「FM1-43」の版間の差分

| ImageSize = 220px

| ImageAlt =  

| OtherNames = Frie Mao 1-43, SynaptoGreen™ Reagent, SureCN1527120, N-(3-Triethylammoniumpropyl)-4-(p-dibutylaminostyryl)pyridinium, 2Br

| CASNo = 149838-22-2

| PubChem = 2733618

| SMILES =CCCCN(CCCC)C1=CC=C(C=C1)C=CC2=CC=[N+](C=C2)CCC[N+](CC)(CC)CC.[Br-].[Br-] }}

| Formula = C30H49Br2N3

| MolarMass = 611.53816

| Appearance =  

| Density =  

| MeltingPt =  

| BoilingPt =  

| Solubility = }}

| MainHazards =  

| FlashPt =  

| Autoignition = }}

}}  

 

　色素の特性として次の3つの性質がある。  

 

#水溶液中に存在する場合に比べ、細胞膜に結合すると[[wikipedia:ja:量子効率|量子効率]]が著増し、強い[[wikipedia:ja:蛍光|蛍光]]を出す。  

#[[wikipedia:ja:脂質二重層|脂質二重膜]]を透過しない。  

== 分子構造 ==

 

[[Image:Takahashinoriko fig 2.jpg|thumb|250px|'''図2．（タイトル：FM 色素群の分子構造）'''　説明：二重結合の数は色調に、炭素鎖の数は細胞膜との親和性や蛍光強度に関連する]] 　構造は、[[wikipedia:ja:親水性|親水性]]領域、[[wikipedia:ja:二重結合|二重結合]]領域、[[wikipedia:ja:疎水性|疎水性]]炭素鎖領域に分けられる。  

　親水性領域が正の電荷をもつため、膜を通過しない。二重結合の数は蛍光波長に関連する。  

　二重結合が一つの FM1-43、FM1-84、FM2-10 は黄色蛍光を呈し、二重結合が二つの FM4-64、FM5-95 は赤色蛍光を呈する。  

　疎水性炭素鎖の長さは細胞膜の染め方に関連し、長いものほど明るく、一旦膜に組み込まれると離脱しがたい<ref><pubmed> 10202529 </pubmed></ref>。 FM1-43 の炭素鎖数は4であり、解離時定数τ_dissは8 msを示す。より短いFM2-10(炭素鎖数 2)は、比較的離脱しやすい(τ_diss=6.4 ms)。逆に、より長い FM1-84（炭素鎖数 5）は離脱に時間がかかる(τ_diss=36 ms)<ref><pubmed> 19580748 </pubmed></ref>。  

　FM1-43の[[wikipedia:ja:励起状態|励起]]には1光子では波長480 nm光、2光子では波長840 nm光が頻用される。  

　極大蛍光波長は[[wikipedia:ja:リポソーム|リポソーム]]中にて580 nmである。  

　波長480nm光の高出力励起（～150 μW）にて[[wikipedia:3,3'-Diaminobenzidine|ジアミノベンチジン]]（DAB）の光変換（photoconversion） を起こす。そのため、[[wikipedia:ja:アルデヒド|アルデヒド]]で固定可能な色素であるFM1-43FX と DABを細胞に与え光変換させると、共局在部位で電子密度の高い産物が作られ、[[電子顕微鏡]]観察が可能となる。FM1-43を取り込んだ小胞が、高い電子密度で描出され、微細構造解析に活用されている。  

[[Image:Takahashinoriko fig 3.jpg|thumb|250px|'''図3．（タイトル：開口放出に伴う FM 蛍光の変化'''　説明：膜融合時、細胞外色素の有無により蛍光変化の様式が異なる）]]  

　[[シナプス小胞]]は30-60秒で細胞内部に[[エンドサイトーシス]]で取り込まれる(図 3左）。その後、細胞外を色素を含まない溶液で還流し、細胞外膜に結合した色素を wash out する。このような loading過程を経て示される蛍光量は、30回の刺激時に開口放出した小胞にあたり[[Readily releasable pool]]（RRP）のサイズの指標となる。[[wikipedia:ja:カエル|カエル]][[神経筋接合部]]の場合、RRPの小胞数は神経終末内小胞の約15％（12-17％）と報告された<ref><pubmed>　15044806 </pubmed></ref>。  

　次に、細胞外色素フリーの状態で放出刺激を与えると、前段階で染められたシナプス小胞は細胞膜と融合し、細胞外液への拡散により神経終末の蛍光は減弱する（destaining 図3右）。この減弱の程度や時間経過から、開口放出の量と速度が評価できる。蛍光減弱の時間経過はsingle exponentialに近似されることから、[[放出確率]] (Release probability, Pr) は蛍光減弱の[[wikipedia:ja:時定数|時定数]]に反比例すると考えられる。Prの計算法として、（Recycling pool の小胞数×0.63）/ (37％に蛍光減弱するまでに与えた電気パルス数）で示す方法<ref><pubmed> 18701072 </pubmed></ref> が提起された。より簡易的には、FM1-43 の蛍光[[wikipedia:ja:半減期|半減期]]の[[wikipedia:ja:逆数|逆数]]<ref><pubmed> 11426227 </pubmed></ref>で示されるケースもある。  

　開口放出した顆粒は[[Active zone]]の周辺から内部に取り込まれ（[[エンドサイトーシス]]）、再び放出可能となる（[[リサイクル]]）。このリサイクルにかかる時間は、[[海馬]]培養標本では 20-30秒、神経筋接合部では 60秒と見積もられた。そこで[[Recycling pool]]（= RRP + Reserve pool）の測定は、RRP 測定時よりも長い時間電気刺激を与え、色素をロードする事により達成できる（例 10Hz 900 発）。リサイクルされた小胞は、元来小胞があった領域のほぼ全域に拡散し、core(中央部）への拡散のみが軽度に少なかった。また、リサイクルした小胞は、初めて刺激を受けたプール同様の放出確率を持つことが報告された<ref><pubmed> 1553547 </pubmed></ref> 。  

=== 膜融合様式の解析 ===

　FM色素には、炭素鎖数の異なる複数種類の色素がある。これらが小胞膜を染める頻度を比較することにより、融合細孔の開放時間の長短が識別可能となる。  

　FM2-10やFM1-43色素を用い、小胞膜から離脱する[[完全融合]]型（full fusion）と、離脱しない[[不完全融合]]型（incomplete fusion）の識別が行われた<ref><pubmed> 9707119 </pubmed></ref> <ref><pubmed> 12354398 </pubmed></ref>。  

　FM1-43を[[網膜]][[双極性細胞]]のシナプス小胞に取り込ませて標識し、[[全反射顕微鏡]]で細胞膜直下（～100nm）の観察を行い、単一小胞の開口放出現象の可視化が報告された<ref><pubmed> 10972279 </pubmed></ref> 。  

　水溶性色素（赤色[[wikipedia:ja:スルホローダミンB|スルホローダミンB]], SRB）とFM1-43を細胞外液に同時に与え、開口放出を誘発すると、水溶性色素は小胞内部に進入し、FM1-43は細胞外膜から小胞内膜へ拡散するため、開口放出した小胞が両色素で描出される。この際 [[２光子レーザー走査顕微鏡]]で画像を取得し、双方の色素の増加分の比を求めると小胞直径が計算される（直径＝6 ΔSRB/ΔFM1-43）。本法は色素濃度やレンズ特性（[[wikipedia:ja:点拡がり関数|点拡がり関数]]）によらず、シナプス小胞のような光学[[wikipedia:ja:解像度|解像度]]以下の器官の計測にも応用可能である。  

<br>（執筆者：高橋倫子、河西春郎　担当編集委員：柚崎通介）