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# アンカープライマーによるmRNAの選択的逆転写（第1鎖合成） | # アンカープライマーによるmRNAの選択的逆転写（第1鎖合成） | ||
#:比較したい２種類（またはそれ以上）の細胞からそれぞれ抽出したmRNAを、ポリ(A) | #:比較したい２種類（またはそれ以上）の細胞からそれぞれ抽出したmRNAを、ポリ(A)鎖と結合するアンカープライマーと逆転写酵素を用いた逆転写反応によってcDNAに変換する。アンカープライマーとしはT（チミジン）12個からなる[[wikipedia:ja:オリゴヌクレオチド|オリゴヌクレオチド]]の3’端に1個の任意の塩基を付加したものを用いる。 | ||
# 任意プライマーによるmRNAの選択的第2鎖合成とPCRによる増幅 | # 任意プライマーによるmRNAの選択的第2鎖合成とPCRによる増幅 | ||
#:次に、合成されたcDNAを鋳型に、アンカープライマーと任意の混成塩基配列を持つ（通常10merの）オリゴヌクレオチド群をプライマーとしてPCRを行う。これによって任意の共通塩基配列をもつ複数のcDNA断片を、同時にPCR増幅する。この結果、両端をアンカープライマーと任意プライマーの配列で置換された分子が生じる。 | #:次に、合成されたcDNAを鋳型に、アンカープライマーと任意の混成塩基配列を持つ（通常10merの）オリゴヌクレオチド群をプライマーとしてPCRを行う。これによって任意の共通塩基配列をもつ複数のcDNA断片を、同時にPCR増幅する。この結果、両端をアンカープライマーと任意プライマーの配列で置換された分子が生じる。 | ||
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#:反応生成物を[[wikipedia:ja:ポリアクリルアミド|ポリアクリルアミド]]電気泳動で展開すると、複数のcDNA断片からなるフィンガープリントが得られる。この中から、強度に変化のある、または特異的な泳動パターンを示すバンドの切り出しを行う。 | #:反応生成物を[[wikipedia:ja:ポリアクリルアミド|ポリアクリルアミド]]電気泳動で展開すると、複数のcDNA断片からなるフィンガープリントが得られる。この中から、強度に変化のある、または特異的な泳動パターンを示すバンドの切り出しを行う。 | ||
#バンドの再増幅およびクローン化 | #バンドの再増幅およびクローン化 | ||
#:ゲルからサンプルを回収し、それを鋳型としてPCRを繰り返し行い、再現性を高めて、cDNA[[wikipedia:ja:クローン|クローン]]を回収する。 | #:ゲルからサンプルを回収し、それを鋳型としてPCRを繰り返し行い、再現性を高めて、cDNA[[wikipedia:ja:クローン|クローン]]を回収する。 | ||
== 参考文献 == | == 参考文献 == | ||