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→‎相同組換えを利用した遺伝子ノックイン

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 ===== 相同組換えを利用した遺伝子ノックイン =====
-　神経細胞は分裂を行っていない細胞なので、相同組換えを利用した遺伝子ノックインをすることは困難であった。これを克服する方法として[[single-cell labeling of endogenous proteins by CRISPR-Cas9-mediated homology-directed repair法|single-cell labeling of endogenous proteins by CRISPR-Cas9-mediated homology-directed repair]] ([[SLENDR法|SLENDR]])法が開発された<ref name=mikuni2016><pubmed>27180908</pubmed></ref>。SLENDR法では、分裂能を持つ神経前駆細胞に、標的部位のDNA二本鎖切断に必要なガイドRNA、Cas9のcDNA、相同性を持つ外来遺伝子を子宮内電気穿孔法を用い導入する。この方法を用い標的遺伝子にタグ配列を挿入することができ、免疫組織化学に適した抗体のない遺伝子でもその局在を解析することができる。
+　神経細胞は分裂を行っていない細胞なので、相同組換えを利用した遺伝子ノックインをすることは困難であった。これを克服する方法としてSLENDR(single-cell labeling of endogenous proteins by CRISPR-Cas9-mediated homology-directed repair)法が開発された。SLENDR法では、分裂能を持つ神経前駆細胞に、標的部位のDNA二本鎖切断に必要なガイドRNA、Cas9のcDNA、相同性を持つ外来遺伝子を子宮内電気穿孔法を用い導入する。この方法を用い標的遺伝子にタグ配列を挿入することができ、免疫組織化学に適した抗体のない遺伝子でもその局在を解析することができる[56]。さらに最近、挿入する外来遺伝子をアデノ随伴ウイルスベクターを用い脳に導入することにより、相同組換えによるノックイン効率が高くなることが報告された<ref><pubmed>29056297</pubmed></ref>。標的部位のDNA二本鎖切断に必要なguide RNA、Cas9のcDNA、相同性を持つ外来遺伝子をアデノ随伴ウイルスベクターに組み込み、脳へ局所注入することにより、HITI法と同等な効率で狙った部位に遺伝子をノックインできる。
-　さらに最近、挿入する外来遺伝子をアデノ随伴ウイルスベクターを用い脳に導入することにより、相同組換えによるノックイン効率が高くなることが報告された<ref><pubmed>29056297</pubmed></ref>。標的部位のDNA二本鎖切断に必要なguide RNA、Cas9のcDNA、相同性を持つ外来遺伝子をアデノ随伴ウイルスベクターに組み込み、脳へ局所注入することにより、HITI法と同等な効率で狙った部位に遺伝子をノックインできる。
+=====不活性型Cas9を用いた遺伝子の転写制御=====
+　ガイドRNAとは複合体を形成できるがヌクレアーゼ活性を持たない不活性型Cas9 (dCas9)に転写抑制因子KRABを融合し (dCas9-KRAB)、標的ゲノム部位と相補的配列を持つガイドRNAと伴にレンチウイルスベクターを用い脳に導入することにより、標的遺伝子の発現を効率よくノックダウンできることが報告された (CRISPRi)[58]。また、dCas9に3種類の転写活性化因子(VP64、p65、Rta)を融合し (dCas9-VPR)、標的遺伝子の転写開始点に近接した領域に設計したガイドRNAと伴にレンチウイルスベクターを用い脳に導入することにより、標的遺伝子の転写を活性化できることも報告された (CRISPRa)[59]。CRISPRiおよびCRISPRaとも、ガイドRNAを複数導入することにより、同時に複数の遺伝子の転写制御が可能である。さらに、細胞種特異的プロモーターを用いdCas9-KRABあるいはdCas9-VPRを特定の細胞種に発現させることにより、細胞特異的な転写制御が可能であり、従来の細胞種特異的遺伝子欠損マウスで必要なマウスの交配を省略することができる。
 == ゲノム編集研究の今後 ==