テタヌス毒素

英：tetanus toxin、英語略: TeNT、独：Wundstarrkrampf、仏：

同義語： tetanus neurotoxin、tetanospasmin

　テタヌス毒素とは、土壌中に棲息するグラム陽性型の嫌気性細菌であるクロストリジウム属のClostridium tetaniにより産出される世界最強のタンパク質毒素の１つである。 同属にはボツリヌス毒素があり、これらは分子量約15万の１本のポリペプチド鎖として合成された後、限定分解を受け、分子量約5万の軽鎖と10万の重鎖の２本のポリペプチド鎖となり、これらは１つのジスルフィド結合により連結している。重鎖が、神経細胞の膜にあるガングリオシドに結合し、テタヌス毒素分子の細胞内への侵入を起こす。そして最終的に、重金属依存的なタンパク質分解活性をもつ軽鎖が、神経伝達物質の開口放出を担うSNAREタンパク質のVAMPを分解することにより神経伝達物質の放出が抑制される仕組みとなっている。

 1 テタヌス毒素とは

Tetanus（テタヌス）という用語は、それによって起きる強直（麻痺）を”tetanus”として定義したヒポクラテスにより、最初に医学用語に記された。

破傷風は、土壌中に棲息するグラム陽性型の嫌気性であるClostridium tetani の胞子が、傷口から体内に侵入することにより感染が起こる。最初の感染から発症まで数日から４週間と異なるがこれは、(1)　胞子の出芽、(2)　毒素の産出と放出、(3)　脊髄内の標的細胞への毒素の結合と輸送、に必要な時間に相当する。その結果、中枢神経系のシナプス終末から放出される神経伝達物質の阻害を行い、痙性対麻痺を引き起こす。破傷風は通常、開口障害、嚥下障害そして項部硬直などの症状により始まる。麻痺は時間経過に伴い、胴体、腹部そして脚の筋肉へと下部へと広がっていく。破傷風はしばしば致命的となり、全身倦怠、呼吸器系や心不全の後、死に到る。世界最強の毒素の１つとして知られるテタヌス毒素のLD₅₀は、マウスの抹消神経へ投与した場合、1　kgあたり0.4　ngから1 ngの間である。致死率は近年の医学の進歩により減少しているが、高齢者の患者の場合では依然として高い。破傷風のワクチン化（ホルムアルデヒドで処理した毒素）により、破傷風は先進国からはほとんど消失したが、ワクチン化が進んでいない国々では依然として年間数十万人もの人々が亡くなっている。

 2 テタヌス毒素の構造

　　テタヌス毒素の遺伝子は、Clostridium tetani において75 kbのプラスミド上にコードされ、分子量150 kDaの単純タンパク質を合成する。合成された1本のポリペプチド鎖（1315アミノ酸）は不活性であるが、トリプシン様のタンパク質分解酵素により457番目のAlaから461番目のAspまでの間で限定分解を受け、N末端側の分子量50 kDaの軽鎖（449アミノ酸）とC末端側の分子量100 kDaの重鎖（857アミノ酸）となり活性型となる。両鎖は、１つのジスルフィド結合と非共有結合により繋がっている。翻訳後の分解が正しく行われた場合にのみ培養液中に放出される。
　　テタヌス毒素の構造名称については、破傷風菌と同属であるボツリヌス菌が産出するボツリヌス毒素で提唱された名称と、第８回国際破傷風会議(1987)で採択された名称とがある。前者の場合、軽鎖を(L)、重鎖を(H)とする。また重鎖(H)は、そのN末端側の50 kDaのαヘリックスドメインを(H_N)、そのC末端側(865-1315)にある50 kDaを(H_C)とし、さらにH_Cには分子量25 kDaのH_CNとH_CCのサブドメインに分けられる。一方後者の場合、テタヌス毒素をパパイン処理するとC末端側50 kDaのペプチド断片とN末端側100 kDaのペプチド断片に分離されたことから、重鎖のC末端側50 kDaをFragment C(Frg C)、N末端側50 kDaをFragment B (Frg B)、さらに軽鎖をFragment A (Frg A) と呼称している。テタヌス毒素と各血清型のボツリヌス毒素との遺伝子レベルでの比較では、全体の相同性は～35%と低い。各ドメインにはそれぞれ異なる機能があり、N末端側のLドメインは金属タンパク質分解活性をもち、H_Nドメインは膜移行に、そしてH_Cドメインは結合に、それぞれ関与している。

 3 軽鎖(L)構造と機能

　　他のボツリヌス毒素の軽鎖(L)と同様に、テタヌス毒素の軽鎖(L)は、亜鉛依存的な金属タンパク質分解酵素として作用し毒性を引き起こす。テタヌス毒素の軽鎖(L)は、ボツリヌス毒素Bと同様にシナプス小胞の膜蛋白質のv-SNAREであるSynaptobrevin-2/vesicle-associated membrane protein (VAMP)のGln(76)とPhe(77)の間の限定分解を行う（図3）。その結果、シナプス小胞とシナプス前膜とのドッキングが阻害され、抑制性神経伝達物質であるGABAやGlycineなどの放出が抑制される。これがテタヌス毒素によるシナプス前抑制の分子機構である。テタヌス毒素の軽鎖(L)の触媒ドメインの二量体構造(図4A)とその活性部位（図4B）を示す。テタヌス毒素の軽鎖(L)の活性部位は、基質となるタンパク質が近づきやすい溝の内部に位置し、亜鉛に結合するモチーフであるHExxH(233-237)が中央部となるように正に荷電した亜鉛と配位結合する。つまり、亜鉛は2つのHisのイミダゾ－ル環（His(232)とHis(236))、そしてGlu(270)などのアミノ酸、さらにGlu(233)と強固な水素結合を形成する求核性の水分子、といった４つと相互作用している。特にこのモチーフ内にあるグルタミン酸は、それに結合している水分子が直接的にタンパク質の加水分解反応に関与するため特に重要である。

 4 重鎖(H)構造と機能

　　テタヌス毒素の重鎖(H)は、２つのサブドメインH_NとH_Cに分けられる。テタヌス毒素重鎖(H)Ｎ末端側のH_Nは、ベシクル膜から軽鎖(L)を移行させることに関与しているが、疎水性が極めて高く、容易に不溶化沈殿するためにその構造解析が進んでいない。H_Cドメインは神経筋接合部での神経終末へのテタヌス毒素の特異的な結合とその後の内部への取り込みに関与する。その結合には、神経細胞膜上に特にみられるポリシアロガングリオシド、グリコスフィンゴリン脂質と複合体を形成する。テタヌス毒素重鎖(H)C末端側H_Cの立体構造を図４に示す。H_Cドメインには、さらに２つのサブドメイン構造のH_CNとH_CCから構成される。H_CNサブドメインはいくつかの炭水化物結合タンパク質（マメ科植物のレクチン等）と似たようなjelly-rollモチーフ内にβストランド構造を含む。H_CNのアミノ酸配列は、クロストリジウム属の中でも高度に保存されている。H_CCサブドメインはIL-1やFGFといったタンパク質の認識と結合に関与するβシートが３つパックされたβ-trefoilという３つ葉状の構造を形成している。この配列はクロストリジウム属の中でも非常に保存性が低い。HCCサブドメインにはポリシアロガングリオシド(GD1bとGT1b)のオリゴ糖の部分に対して２つの結合部位があり、結合する部位(1281-1314)の中でもHis(1293)が関与する。

 5 テタヌス毒素の作用機序

　　テタヌス毒素は神経筋接合部から神経終末膜を介して神経内に取り込まれる。テタヌス毒素は逆行性輸送され、脊髄前角に到達し、細胞膜を通過しシナプス前膜を通りさらに上位の中枢へと運搬される。そこで抑制性シナプスを遮断し、痙性麻痺を引き起こす。ついで興奮性シナプスも遮断し、筋は拘縮した状態となる。ちなみにこれは筋の弛緩を発生させるボツリヌストキシンの作用と逆となる。テタヌス毒素は、神経細胞に対して、(1) 毒素の結合、(2) 毒素のエンドサイトーシス、(3) 膜からの細胞質への移行、(4) 標的タンパク質であるVAMPの分解、といった４段階を介して作用する（図５）。現在もなおテタヌス毒素の受容体については不明であるが、テタヌス毒素のHcCドメインには、２つのガングリオシド結合部位がこれまでに同定され、ポリシアロガングリオシド分子と糖タンパク質にそれぞれ結合することが考えられている。実際にテタヌス毒素はGPI-アンカー型糖タンパク質と脂質ラフトに結合する。図５に示したように、運動神経終末での形質膜上に発現する受容体を介したエンドサイトーシスにより取り込まれるボツリナム毒素とは異なり、テタヌス毒素は脂質ラフトやガングリオシドであるGD1bを含む脂質タンパク質受容体複合体に結合するクラスリン依存的なエンドサイトーシスにより内部に入る。クラスリン被覆小胞によりいったん取り込まれたテタヌス毒素は、神経中枢の神経細胞体へ逆行性に運ばれ、さらにシナプスを越えて高次神経細胞のシナプス前部に到達する過程（Transcytosis）にHcが関与している。標識されたHcは取り込まれた後も中性を保ったコンパートメントで細胞体へと逆行性に運搬され、運動神経の樹状突起に集積される。BDNFやGDNFなどの神経栄養因子と比較すると、運搬速度や樹状突起への集積速度は同じ（1 μm/sec）であるが、シナプスを越えて次のシナプス前部への移行はHcの方がほぼ倍の速度で行われることが明らかにされた。