超解像蛍光顕微鏡

川岸 将彦, 寺田 純雄
東京医科歯科大学

英: Super-resolution microscopy

光学顕微鏡は、光の屈折、反射などを使って、物体を拡大して観察する器械である。しかし、光という電磁波を利用するため、その分解能は、光の回折限界(可視光では250 nm程度)によって制限される。そのため、従来の光学顕微鏡では、それよりも小さい構造を見る事は出来なかった。螢光顕微鏡とは、励起光を当てて、螢光色素、螢光蛋白質から発せられる螢光を観察する光学顕微鏡であるが、やはり、分解能には制限があった。それに対して、超解像螢光顕微鏡とは、励起照明法や、観察される螢光分子、解析方法などの工夫により、光の回折限界で制限される分解能を超える (超解像)螢光像を作る顕微鏡である。

光学顕微鏡の分解能

光の回折と点拡がり関数、エアリーディスク

光は電磁波の一種であり、波としての性質を持つ。波である光が、限られた大きさの開口を通ると、通り抜けた光の波面はホイヘンス-フレネルの原理によって変化する。開口面から十分遠い面での光波の振幅分布は、フラウンホーファー回折と呼ばれる分布を示す。

レンズは、屈折によって、光の平面波を、収斂/発散する球面波に変化させる光学素子である。レンズの径は有限なので、フラウンホーファー回折と同様の回折が、焦点面において形成される。

この回折のため、点光源から発した光がレンズを通って像を形成しても、その像は一点には収斂せず、3次元に一定の広がりと強度分布をもったものになる。この分布を、点拡がり関数 (点像分布関数, Point spread function, PSF)と呼ぶ。顕微鏡に即して言えば、点状の物体を拡大した像は、単純に拡大された形状になるのではなく、周囲に一定の滲み、広がりを持ったものになる。

無限遠にある点光源から、円形開口を通過した光が、収差のない理想的なレンズ光学系によって像を形成した時、そこに形成されるPSFを、エアリーディスク (Airy disc)と呼ぶ。その焦点面での光強度の分布$I(\theta )$は

$I(\theta )=I_{0}\left({\frac {2J_{1}(x(\theta ))}{x(\theta )}}\right)^{2}$, $x(\theta )={\frac {2\pi a\sin \theta }{\lambda }}$

$\theta$: レンズの中心から、焦点面上の観察点を見た観察角。光軸方向を0とする。
$I_{0}$: 光軸上の、つまり、最も明るい点での光強度。
$J_{1}(.)$: 一次の第一種ベッセル函数。
$a$: 円形開口の半径。顕微鏡のレンズの半径に当たる。
$\lambda$: 光の波長。

と表される。この分布は、中心に高い山があり、それを同心円状の低い縞が囲むような形になる。最初の極小までの半径は、

$x(\theta )={\frac {2\pi a\sin \theta }{\lambda }}\approx 3.831706...$, ∴ $\sin \theta \approx 1.2197{\frac {\lambda }{2a}}=0.6098{\frac {\lambda }{a}}$

が成り立つ位置になる。

2点分解能

光学顕微鏡の分解能は、2点分解能で表現される事が多い。つまり、2つの点光源を、異なる点として識別できるような、2点間の最小角度、又は距離である。螢光顕微鏡のように、独立に発光する二つの光源の場合、収差のない理想的な光学系では、レイリー基準により、上の式で表される、エアリーディスクの最初の極小までの半径に相当する角度だとされる。

この2点分解能を、顕微鏡の試料面上の2光源間の最小距離$R$で表すと、$R=f\sin \theta$ ($f$: 焦点距離)となる。開口数$\mathrm {NA} =\sin \alpha \approx a/f$ ($\alpha$: 光源からレンズの開口半径を見込む角度)とすると、

$R=1.2197{\frac {\lambda }{2\mathrm {NA} }}=0.6098{\frac {\lambda }{\mathrm {NA} }}$

これが、光学顕微鏡の2点分解能としてよく使われる式である。

高倍率の対物レンズでは、入射角の大きい光の全反射を防いで、開口数を大きくするため、液浸が使われる事が多い。その場合、$\mathrm {NA} =n\sin \alpha$ ($n$: レンズと物体の間の媒質の屈折率。) となり、開口数が1より大きいレンズも使えるようになる。2点分解能の式は同様である。波長$\lambda$ = 550 nm, 油浸で開口数$\mathrm {NA}$ = 1.4 - 1.6程度だと、分解能$R$は、240 - 210 nm程度になる。

超解像蛍光顕微鏡

超解像蛍光顕微鏡とは、上述の、対物レンズの回折限界で制限される分解能を越える (超解像)蛍光像を作る顕微鏡のことである。分解能を超える手法としては、RESOLFTを利用するもの、単分子の局在は2点分解能よりも細かく決められる事を利用するもの、励起照明を工夫して回折限界以上の高周波成分の情報を得るもの、統計学的手法を使うものなど、多くの手法が開発、実用化されている。ここでは、代表的なものを紹介する。

Localization Microscopy

図１　PALMの原理
①光刺激による疎らなPSFPのオンへのスイッチング　実際はここでは画像は撮影されないが理解のために蛍光状態がオフからオンに切り替わったPSFPの視野内での位置を灰色の◯で示した。
②蛍光観察による蛍光一分子画像の取得　蛍光観察はPALMでは主に全反射顕微鏡によって行う。得られる輝点は前述のとおり2次元のPSFに従った広がりを持つ。撮影後はいちど視野内にあるオンのPSFPを全て退色させる（あるいは退色するまで撮影を続ける）。
③座標推定による分子の局在画像の構築　②の蛍光一分子画像を2次元のガウス関数で解析する事で、視野内での蛍光分子の「座標」を推定する。また推定座標の「不確かさ」も同時に求められる。座標推定から構築した点は②の元の点に比べて小さくなるが、極小の一点として表されるわけではなく、この点もまた2次元のガウス関数の輝度分布として表わされる。この2次元のガウス関数の中心は解析により推定された「座標」、標準偏差が「不確かさ」になる。また各一分子の輝度の合計が等しくなるように規格化される。この結果、精度が高く推定された点は小さな明るい点として、精度が低く推定された点は大きな暗い点として局在画像上で表わされる。
④1-Nサイクルの積分によるPALM画像の構築　上記①～③操作を全てのPSFPがなくなるまで（Nサイクル）繰り返した後に、③で得られた画像を全て足し合わせる事でPALM画像が得られる。最終的に得られたPALM画像の輝度は「蛍光分子がその位置で見つかる可能性」に比例する。

光学顕微鏡の空間分解能は先述のとおり2つの点光源を異なる点として区別する「2点分解能」で表現され、可視光では200-300 nm程度である。しかしながら隣り合った2点が重ならないほど離れていれば、蛍光一分子のPSFを2次元のガウス関数で解析する事で最大1 nm程度の精度で位置を決定できる。この蛍光一分子の正確な位置解析は（FIONA；fluorescence imaging with one-nanometer accuracy）として知られる。超解像顕微鏡法の一つであるLocalization microscopy（蛍光一分子局在化顕微鏡法）は、FIONAを利用し光学顕微鏡の分解能を超えた画像を取得する方法である。このような考えに基づいて超解像を達成するというアイディアは古くからあったが、理想的なサンプルを準備するのが困難なため実現はされなかった。例えば単純にGFP融合タンパク質を発現した細胞にFIONAを適用するのは、多くの場合で以下の問題が生じる。
　１）通常の条件では、発現しているGFPの数が多いため隣り合ったGFPのPSFが重なりあってしまいFIONAを適用できない。
　２）この状況を回避するためにPSFの重なりが無い程度に一つの細胞にGFPを極少なく発現させる事は困難である。
　３）仮に２）が達成できたとしても数個のGFPの詳細位置がわかるだけであり、分子の局在情報として不十分である。
以下に紹介するそれぞれの蛍光一分子局在化法では、蛍光色素の蛍光状態（蛍光能）や蛍光色が切り替わる性質を利用してこれらの問題を巧妙に回避した。

PALM,FPALM

蛍光一分子局在化法の一つとしてまず初めにPALM(photoactivated localization microscopy)の原理について説明する。PALMは蛍光色素として特定波長の刺激光照射により蛍光状態がオフからオンへ変化するPA-GFPのような「光スイッチング蛍光タンパク質(Photo-Switchable Fluorescent Protein; PSFP)」を利用する。オフからオンへ切り替わる確率は刺激光の強度と照射時間とおよそ比例関係にあるので、それらを適切にコントロールすることで、視野内でPSFが重ならない程度に疎らにPSFPをオンにする事ができる(図-①)。この状態であればFIONAを適用し蛍光一分子の位置解析を行う事ができる(図-②,③)。視野内のPSFPを退色させた後に、①-③をPSFPが全てなくなるまで何度も繰り返す。こうして発現させた全てのPSFPの局在画像（PALM画像）を得る事ができる。図では比較のために②で得られた画像の総和も示した。これはPSFPを全てオンにして撮った通常の蛍光画像に相当する。通常の蛍光画像では観られなかった「P A L M」の4文字がPALM画像では確認できる。
PALMと同時期に発表されたFPALM（Fluorescence photoactivation localization microscopy）もPALMと同じくPSFPを利用する方法である。PALM・FPALMではPA-GFPの他のPSFPとして刺激光により蛍光色が変化するmEOS2(緑色から赤色)が利用される。またケージド蛍光色素の利用も可能である。

蛍光一分子局在化法はPALM・FPALMの他にも様々な方法が開発されているが、大きく異なるのは図-①においてどのようにして疎らな蛍光分子のオンを達成するかであり、FIONAに相当する図-②,③の操作はどの方法でもほぼ同様である。そこでその他の方法については蛍光分子の蛍光状態のオン・オフの切り替えに焦点を絞り、以下の項目で簡単に説明するにとどめる。

STORM

STORM（stochastic optical reconstruction microscopy）もPALM・FPALMとほぼ同時期に発表された。STORMではある種の蛍光色素が特定の条件下で可逆的に暗状態(蛍光状態=オフ)へと遷移する現象を利用している。詳細には、シアニン系色素(例：Cy5)に強い励起光(赤色)を与えた際に、一定の確率で寿命の非常に長い暗状態に入る。暗状態において、より蛍光波長の短い別のシアニン系色素(例：Cy3)が近接している際にCy3への励起光(緑色)を与えるとCy5が基底状態(蛍光状態=オン)へ回復する。オンになったCy5は強い励起光(赤色)を与えられ蛍光観察に利用される。蛍光観察中にある確率で暗状態(オフ)へと遷移する。Cy5が基底状態へ回復する確率はCy3に与える励起光(緑色)の強度と照射時間とおよそ比例関係にあるので、PALMと同様に励起光(緑色)を適切にコントロールする事で常に視野内のCy5を疎らにオンに保つ事ができる。

dSTORM,GSDIM

STORMでは超解像画像を得るために2つの蛍光色素を必要とするため、マルチカラー化は容易ではなかった。その後に報告されたdSTORM (direct STORM)やGSDIM(ground-state depletion and single-molecule return)ではこの問題が解決された。これらの方法では、蛍光色素の暗状態からの回復が別の蛍光色素の近接や励起光無しでもある確率で（稀にではあるが）起こる事を利用する。そのためCy3とその励起光(緑色)無しにも、視野内のCy5を疎らにオンに保つことが可能となる。こうして1つの蛍光色素で超解像画像が得られるようになりマルチカラー化が容易となった。

その他の方法

蛍光一分子局在化法のための蛍光色素の開発は現在も活発にされている。最近になり自然にオン・オフを繰り返す画期的な蛍光色素HMSiR（Hydroxymethyl Si-rhodamine）が開発された。これはSTORMやdSTORMと比べて、暗状態を作るための高濃度のチオールや強い励起光照射が不要なためサンプルへのダメージを抑えられる。また強い励起光照射が必要ではないので全反射顕微鏡でなく共焦点顕微鏡の使用も容易となり、細胞の深部構造の超解像観察が可能となった。