「シングルセルRNAシーケンシング」の版間の差分

シングルセルRNAシーケンシング(single-cell RNA sequencing, 以下scRNAseq)は、[[次世代シーケンサー]] （next generation sequencer、以下NGS）を用いることで、個々の細胞が保持しているmRNA全体を質的、量的に網羅的に調べる方法である。次元圧縮などの数理的な解析と組み合わせることで、遺伝子発現の状態に基づいた細胞の分類を行うことが可能であり、従来の組織学的、あるいは細胞生物学的手法では知られなかった新規の細胞種の同定や細胞状態の推定を行うことが可能になった。また、時系列解析によって遺伝子発現プロファイルの変化に基づいて、刺激や発生に伴う細胞状態の遷移の描写ができる。神経系では、この方法により、神経細胞や非神経細胞の分類や状態についての知見が深まり、新しい神経細胞タイプ、細胞マーカー、病態の理解、更に機能的な遺伝子の同定などが系統的かつ網羅的に行われるようになった。scRNAseqとともに、空間的情報、エピゲノム情報、タンパク質情報なども取り入れた複数のモダリティを考慮した研究も行われている。

===scRNAseqの現状===

 

これらの方法のうち、SMART-seqは、マイクロピペットによる捕獲、セルソーター、[[レーザー捕獲]]などを用いるマルチウェル法、あるいは半導体集積回路の製作技術で作った流体集積回路を利用するFluidigm C1の装置（C1 Single- Cell Auto Prep

）[https://jp.fluidigm.com] など、様々な組み合わせに対応できる<ref><pubmed>30405621</pubmed></ref>[https://doi.org/10.1101/742304]。SMART-seqプロトコールの特徴は、全長mRNAのトランスクリプトーム情報を得ることができることであり、mRNAのスプライシングバリアントなどのアイソフォーム、SNPsの情報を利用したアリル特異的発現、変異の検出にも利用できる。また、それぞれ細胞ごとの反応を独立した場所で行うため、反応中に別の細胞の反応と混じる可能性が低い。小型のナノウェルを用いるSeq-Wellも同様に反応自体が混じる可能性が低い<ref><pubmed>28192419</pubmed></ref>。これらの点が、次に説明するドロップレットを使用して3’末端のみを標的にしたscRNAseqと比べた場合の長所であるが、その高コスト（1細胞あたり数十ドル）と処理可能な細胞数の少なさが短所である。

 

しかしながら、scRNAseqの方法論についての顕著な進歩は、2015年、Harvard Medical Schoolの独立した２つのグループが、inDrops<ref><pubmed>26000487</pubmed></ref>そしてDrop-seq<ref><pubmed>26000488 </pubmed></ref>という類似した2つのハイスループットな方法を開発したことであろう（inDropsはT7RNAポリメラーゼ、Drop-seqはPCRで増幅）。これらの方法では、[[マイクロ流体力学]] (Microfluidics) 、 UMI（上述）と細胞ごとのバーコード（Cell Barcode）という2種類のDNAバーコーディング、そしてNGSと情報解析法を利用している。そして、多く細胞のサンプル調製の自動化と容易さから、1つの細胞あたりに要するコストを大幅に低下させることに成功した（Drop-seqは発表時で、１細胞あたり約5セント）。つまり、細胞1つずつをマイクロ流体力学によるエマルジョン作製技術を利用した装置に流入させ、その１細胞を1つのドロップレットに自動的に閉じ込める。そのドロップレット中には、ドロップレットごとにCell barcode/UMIとしてユニークなDNAバーコードを持つゲルビーズ(Gel Beads in Emulsion, GEMs)が入っており、それを足場に3’末端のみを標的にしたcDNA合成反応を実施することで、同じ細胞に含まれていた1分子のmRNAが同じCell barcodeを持つcDNAとして合成され、そのmRNA/cDNAが由来した細胞を識別できるということを利用している（図１）。

ここでは主流になっている10x Genomics社のChromiumなどのドロップレットを用いた方法とSMART-seqなどを用いた方法に共通する方法の実際について概説する。scRNAseqの利用には、4つのステップがある（図２）<ref><pubmed> 31217225</pubmed></ref><ref><pubmed>30089861</pubmed></ref>。１）個体や組織を採集し、そこから細胞あるいは細胞核を個別に解離された状態にすること。２）ドロップレット法やSMART-seqなどによる個々の細胞からのライブラリーの作製とNGS。３）得られた配列情報の前処理（preprocessing）。４）ダウンストリーム解析と生物学的な情報を得るコンピューター生物学。これらのうち、２）の段階については、上に記述したように市販の機器や試薬を利用する機会が多くなっているので、詳細は説明しない

  [[ファイル:ScFig2c.jpg|サムネイル|500px|'''図２．scRNAseqの実際のステップ '''<br>細胞の単離、ライブラリ作製とNGS、データの前処理から次元圧縮、ダウンストリーム解析。図の一部は2016 DBCLS TogoTV、あるいはSeuratを用いて10x Genomics社のPBMCデータ（[https://support.10xgenomics.com/single-cell-gene-expression/datasets]から執筆者が作製。]]

 

 

10x Genomics社のChromium、Illumina社のNGSを利用した場合、Cell Rangerのmkrefコマンド(Linux上で作動, [https://support.10xgenomics.com/single-cell-gene-expression/software/pipelines/latest/using/tutorial_mr])などにより、各生物種ごとのレファレンス配列リスト（[https://www.ncbi.nlm.nih.gov/grc]、マウスやヒトでは既製のものを利用できる）などを参考にしながら、細胞と転写産物量の対応マトリックスを作製する。その後のデータの処理についても、10x Genomics社がソフトウェアLoupeを提供している。しかしながら、その後の下流解析を考慮して、[[R]], [[Python]], MATLABなどのデータ解析のための汎用プログラミング言語やコードで扱えるオブジェクトに変換するのが通常である。ここでは、scRNAseqデータ解析のために最もよく利用されているRを用いたパッケージ「Seurat」<ref><pubmed> 29608179 </pubmed></ref> <ref><pubmed> 31178118 </pubmed></ref>を中心に紹介したい。なお、一部の解析操作は、University of WashingtonのCole Trapnell研究室で開発されてきた軌道推定（下記参考）によく使用されるMonocle3でも可能である（[https://cole-trapnell-lab.github.io/monocle3/]）。Pythonを利用したものでは、ドイツ・ミュンヘンInstitute of Computational Biologyの Fabian Theisらが開発しているScanpyが有名である<ref><pubmed> 29409532</pubmed></ref>。

 

また、Dropletを使用するscRNAseqでしばしば問題になるのが、Dropletに２つ以上の細胞が封じ込められ、それらが同一のCell barcodeを持ってしまうアーティファクトである。通常「Doublet」「Multilet」と呼ばれるこの問題はダウンストリーム解析を混乱させるので、細胞単離の段階から注意する必要があるが、scRNAseqデータ取得後にもデータ処理で解決できる可能性もある<ref><pubmed>30954476</pubmed></ref><ref><pubmed>30954475</pubmed></ref> <ref><pubmed>31693907</pubmed></ref><ref><pubmed>32592658</pubmed></ref> <ref><pubmed>29227470</pubmed></ref><ref><pubmed>31836005</pubmed></ref><ref><pubmed>31856883</pubmed></ref><ref><pubmed>30567574</pubmed></ref> <ref><pubmed>31266958</pubmed></ref>    [https://doi.org/10.1101/2019.12.17.879304][https://doi.org/10.1101/699637][ http://dx.doi.org/10.2139/ssrn.3646565]。なお、この手法を利用することで、バッチ効果を抑えるために、異なるバーコードを持つ複数の試料を混ぜて一つの試料として扱い、計算機的に再び分離、解析するdemultiplexingが注目されている<ref><pubmed>32483174</pubmed></ref>。

 

。クラスタリングにより、異なった細胞集団の存在が認識されると、それぞれのクラスター（群）に特徴的に発現している具体的な遺伝子を探索し、細胞集団の持つバイオマーカーによって、そのクラスター（群）の同定が可能になる。例えば、既に神経細胞とグリア細胞に特異的に発現する典型的マーカーはよく知られており、それぞれのクラスターの識別は容易である。更に、神経細胞のタイプ（下記参考）を区別できるマーカーや、外部刺激によって遺伝子発現が変化した神経細胞の状態は、In situ hybridizationや免疫組織化学などにより確認できる。このようなクラスターごとに発現が異なる遺伝子（差次的発現遺伝子）を見つけるためには（Differential expression analysis, DE analysis）、SeuratのFindMarkersコマンド中でも利用可能であるコード（MAST、DESeq2など<ref><pubmed>26653891</pubmed></ref><ref><pubmed>25516281</pubmed></ref><ref><pubmed>30658573</pubmed></ref>）を用いることができる。scRNAseqの解析に必要なコードは、scRNA-tools [https://www.scrna-tools.org], Awesome single cell [https://github.com/seandavi/awesome-single-cell], Bioconductor[https://www.bioconductor.org]などで紹介されており、ほとんどがダウンロード可能である。また、最新の情報については、bioRxivなどのプレプリントサーバで公開されていることが多く、scRNAseqのデータ（下記参考）とともに、オープンサイエンス実践の好例となっている。細胞ごとの差次的発現遺伝子のVisualization（表示可視化）には、ドットプロット（dot plot）、ヴァイオリンプロット（violin plot）、リッジプロット（Ridge plot, joy plot）、UMAPなどの次元圧縮図上に上書きするFeatureプロット（feature plot）などが、目的に応じて頻繁に用いられる（図４）。

[[ファイル:scFig4.jpg|サムネイル|300px|'''図４．scRNAseqデータの可視化の例 '''<br>A. ドットプロット。B.ヴァイオリンプロット。C. リッジプロット。D. UMAPと重ねたFeatureプロット。網膜の視細胞のデータを用いて執筆者が作製[https://doi.org/10.1101/2020.10.09.333633

 

===擬時系列解析、遺伝子制御ネットワーク、パスウェイ解析===

 

また細胞分化や刺激などによる変動に伴う特徴的な遺伝子発現をscRNAseqで観察することは、遺伝子制御ネットワーク（例、SCENIC<ref><pubmed>28991892</pubmed></ref>, [https://github.com/aertslab/SCENIC]）、[[代謝経路]]や[[シグナル伝達系]]のための[[パスウェイ解析]](例、Metascape<ref><pubmed>30944313</pubmed></ref>, [http://metascape.org]、Gene Ontolgoy[http://geneontology.org])を理解するシステム生物学的な研究として有用である<ref><pubmed>32051003</pubmed></ref>。更に、scRNAseqで得られた結果をもとに、細胞間相互作用の理解を深めるのを目的とするCellPhoneDB<ref><pubmed>32103204</pubmed></ref>[https://github.com/Teichlab/cellphonedb]、NicheNet<ref><pubmed>3181926</pubmed></ref>,　SVCA<ref><pubmed>31577949</pubmed></ref>などがある。特に、Perturb-seq<ref><pubmed>27984732</pubmed></ref> やその変法<ref><pubmed> 32231336</pubmed></ref>は、CRISPRライブラリーによるゲノム編集を施した細胞をscRNAseqで解析することで、ゲノム編集で破壊された遺伝子の機能や遺伝子間の相互作用の理解を可能にしている後述するマルチモーダルなscRNAseqの１つであり、注目されている。

 

[[大脳皮質]]には、[[錐体細胞]]や[[非錐体細胞]]などの神経細胞や様々なグリア細胞などが見られ、古くから神経細胞タイプの識別が行われてきた。初期のFluidigm C1を用いたscRNAseq技術でも、マウス皮質の小規模な細胞数を分類した研究で、これまで知られていた主要な神経細胞タイプとは違うタイプが見つかりその有効性が示された<ref><pubmed>25700174</pubmed></ref>。その後のDroplet使用の3’エンドリード法を利用した多数の細胞数の解析で、更に多数の神経細胞のタイプが見つかっている<ref><pubmed>32839617</pubmed></ref><ref><pubmed>28846088</pubmed></ref><ref><pubmed>30096299</pubmed></ref><ref><pubmed>30096314</pubmed></ref><ref><pubmed>30382198</pubmed></ref><ref><pubmed>29320739</pubmed></ref><ref><pubmed>28846088</pubmed></ref>[https://doi.org/10.1101/2020.03.14.991018][https://doi.org/10.1101/2020.06.04.105700] [https://doi.org/10.1101/2020.07.02.184051]。特に、GABA作動性介在神経細胞タイプの多様性とその発生<ref><pubmed>28942923</pubmed></ref><ref><pubmed>28134272</pubmed></ref><ref><pubmed>29472441</pubmed></ref><ref><pubmed>29513653</pubmed></ref>についての、これまでの組織化学的な研究からは得られていなかった多くの情報は重要であろう。また、初期の発生過程<ref><pubmed>26940868</pubmed></ref><ref><pubmed>30485812</pubmed></ref><ref><pubmed>31073041</pubmed></ref><ref><pubmed>30635555</pubmed></ref><ref><pubmed>30625322</pubmed></ref>、老化<ref><pubmed>31551601</pubmed></ref><の理解が、scRNASeq技術を利用することで進んでいる。更に、[[神経活動]]や[[臨界期]]によって変化するmRNA量の変化も細胞ごとに調査され興味深い<ref><pubmed>29230054</pubmed></ref> <ref><pubmed>32404418</pubmed></ref>。 ヒトを含めた霊長類の大脳についても発達段階を含めてscRNAseqが適用されてきている<ref><pubmed>26060301</pubmed></ref><ref><pubmed>27339989</pubmed></ref><ref><pubmed>29539641</pubmed></ref><ref><pubmed>29217575</pubmed></ref><ref><pubmed>28846088</pubmed></ref><ref><pubmed>29227469</pubmed></ref><ref><pubmed>31303374</pubmed></ref><ref><pubmed>29867213</pubmed></ref><ref><pubmed>31435019</pubmed></ref><ref><pubmed>32424074</pubmed></ref> [https://doi.org/10.1101/709501][https://doi.org/10.1101/2020.03.31.016972][https://doi.org/10.1101/2020.04.23.056390]。ヒトや霊長類に特徴的とされる[[島]]のvon Economo神経細胞（紡錘細胞）のような希少な神経細胞のscRNAseqにも成功している<ref><pubmed>32127543</pubmed></ref>。

脳の外部では、[[運動神経]][https://doi.org/10.1101/2020.03.16.992958]、[[感覚神経]]<ref><pubmed>25420068</pubmed></ref><ref><pubmed>26691752</pubmed></ref>、[[らせん神経節]]<ref><pubmed>30078709</pubmed></ref><ref><pubmed>30209249</pubmed></ref> 、[[臭覚神経]]<ref><pubmed>26541607</pubmed></ref> <ref><pubmed>32059767</pubmed></ref>、[[腸神経系]] <ref><pubmed>29483303</pubmed></ref>[https://doi.org/10.1101/2020.03.02.955757]　、[[網膜]]<ref><pubmed>27565351</pubmed></ref><ref><pubmed>29909983</pubmed></ref><ref><pubmed>30018341</pubmed></ref><ref><pubmed>31260032</pubmed></ref><ref><pubmed>31128945</pubmed></ref><ref><pubmed>30712875</pubmed></ref><ref><pubmed>30548510</pubmed></ref><ref><pubmed>31075224</pubmed></ref><ref><pubmed>31399471</pubmed></ref><ref><pubmed>31848347</pubmed></ref><ref><pubmed>31673015</pubmed></ref><ref><pubmed>31653841</pubmed></ref><ref><pubmed>31784286</pubmed></ref>[https://doi.org/10.1101/2020.02.26.966093][https://doi.org/10.1101/779694][https://www.biorxiv.org/content/10.1101/617555][A]でのscRNAseqデータがある。また[[iPS細胞]]や[[ES細胞]]由来の神経組織[[オルガノイド]]に含まれる神経細胞タイプを知る上でも利用されている<ref><pubmed>28094016</pubmed></ref><ref><pubmed>28279351</pubmed></ref><ref><pubmed>31168097</pubmed></ref><ref><pubmed>31996853</pubmed></ref><ref><pubmed>31968264</pubmed></ref><ref><pubmed><ref><pubmed>32221280</pubmed></ref>。このようなアプローチは、ネアンデルタール人型の遺伝子を持つ脳オルガノイドの解析<ref><pubmed> 32559457</pubmed></ref>やSARS-CoV-2に感染する脳オルガノイド中の細胞の同定<ref><pubmed> 33113348</pubmed></ref>など、新たな応用例が発表されてきており興味深い。

[[上衣細胞]]<ref><pubmed>29727663</pubmed></ref>は、[[神経幹細胞]]としての役割が示唆されてきたが、scRNAseqによる解析ではその可能性が支持されなかった。グリア細胞では、[[ラジアルグリア]]<ref><pubmed>26406371</pubmed></ref><ref><pubmed>25734491</pubmed></ref><ref><pubmed>29281841</pubmed></ref><ref><pubmed>29217575</pubmed></ref><ref><pubmed>29539641</pubmed></ref>[A]、アストロサイト<ref><pubmed>32139688</pubmed></ref><ref><pubmed>32203496</pubmed></ref>[https://doi.org/10.1101/2020.04.27.064881]に多様性があることが示唆されてきている。また、オリゴデンドロサイト<ref><pubmed>27284195</pubmed></ref><ref><pubmed>30078729</pubmed></ref><ref><pubmed>30257220</pubmed></ref><ref><pubmed>30747918</pubmed></ref><ref><pubmed>31958186</pubmed></ref>[https://doi.org/10.1101/2020.03.06.981373]については、これまで細胞生物学的に研究されてきた分化の過程がscRNAseqにより詳細に解析されている。ミクログリアは、神経系の発達、老化、損傷などに伴う重要なトランスクリプトームの変化がscRNAseqにより詳細に明らかになった<ref><pubmed>27338705</pubmed></ref><ref><pubmed>29020624</pubmed></ref><ref><pubmed>30206190</pubmed></ref><ref><pubmed>30471926</pubmed></ref><ref><pubmed>31209379</pubmed></ref>

NGSを用いることで、どんな生物種にも適用可能なscRNAseqは、既に多様な生物の神経系の細胞の理解、更には種間の相同性や差異の研究に利用されており、神経系の進化を細胞レベルで考察するのに有用であろう（例、センチュウ<ref><pubmed> 28818938 </pubmed></ref>、ショウジョウバエ  <ref><pubmed>29909982</pubmed></ref><ref><pubmed>29149607</pubmed></ref><ref><pubmed>30703584</pubmed></ref><ref><pubmed>29909983</pubmed></ref><ref><pubmed>33125872</pubmed></ref>、カタユウレイボヤCiona intestinalis <ref><pubmed>30069052</pubmed></ref><ref><pubmed>30228204</pubmed></ref>、ゼブラフィッシュ<ref><pubmed>31018142</pubmed></ref><ref><pubmed>30929901</pubmed></ref>、アカミミガメTrachemys scripta elegans、トカゲPogona vitticeps, pv<ref><pubmed>29724907</pubmed></ref>、ニワトリ[https://doi.org/10.1101/2020.10.09.333633]、霊長類<ref><pubmed>30730291</pubmed></ref><ref><pubmed>31619793</pubmed></ref>[https://doi.org/10.1101/2020.03.31.016972]）。ただ、遺伝子やトランスクリプトームの研究が進んでいる生物種では比較的容易であるが、遺伝子のアノテーションが十分でない生物種を用いる場合、scRNAseqのデータ解析は困難を伴う。また種を超えた細胞タイプの相同性の理解には様々な工夫が必要である<ref><pubmed>31552245</pubmed></ref><ref><pubmed>30712875</pubmed></ref>[https://doi.org/10.1101/2020.03.31.016972]。

 

獲得されたscRNAseqのデータは様々な目的で利用できるので、データベース化し利用できるようにする必要がある。神経系のトランスクリプトーム一般のデータベースが多数公開されており<ref><pubmed>29437890</pubmed></ref>、scRNAseqのデータも基本的にNCBIのGene Expression Omnibus[https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/]に登録されている。また、オープンサイエンス推進のためにcommon coordinate framework (CCF) やcentral annotation platform (CAP)という概念のもと、特にscRNAseqを意識したものとして、米国のBRAIN Initiative Cell Census Consortium<ref><pubmed>29096072</pubmed></ref> 、Human Cell Atlas ProjectのHuman Cell Atlas Data Portal [https://data.humancellatlas.org]、そのマウス版であるTabula Muris <ref><pubmed>30283141</pubmed></ref>[https://genome.ucsc.edu/cgi-bin/hgTrackUi?db=mm10&g=tabulaMuris]やSten Linnarssonラボのマウス脳発生データベース[http://mousebrain.org]、アレン脳研究所のAllen Brain Atlas [https://portal.brain-map.org]、ブロード研究所のSingle Cell Portal [https://singlecell.broadinstitute.org/]などのデータベースが稼働している。また、異なった方法や実験で得られたscRNAseqのデータや後述のマルチモーダルなシングルセルオミクスのデータを体系的に比較することも重要であり、CCA (Canonical correlation analysis)<ref><pubmed>29608179</pubmed></ref>, Seurat 3.0以降に組み込まれたMMN (Mutual Nearest Neighbors)、LIGER<ref><pubmed>31178122</pubmed></ref> 、Harmony<ref><pubmed>31740819</pubmed></ref>  、MetaNeighber<ref><pubmed>29491377</pubmed></ref>、Conos<ref><pubmed>31308548</pubmed></ref>[https://doi.org/10.1101/2020.05.22.111161]のようなアルゴリズムが開発され、後述のマルチモーダルなシングルセルオミクスを組み込んだ統合サイトもでき始めている（[https://biccn.org]）。またデータベースを利用して発現類似性検索も研究されている<ref><pubmed>29608555</pubmed></ref><ref><pubmed>30744683</pubmed></ref>。

多数の細胞を扱うscRNAseqの弱点は、組織から細胞や細胞核を解離する必要があるので、その細胞が存在していた解剖学的あるいは空間的な位置の情報を消去してしまうということである。組織切片におけるタンパク質などの分布は免疫組織化学、mRNAの分布はin situ hybridizationで検出することができるが、数多くのmRNAの分布を情報処理技術と組み合わせ一気に同定する方法がscRNAseqと同様に開発されてきている（Slide-seq<ref><pubmed>30923225</pubmed></ref>[https://doi.org/10.1101/2020.03.12.989806]、HDST<ref><pubmed>31501547</pubmed></ref>、Expansion sequencing[http://doi.org/10.1101/2020.05.13.094268]など<ref><pubmed>27365449</pubmed></ref>, <ref><pubmed>31932730</pubmed></ref> <ref><pubmed>30948552</pubmed></ref>）、更に10x Genomics社が市販するVisiumなどがある。現状では、大きな組織の空間トランスクリプトミクスは、空間解像度は限定されており、技術普及の観点からも課題が多い。しかし、そのデータを解析するためのアルゴリズム<ref><pubmed>29553578</pubmed></ref><ref><pubmed>29553579</pubmed></ref><ref><pubmed>32350282</pubmed></ref> [https://doi.org/10.1101/757096][ https://doi.org/10.1101/701680] [https://doi.org/10.1101/431957]、

 

 

===複数モダリティのシングルセルオミクス===

同様な複数モダリティのシングルセルオミクスとして、神経科学分野で注目されるのは、scRNAseqをパッチクランプによる電気生理学的情報と組み合わせたPatch-seq<ref><pubmed>26689544</pubmed></ref> <ref><pubmed>26689543</pubmed></ref>である。また、ゲノムDNAとscRNAseqを同時に観察することによって、近年、精神疾患の観点から注目されている発生途中で生じる遺伝子変異を研究するPRDD-seqは今後の展開が注目される[https://doi.org/10.1101/2020.04.19.046904]。最後に、BARseq (barcoded anatomy resolved by sequencing) <ref><pubmed>31626774</pubmed></ref>、CONNECTID[https://doi.org/10.1101/378760]、Epi-Retro-seq[https://doi.org/10.1101/2020.04.01.019612]のような方法は、[[コネクトーム]]（神経細胞の結合性）と遺伝子発現を記録できるオミクスの新たな方向として興味深い。

 

 

<references />c