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#カラム | #カラム | ||
#: カラムは、分析する物質の性質を考慮して種類を選択しなければならない。カラムの種類には、主にイオン交換、逆相、順相、サイズ排除（ゲル濾過）そして光学異性体分離カラムがある。イオン交換カラムには、陽イオン、陰イオン、両イオン型の３つのタイプがある。これらは、金属イオン、無機酸、アミノ酸、ペプチドやタンパク質の分析・分取に用いられる。逆相カラムは、最も種類が多く様々なカラムが開発されている。特に低分子の分析に用いられることが多く神経伝達物質、誘導化したアミノ酸、医薬品、ホルモン、ペプチドの分析などに用いられている。順相カラムは、有機合成した化合物の分離に多く用いられる。サイズ排除カラムは、タンパク質を分子量ごとに分画または会合体としてモノマー、ダイマー、トリマーの分析・分取に用いられる。光学異性体分離カラムはアミノ酸のD体とL体や医薬品などの光学異性体化合物の分析・分取に用いられている。 | #: カラムは、分析する物質の性質を考慮して種類を選択しなければならない。カラムの種類には、主にイオン交換、逆相、順相、サイズ排除（ゲル濾過）そして光学異性体分離カラムがある。イオン交換カラムには、陽イオン、陰イオン、両イオン型の３つのタイプがある。これらは、金属イオン、無機酸、アミノ酸、ペプチドやタンパク質の分析・分取に用いられる。逆相カラムは、最も種類が多く様々なカラムが開発されている。特に低分子の分析に用いられることが多く神経伝達物質、誘導化したアミノ酸、医薬品、ホルモン、ペプチドの分析などに用いられている。順相カラムは、有機合成した化合物の分離に多く用いられる。サイズ排除カラムは、タンパク質を分子量ごとに分画または会合体としてモノマー、ダイマー、トリマーの分析・分取に用いられる。光学異性体分離カラムはアミノ酸のD体とL体や医薬品などの光学異性体化合物の分析・分取に用いられている。 | ||
#検出器 | #検出器 | ||
#: 様々な検出器が開発されておりUV検出器、蛍光検出器、電気化学検出器、質量分析器、蒸発光散乱検出器などが用いられている。HPLCにおいて、最も汎用的な検出器はUV 検出器であり、次いで蛍光検出器、電気化学検出器の順である。 | #: 様々な検出器が開発されておりUV検出器、蛍光検出器、電気化学検出器、質量分析器、蒸発光散乱検出器などが用いられている。HPLCにおいて、最も汎用的な検出器はUV 検出器であり、次いで蛍光検出器、電気化学検出器の順である。 | ||
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===応用例（スイッチングバルブ法）=== | ===応用例（スイッチングバルブ法）=== | ||
 これまでHPLCの一般的な装置構成について述べてきた。ここでは、装置構成の応用例としてスイッチングバルブ装置を用いたHPLCのシステムについて述べる。 |  これまでHPLCの一般的な装置構成について述べてきた。ここでは、装置構成の応用例としてスイッチングバルブ装置を用いたHPLCのシステムについて述べる。 | ||
<br />図3-AのHPLCシステムではアイソクラティック法にスイッチングバルブ装置を組んでいる（構成：移動相２液、ポンプ２台、スイッチングバルブ１台、トラップカラム１本、分離用カラム２本、検出器２台）。スイッチングバルブとは、特定な時間を設定してその時間になると流路を切り替えることができる装置のことである。トラップカラムは、サンプル内の物質を一時的に保持するための長さが短いカラム（1 cm程度）である。インジェクション前の流路は、移動相AはポンプA → インジェクター → トラップカラム → カラムA → 検出器Aへ流れている。このとき移動相Bは、ポンプB → カラムB → 検出器Bを流れており、トラップカラムには流れない。インジェクション後スイッチングバルブ設定時間にバルブが作動するとトラップカラムに移動相Bが流れる。このシステムで重要な点は、スイッチングバルブ設定時間である。設定時間を調節することによりカラムBで検出する物質の溶出時間を変えることができる。また目的物質の溶出が移動相の変わり目になると正確な分析ができなくなるため注意が必要である。溶出時間の速いものと遅いものを同時に分析したい場合、スイッチングバルブ法は１本のカラムで分析する場合と比較し約半分の時間でかつ溶出時間の遅い物質を感度良く分析できる利点がある。 | <br />図3-AのHPLCシステムではアイソクラティック法にスイッチングバルブ装置を組んでいる（構成：移動相２液、ポンプ２台、スイッチングバルブ１台、トラップカラム１本、分離用カラム２本、検出器２台）。スイッチングバルブとは、特定な時間を設定してその時間になると流路を切り替えることができる装置のことである。トラップカラムは、サンプル内の物質を一時的に保持するための長さが短いカラム（1 cm程度）である。インジェクション前の流路は、移動相AはポンプA → インジェクター → トラップカラム → カラムA → 検出器Aへ流れている。このとき移動相Bは、ポンプB → カラムB → 検出器Bを流れており、トラップカラムには流れない。インジェクション後スイッチングバルブ設定時間にバルブが作動するとトラップカラムに移動相Bが流れる。このシステムで重要な点は、スイッチングバルブ設定時間である。設定時間を調節することによりカラムBで検出する物質の溶出時間を変えることができる。また目的物質の溶出が移動相の変わり目になると正確な分析ができなくなるため注意が必要である。溶出時間の速いものと遅いものを同時に分析したい場合、スイッチングバルブ法は１本のカラムで分析する場合と比較し約半分の時間でかつ溶出時間の遅い物質を感度良く分析できる利点がある。 | ||
==脳科学への応用== | ==脳科学への応用== | ||
[[ファイル:HPLC 図2.jpg|thumb|300px|right|図2. (A) OPA化のアミノ基の反応． (B) 実験に用いたHPLCのフローチャート. (C)と(D)は、 OPA化アミノ酸のクロマトグラム. (C) 0.5~20 pmol/uLのスタンダード. (D)脳組織をホモジネートしたサンプル.。<br />[分析条件] 装置：Shimadzu SCL-10Avpシステム, オートサンプラー：GILSON 232XLシステム，カラム：COSMOSIL 5C18-MS-II(4.6ID×150 mm)， 流速：0.8 ml/min， カラム温度：36 ℃， 励起波長：340 nm, 蛍光波長：445 nm．]] | |||
===神経伝達アミノ酸の分析（蛍光誘導化法）=== | ===神経伝達アミノ酸の分析（蛍光誘導化法）=== | ||
蛍光誘導化法で用いられる誘導化試薬は、メーカーから様々な種類が出されている。その中でも本稿では非常に安価なOPA法について述べる。 | 蛍光誘導化法で用いられる誘導化試薬は、メーカーから様々な種類が出されている。その中でも本稿では非常に安価なOPA法について述べる。 | ||
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#測定例１ （グラジエント法） | #測定例１ （グラジエント法） | ||
#: 脳組織ホモジネートを用いて、興奮性アミノ酸である[[グルタミン酸]]と[[抑制性アミノ酸]]であるGABAを測定した例を述べる。<br />図2-Bに示したHPLCの構成で、グラジエント法を用いて分析した。移動相は２種類あり、移動相Aの組成は、100 mM リン酸緩衝液（pH 5.6）、移動相Bの組成は100％アセトニトリルでステップワイズに濃度を変え、25分間で1分析を行った（グラジエントの条件：0 min→1 min 15%, 1 min→4.5 min 16%, 4.5 min→8 min 21%, 8 min→11 min 24%, 11 min→13.5 min 31%, 13.5 min→16.5 min 35%, 16.5 min→25 min 15%）。蛍光誘導化試薬は、OPA試薬7.5 mgをメタノール300 μLで溶解した後、2メルカプトエタノールを7.5μLを加え、さらにミリQ水1200 μLを加えた。100 mMホウ酸緩衝液（pH 10.0）は、Na<sub>4</sub>B<sub>4</sub>O<sub>7</sub>･10H<sub>2</sub>O 1.905 gをミリQ水50 mLに溶解し調製した。<br />試料の前処理として、摘出した脳組織にすみやかに5〜10倍量の0.2 M PCA(100 μM EDTA･2Na含有)を加え、超音波で30秒間ホモジナイズした。次に、除タンパクを完全にするため氷中で30分間放置した後、4 ℃で10,000 rpm × 15分間遠心し、上清を採取した。上清は20倍に希釈し、15 μLを HPLCサンプルとした。サンプルは、オートサンプラー内にてOPA試薬と反応し、HPLCで分析した。すなわち蛍光誘導化のため反応型のオートサンプラーのサンプルラックを12 ℃に冷却、蛍光誘導化試薬15 μL、サンプル15 μL、100 mM ホウ酸緩衝液（pH 10.0）20 μLを加え30 ℃で2分間インキュベートし、誘導体化されたサンプル35 μLをHPLCにインジェクションした。<br />分析例として、図2に0.5~20 pmol/μLのスタンダード(C)と脳組織をホモジネートしたサンプル(D)を分析したクロマトグラフを示した。定量限界は、0.5 pmol/μLであった。このクロマト条件においては、脳内のグルタミン酸とGABAの濃度は充分な測定感度範囲に入り、その他の生体アミノ酸（アスパラギン酸、セリン、アスパラギン、アルギニン、グリシン、アラニン、タウリン）も同時一斉分析を行うことが可能である。 | #: 脳組織ホモジネートを用いて、興奮性アミノ酸である[[グルタミン酸]]と[[抑制性アミノ酸]]であるGABAを測定した例を述べる。<br />図2-Bに示したHPLCの構成で、グラジエント法を用いて分析した。移動相は２種類あり、移動相Aの組成は、100 mM リン酸緩衝液（pH 5.6）、移動相Bの組成は100％アセトニトリルでステップワイズに濃度を変え、25分間で1分析を行った（グラジエントの条件：0 min→1 min 15%, 1 min→4.5 min 16%, 4.5 min→8 min 21%, 8 min→11 min 24%, 11 min→13.5 min 31%, 13.5 min→16.5 min 35%, 16.5 min→25 min 15%）。蛍光誘導化試薬は、OPA試薬7.5 mgをメタノール300 μLで溶解した後、2メルカプトエタノールを7.5μLを加え、さらにミリQ水1200 μLを加えた。100 mMホウ酸緩衝液（pH 10.0）は、Na<sub>4</sub>B<sub>4</sub>O<sub>7</sub>･10H<sub>2</sub>O 1.905 gをミリQ水50 mLに溶解し調製した。<br />試料の前処理として、摘出した脳組織にすみやかに5〜10倍量の0.2 M PCA(100 μM EDTA･2Na含有)を加え、超音波で30秒間ホモジナイズした。次に、除タンパクを完全にするため氷中で30分間放置した後、4 ℃で10,000 rpm × 15分間遠心し、上清を採取した。上清は20倍に希釈し、15 μLを HPLCサンプルとした。サンプルは、オートサンプラー内にてOPA試薬と反応し、HPLCで分析した。すなわち蛍光誘導化のため反応型のオートサンプラーのサンプルラックを12 ℃に冷却、蛍光誘導化試薬15 μL、サンプル15 μL、100 mM ホウ酸緩衝液（pH 10.0）20 μLを加え30 ℃で2分間インキュベートし、誘導体化されたサンプル35 μLをHPLCにインジェクションした。<br />分析例として、図2に0.5~20 pmol/μLのスタンダード(C)と脳組織をホモジネートしたサンプル(D)を分析したクロマトグラフを示した。定量限界は、0.5 pmol/μLであった。このクロマト条件においては、脳内のグルタミン酸とGABAの濃度は充分な測定感度範囲に入り、その他の生体アミノ酸（アスパラギン酸、セリン、アスパラギン、アルギニン、グリシン、アラニン、タウリン）も同時一斉分析を行うことが可能である。 | ||
[[ファイル:HPLC | [[ファイル:HPLC 図3.jpg|thumb|300px|right|図 3. (A) HPLCのフローチャート, (B) 2pmol/μLのスタンダード, (C) 脳組織ホモジネートのサンプル.<br />[分析条件] 装置：ポンプHITACHI L-2130，検出器：EICOM L7480とGL Sciences GL-7453A，カラムオーブン：EICOM CTC-100，デガッサー：EICOM DG-100，オートサンプラー：EICOM，ソフトウェア：PowerChrom EPC-500，トラップカラム：COSMOSIL Guard 5C18-MS-II(4.6ID×10 mm), 分離用カラム：COSMOSIL 5C18-MS-II(4.6ID×150 mm), 流速：1.1 ml/min, カラム温度：36 ℃, 励起波長：340 nm, 蛍光波長：440 nm． | ||
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#測定例２ （スイッチングバルブ法） | #測定例２ （スイッチングバルブ法） | ||
#: 図3-Aに示したHPLCの構成で、アイソクラティック法を用いて脳組織のホモジネートを分析した。<br />移動相は２種類あり、移動相Aにクエン酸−リン酸緩衝液 pH 5.8, 12%アセトニトリル、移動相Bにクエン酸−リン酸緩衝液 pH 6.2, 25%アセトニトリルを用い15分間で1分析を行った。スイッチングバルブは、インジェクションから1分30秒で切り替わり、12分後に元の流路に戻るセッティングをした。蛍光誘導化試薬は、OPA試薬5 mgをメタノール200 μLで溶解した後、2メルカプトエタノール5 μL、0.1 M Na<sub>2</sub>CO<sub>3</sub>溶液800 μL加え、調製した。試料の前処理は、測定例（1）と同様に行い、上清を1200倍に希釈して15 μLをHPLCサンプルにした。蛍光誘導化のため、オートサンプラーのサンプルラックを12 ℃に冷却、蛍光誘導化試薬15 μL、サンプル15 μLを加え30 ℃で2分間インキュベートし、誘導体化されたサンプル10 μLをインジェクションした。 | #: 図3-Aに示したHPLCの構成で、アイソクラティック法を用いて脳組織のホモジネートを分析した。<br />移動相は２種類あり、移動相Aにクエン酸−リン酸緩衝液 pH 5.8, 12%アセトニトリル、移動相Bにクエン酸−リン酸緩衝液 pH 6.2, 25%アセトニトリルを用い15分間で1分析を行った。スイッチングバルブは、インジェクションから1分30秒で切り替わり、12分後に元の流路に戻るセッティングをした。蛍光誘導化試薬は、OPA試薬5 mgをメタノール200 μLで溶解した後、2メルカプトエタノール5 μL、0.1 M Na<sub>2</sub>CO<sub>3</sub>溶液800 μL加え、調製した。試料の前処理は、測定例（1）と同様に行い、上清を1200倍に希釈して15 μLをHPLCサンプルにした。蛍光誘導化のため、オートサンプラーのサンプルラックを12 ℃に冷却、蛍光誘導化試薬15 μL、サンプル15 μLを加え30 ℃で2分間インキュベートし、誘導体化されたサンプル10 μLをインジェクションした。 | ||
===神経伝達モノアミンとその代謝物、およびアセチルコリンの分析（電気化学検出法）=== | ===神経伝達モノアミンとその代謝物、およびアセチルコリンの分析（電気化学検出法）=== | ||
[[ファイル:HPLC 図4.jpg|thumb|300px|right|図 4. (A) ドーパミンの酸化反応. (B) 標準物質の分析; 10-100 pg の範囲で定量性がある。(C) マウス線条体抽出物の分析; ドーパミン作動性ニューロンが多いことが分かる。(D) マウス小脳抽出物の分析; 線条体と全く異なる溶出パターンをすることが分かる。<br />[分析条件] 装置:エイコム社製システム（デガッサー：DG-300, ポンプ：EP-300, カラムオーブン：ATC-300, 検出器：ECD-300, EICOM), カラム : EICOMPAK SC-50DS (3.0ID × 150 mm, EICOM), 移動相: 83% 0.1 M 酢酸-クエン酸緩衝液(pH 3.5)/17% メタノール(190 mg/L SOS, 5 mg/L EDTA•2Na を含む), 流速:0.5 mL/min, 作用電極: グラファイト電極(WE-3G, EICOM), 印加電圧:+750 mV vs. Ag/AgCl(RE-100, EICOM), 注入量:10 μL, 温度: 25℃,<br /> | |||
MHPG:3-Methoxy-4-hydroxyphenylglycol, NA:Noradrenaline, AD:Adrenaline, DOPAC:3,4-dihydroxy-phenylacetic acid, NM:Normethanephrine, DA:Dopamine, 5-HIAA:5-Hydroxyindoleacetic acid, ISO:Isoproterenol, HVA:Homovanillic acid, 3-MT:3-Methoxytyramine, 5-HT:5-Hydroxytryptamine | |||
]] | |||
#電気化学検出の原理 | #電気化学検出の原理 | ||
#: 酸化還元活性を有する物質を高感度に検出する方法である。一定の電位を印加した電極上で物質が酸化又は還元された時に流れる電流を検出する。電流量は濃度に比例する為、定量分析が可能である。検出器には、電流測定検出器 (Amperometric detector) と電量検出器(Coulometric detector) の2種類があり、一般的にHPLCにおいては電流測定検出器を用いることが多い。これは、電量検出器に比べて電解効率が大幅に低いものの、良いシグナルノイズ比・感度が得られるためである。検出セルは作用電極、参照電極、対極電極からなり、作用電極は測定対象に応じてグラッシーカーボン、グラファイト、白金などを使用する。電気化学検出は1950年代にKemuraによって最初にクロマトグラフィーの検出法として用いられ、1960年代後半から1970年代前半にかけてAdamsらにより[[カテコールアミン]]およびアスコルビン酸の分析に応用された。それからさらなる改良が重ねられ、現在神経伝達物質およびその代謝物の定量方法として、一般的な技術となっている。詳細な測定原理や方法については、Meffordによる総説<ref name=ref2><pubmed>6163932</pubmed></ref>やZapataらのプロトコル<ref name=ref3><pubmed>19575473</pubmed></ref>等が参考となる。 | #: 酸化還元活性を有する物質を高感度に検出する方法である。一定の電位を印加した電極上で物質が酸化又は還元された時に流れる電流を検出する。電流量は濃度に比例する為、定量分析が可能である。検出器には、電流測定検出器 (Amperometric detector) と電量検出器(Coulometric detector) の2種類があり、一般的にHPLCにおいては電流測定検出器を用いることが多い。これは、電量検出器に比べて電解効率が大幅に低いものの、良いシグナルノイズ比・感度が得られるためである。検出セルは作用電極、参照電極、対極電極からなり、作用電極は測定対象に応じてグラッシーカーボン、グラファイト、白金などを使用する。電気化学検出は1950年代にKemuraによって最初にクロマトグラフィーの検出法として用いられ、1960年代後半から1970年代前半にかけてAdamsらにより[[カテコールアミン]]およびアスコルビン酸の分析に応用された。それからさらなる改良が重ねられ、現在神経伝達物質およびその代謝物の定量方法として、一般的な技術となっている。詳細な測定原理や方法については、Meffordによる総説<ref name=ref2><pubmed>6163932</pubmed></ref>やZapataらのプロトコル<ref name=ref3><pubmed>19575473</pubmed></ref>等が参考となる。 | ||