「血液脳関門」の版間の差分

英語名：Blood-brain barrier (BBB)  

血液脳関門(Blood-brain barrier, BBB)の解剖学的実体は脳毛細血管であり、脳室周囲器官を除いては、内皮細胞同士が密着結合で連結している。当初BBBは、この構造的特徴によって、細胞間隙を介した非特異的な中枢への侵入や、脳内産生物質の流出を阻止している物理的障壁と考えられてきた。しかし現在では、BBBは脳に必要な物質を血液中から選択して脳へ供給し、逆に脳内で産生された不要物質を血中に排出する「動的インターフェース」であるという新たな概念が確立している。BBBには、多様なトランスポーターや受容体が内皮細胞の脳血液側と脳側の細胞膜に極性をもって発現し、協奏的に働くことによって、循環血液と脳実質間でのベクトル輸送を厳密に制御している。中枢作用薬の開発には、良好な脳移行性を持った候補化合物の選択が必要であり、ヒトBBBの解明が不可欠である。近年、「機能タンパク質の絶対定量法(Quantitative Targeted Absolute Proteomics (QTAP)」によって、ヒト、サル、マウスのBBBにおけるトランスポーター・受容体の質的及び量的な種差が解明された。BBB研究は、げっ歯類を中心とした発現の有無、BBBを透過するか否かといった定性的解析から、発現量、透過速度、輸送速度およびヒト-動物間の種差や正常-病態間の差などに基づく定量的解析へと大きく舵を切りつつある。  

==構造と役割==

血液と脳実質細胞間液の物質交換は、様々な輸送システムによって制御されている (図2)。この輸送系の分子的実体は、多様なトランスポーターや受容体、及びその複合体であり、脳毛細血管内皮細胞の脳血液側と脳側の細胞膜に極性をもって発現する。トランスポーターは、脳血液側と脳側の細胞膜のどちらか一方又は、両方の細胞膜に局在し、細胞外から細胞内、又は細胞内から細胞外へ、特定の基質を輸送する能力を有している。トランスポーターは、大きく2つのファミリーに分類される。1つは、ATP-binding cassette (ABC) transporterファミリーで、ATPの加水分解エネルギーを直接利用して、主に細胞内から細胞外への輸送を担う。 もう1つは、solute carrier (SLC)ファミリーで、エネルギーを消費しないで濃度勾配に従って下り坂輸送を行う促進拡散や、無機イオンや有機イオンの濃度勾配を利用して、濃度勾配に逆らった基質輸送を行う2次性能動輸送に関与する。受容体はトランスサイトーシスによって、リガンドを輸送する機能を有している。これらのトランスポーターや受容体が協同的に働くことによって、循環血液から脳への供給方向及び、脳から循環血液への排出方向の物質のベクトル輸送を厳密に制御している。

　図3a-cに、BBBにおける内因性物質の輸送システムをまとめた<ref name=ref1 /><ref name=ref3><pubmed> 23399670 </pubmed></ref>。BBB供給輸送系の最も重要な役割の一つは、エネルギー源となるグルコースや乳酸及びタンパク質や神経伝達物質の原料となるアミノ酸の循環血液から脳への供給である。グルコーストランスポーター 1 (GLUT1/SLC2A1)は、促進拡散型のトランスポーターで、脳毛細血管内皮細胞の両側の細胞膜に局在し、循環血液中から脳方向へのグルコースの供給輸送を担う。この他、モノカルボン酸トランスポーター (MCT1/SLC16A1) は、乳酸などのケトン体エネルギー源の供給に関与し、L型アミノ酸トランスポーター(LAT1/SLC7A5)は、4F2抗原重鎖4F2hc (CD98/SLC3A2)とヘテロダイマーを形成して、主にチロシンやフェニルアラニンなどの大型の中性アミノ酸を脳内に供給する役割を果たす。この他に、エネルギー貯蔵物質クレアチン、浸透圧調節物質タウリンの輸送系などが知られている。<br>BBB排出輸送系の主要な役割は、脳内で産生される神経伝達物質、メディエーターや代謝物の循環血液中へのくみ出しであり、SLCファミリーである神経伝達物質トランスポーター、アミノ酸トランスポーター、有機アニオントランスポーターや、ABCトランスポーターファミリーであるmultidrug resistance-associated protein 4 (MRP4/ABCC4)などがそれぞれ関与している。これらの輸送系は、脳細胞間隙中の神経伝達物質の第二のクリアランス機構や、脳内不要物質の脳内蓄積を防止する機構として、機能している。さらに、BBBには、アルツハイマー病で脳内に蓄積する-アミロイド(1-40)の排出輸送系が存在する)<ref><pubmed> 17908238 </pubmed></ref><ref><pubmed> 16926058 </pubmed></ref><ref><pubmed> 20367755 </pubmed></ref>。この分子的実体には、P-糖タンパク<ref><pubmed> 16239972 </pubmed></ref>、BCRP<ref><pubmed> 19403814 </pubmed></ref>、lipoprotein receptor related protein-1(LRP-1) <ref><pubmed> 11120756 </pubmed></ref>など諸説あるが、現時点で結論が出ていない。

  図3dに、BBBにおける薬物の輸送システムをまとめた<ref name=ref1 /><ref name=ref3 />。脂質二重膜で構成される細胞膜は、脂溶性の物質はBBBを透過しやすいとされる。しかし、脳毛細血管内皮細胞の血液側膜に局在するP-糖タンパクやBCRPは広範な基質認識性を示す。これらの基質となる物質は、内皮細胞内に侵入した際に速やかに細胞外へ排出輸送されるため、循環血液から脳への移行性が著しく制限される。中枢作用薬の開発段階においてP-糖タンパクやBCRPの基質となるか否かは脳移行性を予測する重要な指標となる。さらに、内因性代謝物質の排出輸送にも関与するOAT3やMRP4は、比較的水溶性の高いアニオン性薬物の脳内移行性を制限している。これらのトランスポーターを介した内因性物質と薬物間の相互作用が起こると、内因性物質の脳内挙動が変化し、副作用に繋がる可能性がある。脳移行性の優れた中枢作用薬の開発に当たっては、排出輸送に関与するトランスポーターの高親和性基質にならないことが望まれている。

  表1に、BBB研究で用いられる実験手法をまとめた。BBBにおける輸送システムを解明する研究は、functional genomicsを背景に、多様な実験手法が開発されたことで飛躍的に進んだ。主な研究手法は、以下の様に大別される。詳細は、総説<ref>'''寺崎哲也,大槻純男,上家潤一'''<br>3. 薬効組織(脳、腫瘍)への輸送特性の評価 1) 血液脳関門の透過性の評価 7:170-177 遺伝子医学MOOK 最新創薬学2007, <br>''メディカル ドゥ'':2007</ref>を参照されたい。

(1)　主にげっ歯類で開発された''in vivo''解析系を用いて、循環血液から脳方向及び脳から循環血液方向の物質輸送を速度論的に解析する方法。

(2)　単離脳毛細血管や''in vitro'' BBBモデルとして脳毛細血管内皮細胞株を樹立して、詳細な輸送特性(基質の親和性、駆動力、基質選択性)を解析し、トランスポーターを同定する方法。既知のトランスポーターの特性と一致しない場合は、遺伝子クローニングを行う方法。(3)　トランスポーター発現系を用いて、''in vivo''解析系や''in vitro''解析で得られた輸送特性と一致することを実証する方法。新たなトランスポーター輸送機能の解明のために、新規基質をスクリーニングする方法。

(4)　RT-PCR法やin situ hybridization法を用いたmRNAレベルか、抗体を用いたウエスタンブロット法及び免疫染色法を用いたタンパク質レベルでの発現局在解析。

(5)　QTAPの手法を用いて、BBBトランスポーターの定量的アトラスを作成する。絶対定量値と単分子活性を基に、ヒト'' in vivo'' BBBにおける物質透過速度を予測する方法 (後述)。

PET, SPECTおよびMRIなどのイメージング技術を利用することによって、ヒトのBBBにおける物質の透過速度やトランスポーターの輸送活性が測定され、ヒトと実験動物の間の違いが定量的に解析されている。合成可能なリガンド数が少ないこと、特定のトランスポーターだけに輸送される物質がほとんどないことから、現在、一部の化合物やトランスポーターを対象とした解析に限られている。一方、寺崎らが開発した「機能性分子のタンパク質絶対定量法(Quantitative Targeted Absolute Proteomics (QTAP)」によって、ヒト、サル、マウスのBBBにおける複数のトランスポーターのタンパク質発現量が解明された（図4）<ref name=ref1 />{Agarwal, 2012 #10;Ito, 2011 #11;Kamiie, 2008 #9;Uchida, 2011 #12}。これら2つの手法によって、ヒト血液脳関門研究およびヒト-動物間の種差研究は、発現の有無、BBBを透過する・しないなどといった定性的解析から、発現量(mol)、透過速度、輸送速度およびその差などに基づく定量的解析へと大きく舵を切りつつある。

===P-glycoprotein (P-gp/MDR1/mdr1a)===

  Syvänenらは、P-gpの基質である[11C]GR205171と[18F]Altanserinの脳への移行性（脳対血漿中薬物濃度比、Kp brain)は、齧歯類と比較してヒトではそれぞれ4.5倍および8.6倍大きいことを報告している{Syvanen, 2009 #22}。従って、ヒトBBBにおけるP-gpの薬物排出機能は齧歯類と比較して小さいことが示唆されている。ヒトの脳毛細血管におけるP-gpのタンパク質発現量はマウスに比べて2.33倍小さいことから(図4) {Uchida, 2011 #12}、ヒトではP-gpの発現量の低下に伴ってP-gpの排出機能が低下していることが示唆される。一方、カニクイザルのP-gpのタンパク質発現量はヒトと有意な差はなかった。

===Breast cancer resistance protein (BCRP/ABCG2/MXR/ABCP)===

これまでのげっ歯類を用いた研究から、BBBの薬物トランスポーターの中で、P-gpが輸送機能及び発現量ともに最大であることが示されてきた。しかし、ヒトの脳毛細血管では、BCRPのタンパク質発現量がP-gpに比べてやや大きいことが示された(図4) {Uchida, 2011 #12}。従って、げっ歯類に比べて、ヒトのBBBでは薬物排出へのBCRPの寄与が大きいことを推察される。

MRP4、OAT3、OATP1A2、OATP2B1およびoatp1a4など、脳毛細血管内皮細胞に発現することが報告されている有機アニオントランスポーターについて、輸送活性の種差はまだ明かとなっていないが、タンパク質発現量の種差の程度が解明されている(図4) {Uchida, 2011 #12}。ヒト脳毛細血管におけるMRP4の発現量は、カニクイザルと比べて有意な差はないが、マウスに比べて有意に8.15倍小さい。ヒトのOAT3の発現量は、マウスの5.66倍以下である。さらに、ヒトのOATP1A2およびOATP2B1の発現量は、マウスのoatp1a4の発現量に比べて、それぞれ3.04倍以下および6.26倍以下である。従って、マウスに比べて、ヒトではMRP4、OAT3、OATP1A2およびOATP2B1を介した有機アニオン性物質の輸送は制限されていることが示唆されている。

ヒトにおいてBBBを介した脳へのグルコース供給速度の最大値は0.4–2.0 μmol/min/g brainであり、げっ歯類（1.42 μmol/min/g brain）と同程度であることが報告されている{Hawkins, 1989 #24;Pardridge, 1983 #23}。この報告に一致して、脳へのグルコース供給を担うGLUT1のタンパク質発現量に顕著な種差はない(図4) {Uchida, 2011 #12} BBBにおいて、GLUT1に加えてGLUT3の発現も認められている。タンパク質発現量に顕著な種差があるが、GLUT1に比べて絶対量が極めて小さいため(図4)、その種差はBBBにおけるグルコース供給速度に影響しないと考えられる。

ヒト脳毛細血管におけるLAT1および4f2hcのタンパク質発現量はともに、マウスに比べて5倍小さい(図4)。L-[1-11C]leucineとthree-compartment modelを用いたPET解析によって、ヒトの脳内のタンパク質合成速度(0.345-0.614 nmol/min/g)は、げっ歯類(3.38 nmol/min/g)に比べて顕著に小さいことが報告されている{Pardridge, 1977 #26}。脳内タンパク質合成は、脳内のアミノ酸濃度によって影響され、アミノ酸濃度はBBBを介したアミノ酸供給速度に依存している{Pardridge, 1977 #26;Pratt, 1976 #27}。従って、ヒトBBBではLAT1および4f2hcの発現量の低下に伴って、アミノ酸供給速度がげっ歯類に比べて小さいことが示唆される。

トランスポーターの輸送活性を構成する個々の要素（分子数、1分子あたりの輸送活性）をin vitro実験等で解明し、それらのデータを統合することによってin vivoのトランスポーターの輸送活性を解析する手法である。イメージング技術と異なり、ヒトにプローブ化合物を投与することなく、ヒトBBBにおけるトランスポーターの輸送活性を解析することが理論的に可能であり、現在、この実現を目指している。理論的に、全てのトランスポーターに適用可能であり、有用な解析手法として期待されている。<br>トランスポーターの輸送活性は、トランスポーター1分子あたりの輸送活性と分子数（タンパク質発現量, mol）の積に分解できる(図5)。従って、トランスポーター1分子あたりの輸送活性をin vitro実験によって測定し、ヒト死後脳から単離した脳毛細血管におけるトランスポーターのタンパク質発現量と統合することによって、in vivoのヒトBBBにおける輸送活性を再構築できる。この考え方を実証するために、マウスmdr1a発現細胞単層膜で測定したmdr1aの輸送活性をそのmdr1a発現量で除することによってmdr1a 1分子あたりの輸送活性を算出した。これをマウス脳毛細血管におけるmdr1a発現量と統合することによって、BBBのmdr1a輸送活性を再構築した。その結果、異なる輸送活性を示す全11基質について再構築された輸送活性は実測値と良好に一致した(図5){Uchida, 2011 #13}。<br>このように、in vivoのBBBにおける輸送活性を再構築できることが実験的に証明されている。この再構築の考え方をヒトに適用し、ヒトのトランスポーターの発現培養細胞における1分子輸送活性およびヒト脳毛細血管における発現量を測定することによって、ヒトBBBにおける種々のトランスポーターの輸送活性を解析できるようになると考えられている。

　（執筆者：立川正憲, 内田康雄, 寺崎哲也, 担当編集委員：河西春郎）