃度無限大の時の最大反応速度<span class="texhtml">''V''<sub>''max''</sub></span>の1/2の速度を与える時の基質濃度に一致する。<span class="texhtml">''K''<sub>''m''</sub></span>はES complexの解離平衡定数<span class="texhtml">''K''<sub>''d''</sub></span>であるから、酵素と基質の親和性の尺度となり、値が小さいほど酵素と基質の親和性が強い。  


== ブリッグス・ホールデンの式  ==
== ブリッグス・ホールデンの式  ==


 しかしながら、上記、Michaelis とMentenの考えではいくつかの仮定を設けており、常にこれらの仮定が成立するとは限らない。そこで1925年に[[wikipedia:George Edward Briggs|G. E. Briggs]]と[[wikipedia:ja:J・B・S・ホールデン|J. B. S. Haldane]]は、ミカエリス・メンテンの式の、より一般化された誘導法を示した<ref><pubmed>16743508</pubmed></ref>。上記(1)の反応スキームにおいて、彼らは酵素反応が直線的に進行する定常状態ではES complexの形成速度と分解速度が釣り合っていて、見かけ上<span class="texhtml">[''E''''S'']</span>が一定になると仮定した(定常状態近似)。すなわち、  
 しかしながら、上記、Michaelis とMentenの考えではいくつかの仮定を設けており、常にこれらの仮定が成立するとは限らない。そこで1925年に[[wikipedia:George Edward Briggs|G. E. Briggs]]と[[wikipedia:ja:J・B・S・ホールデン|J. B. S. Haldane]]は、ミカエリス・メンテンの式の、より一般化された誘導法を示した<ref><pubmed>16743508</pubmed></ref>。上記(1)の反応スキームにおいて、彼らは酵素反応が直線的に進行する定常状態ではES complexの形成速度と分解速度が釣り合っていて、見かけ上<span class="texhtml">[''ES'']</span>が一定になると仮定した(定常状態近似)。すなわち、 '''


<br>      <math>\frac{d[ES]}{dt} = 0 = k_1[E][S] - k_2[ES] -k_3[ES]</math>     (8)  
<br>      <math>\frac{d[ES]}{dt} = 0 = k_1[E][S] - k_2[ES] -k_3[ES]</math>     (8)  
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<br>      <math>v = \frac{k_1k_3[E_0][S]}{k_1[S]+(k_2 + k_3)} = \frac{k_3[E_0][S]}{[S]+\frac{k_2 + k_3}{k_1}}</math>     (12)  
<br>      <math>v = \frac{k_1k_3[E_0][S]}{k_1[S]+(k_2 + k_3)} = \frac{k_3[E_0][S]}{[S]+\frac{k_2 + k_3}{k_1}}</math>     (12)  


<br>  ここで <span class="texhtml">(''k''<sub>2</sub> + ''k''<sub>3</sub>) / ''k''<sub>1</sub> = ''K''<sub>''m''</sub></span>、<span class="texhtml">''k''<sub>3</sub>[''E''<sub>0</sub>] = ''V''<sub>''m''''a''''x''</sub></span>とおくと  
<br>  ここで <span class="texhtml">(''k''<sub>2</sub> + ''k''<sub>3</sub>) / ''k''<sub>1</sub> = ''K''<sub>''m''</sub></span>、<span class="texhtml">''k''<sub>3</sub>[''E''<sub>0</sub>] = ''V''<sub>''max''</sub></span>とおくと  


<br>      <math>v = k_3[ES] = \frac{V_{max}[S]}{K_m +[S]}</math>     (13)  
<br>      <math>v = k_3[ES] = \frac{V_{max}[S]}{K_m +[S]}</math>     (13)  


<br>  となり、(7)式と同じ式が得られる。 (13)式は厳密にはブリッグス・ホールデンの式と言うが、 (7)式と同じ形であるので実際にはミカエリス・メンテンの式と言うことが多い。また、(13)式の<span class="texhtml">''K''<sub>''m''</sub></span>もミカエリス定数と言うが、(7)式の場合と異なり、ES complexの解離平衡定数<span class="texhtml">''K''<sub>''d''</sub></span>とは一致しない。<span class="texhtml">''K''<sub>2</sub> &gt;  &gt; ''K''<sub>3</sub></span>の場合にのみ、<span class="texhtml">''K''<sub>''m''</sub></span>≈<span class="texhtml">''k''<sub>2</sub></span>/<span class="texhtml">''k''<sub>1</sub></span>となって<span class="texhtml">''K''<sub>''d''</sub></span>と一致するのであるが、多くの場合、(13)式の<span class="texhtml">''K''<sub>''m''</sub></span>も酵素と基質の親和性の尺度を表すと考えてよい。実験的には、(13)式の<span class="texhtml">''K''<sub>''m''</sub></span>も(7)式の場合と同様、基質濃度無限大の時の最大反応速度<span class="texhtml">''V''<sub>''m''</sub>''a''''x''</span>の1/2の速度を与える基質濃度として定義される。  
<br>  となり、(7)式と同じ式が得られる。 (13)式は厳密にはブリッグス・ホールデンの式と言うが、 (7)式と同じ形であるので実際にはミカエリス・メンテンの式と言うことが多い。また、(13)式の<span class="texhtml">''K''<sub>''m''</sub></span>もミカエリス定数と言うが、(7)式の場合と異なり、ES complexの解離平衡定数<span class="texhtml">''K''<sub>''d''</sub></span>とは一致しない。<span class="texhtml">''k''<sub>2</sub> &gt;  &gt; ''k''<sub>3</sub></span>の場合にのみ、<span class="texhtml">''K''<sub>''m'' </sub></span>≈<span class="texhtml"> ''k''<sub>2</sub></span>/<span class="texhtml">''k''<sub>1</sub></span>となって<span class="texhtml">''K''<sub>''d''</sub></span>と一致するのであるが、多くの場合、(13)式の<span class="texhtml">''K''<sub>''m''</sub></span>も酵素と基質の親和性の尺度を表すと考えてよい。実験的には、(13)式の<span class="texhtml">''K''<sub>''m''</sub></span>も(7)式の場合と同様、基質濃度無限大の時の最大反応速度<math>V_{max}</math>の1/2の速度を与える基質濃度として定義される。
 


== ミカエリス・メンテンプロット  ==
== ミカエリス・メンテンプロット  ==
73行目: 74行目:
== 速度論的パラメータの求め方  ==
== 速度論的パラメータの求め方  ==


 図1のようなミカエリス・メンテンプロットより、上記<span class="texhtml">''K''<sub>''m''</sub></span>や<span class="texhtml">''V''<sub>''m''''a''''x''</sub></span>などの速度論的パラメータを求めることが出来る。(7)式または(13)式の両辺の逆数をとって  
 図1のようなミカエリス・メンテンプロットより、上記<span class="texhtml">''K''<sub>''m''</sub></span>や<span class="texhtml">''V''<sub>''max''</sub></span>などの速度論的パラメータを求めることが出来る。(7)式または(13)式の両辺の逆数をとって  


<br>      <math>\frac{1}{v} = \frac{K_m}{V_{max}}\frac{1}{[S]} + \frac{1}{V_{max}}</math>     (14)  
<br>      <math>\frac{1}{v} = \frac{K_m}{V_{max}}\frac{1}{[S]} + \frac{1}{V_{max}}</math>     (14)  


<br>  とすれば、<span class="texhtml">1 / [''S'']</span>に対する<span class="texhtml">1 / ''v''</span>のプロットが直線となる。従ってミカエリス・メンテンの式に従う酵素では、基質濃度の逆数に対して、酵素活性の逆数をプロットすれば図2に示すような直線プロット(ラインウィーバー・バークプロットまたは二重逆数プロット)となり、このプロットのx切片が<span class="texhtml"> − 1 / ''K''<sub>''m''</sub></span>,y切片が<span class="texhtml">1 / ''V''<sub>''m''''a''''x''</sub></span>を与える。この方法はグラフ用紙さえあれば簡単にできるので以前はよく行われたが、低基質濃度のデータの誤差が大きく出るなどの欠点もあり、パソコンが普及した現在では、ミカエリス・メンテンプロットを適当なソフトウェアを用いて双曲線にフィッティングして、直接(7)式または(13)式の各パラメータを求めるdirect fitting法によることが多くなった。    
<br>  とすれば、<span class="texhtml">1 / [''S'']</span>に対する<span class="texhtml">1 / ''v''</span>のプロットが直線となる。従ってミカエリス・メンテンの式に従う酵素では、基質濃度の逆数に対して、酵素活性の逆数をプロットすれば図2に示すような直線プロット(ラインウィーバー・バークプロットまたは二重逆数プロット)となり、このプロットのx切片が<span class="texhtml"> − 1 / ''K''<sub>''m''</sub></span>,y切片が<span class="texhtml">1 / ''V''<sub>''max''</sub></span>を与える。この方法はグラフ用紙さえあれば簡単にできるので以前はよく行われたが、低基質濃度のデータの誤差が大きく出るなどの欠点もあり、パソコンが普及した現在では、ミカエリス・メンテンプロットを適当なソフトウェアを用いて双曲線にフィッティングして、直接(7)式または(13)式の各パラメータを求めるdirect fitting法によることが多くなった。 [[Image:AtsuhikoIshida fig 2.jpg|thumb|300px|図2 ラインウィーバー・バークプロット(二重逆数プロット)]]  <br> (7)式または(13)式(ミカエリス・メンテンの式またはブリッグス・ホールデンの式)は多くの酵素にあてはまる便利な式であるが、(1)の反応スキームに従うことを前提にしているので、当然これにあてはまらない場合も存在する。そのような場合に(7)式または(13)式を無理にあてはめて解析することは、誤った結論を導く可能性があるので注意が必要である。そのような場合の扱いに関しては、例えば以下の文献を参照されたい<ref>''' 堀尾武一、山下仁平<br>蛋白質・酵素の基礎実験法<br>''南江堂 (東京)'':1981</ref>。      
<br> (7)式または(13)式(ミカエリス・メンテンの式またはブリッグス・ホールデンの式)は多くの酵素にあてはまる便利な式であるが、(1)の反応スキームに従うことを前提にしているので、当然これにあてはまらない場合も存在する。そのような場合に(7)式または(13)式を無理にあてはめて解析することは、誤った結論を導く可能性があるので注意が必要である。そのような場合の扱いに関しては、例えば以下の文献を参照されたい<ref>''' 堀尾武一、山下仁平<br>蛋白質・酵素の基礎実験法<br>''南江堂 (東京)'':1981</ref>。    


== 速度論的パラメータの意味  ==
== 速度論的パラメータの意味  ==
92行目: 92行目:
<br>  ここで基質濃度が非常に希薄な<span class="texhtml">[''S''] &lt;  &lt; ''K''<sub>''m''</sub></span>の濃度領域を考えると  
<br>  ここで基質濃度が非常に希薄な<span class="texhtml">[''S''] &lt;  &lt; ''K''<sub>''m''</sub></span>の濃度領域を考えると  


<br>      <math>v = \frac{k_{cat}[E_0][S]}{K_m +[S]} \approx \frac{k_{cat}[E_0][S]}{K_m} = \frac{k_{cat}}{K_m}[E_0][S]</math>         (17)  
<br>      <math>v = \frac{k_{cat}[E_0][S]}{K_m +[S]} \approx \frac{k_{cat}[E_0][S]}{K_m} = \frac{k_{cat}}{K_m}[E_0][S]</math>       (17)  
 
<br>  基質が非常に薄い条件下では、基質は殆ど酵素に結合していないと考えられるから <span class="texhtml">[''E''<sub>0</sub>]</span>≈<span class="texhtml">[''E'']</span>


 従って
<br>  基質が非常に薄い条件下では、基質は殆ど酵素に結合していないと考えられるから
<span class="texhtml">[''E''<sub>0</sub>]</span>≈<span class="texhtml">[''E'']</span>
従って


<br>      <math>v =  \frac{k_{cat}}{K_m}[E][S]</math>          (18)  
<br>      <math>v =  \frac{k_{cat}}{K_m}[E][S]</math>          (18)  
106行目: 106行目:
 酵素の特異的阻害剤は、その酵素の生理的意義を明らかにする分子プローブとして重要であるのみならず、医薬品として臨床上、重要な役割を担うものも多い。ミカエリス・メンテンの式を応用して様々な濃度の酵素阻害剤存在下での酵素活性を詳細に調べることにより、阻害剤と酵素の結合様式や結合親和性について重要な情報を得ることが出来る。  
 酵素の特異的阻害剤は、その酵素の生理的意義を明らかにする分子プローブとして重要であるのみならず、医薬品として臨床上、重要な役割を担うものも多い。ミカエリス・メンテンの式を応用して様々な濃度の酵素阻害剤存在下での酵素活性を詳細に調べることにより、阻害剤と酵素の結合様式や結合親和性について重要な情報を得ることが出来る。  


1.競合阻害(拮抗阻害:competitive inhibition) (1)の反応スキームにおいて阻害剤Iが酵素の基質結合部位に結合し、基質Sと阻害剤Iが結合部位を奪い合うような場合を競合阻害(拮抗阻害:competitive inhibition)と呼ぶ。この場合、(1)の反応スキームに加えて
<br>
 
=== 1. 競合阻害(拮抗阻害:competitive inhibition) ===
 
(1)の反応スキームにおいて阻害剤<math>I</math>が酵素の基質結合部位に結合し、基質Sと阻害剤<math>I</math>が結合部位を奪い合うような場合を競合阻害(拮抗阻害:competitive inhibition)と呼ぶ。この場合、(1)の反応スキームに加えて  
 
<br>      <math>E + I {\rightleftarrows} EI</math>      (19)


<br>          <math>E + I {\rightleftarrows} EI</math>              (19)
という結合解離平衡を仮定し、その解離定数を<span class="texhtml">''K''<sub>''i''</sub></span>とおくと


という結合解離平衡を仮定し、その解離定数を<math>K_i</math>とおくと
<br>      <math>K_i = \frac{[E][I]}{[EI]}</math>      (20)


<br>          <math>K_i = \frac{[E][I]}{[EI]}</math>              (20)  
この場合、酵素の全濃度<span class="texhtml">[''E''<sub>0</sub>]</span>(4)式に代わって


この場合、酵素の全濃度<math>[E_0]</math>(4)式に代わって
<br>      <span class="texhtml">[''E''<sub>0</sub>] = [''E''] + [''ES''] + [''EI'']</span>     (21)


<br>          <math>[E_0] = [E] + [ES] + [EI]</math>              (21)
(2)(20)(21)より<span class="texhtml">[''E'']</span>と<span class="texhtml">[''EI'']</span>を消去して<math>[ES]</math>について整理すると


(2)(20)(21)より<math>[E]</math>と<math>[EI]</math>を消去して<math>[ES]</math>について整理すると
<br>       <math>[ES] = \frac{[E_0][S]}{[S]+K_d(1+\frac{[I]}{K_i})}</math>       (22)  
<br>         <math>[ES] = \frac{[E_0][S]}{[S]+K_d(1+\frac{[I]}{K_i})}</math>               (22)


これを(3)に代入すれば  
これを(3)に代入すれば  


<br>         <math>v = \frac{k_3[E_0][S]}{[S]+K_d(1+\frac{[I]}{K_i})}</math>               (23)
<br>       <math>v = \frac{k_3[E_0][S]}{[S]+K_d(1+\frac{[I]}{K_i})}</math>       (23)  
 
ここで <span class="texhtml">''k''<sub>3</sub>[''E''<sub>0</sub>] = ''V''<sub>''max''</sub></span>, <span class="texhtml">''K''<sub>''d''</sub> = ''K''<sub>''m''</sub></span>であるから


ここで <math>k_3[E_0] = V_{max}</math>,<math>K_d = K_m</math>であるから
<br>      <math>v = \frac{V_{max}[S]}{[S]+K_m(1+\frac{[I]}{K_i})}</math>       (24)


<br>          <math>v = \frac{V_{max}[S]}{[S]+K_m(1+\frac{[I]}{K_i})}</math>              (24)
この式を元のミカエリス・メンテンの式 (7)式と比較すると、競合阻害剤<math>I</math>の存在下では<span class="texhtml">''V''<sub>''max''</sub></span>は変化しないが、<span class="texhtml">''K''<sub>''m''</sub></span>値が<span class="texhtml">1 + [''I''] / ''K''<sub>''i''</sub></span>倍だけ増加していることが分かる。 また、(14)式と同様に(24)式の逆数をとって整理すると


この式を元のミカエリス・メンテンの式 (7)式と比較すると、競合阻害剤Iの存在下では<math>V_{max}</math>は変化しないが、<math>K_m</math>値が<math>1+[I]/K_i</math>倍だけ増加していることが分かる。 また、(14)式と同様に(24)式の逆数をとって整理すると
<br>      <math>\frac{1}{v} = \frac{K_m(1+\frac{[I]}{K_i})}{V_{max}}\frac{1}{[S]} + \frac{1}{V_{max}}</math>            (25)  


<br>          <math>\frac{1}{v} = \frac{K_m(1+\frac{[I]}{K_i})}{V_{max}}\frac{1}{[S]} + \frac{1}{V_{max}}</math>                   (25)
従って<span class="texhtml">1 / [''S'']</span>に対して<span class="texhtml">1 / ''v''</span>をプロット(ラインウィーバー・バークプロットまたは二重逆数プロット)すると図3のような直線プロットとなり、様々な濃度の阻害剤<math>I</math>の存在下で実験すると、y軸上の一点(y切片 = <span class="texhtml">1 / ''V''<sub>''max''</sub></span>)で交わる直線群が得られる。[[Image:AtsuhikoIshida fig 3.jpg|thumb|300px|図3 競合阻害剤存在下でのラインウィーバー・バークプロット。各直線はy軸上の一点で交わる。]]これらの直線の傾きは


従って<math>1/[S]</math>に対して<math>1/v</math>をプロット(ラインウィーバー・バークプロットまたは二重逆数プロット)すると図3のような直線プロットとなり、様々な濃度の阻害剤Iの存在下で実験すると、y軸上の一点(y切片 = <math>1/V_{max}</math>)で交わる直線群が得られる。これらの直線の傾きは
<br>      <math>\frac{K_m(1+\frac{[I]}{K_i})}{V_{max}} = \frac{K_m}{V_{max}}\frac{1}{K_i}[I] + \frac{K_m}{V_{max}}</math>            (26)


<br>         <math>\frac{K_m(1+\frac{[I]}{K_i})}{V_{max}} = \frac{K_m}{V_{max}}\frac{1}{K_i}[I] + \frac{K_m}{V_{max}}</math>                   (26)
と表せるので、各阻害剤濃度<span class="texhtml">[''I'']</span>に対して、図3のラインウィーバー・バークプロットの傾きをプロットした図4のような2次プロットを作成すると、(26)式に従った直線となり、その直線のx切片の値から<span class="texhtml">''K''<sub>''i''</sub></span>値を求めることが出来る。<span class="texhtml">''K''<sub>''i''</sub></span>は阻害定数と呼ばれ、この場合、酵素—阻害剤複合体の解離定数に相当する。<span class="texhtml">''K''<sub>''i''</sub></span>は酵素と阻害剤の親和性の尺度であり、値が小さいほど酵素に対する親和性が強いことを示す。 [[Image:AtsuhikoIshida fig 4.jpg|thumb|300px|図4 Ki値を求めるための二次プロット。各阻害剤濃度に対して図3のプロットの傾きをプロットしたもの。]]


と表せるので、各阻害剤濃度<math>[I]</math>に対して、図3のラインウィーバー・バークプロットの傾きをプロットした図4のような2次プロットを作成すると、(26)式に従った直線となり、その直線のx切片の値から<math>K_i</math>値を求めることが出来る。<math>K_i</math>は阻害定数と呼ばれ、この場合、酵素—阻害剤複合体の解離定数に相当する。<math>K_i</math>は酵素と阻害剤の親和性の尺度であり、値が小さいほど酵素に対する親和性が強いことを示す。
=== 2. 非競合阻害(非拮抗阻害:noncompetitive inhibition) ===


2. 非競合阻害(非拮抗阻害:noncompetitive inhibition) (1)の反応スキームにおいて阻害剤Iと基質Sが互いに異なる部位に独立に結合し、互いの結合に影響を及ぼさないような場合、これを非競合阻害(非拮抗阻害:noncompetitive inhibition)と呼ぶ。この場合、(1)(19)の反応スキームに加えて
(1)の反応スキームにおいて阻害剤<math>I</math>と基質Sが互いに異なる部位に独立に結合し、互いの結合に影響を及ぼさないような場合、これを非競合阻害(非拮抗阻害:noncompetitive inhibition)と呼ぶ。この場合、(1)(19)の反応スキームに加えて  


<br>              <math>ES + I {\rightleftarrows} ESI</math>              (27)  
<br>      <math>ES + I {\rightleftarrows} ESI</math>    (27)      
   


<br>               <math>EI + S {\rightleftarrows} ESI</math>               (28)  
<br>       <math>EI + S {\rightleftarrows} ESI</math>       (28)  


という結合解離平衡の存在を仮定することになるが、その場合の解離定数は、互いの結合に影響を及ぼさないという定義により、それぞれ<math>K_i</math>, <math>K_d</math>と等しくなる。すなわち、  
という結合解離平衡の存在を仮定することになるが、(27)(28)の解離平衡定数は、互いの結合に影響を及ぼさないという定義により、それぞれ<span class="texhtml">''K''<sub>''i''</sub></span>, <span class="texhtml">''K''<sub>''d''</sub></span>と等しくなる。すなわち、  


<br>               <math>K_i = \frac{[E][I]}{[EI]} =  \frac{[ES][I]}{[ESI]}</math>              (29)
<br>       <math>K_i = \frac{[E][I]}{[EI]} =  \frac{[ES][I]}{[ESI]}</math>    (29)       
 
<br>       <math>K_d = \frac{[E][S]}{[ES]} =  \frac{[EI][S]}{[ESI]}</math>       (30)  
  
<br>             <math>K_d = \frac{[E][S]}{[ES]} =  \frac{[ES][I]}{[ESI]}</math>               (30)


また酵素の全濃度<math>[E_0]</math>は  
また酵素の全濃度<span class="texhtml">[''E''<sub>0</sub>]</span>は  


<br>         <math>[E_0] = [E] + [ES] + [EI] + [ESI]</math>              (31)
<br>       <span class="texhtml">[''E''<sub>0</sub>] = [''E''] + [''ES''] + [''EI''] + [''ESI'']</span>     (31)


となる。上記と同様に(2)(29)(30)(31)より<math>[E]</math>, <math>[EI]</math>, <math>[ESI]</math>を消去し、得られた<math>[ES]</math>[ES]を(3)に代入して、<math>k_3[E_0] = V_{max}</math>,<math>K_d = K_m</math>とおくと、  
となる。上記と同様に(2)(29)(30)(31)より<span class="texhtml">[''E'']</span>, <span class="texhtml">[''EI'']</span>, <span class="texhtml">[''ESI'']を消去し、得られた<span class="texhtml">[</span>''ES'']を(3)に代入して、<span class="texhtml">''k''<sub>3</sub>[''E''<sub>0</sub>] = ''V''<sub>''max''</sub></span>, <span class="texhtml">''K''<sub>''d''</sub> = ''K''<sub>''m''</sub></span>とおくと、  </span>''' <br>       <math>v = \frac{1}{1+\frac{[I]}{K_i}}\frac{V_{max}[S]}{K_m +[S]}</math>       (32)  
 
<br>             <math>v = \frac{1}{1+\frac{[I]}{K_i}}\frac{V_{max}[S]}{K_m +[S]}</math>             (32)


この式を元のミカエリス・メンテンの式 (7)式と比較すると、非競合阻害剤Iの存在下では<math>K_m</math>は変化しないが<math>V_{max}</math>が<math>1/(1+[I]/K_i)</math>だけ減少していることが分かる。また、(14)や(24)と同様に(32)式の逆数をとって整理すると  
この式を元のミカエリス・メンテンの式 (7)式と比較すると、非競合阻害剤<math>I</math>の存在下では<span class="texhtml">''K''<sub>''m''</sub></span>は変化しないが<span class="texhtml">''V''<sub>''max''</sub></span>が<span class="texhtml">1 / (1 + [''I''] / ''K''<sub>''i''</sub>)</span>だけ減少していることが分かる。また、(14)や(24)と同様に(32)式の逆数をとって整理すると  


<br>               <math>\frac{1}{v} = \frac{K_m(1+\frac{[I]}{K_i})}{V_{max}}\frac{1}{[S]} + \frac{1+\frac{[I]}{K_i}}{V_{max}}</math>             (33)
<br>       <math>\frac{1}{v} = \frac{K_m(1+\frac{[I]}{K_i})}{V_{max}}\frac{1}{[S]} + \frac{1+\frac{[I]}{K_i}}{V_{max}}</math>       (33)  


従って<math>1/[S]</math>に対して<math>1/v</math>をプロットすると図5のような直線プロットとなり、様々な濃度の阻害剤Iの存在下で実験すると、x軸上の一点(x切片 = <math>-1/K_m</math>)で交わる直線群が得られる。これらの直線の傾きは (26)式で表せるので、競合阻害の場合と同様、各阻害剤濃度<math>[I]</math>に対して、図5のラインウィーバー・バークプロットの傾きをプロットした2次プロットは図4のようになり、その直線のx切片の値から<math>K_i</math>値を求めることが出来る。この場合も阻害定数<math>K_i</math>は値が小さいほど酵素に対する親和性が強いことを示す。  
従って<span class="texhtml">1 / [''S'']</span>に対して<span class="texhtml">1 / ''v''</span>をプロットすると図5のような直線プロットとなり、様々な濃度の阻害剤<math>I</math>の存在下で実験すると、x軸上の一点(x切片 = <span class="texhtml"> 1 / ''K''<sub>''m''</sub></span>)で交わる直線群が得られる。これらの直線の傾きは (26)式で表せるので、競合阻害の場合と同様、各阻害剤濃度<span class="texhtml">[''I'']</span>に対して、図5のラインウィーバー・バークプロットの傾きをプロットした2次プロットは図4のようになり、その直線のx切片の値から<span class="texhtml">''K''<sub>''i''</sub></span>値を求めることが出来る。この場合も阻害定数<span class="texhtml">''K''<sub>''i''</sub></span>は値が小さいほど酵素に対する親和性が強いことを示す。 [[Image:Atsuhikoishida fig 5.jpg|thumb|300px|図5 非競合阻害剤存在下のラインウィーバー・バークプロット。各直線はx軸上の一点で交わる。]]


 以上のように、阻害剤濃度や基質濃度を様々に変えて酵素活性を測定し、図3や図5のようなラインウィーバー・バークプロットのパターンを調べることにより、その阻害剤と酵素の親和性や阻害剤の結合部位に関する情報を簡便に得ることが出来る。  
 以上のように、阻害剤濃度や基質濃度を様々に変えて酵素活性を測定し、図3や図5のようなラインウィーバー・バークプロットのパターンを調べることにより、その阻害剤と酵素の親和性や阻害剤の結合部位に関する情報を簡便に得ることが出来る。  


<br>


== 酵素反応速度論的解析の実例  ==
== 酵素反応速度論的解析の実例  ==


 以上述べてきたような各種の速度論的パラメータは、酵素の反応特異性や反応機構に関して、しばしば重要な知見を与える。神経科学分野で重要な役割を担ういくつかの酵素においてもこのような解析がなされている。例えばカテコールアミンの生合成に重要な役割を果たすチロシンヒドロキシラーゼでは、Aキナーゼ<ref><pubmed>6102382</pubmed></ref>やCキナーゼ<ref><pubmed>6151178</pubmed></ref>によってリン酸化されると、補酵素である6-methyltetrahydropterineに対するKmが著明に減少し、補酵素との親和性が高まって活性化されることが示されている。  記憶学習に深く関係することが明らかとなっているCaMキナーゼⅡに関しても、詳細な速度論的解析がなされている。CaMキナーゼⅡはThr286が自己リン酸化されるとCa2+/CaMに非依存的な活性が出現し、この活性が記憶やその素過程と考えられる長期増強の成立に重要な役割を果たすと考えられているが、様々な基質を用いて速度論的解析を行った結果、このCa2+/CaM非依存性活性ではCa2+/CaM存在下の活性に比べて、Vmaxには変化がないものの、調べた全ての基質に関してKmが増大しており、基質との親和性が低下していることが判明した<ref><pubmed>1646810</pubmed></ref>。また、本酵素の活性制御に重要な役割を果たす自己阻害ドメインの合成ペプチドを用いて図3や図5のような阻害実験を行うことにより、活性制御機構に関する重要な知見が得られている<ref><pubmed>2538462</pubmed></ref>。同様に自己リン酸化部位Thr286周辺の配列を模した合成阻害ペプチドを用いて阻害実験を行うことにより、少なくとも2種類の異なる基質結合部位が存在することが初めて示唆されたが<ref><pubmed>7836445</pubmed></ref>、この結果は、後に本酵素の活性制御機構やNMDA受容体との相互作用を解明する上で不可欠となるT-site, S-siteという2種類の基質結合部位に関する概念<ref><pubmed>11459059</pubmed></ref>を確立する上で、先駆的な役割を果たしている。  
 以上述べてきたような各種の速度論的パラメータは、酵素の反応特異性や反応機構に関して、しばしば重要な知見を与える。神経科学分野で重要な役割を担ういくつかの酵素においてもこのような解析がなされている。例えばカテコールアミンの生合成に重要な役割を果たすチロシンヒドロキシラーゼでは、Aキナーゼ<ref><pubmed>6102382</pubmed></ref>やCキナーゼ<ref><pubmed>6151178</pubmed></ref>によってリン酸化されると、補酵素である6-methyltetrahydropterineに対する<math>K_m</math>が著明に減少し、補酵素との親和性が高まって活性化されることが示されている。  
<br>  記憶学習に深く関係することが明らかとなっているCaMキナーゼⅡに関しても、詳細な速度論的解析がなされている。CaMキナーゼⅡはThr286が自己リン酸化されるとCa<sup>2+</sup>/CaM (カルモジュリン)に非依存的な活性が出現し、この活性が記憶やその素過程と考えられる長期増強の成立に重要な役割を果たすと考えられているが、様々な基質を用いて速度論的解析を行った結果、このCa<sup>2+</sup>/CaM非依存性活性ではCa<sup>2+</sup>/CaM存在下の活性に比べて、<math>V_{max}</math>には変化がないものの、調べた全ての基質に関して<math>K_m</math>が増大しており、基質との親和性が低下していることが判明した<ref><pubmed>1646810</pubmed></ref>。また、本酵素の活性制御に重要な役割を果たす自己阻害ドメインの合成ペプチドを用いて図3や図5のような阻害実験を行うことにより、活性制御機構に関する重要な知見が得られている<ref><pubmed>2538462</pubmed></ref>。同様に自己リン酸化部位Thr286周辺の配列を模した合成阻害ペプチドを用いて阻害実験を行うことにより、少なくとも2種類の異なる基質結合部位が存在することが初めて示唆されたが<ref><pubmed>7836445</pubmed></ref>、この結果は、後に本酵素の活性制御機構やNMDA受容体との相互作用を解明する上で不可欠となるT-site, S-siteという2種類の基質結合部位に関する概念<ref><pubmed>11459059</pubmed></ref>を確立する上で、先駆的な役割を果たしている。  


== 関連項目  ==
== 関連項目  ==
181行目: 182行目:
*[[速度論的パラメータ]]  
*[[速度論的パラメータ]]  
*[[ミカエリス定数|<span class="texhtml">''K''<sub>''m''</sub></span>(ミカエリス定数)]]  
*[[ミカエリス定数|<span class="texhtml">''K''<sub>''m''</sub></span>(ミカエリス定数)]]  
*[[V max|<span class="texhtml">''V''<sub>''m''''a''''x''</sub></span>]]  
*[[V max|<span class="texhtml">''V''<sub>''max''</sub></span>]]  
*[[触媒定数|<span class="texhtml">''k''<sub>''c''''a''''t''</sub></span>(触媒定数)]]  
*[[触媒定数|<span class="texhtml">''k''<sub>''cat''</sub></span>(触媒定数)]]  
*[[酵素基質複合体(ES complex、ミカエリス複合体)]]  
*[[酵素基質複合体(ES complex、ミカエリス複合体)]]  
*[[酵素活性]]  
*[[酵素活性]]  
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