「パッチクランプ法」の版間の差分

 

===手技===

　先端が開口しているガラス電極に実験目的に応じて選択された電極内液を満たす。電極内液を満たす際は、フィルターを介して行い、電極内部へのゴミの侵入を防ぐ。また、電極内部に気泡が入った場合は電極を軽く叩いて、気泡を取り除く。[[wikipedia:ja:塩化銀|塩化銀]]の金属線が付いた電極ホルダーへ電極を装着する。電極内液と接触している塩化銀の金属線により、プレアンプへ電流・電圧が伝えられる。電極内部へ繋がっているチューブを介し陽圧をかけることで、電極先端へのゴミや組織の付着を防ぎ、ギガシールを形成し易くする。矩形波電位パルスを与え（通常数mV)、電極抵抗Rp（通常2-10MΩ）を測定し、矩形波電流をオシロスコープ上でモニターする（図1A）。

 

　[[wikipedia:ja:顕微鏡|顕微鏡]]と[[wikipedia:ja:マニュピレーター|マニュピレーター]]を操作し、標的細胞へ電極先端を近づける。細胞に電極先端が近づくと矩形波電流が小さくなる（図1B）。また、陽圧によって細胞表面にくぼみ（dimple）が観察される。

 

 

 

 

　細胞が大きい場合、膜容量Cmに荷電する電流が大きくなり、時定数の早いイオンチャネルなどの電流応答を正確に記録できないため、膜容量Cmの補正（membrane capacitance compensation）を行う。また、細胞が大きいとピペット電流Ipが大きくなるため、[[直列抵抗]]Rsによるクランプ電位誤差（Vm=Vp- Ip・Rs）が生じる。そのため、直列抵抗Rsの補正（Series resistance compensation）をアンプを介して行う（図1F）。

　先端が開口しているガラス微小ピペットを電極として用いる。材質は軟質[[wikipedia:ja:ソーダガラス|ソーダガラス]]、誘電率が低くてノイズの少ない硬質の[[wikipedia:ja:ホウケイ酸ガラス|ホウケイ酸ガラス]]が用いられる。これらのガラス管を、プラーにより電極先端の径が1-5μm程度の電極を作製する。より高いギガシールの形成には、電極先端を[[wikipedia:ja:マイクロフォージ|マイクロフォージ]]により更に熱加工し（ファイアーポリッシュ）、電極先端表面を滑らかにする。ノイズを軽減するために、ファイアーポリッシュした電極先端を[[wikipedia:ja:シルガード|シルガード]]や、[[wikipedia:ja:シリコン|シリコン]]でコーティングする場合もある。

===顕微鏡===

　スライス標本ではスライスの上層にある細胞から測定することが多い為、[[wikipedia:ja:正立型微分干渉顕微鏡|正立型微分干渉顕微鏡]]を用いる。[[wikipedia:ja:赤外線微分干渉|赤外線微分干渉]]（IR-DIC）カメラを通したビデオ映像を利用することにより、厚いスライスの深部の細胞を捉えることができる。[[ブラインドパッチ法]]では細胞を捉える必要が無い為、[[wikipedia:ja:実体顕微鏡|実体顕微鏡]]を利用する。単層の培養細胞では、[[wikipedia:ja:位相差顕微鏡|位相差顕微鏡]]を使用する。

　膜容量に対して直列に配置される抵抗成分であり、[[電極抵抗]]Rpと[[アクセス抵抗]]Raccess（電極と細胞の間の抵抗成分）の和である。直列抵抗Rsを測定するには電位固定し、矩形波パルスを与えた時の電流を測定する。この電流は容量性サージ電流（capatitative surge current）と呼ばれ、この振幅値は直列抵抗に反比例することから、容量性サージ電流とピペット電位Vpから直列抵抗Rsの値を算出することができる（図1E）。また、膜抵抗Rm（入力抵抗）も算出することができる（図1E）。