超解像蛍光顕微鏡

川岸 将彦, 寺田 純雄
東京医科歯科大学

英: Super-resolution microscopy

光学顕微鏡は、光の屈折、反射などを使って、物体を拡大して観察する器械である。しかし、光という電磁波を利用するため、その分解能は、光の回折限界(可視光では250 nm程度)によって制限される。そのため、従来の光学顕微鏡では、それよりも小さい構造を見る事は出来なかった。螢光顕微鏡とは、励起光を当てて、螢光色素、螢光蛋白質から発せられる螢光を観察する光学顕微鏡であるが、やはり、分解能には制限があった。それに対して、超解像螢光顕微鏡とは、励起照明法や、観察される螢光分子、解析方法などの工夫により、光の回折限界で制限される分解能を超える (超解像)螢光像を作る顕微鏡である。

光学顕微鏡の分解能

光の回折と点拡がり関数、エアリーディスク

光は電磁波の一種であり、波としての性質を持つ。波である光が、限られた大きさの開口を通ると、通り抜けた光の波面はホイヘンス-フレネルの原理によって変化する。開口面から十分遠い面での光波の振幅分布は、フラウンホーファー回折と呼ばれる分布を示す。

レンズは、屈折によって、光の平面波を、収斂/発散する球面波に変化させる光学素子である。レンズの径は有限なので、フラウンホーファー回折と同様の回折が、焦点面において形成される。

この回折のため、点光源から発した光がレンズを通って像を形成しても、その像は一点には収斂せず、3次元に一定の広がりと強度分布をもったものになる。この分布を、点拡がり関数 (点像分布関数, Point spread function, PSF)と呼ぶ。顕微鏡に即して言えば、点状の物体を拡大した像は、単純に拡大された形状になるのではなく、周囲に一定の滲み、広がりを持ったものになる。

無限遠にある点光源から、円形開口を通過した光が、収差のない理想的なレンズ光学系によって像を形成した時、そこに形成されるPSFを、エアリーディスク (Airy disc)と呼ぶ。その焦点面での光強度の分布$I(\theta )$は

$I(\theta )=I_{0}\left({\frac {2J_{1}(x(\theta ))}{x(\theta )}}\right)^{2}$, $x(\theta )={\frac {2\pi a\sin \theta }{\lambda }}$

$\theta$: レンズの中心から、焦点面上の観察点を見た観察角。光軸方向を0とする。
$I_{0}$: 光軸上の、つまり、最も明るい点での光強度。
$J_{1}(.)$: 一次の第一種ベッセル函数。
$a$: 円形開口の半径。顕微鏡のレンズの半径に当たる。
$\lambda$: 光の波長。

と表される。この分布は、中心に高い山があり、それを同心円状の低い縞が囲むような形になる。最初の極小までの半径は、

$x(\theta )={\frac {2\pi a\sin \theta }{\lambda }}\approx 3.831706...$, ∴ $\sin \theta \approx 1.2197{\frac {\lambda }{2a}}=0.6098{\frac {\lambda }{a}}$

が成り立つ位置になる。

2点分解能

光学顕微鏡の分解能は、2点分解能で表現される事が多い。つまり、2つの点光源を、異なる点として識別できるような、2点間の最小角度、又は距離である。螢光顕微鏡のように、独立に発光する二つの光源の場合、収差のない理想的な光学系では、レイリー基準により、上の式で表される、エアリーディスクの最初の極小までの半径に相当する角度だとされる。

この2点分解能を、顕微鏡の試料面上の2光源間の最小距離$R$で表すと、$R=f\sin \theta$ ($f$: 焦点距離)となる。開口数$\mathrm {NA} =\sin \alpha \approx a/f$ ($\alpha$: 光源からレンズの開口半径を見込む角度)とすると、

$R=1.2197{\frac {\lambda }{2\mathrm {NA} }}=0.6098{\frac {\lambda }{\mathrm {NA} }}$

これが、光学顕微鏡の2点分解能としてよく使われる式である。

高倍率の対物レンズでは、入射角の大きい光の全反射を防いで、開口数を大きくするため、液浸が使われる事が多い。その場合、$\mathrm {NA} =n\sin \alpha$ ($n$: レンズと物体の間の媒質の屈折率。) となり、開口数が1より大きいレンズも使えるようになる。2点分解能の式は同様である。波長$\lambda$ = 550 nm, 油浸で開口数$\mathrm {NA}$ = 1.4 - 1.6程度だと、分解能$R$は、240 - 210 nm程度になる。

超解像蛍光顕微鏡

超解像蛍光顕微鏡とは、上述の、対物レンズの回折限界で制限される分解能を越える (超解像)蛍光像を作る顕微鏡のことである。分解能を超える手法としては、RESOLFTを利用するもの、単分子の局在は2点分解能よりも細かく決められる事を利用するもの、励起照明を工夫して回折限界以上の高周波成分の情報を得るもの、統計学的手法を使うものなど、多くの手法が開発、実用化されている。ここでは、代表的なものを紹介する。

Localization Microscopy

図１　PALMの原理
①視野内の疎らなPSFPのオン。オン状態のPSFPの位置をグレーの◯で示した。
②蛍光一分子画像の取得。主に全反射顕微鏡によって行うが共焦点顕微鏡の利用も可能である。得られる輝点は前述のとおり2次元のPSFに従った広がりを持っている。撮影後は視野内のオン状態のPSFPを全て退色させる（あるいは退色するまで撮影を続ける）。
③座標推定による分子の局在画像の構築。これは②の蛍光一分子画像をガウス関数でフィッティングして、蛍光分子の「座標」を推定する事である。さらに、推定座標の「不確かさ」も求められる。座標推定から構築した点は②の相当する点に比べて小さくなるが、この点の輝度も2次元のガウス関数として表現される。ガウス関数の中心が上記のフィッティングにより推定された「座標」、標準偏差が「不確かさ」に相当する。また、一分子当たりの輝度の合計が等しくなるように規格化される。つまり、精度が高く推定された点は小さく明るい点、精度が低く推定された点は大きく広がった暗い点として局在画像では表現される事になる。
④上記①～③操作を全てのPSFPがなくなるまで繰り返した後に、③で得られた画像を全て足し合わせる事で、PALM画像を得る事ができる。
PALM画像の輝度は蛍光分子がその位置で見つかる可能性に比例する。図では比較のために②で得られた画像の総和も示した。これは通常の顕微鏡観察画像に相当する。この例では②の総和では見られなかった「P A L M」の4文字が③の総和では確認できる。

PALM

光学顕微鏡の空間分解能は先述のとおり、2つの点光源を異なる点として区別する「2点分解能」で表現され、可視光では200-300 nm程度である。しかしながら、隣り合った2点が重ならないほど離れていれば、蛍光一分子のPSFを2次元のガウス関数でフィッティングする事で、条件によっては~1.5 nmの精度で位置を決定できる。この蛍光一分子の正確な位置解析は（FIONA；fluorescence imaging with one-nanometer accuracy）として知られる。超解像顕微鏡法の一つであるLocalization microscopy（蛍光一分子局在化顕微鏡法）は、FIONAを利用し光学顕微鏡の分解能を超えた画像を取得する方法である。このアイディアは古くからあったが、実現はされなかった。例えばGFPを発現した細胞にFIONAをそのまま適用する事は以下の点で困難なためである。
１）発現しているGFPの数が多く、隣り合ったGFPのPSFが重なりあってしまう。
２）GFPを重なりが無い程度に発現させるのは非常に困難である。
３）仮に２）ができたとしても、細胞内に数個のGFPの位置を検出したところで分子の局在を知るには情報に乏しい。
蛍光一分子局在化法では、蛍光色素の蛍光能や蛍光色が切り替わる性質を利用してこれらの問題を巧妙に回避した。具体例として蛍光一分子局在化法の一つであるPALM(photoactivated localization microscopy)の原理を図解した。PALMでは蛍光色素として、特定波長の刺激光照射により無蛍光から蛍光状態へと変化するPA-GFPや、蛍光色が緑色から赤色に変化するmEOSといった「光スイッチング蛍光タンパク質(Photo-Switchable Fluorescent Protein; PSFP)」を利用する。光スイッチングにより蛍光性が切り替わる確率は刺激光の強度と照射時間におおよそ比例するので、それらをコントロールすることで、PSFが重ならない程度にPSFPをスイッチングさせる事が可能になる(図-①)。この状態でFIONAを適用し、各一分子の位置解析を行う(図-②,③)。視野内のPSFPを退色させた後に、同じ事をPSFPが全てなくなるまで何度も繰り返す。これにより発現させた蛍光分子全ての詳細な局在画像（PALM画像）を得る事ができる。

その他の蛍光一分子局在化法

蛍光一分子局在化法はPALMの他にも様々な方法が開発されているが、異なるのは図-①においてどのように蛍光一分子を疎らにオンするかだけであり、FIONAに相当する図-②,③の操作はほぼ同じと考えて良い。そこで、PALM以外の主な蛍光一分子局在化法に関しては以下に簡潔に記載する。
FPALM（Fluorescence photoactivation localization microscopy）、STORM（stochastic optical reconstruction microscopy）はPALMとほぼ同時期に発表された。FPALMではPALMと同じくPSFPを利用している。STORMでは蛍光色素がある条件下で暗状態と蛍光状態を可逆的に遷移する現象を利用している。具体的には、シアニン系色素(例えばCy5)に強い励起光(赤色)を与えた際に、寿命の非常に長い暗状態に入る。この暗状態において、より蛍光波長の短い別のシアニン系色素(例えばCy3)が近接している際にその励起光(緑色)を当てる事で蛍光状態への回復が起こるため、これを疎らな蛍光一分子のオンへと応用できる。STORMではそのため2色の蛍光色素、2波長の光源を必要とするが、その後に報告されたdSTORM (direct STORM)やGSDIM(ground-state depletion and single-molecule return)では、暗状態からの回復が別の蛍光色素の近接やその励起光無しでも非常に稀に起こる事を利用し、2つ以上の異なる蛍光色素をオン、オフさせる事が容易となりマルチカラー化への道を開いた。
蛍光一分子局在化法のための蛍光色素の開発は現在も活発にされており、最近になり、自然に明滅を繰り返す蛍光色素HMSiR（Hydroxymethyl Si-rhodamine）が開発された。これは高濃度のチオールや暗状態を作るための強い励起光照射が不要なため、サンプルへのダメージを最小限に抑えられる。また、自然に明滅するため一分子観察に共焦点顕微鏡を使用する事が可能となり、深部の構造を観察することも可能となった。