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「高速液体クロマトグラフィー」の版間の差分
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[[ファイル:図1 ABC.jpg|thumb|300px|right|図1. (A) HPLCの基本フローチャート. (B) プレカラム法の基本フローチャート. (C) ポストカラム法の基本フローチャート.]] | [[ファイル:図1 ABC.jpg|thumb|300px|right|図1. (A) HPLCの基本フローチャート. (B) プレカラム法の基本フローチャート. (C) ポストカラム法の基本フローチャート.]] | ||
====ポンプ==== | ====ポンプ==== | ||
移動相の制御に欠かせない装置である。メーカーによって多少異なる形をしているが基本的な構造は同じである。１台のポンプで１つの移動相が基本であるが、２つの電磁弁が付属していると２つの移動相を制御することができる。高速アミノ酸分析計（HITACHI）では電磁弁が５つ付属しており、１台のポンプで５種類の移動相を切り替えて１分析で約４０種類のアミノ酸を定量することができる。電磁弁以外では、リザーバ−切り替えバルブがあり同様に６種類の移動相を変えることが可能である。 | |||
====インジェクター==== | ====インジェクター==== | ||
インジェクターには、マイクロシリンジを用いて手動でサンプルを注入するマニュアルインジェクターと、専用バイアル瓶に入れたサンプルをオートサンプラーと呼ばれる装置を用いて自動的に注入するオートインジェクターがある。各メーカーでシステムに合わせたオートサンプラーを開発しており、生体サンプルを取り扱うための冷却機能を備えた装置や誘導化するための反応型オートサンプラーがある。現在では、オートサンプラーを使用して分析する事が多い。 | インジェクターには、マイクロシリンジを用いて手動でサンプルを注入するマニュアルインジェクターと、専用バイアル瓶に入れたサンプルをオートサンプラーと呼ばれる装置を用いて自動的に注入するオートインジェクターがある。各メーカーでシステムに合わせたオートサンプラーを開発しており、生体サンプルを取り扱うための冷却機能を備えた装置や誘導化するための反応型オートサンプラーがある。現在では、オートサンプラーを使用して分析する事が多い。 | ||
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図2-Bに示したHPLCの構成で、グラジエント法を用いて分析した。移動相は２種類あり、移動相Aの組成は、100 mM リン酸緩衝液（pH 5.6）、移動相Bの組成は100％アセトニトリルでステップワイズに濃度を変え、25分間で1分析を行った（グラジエントの条件：0 min→1 min 15%, 1 min→4.5 min 16%, 4.5 min→8 min 21%, 8 min→11 min 24%, 11 min→13.5 min 31%, 13.5 min→16.5 min 35%, 16.5 min→25 min 15%）。 | 図2-Bに示したHPLCの構成で、グラジエント法を用いて分析した。移動相は２種類あり、移動相Aの組成は、100 mM リン酸緩衝液（pH 5.6）、移動相Bの組成は100％アセトニトリルでステップワイズに濃度を変え、25分間で1分析を行った（グラジエントの条件：0 min→1 min 15%, 1 min→4.5 min 16%, 4.5 min→8 min 21%, 8 min→11 min 24%, 11 min→13.5 min 31%, 13.5 min→16.5 min 35%, 16.5 min→25 min 15%）。 | ||
蛍光誘導化試薬は、OPA試薬7.5 mgをメタノール300 μLで溶解した後、2メルカプトエタノールを7.5μLを加え、さらにミリQ水1200 μLを加えた。100 mMホウ酸緩衝液（pH 10.0）は、Na<sub>4</sub>B<sub>4</sub>O<sub>7</sub>･10H<sub>2</sub>O 1.905 gをミリQ水50 mLに溶解し調製した。 | 蛍光誘導化試薬は、OPA試薬7.5 mgをメタノール300 μLで溶解した後、2メルカプトエタノールを7.5μLを加え、さらにミリQ水1200 μLを加えた。100 mMホウ酸緩衝液（pH 10.0）は、Na<sub>4</sub>B<sub>4</sub>O<sub>7</sub>･10H<sub>2</sub>O 1.905 gをミリQ水50 mLに溶解し調製した。 | ||
試料の前処理として、摘出した脳組織にすみやかに5〜10倍量の0.2 M PCA(100 μM EDTA･2Na含有) | 試料の前処理として、摘出した脳組織にすみやかに5〜10倍量の0.2 M PCA(100 μM EDTA･2Na含有)を加え、超音波で30秒間ホモジナイズした。次に、除タンパクを完全にするため氷中で30分間放置した後、4 ℃で10,000 rpm × 15分間遠心し、上清を採取した。上清は20倍に希釈し、15 μLを HPLCサンプルとした。サンプルは、オートサンプラー内にてOPA試薬と反応し、HPLCで分析した。すなわち蛍光誘導化のため反応型のオートサンプラーのサンプルラックを12 ℃に冷却、蛍光誘導化試薬15 μL、サンプル15 μL、100 mM ホウ酸緩衝液（pH 10.0）20 μLを加え30 ℃で2分間インキュベートし、誘導体化されたサンプル35 μLをHPLCにインジェクションした。 | ||
分析例として、図2に0.5~20 pmol/μLのスタンダード(C)と脳組織をホモジネートしたサンプル(D)を分析したクロマトグラフを示した。定量限界は、0.5 pmol/μLであった。このクロマト条件においては、脳内のグルタミン酸と GABAの濃度は充分な測定感度範囲に入り、その他の生体アミノ酸（アスパラギン酸、セリン、アスパラギン、アルギニン、グリシン、アラニン、タウリン）も同時一斉分析を行うことが可能である。 | 分析例として、図2に0.5~20 pmol/μLのスタンダード(C)と脳組織をホモジネートしたサンプル(D)を分析したクロマトグラフを示した。定量限界は、0.5 pmol/μLであった。このクロマト条件においては、脳内のグルタミン酸と GABAの濃度は充分な測定感度範囲に入り、その他の生体アミノ酸（アスパラギン酸、セリン、アスパラギン、アルギニン、グリシン、アラニン、タウリン）も同時一斉分析を行うことが可能である。 | ||