「ADPリボシル化因子」の版間の差分

　ADPリボシル化因子(Arf)は、コレラ毒素Aサブユニットによるヘテロ三量体Gタンパク質GsのADP-リボシル化に必要な補因子として、ウサギ肝臓とウシ脳から精製された<ref name=Enomoto1980><pubmed>6766444</pubmed></ref><ref name=Kahn1984><pubmed>6327671</pubmed></ref><ref name=Schleifer1982><pubmed>6273425</pubmed></ref>。精製されたArf自体がGTP結合能を持ち<ref name=Kahn1986><pubmed>3086320</pubmed></ref>、さらにSewellとKahn (1988年) <ref name=Sewell1988><pubmed>3133654</pubmed></ref>によりクローニングされたウシArf1の一次構造から、Rasや三量体Gタンパク質Gsと相同性の高い配列を持つ低分子量GTP結合タンパク質であることが明らかになった。その後、哺乳類ではArf1-Arf6の6分子（ヒトでは5分子）のパラログの存在が明らかになっている<ref name=Hosaka1996><pubmed>8947846</pubmed></ref>。

「ADPリボシル化因子」の名称は、試験管内でのコレラ毒素の補酵素としての性質に由来するもので、生理的な機能を反映するものではない。細胞内において、Arfは小胞輸送やアクチン細胞骨格の制御に関わる低分子量GTP結合タンパク質として機能している。コレラ毒素のADPリボシル化の補酵素としての性質に基づいたArfの本来の定義に該当する分子はArf1-Arf6の6分子（ヒトでは5分子）のみであるが、近年、Arl (Arf-like)、ARFRP１(Arf-related protein 1)、SAR1などの近縁分子が多数同定され、Arfスーパーファミリーとして広がりつつある。

　哺乳類のArfファミリーは、異なる遺伝子から生じる６種のパラログ(Arf1-6)からなる<ref name=Hosaka1996><pubmed>8947846</pubmed></ref>。ただし、ヒトARF2は偽遺伝子化しタンパク質として存在しない。６種のArf分子は一次配列とゲノム構造の類似性から３つのクラスに分類され、クラスIにはArf1, Arf2, Arf3、クラスIIにはArf4, Arf5、クラスIIIにはArf6が属する。クラスIは181アミノ酸、クラスII は180アミノ酸、唯一クラスIIIに属するArf6は175アミノ酸からなる。マウスArfにおいて同一クラス間で90-96%, クラスIとクラスII間では78-81%、クラスI/IIとクラスIII間では65-69%のアミノ酸の同一性がある。なお、記載法として、「ARF」はヒトの遺伝子あるいはタンパク質に対して使われ、「Arf」はヒト以外の種での名称、総称、活性などに対して用いられることが推奨されている<ref name=Kahn2006><pubmed>16505163</pubmed></ref>。

　Arfは、低分子量GTP結合タンパク質に共通の構造として、GTPおよびGDPとの結合により大きく立体構造を変化させてGTP依存的にエフェクターと相互作用するスイッチIとスイッチII領域を持つ<ref name=Gillingham2007><pubmed>17506703</pubmed></ref><ref name=Pasqualato2001><pubmed>11266366</pubmed></ref>。さらに他の低分子量GTP結合タンパク質とは異なる特徴として、N末端の開始メチオニン残基が除去され、2番目のグリシン残基に14炭素鎖飽和脂肪酸のミリスチン酸(C14:0)が不可逆的にアミド結合で付加されている。さらにそれに続くN末端領域に両親媒性αヘリックス領域が存在し、Arfの脂質膜との相互作用とともにスイッチIとスイッチII領域の構造変化に関わる。脂質膜と相互作用するN末端領域とエフェクターと相互作用するスイッチ領域間の立体構造上の距離が短い(1~2nm)ため、他の低分子量GTP結合タンパク質に比べて、エフェクターは脂質膜のより近くにリクルートされ作用する。これらの性質はArfの下流エフェクターであるリン脂質代謝酵素やアダプタータンパク質によるリン脂質膜への作用を介した小胞輸送制御に密接に関連すると考えられている<ref name=Gillingham2007><pubmed>17506703</pubmed></ref>。さらにGDP結合型とGTP結合型への変換に伴いスイッチIとスイッチII領域を繋ぐインタースイッチ領域も大きく立体構造を変化させるのもArfの構造上の特徴として挙げられる。

　他の低分子量GTP結合タンパク質と同様に、GTP結合型Arfは活性型として、種々のエフェクターを細胞膜や細胞小器官の脂質膜マイクロドメインにリクルートし、小胞輸送経路やアクチン細胞骨格の再構築を促す<ref name=D'Souza-Schorey2006><pubmed>16633337</pubmed></ref><ref name=Donaldson2011><pubmed>21587297</pubmed></ref>。多数のエフェクター分子が同定されており、それぞれArf分子に対する選択性を持つが、主要なエフェクターとして、①コートタンパク質（COPI複合体、GGA(Golgi-localized, -ear-containing, Arf-binding protein)、アダプタータンパク質複合体(AP-1, 2, 3, 4）、②リン脂質修飾酵素（ホスホリパーゼD、ホスファチジルイノシトール 4-リン酸 5-キナーゼ (PIP5K)、ホスファチジルイノシトール 4-キナーゼ）、③モータータンパク質（MKLP1）とアダプター分子（FIP3/4, JIP3/4）、④小胞繋留因子 (エクソシスト複合体サブユニットSec10、ゴルジンGMAP210、GARP/EARP複合体サブユニットVps52)などが挙げられる。また、GDP型Arfに選択的に結合する分子も同定されており、例えばGDP結合型Arf6の場合、アダプタータンパク質Fe65<ref name=Cheung2014><pubmed>24056087</pubmed></ref>、Rac/Rho-GEFであるKalirin <ref name=Koo2007><pubmed>17640372</pubmed></ref>、Rab-GAPであるTBC1D24 <ref name=Falace2010><pubmed>20727515</pubmed></ref>などが挙げられる。これらの事実から、古典的なGDP-GTPサイクルのドグマにおいて不活性型とされるGDP型Arfが、シグナル経路の調節に積極的に関与している可能性が示唆される。

　Arfは様々な組織に幅広く発現する<ref name=Hosaka1996><pubmed>8947846</pubmed></ref>。内因性Arfの細胞内局在は、分子間の高い同一性から特異的な抗体の作製が難しく、依然明らかにされていない。培養細胞への強制発現系を用いた局在解析から、Arf1-5は小胞体、ゴルジ装置、エンドソームに主に局在するのに対して、Arf6は細胞膜とエンドソームに局在することが報告されている<ref name=D'Souza-Schorey2006><pubmed>16633337</pubmed></ref><ref name=Radhakrishna1997><pubmed>9314528</pubmed></ref>。CRISPR-Cas9を用いたゲノム編集技術によりクラスI Arf (Arf1, Arf3)とクラスII Arf (Arf4, Arf5)のC末領域にタグをノックインした内因性Arfタンパク質の細胞内局在に関する超解像度顕微鏡解析の報告によると、HeLa細胞において、クラスIとクラスII Arfとも小胞体–ゴルジ体中間区画（ERGIC）、ゴルジ装置、管状小胞状の構造に部分的に共存しながら分布するが、同じ細胞小器官において異なるナノドメインへの局在も示すことから、クラスIとII のArfの各分子は、重複する機能とともに特異的な機能を持つものと考えられる<ref name=Wong-Dilworth2023><pubmed>37102998</pubmed></ref>。

　ArfのGDP-GTPサイクルはグアニンヌクレオチド交換因子(GEF)とGTPase活性化因子(GAP)により厳密に調節されている。

Arf-GEFは、1996年に酵母からGea1が、哺乳類からサイトヘジン-2 (ARNO)とBIG１のcDNAが最初にクローニングされた<ref name=Chardin1996><pubmed>8945478</pubmed></ref><ref name=Peyroche1996><pubmed>8945477</pubmed></ref>。その一次構造の比較から、GDPからGTPへの交換活性に必須である約200アミノ酸からなるSec7ドメインの存在が明らかになった。Sec7ドメインを持つタンパク質は、ヒトでは15種存在し、ドメイン構造の特徴から、GBF1ファミリー, BIGファミリー、サイトへジンファミリー、BRAG/IQSECファミリー、EFA6/PSDファミリー、FBXO8(F-box only protein 8)に分類される（図）<ref name=Cox2004><pubmed>14742722</pubmed></ref><ref name=Gillingham2007><pubmed>17506703</pubmed></ref><ref name=Sztul2019><pubmed>31084567</pubmed></ref>。FBXO8以外のSec7タンパク質は、Arf各分子に対する基質親和性は異なるもののArfに対するグアニンヌクレオチド交換活性を持つ<ref name=Cox2004><pubmed>14742722</pubmed></ref><ref name=Gillingham2007><pubmed>17506703</pubmed></ref><ref name=Sztul2019><pubmed>31084567</pubmed></ref>。一方、FBXO8はSec7とともにF-boxドメインを持ち、GEFとしては機能せず、Arf6の非分解性のユビキチン化を介した活性の制御に関わる<ref name=Yano2008><pubmed>18094045</pubmed></ref>。Arf-GEFは、Sec7ドメイン以外にコイルドコイルモチーフ、プレクストリン相同(PH)ドメイン、PDZ結合モチーフ、IQモチーフなどファミリーごとに特徴的なドメイン構造を持ち、Arf-GEFの細胞内局在や活性が制御されている。例えば、BRAG1とBRAG2は、C末端のPDZ結合モチーフを介してPSD-95との結合し、海馬神経細胞の興奮性シナプスのシナプス後肥厚部に局在する<ref name=Fukaya2020><pubmed>32341099</pubmed></ref><ref name=Sakagami2008><pubmed>18164504</pubmed></ref>。また、サイトへジン-2はN末端のコイルドコイルモチーフを介してタマリンと結合し代謝型グルタミン酸受容体と複合体を形成し、興奮性シナプスのペリシナプスに局在する<ref name=Ito2021><pubmed>34390832</pubmed></ref><ref name=Kitano2002><pubmed>11850456</pubmed></ref>。一方、BRAG3はゲフィリンやジストロフィンとの結合を介して抑制性シナプスのシナプス後膜に選択的に局在する<ref name=Fukaya2011><pubmed>21198641</pubmed></ref><ref name=Um2016><pubmed>27002143</pubmed></ref>。

　一方、精製されたArfにはGTPase活性が検出されないことより<ref name=Kahn1986><pubmed>3086320</pubmed></ref>、GAPの存在がGTPの加水分解に必須であることが発見当初より予想されていた<ref name=Kahn1986><pubmed>3086320</pubmed></ref>。1994年にRandazzoとKahnによりウシ脳抽出液にホスファチジルイノシトール 4,5-ビスリン酸 (PI(4,5)P2) 存在下で活性化するArf-GAPの存在が示された<ref name=Randazzo1994><pubmed>8144664</pubmed></ref>。同年、MaklerらによりArf1に対するGAP活性を指標に約49kDaのArf-GAPがラット肝臓より精製され<ref name=Makler1995><pubmed>7890632</pubmed></ref>。そのアミノ酸の部分配列よりcDNAが初めてクローニングされた<ref name=Cukierman1995><pubmed>8533093</pubmed></ref>。その結果、C4タイプのジンクフィンガー構造(CX2CX16CX2CX4R)からなるGAP活性に必須のArfGAPドメインが見出された。現在、ArfGAPドメインを共通に持つArf-GAP分子はヒトで31種同定されている <ref name=Kahn2008><pubmed>18809720</pubmed></ref>。ドメイン構造の類似性からArfGAP1ファミリー、ArfGAP2/3ファミリ―、SMAPファミリー、AGFGファミリー、ADAPファミリー、GITファミリー、ACAPファミリー、ASAPファミリー、AGAPファミリー、ARAPファミリーの10種類に分類される(図)<ref name=Kahn2008><pubmed>18809720</pubmed></ref>。ArfGAPのドメイン構造はArf-GEFと比べてより多彩で、例えばARAP1はArf-GAPドメインとともにRho-GAPドメインやRas結合ドメイン<ref name=Miura2002><pubmed>11804590</pubmed></ref>を、GIT1はRac-GEFであるPIXと結合するSpa2相同ドメインなどを持ち<ref name=Zhao2000><pubmed>10938112</pubmed></ref>、Arfのoffスイッチの制御分子であるとともに、Arf-GAP自体がGTP結合型Arfのエフェクターとして他のシグナル経路とのクロストークを担うものと考えられている。また、ArfGAPドメインはArf-GAP分子に必須のものではなく、ArfGAPドメインを持たないC9orf72やELMOD2がArf-GAP活性を示すことが報告されており<ref name=East2012><pubmed>23014990</pubmed></ref><ref name=Ivanova2014><pubmed>24616099</pubmed></ref><ref name=Su2021><pubmed>34145292</pubmed></ref><ref name=Su2020><pubmed>32848248</pubmed></ref>、今後さらにArf-GAPファミリーが広がる可能性がある。

　また、RabやRhoファミリーと異なり、Arf活性制御にはGDP結合型の低分子量GTP結合タンパク質と結合しGDP解離を抑制するGDP解離阻害因子(GDI, GDP dissociation inhibitor)やGDP型低分子量GTP結合タンパク質からGDIを解離させるGDI置換因子(GDF, GDI displacement factor)は存在しない。

　胎生致死。胎生3.5日齢 (E3.5)の胚盤胞までは野生型と外見上の差はなく成長するが、着床後まもないE5.5 においてKOマウスの71.4%に変性がみられ、E12.5にはKOマウスは消失し存在しない。胎生致死の原因は不明であるが、少なくともKOマウスの胚盤胞の栄養外胚葉や内細胞塊は野生型と同様に成長することが培養系実験で示されている<ref name=Hayakawa2014><pubmed>25305484</pubmed></ref> 。

　胎生致死。E9.5のKOマウスは野生型と比較して著明な成長遅延を示し、E10.5には全てのKOマウスが致死に至る。KOマウスの臓性内胚葉細胞において、大型のリソソーム（頂端液胞）の減少やエンドサイトーシス受容体メガリンの頂端領域での分布の減少などが認められることより、臓性内胚葉細胞における母体―胚子間の物質交換の障害が胎生致死の機序として考えられている<ref name=Follit2014><pubmed>24586199</pubmed></ref>。

　KOマウスはメンデル則に従って誕生し正常に成長する。異常な表現型は認められていない<ref name=Hosoi2019><pubmed>31201232</pubmed></ref>。

　胎生致死。KOマウスは胎生中期の肝細胞索の形成障害による肝臓の発達不全を示し、胎生中期(E13.5)から後期にかけて致死に至る<ref name=Suzuki2006><pubmed>16880525</pubmed></ref>。また、E12.5のKOマウスにおいて脊髄交連神経の正中線での軸索投射異常が認められる<ref name=Kinoshita-Kawada2019><pubmed>30674481</pubmed></ref>。

　2004年Sheenらは異所性灰白質を伴う小頭症の原因遺伝子としてクラスI ArfのGEF であるヒトBIG2(ARFGEF2)を同定した<ref name=Sheen2004><pubmed>14647276</pubmed></ref>。マウスBIG2は胎生期の脳室帯に豊富に発現し、Arf-GEF (BIG1, BIG2, GBF1)に対する阻害剤ブレフェルジンAの胎児期脳室帯への投与やBig2ノックアウトマウスにおいて、神経上皮細胞間のN-カドへリンを介した細胞接着が障害され、脳室帯の構造の破綻が生じる<ref name=Ferland2009><pubmed>18996916</pubmed></ref><ref name=Zhang2012><pubmed>22956851</pubmed></ref>。その後、ヒトARF1も異所性灰白質の原因遺伝子として報告され<ref name=Ishida2023><pubmed>36345169</pubmed></ref>、BIG2によるARF1の活性化が、神経上皮細胞間のN-カドへリン依存的な細胞接着の制御を介して脳室帯の構造維持に関与する可能性が示唆される。

　また、胎生期のマウス脳室帯の神経上皮細胞において、EphB2-ephrin B1シグナルは、Arf6の活性化による頂端面でのインテグリンβ1のエンドサイトーシスを抑制し、インテグリンの表面発現を適切に維持することにより、脳室帯の構造維持、非対称分裂、脳室帯から分裂後の細胞離脱を制御することが報告されている<ref name=Arvanitis2013><pubmed>23578932</pubmed></ref>。

　中枢神経系において神経幹細胞の非対称分裂により生じた幼若神経細胞は、脳室帯を離脱し、先導突起の伸長と細胞体や細胞核の牽引を繰り返し、最終的に機能する部位へと細胞移動する。この細胞移動には、牽引力となるアクチン細胞骨格の再構築とともに、小胞輸送経路による先導突起方向への細胞膜成分の輸送、細胞接着分子や誘引因子に対する受容体などの極性配置の調節が重要な役割を果たす。特にヒトARF1とBIG2が異所性灰白質の原因遺伝子であること<ref name=Ishida2023><pubmed>36345169</pubmed></ref><ref name=Sheen2004><pubmed>14647276</pubmed></ref>から、Arfの神経移動の重要性が示唆されていた。

　大脳皮質層形成過程で、興奮性神経細胞は多極性移動、ロコモーション、ターミナルトランスロケーションからなる移動様式を取る。子宮内電気穿孔法を用いた研究から、Arf1、Arf4、Arf6の神経移動への機能関与が明らかになっている<ref name=Falace2014><pubmed>24469796</pubmed></ref><ref name=Hara2016><pubmed>27622210</pubmed></ref><ref name=Hara2023><pubmed>37848288</pubmed></ref><ref name=Ishiguro2024><pubmed>39052890</pubmed></ref>。異所性灰白質と関連するヒトArf1変異遺伝子のマウス脳室帯細胞への導入により、神経細胞移動の障害による大脳皮質の層形成異常が生じる。このArf1変異遺伝子を発現する移動神経細胞はゴルジ装置の拡大を示すことより、Arf1のゴルジ装置での輸送経路の調節を介した神経細胞移動への関与が示唆されている<ref name=Ishiguro2024><pubmed>39052890</pubmed></ref>。一方、Arf4は多極性移動、多極性から双極性への形態変換、それに続くロコモーションに、Arf6は多極性移動とともに多極性から双極性への形態変換の段階に関わる<ref name=Hara2016><pubmed>27622210</pubmed></ref><ref name=Hara2023><pubmed>37848288</pubmed></ref>。移動神経細胞において、Arf4とArf6はそれぞれ逆行性輸送経路およびリサイクリング経路を介したN-カドへリンの小胞輸送の制御により放射状グリアとの細胞接着性を調節する可能性が示唆されている<ref name=Hara2016><pubmed>27622210</pubmed></ref><ref name=Hara2023><pubmed>37848288</pubmed></ref>。また、神経細胞移動におけるArf6の活性化制御としてArf6-GAPであるACAP3の関与が報告されている<ref name=Miura2017><pubmed>28919417</pubmed></ref>が、Arf6-GEFは不明である。

　Arf6は、PIP5Kの活性化を介して、成長円錐でのアクチン細胞骨格を制御し、軸索の分岐や伸長を抑制的に調節することが初代海馬培養細胞において報告されている<ref name=Hernandez-Deviez2004><pubmed>14565977</pubmed></ref>。同様に脊髄神経節初代培養細胞においてもArf6の活性化は軸索の伸長に抑制的に作用する<ref name=Eva2012><pubmed>22836268</pubmed></ref>。

　Arf6ノックアウトマウスは、胎生12.5日齢の脊髄において脊髄交連神経の正中線での軸索投射異常を示す<ref name=Kinoshita-Kawada2019><pubmed>30674481</pubmed></ref>。その機序として、脊髄交連神経の成長円錐において、Arf6が軸索反発因子スリットの受容体Robo1や誘引因子Wnt5aの受容体Frizzledの適切なタイミングでの軸索膜上での発現を調節することにより、正中線通過後の交連線維のネトリンに対する反発活性の獲得や吻側方向での軸索のターニングや伸長に関与する可能性が報告されている<ref name=Kinoshita-Kawada2019><pubmed>30674481</pubmed></ref><ref name=Onishi2013><pubmed>24305805</pubmed></ref>。なお、交連軸索投射異常を示すショウジョウバエ変異体スクリーニングにより、Arf6-GEFであるBRAGファミリー分子のオルソログであるSchizo / Lonerが同定されている。Schizoは正中部グリア細胞において膜結合型SlitのArf6依存的なエンドサイトーシスを介して軸索の正中線の交差に関与する<ref name=Onel2004><pubmed>15148300</pubmed></ref>。

　Arf6は、脊髄神経節ニューロンの軸索やPC12 細胞の突起において、インテグリンを含む輸送小胞の逆行性輸送に関与する<ref name=Eva2012><pubmed>22836268</pubmed></ref>。さらにGTP結合型Arf6は、エフェクターのJIP3/JIP4と結合することにより、JIP3/JIP4のダイナクチン/ダイニン複合体との相互作用とダイニンのモーター活性を促進し、オートファゴソームの逆行性軸索輸送を制御することが初代海馬培養細胞で報告されている<ref name=Cason2023><pubmed>37909920</pubmed></ref>。軸索でのArf6の活性制御機構として、中枢神経系ニューロンにおいて、Arf6-GEFであるEFA6Aは、軸索初節に豊富に局在し、軸索起部においてArf6の活性化を促し、軸索輸送を調節している可能性が報告されている<ref name=Eva2017><pubmed>28935671</pubmed></ref>。

一方、Arf4とArf5のダブルノックアウトマウス (Arf4/5 DKO)は、プロパノールやガバペンチン反応性の本態性振戦様の不随意運動を示す。さらに、Arf4/5 DKOマウスの小脳プルキンエ細胞において、電位依存性ナトリウムチャネルNav1.6の軸索起始部での局在が障害され、自発的な連続発火が低下することから、クラスII Arfが小胞輸送経路を介した軸索起始部でのイオンチャネルの発現を制御する可能性が示唆されている<ref name=Hosoi2019><pubmed>31201232</pubmed></ref>。

Arf1とArf6は異なるシグナル制御経路を介して樹状突起の発達を制御する。Arf1はゴルジ装置においてBIG2により活性化され、RhoA-mDia経路を介して、頂上樹状突起の基部へのゴルジ装置の極性配置を制御し、頂上樹状突起の伸長・分岐に関与する<ref name=Hong2018><pubmed>29455446</pubmed></ref>。一方、Arf6の活性化は、海馬初代培養細胞の樹状突起の分岐形成<ref name=Hernandez-Deviez2004><pubmed>14565977</pubmed></ref>や海馬スライス培養でのCA1錐体神経細胞の樹状突起の網状分子層への伸長を抑制する<ref name=Han2020><pubmed>32873638</pubmed></ref>。樹状突起形成におけるArf6活性の制御因子としては、GEFとしてサイトへジン-1 <ref name=Han2020><pubmed>32873638</pubmed></ref>, サイトへジン-2 <ref name=Hernandez-Deviez2002><pubmed>12032543</pubmed></ref>, EFA6A <ref name=Sakagami2004><pubmed>15009133</pubmed></ref>が、GAPとしてADAP1 (centaurin 1) <ref name=Moore2007><pubmed>17635995</pubmed></ref>とACAP3<ref name=Miura2016><pubmed>27330119</pubmed></ref>の関与が報告されている。Arf6による樹状突起形成制御機構として、Rac1を介した細胞骨格の制御<ref name=Hernandez-Deviez2002><pubmed>12032543</pubmed></ref>、JIP3やFIP3によるモータータンパク質の活性調節を介した小胞輸送の制御<ref name=Suzuki2010><pubmed>20493856</pubmed></ref><ref name=Yazaki2014><pubmed>24576489</pubmed></ref>, GDP結合型Arf6との結合能を持つRab-GAPのTBC1D24を介した経路の関与<ref name=Falace2014><pubmed>24469796</pubmed></ref>が報告されている。

　Arf1はPICK1との相互作用を介して、PICK1によるArp2/3依存的なアクチン重合の阻害を調節することでスパイン構造の制御に関わる<ref name=Rocca2013><pubmed>23889934</pubmed></ref>。GTP型Arf1はPICK1と結合しAMPA型グルタミン酸受容体(AMPAR)をシナプス後肥厚部(PSD)で複合体を形成している。NMDA型グルタミン酸受容体(NMDAR)依存的LTDの過程で、NMDA刺激によりGTP型Arf1がGIT1などのArf-GAPによりGDP型に変換される結果、PICK1はArf1との結合から解放され、それに代わりArp2/3と結合し、Arp2/3によるアクチン線維の重合を抑制することで、スパイン頭部の退縮が引き起こされる。

　一方、Arf6 は、初代海馬培養細胞において、スパインの発達段階に応じて双方向性の作用を示す<ref name=Choi2006><pubmed>16672654</pubmed></ref><ref name=Kim2015><pubmed>25605715</pubmed></ref><ref name=Miyazaki2005><pubmed>16325184</pubmed></ref>。Arf6の活性化は、スパイン形成期(培養11-15日)においてフィロポディアからスパインへの形成に促進的な作用を示すのに対して、スパイン維持期(培養17-20日)にはスパインの維持に対して抑制的に作用する<ref name=Choi2006><pubmed>16672654</pubmed></ref><ref name=Kim2015><pubmed>25605715</pubmed></ref><ref name=Miyazaki2005><pubmed>16325184</pubmed></ref>。発達期におけるArf6の活性化によるスパイン形成・成熟の促進機序としては、ホスホリパーゼDの活性化を介したRac 経路によるアクチン細胞骨格の再編成<ref name=Kim2015><pubmed>25605715</pubmed></ref>や、細胞接着分子テレンセファリンの細胞膜からの取り込みによるフィロポディアからスパインへの成熟の促進<ref name=Raemaekers2012><pubmed>22781129</pubmed></ref>が考えられている。一方、Arf6による成熟期のスパイン維持の抑制機序として、成熟に伴うRacの発現低下とRhoの発現上昇によるRhoに対するArf6依存的なRac活性化経路の相対的な低下<ref name=Kim2015><pubmed>25605715</pubmed></ref>、GDP型Arf6の結合タンパク質である家族性てんかん原因遺伝子産物TBC1D24の関与<ref name=Lin2020><pubmed>32004315</pubmed></ref>が報告されている。Arf6のスパイン制御の上流活性化制御分子としては、Arf6-GEFとしてEFA6A<ref name=Choi2006><pubmed>16672654</pubmed></ref><ref name=Raemaekers2012><pubmed>22781129</pubmed></ref>, BRAG2<ref name=Ansar2019><pubmed>31607425</pubmed></ref>が、 Arf6-GAPとしてGIT1<ref name=Zhang2005><pubmed>15800193</pubmed></ref>, AGAP1<ref name=Arnold2016><pubmed>27713690</pubmed></ref>, ADAP1<ref name=Szatmari2021><pubmed>33139322</pubmed></ref>が関与する。