「ゴルジ染色」の版間の差分

　[[ゴルジ]]染⾊は、イタリアのノーベル⽣理学医学賞受賞者の[[wj:カミッロ・ゴルジ|カミッロ・ゴルジ]]（Camillo Golgi: 1843-1926 '''図１'''）によって考案された鍍銀法の⼀種で、神経細胞の形態や[[樹状突起スパイン]]（[[樹状突起]]に⾒られる[[棘突起構造]]）などの微細構造を可視化するために⽤いられる染⾊法である。本法による染⾊像は他の化学染⾊や[[免疫染⾊]]と⽐べて⾼いコントラストを有するが、それはごくわずかの神経細胞がランダムに染⾊され、染まった細胞は⿊く、そのほかの細胞は無⾊であるため、鍍銀された神経細胞が明瞭に浮かび上がることによる（'''図２'''）。ゴルジ染⾊は、発⾒から約150 年になろうとする現在でも神経科学研究の第⼀線で利⽤される古典的な組織学的⼿法である。

萬年甫による「猫脳ゴルジ染⾊図譜」は、1988 年岩波書店によって210 部が刷られ、そのうち100 部は国外の脳研究所へ送られた(14)<ref>'''萬年甫'''<br>神経細胞の形を求めて<br>''⽇仏医学'' 34, 1-16,: 2012</ref>。残りは⼀部の国⽴⼤学図書館や博物館などに貴重書として保管されている。実際の「猫脳ゴルジ染⾊図譜」を⾒るとわかるが、神経細胞は細胞体の⼤きさによって⾊分けがなされており、明らかに軸索とわかる構造には⽮頭が付されてある（6）<ref name=mannen1988/>。これらはゴルジ染⾊像をスキャンして着⾊したのではなく、すべて⼿書きによる作画である。『意識をめぐる冒険（クリストフ・コッホ著、岩波書店）』の表紙より]]

　ゴルジ染⾊では、クロム酸や塩化第⼆⽔銀などが⽤いられるが、これらの化合物は歴史的に、[[アルコール]]や[[ホルマリン]]と同様に組織固定液として利⽤されてきた(1)<ref>'''Stephen Polyak ; edited Heinrich Klüver'''<br>The vertebrate visual system : its origin, structure, and function and its manifestations in disease with an analysis of its role in the life of animals and in the origin of man, preceded by a historical review of investigations of the eye, and of the visual pathways and centers of the brain<br>''University of Chicago Press'':1957</ref>。他の病理学者と同様に、ゴルジ⾃⾝も様々な固定液を⽤いて病理標本の観察を⾏っていた。ゴルジはクロム酸とオスミウム酸で固定した脳サンプルを、当時、⽤いられ始めていた硝酸銀に沈めて切⽚を作成することを試みた。作成した切⽚を顕微鏡のステージにのせ、レンズを覗き込んだ彼の眼には⿊々と染まった神経細胞が映しだされ、彼はこの⽅法を「⿊い反応」と名付け、すぐさま学術誌に公表した（2）<ref>'''Golgi C'''<br>Sulla struttura fella sostanza grigia del cervello<br>''Gazzetta Medica Italiana, Lombardia,'' 33, 224-246 :2013</ref>。この「⿊い反応」が発⾒されたのは、1873 年ゴルジがちょうど30 歳の時であった。本法は、のちに彼の名前をつけて「ゴルジ染⾊」と呼ばれるようになり、現在に⾄っている。1873 年の「⿊い反応」の発表以降、多くの医師がゴルジの⽅法を⽤いて神経細胞の染⾊を試み、その恩恵を受けたことは想像に難くない。

　1888 年にはイタリアの医師カハール（ゴルジと共に1906 年に神経系の構造に関する研究としてノーベル⽣理学医学賞を受賞）がゴルジの原法を改良し[[反応時間]]を短縮させた急速ゴルジ法（ラピッドゴルジ法）を編み出している（3）<ref>'''Cajal S R'''<br>Estructura de los centros nerviosos de las aves<br>''Cerebelo Rev Trim Histol Norm Patol,'' 1, 1-10: 1888</ref>。さらに1891 年には、オランダの医師コックスがゴルジ染⾊を改変したゴルジ・コックス染⾊法を発表した（4）<ref name=CoxWH1891>'''Cox WH'''<br>Impragnation des centralen Nervensystems mit Quecksilbersalzen<br>''Arch. F. mikrosk. Anat., 37, 16-21,'': 1891</ref>。ゴルジ・コックス染⾊は、発表当時、ゴルジ染⾊よりも安定した結果が得られると評判になった。⽇本においては、神経解剖学者の萬年甫（１９２３−２０１１）がゴルジ・コックス染⾊法を⽤いて様々な[[動物]]の脳の神経構造を明らかにしてきた（5）<ref>'''萬年甫'''<br>動物の脳採集記<br>''中公新書'' :1361</ref>。とくに、１９８８年に出版された「猫脳ゴルジ染⾊図譜」は萬年甫が約30 年の歳⽉をかけて作成した脳地図で、本書はもはや神経解剖学の領域を超えて芸術の域に達している（'''図３'''）（6）<ref name=mannen1988>'''萬年甫'''<br>A dendro‐cyto‐myeloarchitectonic atlas of the catʼs brain 猫脳ゴルジ染⾊図譜<br>''岩波書店'' :1988</ref>。このような歴史のある染⾊法は、現在でも改良が加えられながら時折その⽅法が学術誌に紹介されている。

　ゴルジ染⾊とゴルジ・コックス染⾊は⽤いる化合物が異なっており、ゴルジ染⾊ではシンプルにオスミウム酸と⼆クロム酸カリウムで固定した脳を硝酸銀⽔溶液に漬けるのみであるが、ゴルジ・コックス染⾊では、⼆クロム酸に加えてクロム酸カリウムと塩化⽔銀で固定した脳をアンモニア⽔で発⾊（⿊化）させている（7, 8）<ref name=NautaW1970>'''Eds: Nauta Walle JH; Ebbesson Sven OE'''<br>Contemporary Research Methods in Neuroanatomy<br>''Springer'': 1970</ref><ref name=HW2017>'''HW et al.'''<br>Comprehensive Review of Golgi Staining Methods for Nervous Tissue<br>''Kang Appl Microsc.,'' 47, 63-69: 2017</ref>。すなわちゴルジ染⾊ではクロム酸銀の沈着を、またゴルジ・コックス染⾊では、⽔銀とアンモニア⽔による反応で⾦属⽔銀の沈着を観察することとなる。（9）（アリゾナ州立大学　James P. Birkのウェブサイト[http://www.public.asu.edu/~jpbirk/qual/qualanal/mercury.html Mercury]を参照。

　これらの⽅法はともに、ごくわずかの神経細胞をランダムに染⾊し、染⾊された神経は⿊く強調され、そのほかの細胞は全く染⾊されないという⾮常に⾼いシグナル/ノイズ⽐をもたらすが、この成因については未だ明らかにされていない(10）<ref>'''Nicholls JG'''<br>From neuron to brain<br>''Sinauer Associates Inc.,'' pp. 5,: 2001</ref>。コックスが論⽂の中で述べたゴルジ染⾊の特⾊を、萬年甫は⾃らの書籍の中で次のように紹介している。「化合物の化学的あるいは物理的組成が、おそらく細胞の⽣理的状態の違い、あるいは細胞の死と関連してこのような差異を⽣ずるに違いない」と(4, 11)<ref name=CoxWH1891/><ref name=Mannen2011>'''萬年甫'''<br>脳を固める・切る・染める−先⼈の知恵−<br>''メディカルレビュー社'' p176-177,: 2011</ref>。

# 2.3% (w/w) ⼆クロム酸カリウムならびに0.19% (w/w)四酸化オスミウムを含んだ固定液を作成し、約4-5 mm ⾓の脳標品を20 mL の固定液に浸漬する。室温で７⽇間保存する。

# 100%エタノールで脱⽔し、ソフトパラフィン（⽩⾊ワセリン）内に包埋をする。

# 100%エタノールで湿らせながらスライド式ミクロトームで100-300 μm 程度に薄切する。薄切した切⽚は100%エタノールの⼊った容器に15 分間沈め、その後、クローブ油かテレピン油の⼊った容器に移して15 分間沈める。

# スライドガラスに伸展した後にキシレンでオイルを落とし、中性の封⼊剤を乗せてカバーガラスなしに硬化させる。

# この間にクリオプロテクタント液を作成する。300 g ショ糖、10 g ポリビニルピロリドン、300 ml エチレングリコールを蒸留⽔に溶解1 リットルに保存する。

== ゴルジ染⾊の問題点 ==

　また、ゴルジ染⾊は、たやすく神経細胞のみを選択的に染⾊すると思われがちであるが、浸漬時間や温度などの条件によって、神経細胞に加えて[[グリア細胞]]や[[血管内皮]]が染⾊されることもある（7,8）<ref name=NautaW1970/><ref name=HW2017/>。

　ゴルジ・コックス染⾊液では、⼆クロム酸カリウムだけでなく、クロム酸カリウムを加えているが、⼆クロム酸カリウム溶液（5% ⽔溶液でpH 8.5 からpH9.5 を⽰す）によって酸性に傾いた⽔素[[イオン]]濃度を中性に戻す働きがある（4,8, 11）<ref name=CoxWH1891/><ref name=HW2017/><ref name=Mannen2011/>。このことから、反応温度や時間にくわえて溶液のpH も染⾊結果に影響をもたらすと理解できる。