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「超解像蛍光顕微鏡」の版間の差分
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→Localization Microscopy
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[[Image: | [[Image:PALM図9.png|400px|thumb|'''図１ PALMの原理'''<br>'''①光刺激による疎らなPSFPのオン''' 実際には画像は撮影されないが蛍光状態がオフからオンに切り替わったPSFPの視野内での位置を灰色の点で示した。<br> | ||
'''②蛍光観察による蛍光一分子画像の取得''' 蛍光観察は主に全反射顕微鏡によって行う。得られる輝点は前述のとおり2次元のPSFに従い分布する。撮影後は視野内にあるオンのPSFPを全て退色させる、あるいは退色するまで撮影を続ける。<br> | '''②蛍光観察による蛍光一分子画像の取得''' 蛍光観察は主に全反射顕微鏡によって行う。得られる輝点は前述のとおり2次元のPSFに従い分布する。撮影後は視野内にあるオンのPSFPを全て退色させる、あるいは退色するまで撮影を続ける。<br> | ||
'''③座標推定による分子の局在画像の構築''' ②の蛍光一分子画像の各輝点を2次元のガウス関数で解析する事で、視野内での各蛍光分子の「座標」を推定する。同時に推定座標の「不確かさ」も求まる<ref group="注">解析は輝点(先述の通り、2次元のPSFに従った分布を持つ)を以下の2次元のガウス関数にフィッティングする事で行う。<br> | '''③座標推定による分子の局在画像の構築''' ②の蛍光一分子画像の各輝点を2次元のガウス関数で解析する事で、視野内での各蛍光分子の「座標」を推定する。同時に推定座標の「不確かさ」も求まる<ref group="注">解析は輝点(先述の通り、2次元のPSFに従った分布を持つ)を以下の2次元のガウス関数にフィッティングする事で行う。<br> | ||
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====<small>STORM</small>==== | ====<small>STORM</small>==== | ||
STORM（Stochastic optical reconstruction microscopy）もPALM・FPALMとほぼ同時期に発表された<ref><pubmed> 16896339 </pubmed></ref>。STORMではある種の蛍光色素が特定の条件下で可逆的に暗状態(蛍光状態=オフ)へと遷移する現象を利用している。詳細には、シアニン系色素(例：Cy5)に強い励起光(赤色)を与えた際に、一定の確率で寿命の非常に長い暗状態に入る<ref group="注">この暗状態は寿命が1時間程度とされる。三重項状態の消光剤として働く酸素分子は暗状態の寿命を短くするため、暗状態へは三重項状態から遷移すると予想される。観察時に酸素除去剤を加える必要があるのはこのためである。また、この暗状態はチオールとの結合により起こるため、還元剤を培地へ添加する場合もある</ref><ref><pubmed> 15783528 </pubmed></ref><ref><pubmed> 19961226 </pubmed></ref>。暗状態において、より蛍光波長の短い別のシアニン系色素(例：Cy3)が近接している際にCy3への励起光(緑色)を与えるとCy5が基底状態(蛍光状態=オン)へ回復する<ref><pubmed> 15783528 </pubmed></ref>。オンになったCy5は強い励起光(赤色)を与えられ蛍光観察に利用される。蛍光観察中にある確率で暗状態(オフ)へと遷移する。Cy5が基底状態へ回復する確率はCy3に与える励起光(緑色)の強度と照射時間とおよそ比例関係にあるので、PALMと同様に励起光(緑色) | STORM（Stochastic optical reconstruction microscopy）もPALM・FPALMとほぼ同時期に発表された<ref><pubmed> 16896339 </pubmed></ref>。STORMではある種の蛍光色素が特定の条件下で可逆的に暗状態(蛍光状態=オフ)へと遷移する現象を利用している。詳細には、シアニン系色素(例：Cy5)に強い励起光(赤色)を与えた際に、一定の確率で寿命の非常に長い暗状態に入る<ref group="注">この暗状態は寿命が1時間程度とされる。三重項状態の消光剤として働く酸素分子は暗状態の寿命を短くするため、暗状態へは三重項状態から遷移すると予想される。観察時に酸素除去剤を加える必要があるのはこのためである。また、この暗状態はチオールとの結合により起こるため、還元剤を培地へ添加する場合もある</ref><ref><pubmed> 15783528 </pubmed></ref><ref><pubmed> 19961226 </pubmed></ref>。暗状態において、より蛍光波長の短い別のシアニン系色素(例：Cy3)が近接している際にCy3への励起光(緑色)を与えるとCy5が基底状態(蛍光状態=オン)へ回復する<ref><pubmed> 15783528 </pubmed></ref>。オンになったCy5は強い励起光(赤色)を与えられ蛍光観察に利用される。蛍光観察中にある確率で暗状態(オフ)へと遷移する。Cy5が基底状態へ回復する確率はCy3に与える励起光(緑色)の強度と照射時間とおよそ比例関係にあるので、PALMと同様に励起光(緑色)を適切にコントロールする事で常に視野内の疎らCy5がオンに保たれる。<br> | ||
====<small>dSTORM,GSDIM</small>==== | ====<small>dSTORM,GSDIM</small>==== | ||