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== 背景 == | == 背景 == | ||
従来、[[核型検査]]により検出される[[ヒト]][[ゲノム]]の異常として、[[染色体]]の[[欠失]]、[[重複]]、[[逆位]]、[[転座]]等が知られていた。ゲノムのコピー数変化・多型（copy number variations: CNVs）という概念は、2004年Iafrate AJとSebatらにより提唱された<ref name="ref1"><pubmed>15273396</pubmed></ref> <ref name="ref2"><pubmed>19015223</pubmed></ref>。[[常染色体]]上のゲノムDNAは通常１体細胞当たり2コピーであるが、個々人により1コピー以下しか存在しない領域（欠失）、もしくは3コピー以上存在する領域（重複）があり、病的であるもの、病的でないものを含め、それらをCNVと提唱した。さらに、SchererらはCNVを対照ゲノムと比較してコピー数が異なる1 kb以上のDNA断片と定義し、その中でも1%以上の人口で認めるコピー数変化をcopy number polymorphism (CNP)としている<ref name="ref3"><pubmed>17597780</pubmed></ref>。 | |||
同時期から、コピー数変化を検出できる様々な解析法が開発され、より高密度の解析が可能となり、当初予想された以上にヒトゲノムにはCNVが存在することが判明した。国際HapMapプロジェクトで用いられたヨーロッパ、アフリカ、アジアの異なる祖先をもつ3系統270名の[[リンパ芽球細胞]]（lymphoblastoid cell lines: LCLs)由来のDNAを使用してCNVの検証が行われた。Affymetrix GeneChip Human Mapping 500K early access array (500K EA)と、whole genome TilePath (WGTP) arrayの2種類を用いた検証の結果、合計1447か所のCNVsが検出された。そのゲノムサイズの合計は約360 Mb でヒトゲノムの約12 %に相当した<ref name="ref4"><pubmed>17122850</pubmed></ref> <ref name="ref5"><pubmed>16418744</pubmed></ref>。また、2010年のConradらは、41人の女性のLCLs由来のDNAを用いてNimbleGen arrayを用いた解析を行い、11,700か所のCNV (サイズの中央値：2.7 kb)を検出した<ref name="ref6"><pubmed>19812545</pubmed></ref>。 2006年RedonらによりヒトゲノムCNVカタログが作成され<ref name="ref7"><pubmed>20002459</pubmed></ref>、現在ではヒト、[[マウス]]、[[ラット]]、[[チンパンジー]]、[[アカゲザル]]、[[wikipedia:JA:|キイロショウジョウバエ]]等でも同様のCNVカタログが作成されている<ref name="ref8">'''Henrichsen, C.N., E. Chaignat, and A. Reymond'''<br>Copy number variants, diseases and gene expression.<br>''Hum Mol Genet,'' 2009. 18(R1): p. R1-8.</ref>。 | |||
== CNVの形成メカニズム == | == CNVの形成メカニズム == | ||
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[[Image:3FoSTeS.png|thumb|300px|<b>図3．FoSTeS</b><br />Wenli Gu et al 2008 より改変引用<ref name="ref11"><pubmed>19014668</pubmed></ref>]] | [[Image:3FoSTeS.png|thumb|300px|<b>図3．FoSTeS</b><br />Wenli Gu et al 2008 より改変引用<ref name="ref11"><pubmed>19014668</pubmed></ref>]] | ||
通常１Kb以上の長さで、90%以上の相同性を持つ配列はlow copy repeats (LCRs) またはsegmental duplications (SDs）と定義される<ref name="ref9"><pubmed>20059347</pubmed></ref> | 通常１Kb以上の長さで、90%以上の相同性を持つ配列はlow copy repeats (LCRs) またはsegmental duplications (SDs）と定義される<ref name="ref9"><pubmed>20059347</pubmed></ref>。このような配列はヒト[[ハプロイド]]ゲノムに3.6 %存在するとされる<ref name="ref10"><pubmed>11381028</pubmed></ref>。特に10 kb以上の長さで97%以上の相同性を持つ場合LCRs領域では、ゲノム不安定性が高まり、組み換えが起こりやすくなるため欠失、重複、挿入、転座、逆位によるゲノム再構成 (genomic rearrangement) が生じやすい。これらのゲノム再編成を生じるメカニズムとして、生体内では主に以下の3つが考えられている<ref name="ref11"><pubmed>19014668</pubmed></ref>。 | ||
#NAHR (non-allelic homologous recombination) （図1）<br> | #NAHR (non-allelic homologous recombination) （図1）<br> | ||
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=== Array CGH === | === Array CGH === | ||
[[Image:4ArrayCGH.png|thumb|300px|<b>図4．アレイCGH</b><br />比較ゲノムハイブリダイゼーション法(ComparativeGenomicHybridization:CGH) | [[Image:4ArrayCGH.png|thumb|300px|<b>図4．アレイCGH</b><br />比較ゲノムハイブリダイゼーション法(ComparativeGenomicHybridization:CGH)は全ゲノムを対象にDNAコピー数変化を調べるための効率的な方法。<br />Agilento社HPより一部改変引用]] | ||
Array | Array CGHとは、[[オリゴヌクレオチド]]あるいは[[プラズミド]]DNAにクローン化したヒトゲノムの一部（プローブ）をチップ上に配置したアレイを基盤とする。コピー数変化を調べたい検体DNAと対照とするDNAをそれぞれ異なる波長の[[蛍光色素]]で標識をする。標識した２つのDNAを同量混合させ、[[アレイ]]上のプローブと競合的に[[ハイブリダイズ]]させる。プローブに結合した検体DNAと対照DNAの蛍光シグナルの強度の比から検体DNAと対照DNAコピー数の比を算出することができる。具体的には、両試料でコピー数が等しい場合は同等のシグナル強度を示し、片方の試料に染色体の欠失あるいは重複があれば異なったシグナル強度を示す。（図4） | ||
=== SNP array === | === SNP array === | ||
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[[Image:5SNParray.png|thumb|300px|<b>図5．SNP array</b><br />検体DNAを断片化した後に蛍光色素で標識し、熱変性条件下でチップと反応させる]] | [[Image:5SNParray.png|thumb|300px|<b>図5．SNP array</b><br />検体DNAを断片化した後に蛍光色素で標識し、熱変性条件下でチップと反応させる]] | ||
2004年頃Affymetrix社の[[wikipedia:JA:|一塩基多型]]（SNP）解析用arrayでコピー数解析ができるようになった。このアレイはreference genomeを必要とせず、疾患のゲノムだけで解析が可能である。アレイ上には対立遺伝子の25-merのプローブがあり、既知のSNPサイトに対して異なる塩基（例えばCもしくはT）を搭載している。相補的な配列を持つラベル化された検体DNAがプローブに結合する際、SNPサイトにミスマッチが存在すると結合しにくくなり、シグナルは弱くなる。最近のSNPアレイを用いるとgenotypeも同時に検出が可能で、更にアリルピーク(Genotype: 2 copyの場合 AA/AB/BB, 3 copyの場合 AAA/AAB/ABB/BBB, 1 copyの場合A/B) を見ることで情報性が付加されたコピー数変化としてとらえることが可能となり信頼性が増した。（図5） | |||
=== 定量PCR法（quantitative real time polymerace chain reaction: qPCR） === | === 定量PCR法（quantitative real time polymerace chain reaction: qPCR） === | ||
これは標的とするゲノム領域のCNVをスクリーニングするのに最も一般的に使用される方法の一つである。標的とする遺伝子（領域）に対してプライマーを設計し、蛍光色素をとりこませながら[[PCR]]で増幅させ、PCR産物の増幅効率を測定する。 テンプレートの量に応じて増幅効率が異なるのを利用して、DNAの定量（コピー数解析）が可能である。 | |||
=== MLPA法（multiplex ligation-dependent probe amplification 法） === | === MLPA法（multiplex ligation-dependent probe amplification 法） === | ||
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== CNVと疾患関連性 == | == CNVと疾患関連性 == | ||
欠失、重複などのゲノム再構成が起きる際、遺伝子そのものあるいは遺伝子発現に関与する領域を含む事がある。ヒトゲノムで一世代を経ることで点変異（SNP）は1.8～2.5x10- | 欠失、重複などのゲノム再構成が起きる際、遺伝子そのものあるいは遺伝子発現に関与する領域を含む事がある。ヒトゲノムで一世代を経ることで点変異（SNP）は1.8～2.5x10<sup>-8</sup>、CNVは1.7x10<sup>-6</sup>～1.2x10<sup>-4</sup>の確率で起こるとされており、CNV発生はSNPのそれに比べて102～104倍高率であるため、遺伝子の点変異よりもCNVが原因となる遺伝性疾患が多いと推定される<ref name="ref13"><pubmed>17597781</pubmed></ref> 。CNVはいくつかの分子メカニズム（表１）を介して生じ、病気を惹起する場合もある。病的・非病的CNVがあり、例えばCNVが①罹患の血縁者に存在するか既報の疾患関連CNVに一致する、②疾患責任遺伝子や多数の遺伝子を含むか遺伝子発現領域を含む、③サイズが３Mb以上である、④増幅が3コピー以上である、などの場合、病的CNVである可能性が高いと考えられている<ref name="ref14"><pubmed>17597782</pubmed></ref>。 | ||
== CNVの検索方法 == | == CNVの検索方法 == | ||
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| Examples<ref name="ref15"><pubmed>18160035</pubmed></ref> | | Examples<ref name="ref15"><pubmed>18160035</pubmed></ref> | ||
| colspan="2" | | | colspan="2" | Examples of Disease<ref name="ref15"><pubmed>18160035</pubmed></ref> <ref name="ref16"><pubmed>16444292</pubmed></ref> | ||
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| rowspan="2" | ①遺伝子効果（dose-sensitive gene） | | rowspan="2" | ①遺伝子効果（dose-sensitive gene） | ||
| rowspan="2" | [[Image:コピー数変化表1.png|thumb|250px]] | | rowspan="2" | [[Image:コピー数変化表1.png|thumb|250px]] | ||
| | | [[wikipedia:JA:|Charcot-Marie-Tooth病]]（CMT病1A型） | ||
| Chr 17 p11上のPMP22を含む約1.4 Kbの領域の重複 | | Chr 17 p11上のPMP22を含む約1.4 Kbの領域の重複 | ||
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| | | [[wikipedia:JA:|遺伝性圧脆弱性ニューロパチー]]（NHPP） | ||
| Chr 17 p11上のPMP22を含む約1.4 Kbの領域の欠失 | | Chr 17 p11上のPMP22を含む約1.4 Kbの領域の欠失 | ||
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| ②position effect | | ②position effect | ||
| [[Image:コピー数変化表2.png|thumb|250px]] | | [[Image:コピー数変化表2.png|thumb|250px]] | ||
| Blepharophimosis syndrome | | [[wikipedia:JA:|Blepharophimosis syndrome]] | ||
| | | 責任遺伝子FOXL2の230kb 上流にある[[wikipedia:JA:|転写因子]]の結合部位がCNVにより欠失すると発症する。 | ||
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| ③ unmasking of recessive allele | | ③ unmasking of recessive allele | ||
| [[Image:コピー数変化表3.png|thumb|250px]] | | [[Image:コピー数変化表3.png|thumb|250px]] | ||
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| | | 片方の[[アレル]]に劣性変異が存在する個体で、野生型アレルが欠失した場合、劣性変異が顕在化する。 | ||
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| ④Gene interruption Gene fusion | | ④Gene interruption Gene fusion | ||
| [[Image:コピー数変化表4.png|thumb|250px]] | | [[Image:コピー数変化表4.png|thumb|250px]] | ||
| | | 融合遺伝子：急性骨髄性白血病（AML）や骨髄異形成症候群（MDS） | ||
| CNV配列上に遺伝子が存在した場合遺伝子の破壊や融合遺伝子形成が起こる。 | | CNV配列上に遺伝子が存在した場合遺伝子の破壊や融合遺伝子形成が起こる。 | ||
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