超解像蛍光顕微鏡

川岸 将彦, 寺田 純雄
東京医科歯科大学

英: Super-resolution microscopy

光学顕微鏡は、光の屈折、反射などを使って、物体を拡大して観察する器械である。しかし、光という電磁波を利用するため、その分解能は、光の回折限界(可視光では250 nm程度)によって制限される。そのため、従来の光学顕微鏡では、それよりも小さい構造を見る事は出来なかった。螢光顕微鏡とは、励起光を当てて、螢光色素、螢光蛋白質から発せられる螢光を観察する光学顕微鏡であるが、やはり、分解能には制限があった。それに対して、超解像螢光顕微鏡とは、励起照明法や、観察される螢光分子、解析方法などの工夫により、光の回折限界で制限される分解能を超える (超解像)螢光像を作る顕微鏡である。

光学顕微鏡の分解能

光の回折と点拡がり関数、エアリーディスク

光は電磁波の一種であり、波としての性質を持つ。波である光が、限られた大きさの開口を通ると、通り抜けた光の波面はホイヘンス-フレネルの原理によって変化する。開口面から十分遠い面での光波の振幅分布は、フラウンホーファー回折と呼ばれる分布を示す。

レンズは、屈折によって、光の平面波を、収斂/発散する球面波に変化させる光学素子である。レンズの径は有限なので、フラウンホーファー回折と同様の回折が、焦点面において形成される。

この回折のため、点光源から発した光がレンズを通って像を形成しても、その像は一点には収斂せず、3次元に一定の広がりと強度分布をもったものになる。この分布を、点拡がり関数 (点像分布関数, Point spread function, PSF)と呼ぶ。顕微鏡に即して言えば、点状の物体を拡大した像は、単純に拡大された形状になるのではなく、周囲に一定の滲み、広がりを持ったものになる。

無限遠にある点光源から、円形開口を通過した光が、収差のない理想的なレンズ光学系によって像を形成した時、そこに形成されるPSFを、エアリーディスク (Airy disc)と呼ぶ。その焦点面での光強度の分布$I(\theta )$は

$I(\theta )=I_{0}\left({\frac {2J_{1}(x(\theta ))}{x(\theta )}}\right)^{2}$, $x(\theta )={\frac {2\pi a\sin \theta }{\lambda }}$

$\theta$: レンズの中心から、焦点面上の観察点を見た観察角。光軸方向を0とする。
$I_{0}$: 光軸上の、つまり、最も明るい点での光強度。
$J_{1}(.)$: 一次の第一種ベッセル函数。
$a$: 円形開口の半径。顕微鏡のレンズの半径に当たる。
$\lambda$: 光の波長。

と表される。この分布は、中心に高い山があり、それを同心円状の低い縞が囲むような形になる。最初の極小までの半径は、

$x(\theta )={\frac {2\pi a\sin \theta }{\lambda }}\approx 3.831706...$, ∴ $\sin \theta \approx 1.2197{\frac {\lambda }{2a}}=0.6098{\frac {\lambda }{a}}$

が成り立つ位置になる。

2点分解能

光学顕微鏡の分解能は、2点分解能で表現される事が多い。つまり、2つの点光源を、異なる点として識別できるような、2点間の最小角度、又は距離である。螢光顕微鏡のように、独立に発光する二つの光源の場合、収差のない理想的な光学系では、レイリー基準により、上の式で表される、エアリーディスクの最初の極小までの半径に相当する角度だとされる。

この2点分解能を、顕微鏡の試料面上の2光源間の最小距離$R$で表すと、$R=f\sin \theta$ ($f$: 焦点距離)となる。開口数$\mathrm {NA} =\sin \alpha \approx a/f$ ($\alpha$: 光源からレンズの開口半径を見込む角度)とすると、

$R=1.2197{\frac {\lambda }{2\mathrm {NA} }}=0.6098{\frac {\lambda }{\mathrm {NA} }}$

これが、光学顕微鏡の2点分解能としてよく使われる式である。

高倍率の対物レンズでは、入射角の大きい光の全反射を防いで、開口数を大きくするため、液浸が使われる事が多い。その場合、$\mathrm {NA} =n\sin \alpha$ ($n$: レンズと物体の間の媒質の屈折率。) となり、開口数が1より大きいレンズも使えるようになる。2点分解能の式は同様である。波長$\lambda$ = 550 nm, 油浸で開口数$\mathrm {NA}$ = 1.4 - 1.6程度だと、分解能$R$は、240 - 210 nm程度になる。

超解像蛍光顕微鏡

超解像蛍光顕微鏡とは、上述の、対物レンズの回折限界で制限される分解能を越える (超解像)蛍光像を作る顕微鏡のことである。分解能を超える手法としては、RESOLFTを利用するもの、単分子の局在は2点分解能よりも細かく決められる事を利用するもの、励起照明を工夫して回折限界以上の高周波成分の情報を得るもの、統計学的手法を使うものなど、多くの手法が開発、実用化されている。ここでは、代表的なものを紹介する。

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