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本法の手順を図２に示す。 | 本法の手順を図２に示す。 | ||
#制限酵素によるDNAの消化<br> この際にメチル化感受性制限酵素と非[[wikipedia:ja: | #制限酵素によるDNAの消化<br> この際にメチル化感受性制限酵素と非[[wikipedia:ja:DNAメチル化|メチル化]]感受性[[wikipedia:ja:制限酵素|制限酵素]]を組み合わせて使用することで後述に示すDNAメチル化状態の解析が出来る。 | ||
#[[wikipedia:ja:アガロースゲル|アガロースゲル]][[wikipedia:ja:電気泳動|電気泳動]] | #[[wikipedia:ja:アガロースゲル|アガロースゲル]][[wikipedia:ja:電気泳動|電気泳動]] | ||
#ゲル内DNAの変性<br> 電気泳動により分離されたDNAをアガロースゲル内で1本鎖にする（変性）ために電気泳動後のアガロースゲルをNaOHなどの塩基性溶液で処理をする。 | #ゲル内DNAの変性<br> 電気泳動により分離されたDNAをアガロースゲル内で1本鎖にする（変性）ために電気泳動後のアガロースゲルをNaOHなどの塩基性溶液で処理をする。 | ||
#メンブランへの転写<br> アガロースゲル内のDNAを泳動パターンを維持したままを[[wikipedia:ja:毛細管現象|毛細管現象]] | #メンブランへの転写<br> アガロースゲル内のDNAを泳動パターンを維持したままを[[wikipedia:ja:毛細管現象|毛細管現象]]を利用して[[wikipedia:ja:ナイロン|ナイロン]]製や[[wikipedia:ja:ニトロセルロース|ニトロセルロース]]製のメンブランへ転写する。この作業には数時間から一晩要するため、近年は電気的に転写するエレクトロブロット、吸引によるバキュームブロットなど短時間で転写できる装置も市販されている。 | ||
#プローブとの反応<br> 特定の塩基配列を検出するための標識（ラベリング）された[[wikipedia:ja:核酸|核酸]]をプローブと呼び、標識には[[wikipedia:ja:放射性同位体|放射性同位体]]の他、[[wikipedia:ja:アルカリフォスファターゼ|アルカリフォスファターゼ]]などの酵素が利用される。プローブに用いる核酸はDNA, RNAいずれも使用でき、それぞれDNAプローブ、RNAプローブと呼ばれる。RNAプローブはDNAプローブに比してメンブラン上のDNAとの結合力が高いが扱いにくいためDNAプローブが頻用される。ただしDNAプローブは使用前に1本鎖にする必要がある。 これらのプローブをDNAを転写したメンブラン上で反応させることで相補的な配列をもつDNAとプローブが2本鎖を形成する。 なお、このときに塩濃度を高くすることでプローブの配列と一致しないまでも相同性の高い配列を持つDNAは2本鎖を形成する。これを利用すれば異なる動物種間の遺伝子、あるいは相同遺伝子を検出することが出来る場合もある。 | #プローブとの反応<br> 特定の塩基配列を検出するための標識（ラベリング）された[[wikipedia:ja:核酸|核酸]]をプローブと呼び、標識には[[wikipedia:ja:放射性同位体|放射性同位体]]の他、[[wikipedia:ja:アルカリフォスファターゼ|アルカリフォスファターゼ]]などの酵素が利用される。プローブに用いる核酸はDNA, RNAいずれも使用でき、それぞれDNAプローブ、RNAプローブと呼ばれる。RNAプローブはDNAプローブに比してメンブラン上のDNAとの結合力が高いが扱いにくいためDNAプローブが頻用される。ただしDNAプローブは使用前に1本鎖にする必要がある。 これらのプローブをDNAを転写したメンブラン上で反応させることで相補的な配列をもつDNAとプローブが2本鎖を形成する。 なお、このときに塩濃度を高くすることでプローブの配列と一致しないまでも相同性の高い配列を持つDNAは2本鎖を形成する。これを利用すれば異なる動物種間の遺伝子、あるいは相同遺伝子を検出することが出来る場合もある。 | ||
#メンブランの洗浄<br> メンブラン上のDNAに結合しなかったプローブを洗浄する。この際にも洗浄液の塩濃度を高くすることでプローブと多少配列が異なるDNA間の2本鎖は結合したままにすることが出来る。 | #メンブランの洗浄<br> メンブラン上のDNAに結合しなかったプローブを洗浄する。この際にも洗浄液の塩濃度を高くすることでプローブと多少配列が異なるDNA間の2本鎖は結合したままにすることが出来る。 | ||
#検出<br> プローブ標識に放射性同位体を用いた場合はX線フィルムをを用いた[[wikipedia:ja:オートラジオグラフィー|オートラジオグラフィー]] | #検出<br> プローブ標識に放射性同位体を用いた場合はX線フィルムをを用いた[[wikipedia:ja:オートラジオグラフィー|オートラジオグラフィー]]でプローブの位置を検出する。また、プローブをアルカリホスファターゼ標識した場合は発光基質を反応させその[[wikipedia:ja:発光|発光]]をフィルムで検出するほか、[[wikipedia:ja:CCDカメラ|CCDカメラ]]などの検出器なども用いられる。 | ||
== ノーザンブロットとの相違点 == | == ノーザンブロットとの相違点 == | ||