「In situハイブリダイゼーション法」の版間の差分

　''In situ''とは”原位置で”という意味で、''in situ''ハイブリダイゼーション(''in situ'' hybridization: ISH)とは原位置でのハイブリダイゼーション（後述）ということである。ISH法には、[[wikipedia:ja|染色体]]ISHと組織切片ISH、ホールマウントISH (whole-mount ISH: WISH) がある。染色体ISH法は、染色体における目的遺伝子の[[wikipedia:ja|遺伝子座]]を明らかにし、染色体異常を検出することができる。組織ISH法は、組織切片を用いて遺伝子発現の第一段階である[[wikipedia:ja|mRNA]]の局在を細胞レベルで明らかにする。[[wikipedia:ja|病理]]組織から[[wikipedia:ja|ウイルス]][[wikipedia:ja|ゲノム]]を検出し、ウイルス感染の診断に用いられることもある。また、胚や器官の一部などを丸ごと用いるISH法を、ホールマウントISH（WISH）という。実験例を図1に示す。遺伝子発現部位の三次元的な情報を得た後で、細胞レベルで遺伝子発現部位を同定しなければならない場合は、WISH後の胚などの組織切片を作製する。図2に、組織切片を用いた''in situ''ハイブリダイゼーション法の工程を模式的に示す。ISHは、細胞内mRNAの局在を明らかにする実験であるので、分解されやすいRNAをいかに分解させずに実験を行うかが重要である。

　ISH法では細胞が死んだ状態でmRNAを検出する。細胞が死んでしまうと、mRNAは急速に分解され消滅してしまう。そのため、''in situ''ハイブリダイゼーション法を用いる場合は、細胞内のmRNAの分解を防ぎ、できるだけ生きていた状態を維持しておく必要がある。細胞や組織などをなるべく自然の状態に保存することを[[wikipedia:ja|固定]]とよんでいるが、''in situ''ハイブリダイゼーション法の場合はmRNAの固定が非常に重要である。''In situ''ハイブリダイゼーション法では、用時調製した4%[[wikipedia:ja|パラホルムアルデヒド]]液を用いて[[wikipedia:ja|還流固定]]し、[[wikipedia:ja|臓器]]等を取り出して短時間、低温でさらに[[wikipedia:ja|浸漬固定]]することが多い。新鮮迅速凍結切片を用いてISHを行うこともある。組織切片はスライドガラスに貼付けたもの、あるいは浮遊切片を用いる。

　組織ISH法、WISH法のいずれにおいても、ハイブリダイゼーションを行う前に固定した組織の前処理を行う。主な目的は、[[wikipedia:ja|界面活性剤]]で細胞膜の透過性を上げ、タンパク質分解酵素proteinase Kなどを用いて結合組織等を分解しプローブの浸透性をよくすることと、プローブの非特異的な吸着を防ぐことである。特に、[[wikipedia:ja|タンパク質分解酵素]]の濃度と処理時間は、組織の種類、固定法とも関連し、''in situ''ハイブリダイゼーション法の結果を左右する重要な因子である。

　目的のmRNAを検出するために、そのmRNAと特異的にハイブリダイズする、つまり、目的のmRNAと[[wikipedia:ja|相補的]]な配列をもったRNAまたはDNAプローブが必要である。プローブとして、

# 化学合成したDNAを用いる[[wikipedia:ja|オリゴヌクレオチドプローブ]]<br>

の3種類がよく用いられている。DNAオリゴプローブは、DNA合成装置で合成する。B, Cにおいては、プローブ合成のための[[wikipedia:ja|鋳型]]DNAが必要である。RNA-RNAハイブリッドが3者の中で最も安定であり、現在RNAプローブを用いる方法が一般的である。合成したRNAが分解されないように細心の注意を払う。他に[[wikipedia:ja|locked nucleic acid]] (LNA)（後述）や[[wikipedia:ja|ペプチド核酸]]をプローブとして用いる方法がある。プローブを可視化のために標識する方法には主に次の2つの方法がある。

# [[wikipedia:ja|酵素抗体法]]または[[wikipedia:ja|蛍光抗体法]：適当な[[wikipedia:ja|抗原]]（[[wikipedia:ja|ジゴキシゲニン]]digoxigenin [DIG], [[wikipedia:ja|フルオレセイン]] fluorescein, [[wikipedia:ja|ビオチン]] biotinなど）の結合した[[wikipedia:ja|ヌクレオチド]]を用いてプローブを標識し、その抗原に対する[[wikipedia:ja|抗体]]を用いて発色または蛍光により可視化する。<br>

# [[wikipedia:ja|放射性同位元素]]（radioisotope: RI）を用いて、[[wikipedia:ja|オートラジオグラフィー]]法により可視化する。

　DNAの[[wikipedia:ja|二重らせん]]構造は、塩基対A：Tに形成される2つの[[wikipedia:ja|水素結合]]と塩基対G：Cに形成される3つの水素結合により安定に保たれている。この二本鎖を一本鎖にする方法の1つとして、熱変性がある。二重らせんDNA溶液の温度を高くしながら、DNA溶液の260 nmの[[wikipedia:ja|吸光度]]A260を測定すると、しだいにA260は高くなる。これはDNAの二重らせんが壊れ、一本鎖になるためで、この温度による吸光度の変化を表す曲線をDNAの[[wikipedia:ja|融解曲線]]とよんでいる。この現象は、らせんが消失して塩基間の相互作用が少なくなるため、塩基の光吸収の効率が変化し（深色効果）、各塩基の[[wikipedia:ja|分子吸光係数]]が高くなるために生じる。温度の低い時のDNAをヘリックス100％とし、高温での吸光度が一定になる状態でヘリックス0％と仮定すると、ヘリックス50％になる温度（[[wikipedia:ja|融解温度]] melting temperature: Tm）を決定することができる。

　ここで、Mは1価の正イオンのモル濃度、％G＋CはGC含量、％formamideは[[wikipedia:ja|ホルムアミド濃度]]、lはプローブの長さ（bp）である。

　Tmの温度では、全体の50％ほど二重らせんが形成されていることになる。ハイブリダイゼーションの温度Thは、Tmより5〜20℃低い温度で行う。どの程度まで塩基対のマッチを許容するかを[[wikipedia:ja|stringency]]とよぶ。例えば、（Tm−5）℃でハイブリダイズさせると、stringencyが非常に高くなり、完全マッチした安定なDNA-DNAしかハイブリッドを形成しない。しかし、ハイブリダイズする温度を（Tm−20）℃と低下させ、stringencyを低くすると、ミスマッチをもったハイブリッドが形成される可能性が高くなる。

　DIGを用いた組織''in situ''ハイブリダイゼーション法では、1kb程度のRNAプローブ（GC含量約50%）を使用する場合、50％ホルムアミド中65℃、12〜14時間で、ほぼよい結果が得られる。もし、短いRNAやGC含量の低いRNAをプローブとする場合は、低stringencyの条件でハイブリダイゼーションを行う。プローブの濃度も重要であり、濃度の高いほうが再会合率が高くなる。プローブの長さが大きいほどシグナルが強くなるが、プローブの配列によってはハイブリダイゼーションに交差性を認める結果となる場合もある。2kbをこえると[[wikipedia:ja|アルカリ]][[wikipedia:ja|加水分解]]によってRNAの長さを小さくし、組織への浸透を高めるようにする。

　非特異的に結合したプローブを除去するために、組織を洗浄する．洗浄の条件を厳しくするとバックグラウンドが低下するが、同時にシグナルも弱くなる。RNA-RNAハイブリットは通常の[[wikipedia:ja|RNA分解酵素]] (RNAse)では分解されないので、これ以降の実験工程はRNAseフリーでなくてよい。

　標識プローブのみでは発色することができないので、プローブの中に取り込まれている抗原に対する抗体を用いプローブの検出を行う．プローブをDIGで標識した場合、DIGに特異的に結合する一次抗体を用いて検出する。検出に用いる一次抗体には通常の抗体とは異なり、[[wikipedia:ja|アルカリフォスファターゼ]]（alkaline phosphatase: AP）または[[wikipedia:ja|西洋ワサビペルオキシダーゼ]]（horseradish peroxidase: HRP）などの酵素が結合（conjugate）している．例えば、抗体に結合されたAPの基質として、BCIP (X-リン酸と呼ぶ)（5-Bromo-4-Chloro-3'-Indolylphosphate p-Toluidine salt）およびNBT(nitro-blue tetrazolium chloride)を用いた場合は、酵素がXの結合を切断し、Xが遊離すると発色する（図3）。一方、抗体に蛍光色素が結合している場合には、蛍光顕微鏡や共焦点レーザー走査顕微鏡で検出する。

　Locked nucleic acid (LNA)プローブを用いる。LNAは、リボ核酸の2’位の酸素原子と4’位の炭素原子とが架橋しており、相補的な核酸に対合したときの熱安定性が非常に高く、短いRNAに対して高いTm値でハイブリダイゼーションできる。この性質を利用してLNAプローブによりマイクロRNAのISHが可能になった。

　Allen Brain Atlasは、マイクロソフト社創設者の一人であるPaul G. Allenの出資によって2003年に設立されたAllen Institute for Brain ScienceのISHデータベースである。2006年12月発表のNature の記事によると、まず約2万の遺伝子のマウス成体脳における組織切片ISHのデータが公開された。現在、マウス脳に加えて、ヒト脳、発生期マウス脳、発生期ヒト脳、マウス脳神経回路、ヒト以外の霊長類脳、マウス脊髄、ヒト神経膠芽腫に関するISHデータベースが公開されている。