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共焦点レーザー走査型顕微鏡 (ソースを閲覧)

2015年11月16日 (月) 09:32時点における版

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英語名：Confocal Laser Scanning Microscope
<div align="right"> 
<font size="+1">田島 鉄也</font><br>
''国立研究開発法人理化学研究所　BSI－オリンパス連携センター''<br>
DOI：<selfdoi />　原稿受付日：2015年7月15日　原稿完成日：2015年11月15日<br>
担当編集委員：[http://researchmap.jp/haruokasai 河西 春郎]（東京大学 大学院医学系研究科）<br>
</div>


英略語：CLSM, LSM
英：confocal laser scanning microscope 　英略語：CLSM, LSM　独：Konfokalmikroskop　仏：microscope confocal


== 特徴1（光学的切片効果）==
同義語：共焦点顕微鏡、共焦点レーザー顕微鏡、共焦点レーザー走査顕微鏡


[[image:Tetsuyatajima_fig_1.png|thumb|300px|'''図1．''']]
{{box|text=
　共焦点レーザー顕微鏡は、共焦点光学系を利用しレーザーを光源とした顕微鏡である。焦点が合った面だけの光を選択して像をつくる。そのため、落射蛍光顕微鏡よりもコントラストの強い像が得られる。レーザースポットを標本上にて走らせ（走査：スキャン）、受光部が得た光をデジタル変換して画素をつくり、画面を構成する。一点走査型と多点走査型があり、一点走査型は、スキャンする方法を変えることによりズーム機能や2種の蛍光色素の重複（クロストーク）を最小化するなどさまざまな効果が得られる。多点走査型は多数のレーザースポットを一度に走査することにより高速な画像取得が可能となっている。
}}


　落射式蛍光顕微鏡は対物レンズの焦点面以外のいわゆるボケ像も検出器に入ってきてしまうのに対し、共焦点光学系は対物レンズの焦点面と共役の位置にピンホールを配置し、焦点面以外からの光を除去し、ピントの合った像のみを観察することができる。（光学的切片）
== 共焦点レーザー顕微鏡とは ==
　共焦点レーザー顕微鏡とは[[蛍光顕微鏡]]の一種であり、共焦点光学系を利用し[[wj:レーザー|レーザー]]を光源とした顕微鏡である。[[培養細胞]]や組織切片の[[蛍光]]画像の取得に使われる。[[wj:対物レンズ|対物レンズ]]の[[wj:焦点|焦点]]面の前後のボケ像を光学的に除去し、焦点の合った部分の蛍光のみを取得でき、強いコントラストを持つ像を得ることができる。


　したがってサンプルまたは対物レンズを厚み方向に一定距離ずつ移動させて複数枚の画像を撮ると、そのサンプルの3次元的な蛍光物質の分布を観察することができる。
==特徴==
===光学的切片効果===
[[image:共焦点レーザー顕微鏡1.png|thumb|300px|'''図1．共焦点光学系の概念図''']]
[[image:共焦点レーザー顕微鏡2.png|thumb|300px|'''図2．落射蛍光顕微鏡の画像と共焦点レーザ顕微鏡の画像の比較'''<br>共焦点レーザ顕微鏡の画像は、焦点面前後のぼけた像がない。マウス腎臓の切片。AlexaFluor488にて糸球体と曲尿細管を染色。<br>
FluoCells Prepared Slide #3 (Invitrogen)<br>
スケールバーは30μｍ。]]


== 特徴2（励起光の走査）==
　[[落射式蛍光顕微鏡]]は[[wikipedia:ja:対物レンズ|対物レンズ]]の焦点面以外からの光（いわゆるボケ像）も検出器に入ってきてしまうのに対し、共焦点光学系は対物レンズの焦点面と共役の位置にピンホールを配置することによって、焦点面以外からの光を除去し、焦点面のみを観察することができる（光学的切片）。


　共焦点レーザー顕微鏡は、点状のレーザー励起光（レーザースポット）がサンプル上を万遍なく覆うように移動（これを走査[scan]という）しながらサンプルの蛍光を検出し、像をつくる（＊）。光源にレーザーが採用されている理由は、レーザー光が点光源に近いのでサンプルに点状に投影できるという理由による。またレーザーは音響光学素子によって波長ごとに高速にレーザーのOn/Offができる。 ＊線状の光を走査する方式の共焦点顕微鏡もある。
　したがってサンプルまたは対物レンズを厚み方向に一定距離ずつ移動させて複数枚の画像を撮ると、そのサンプルの3次元的な[[蛍光物質]]の分布を観察することができる<ref name=ref1>'''藤田哲也、河田聡'''<br>新しい光学顕微鏡　第一巻　レーザ顕微鏡の理論と実際<br>''学際企画''　1995　ISBN4-906514-17-0</ref> <ref name=ref2>'''藤田哲也、石川春律、高松哲郎'''<br>新しい光学顕微鏡　第二巻　共焦点レーザ顕微鏡の医学・生物への応用<br>''学際企画''  1995  ISBN4-906514-18-9
</ref> <ref name=ref3>'''J. Pawley'''<br>Handbook of Biological Confocal Microscopy, 3rd edition<br>''Plenum Press''（2006）</ref> <ref name=ref4>'''T. Wilson and C. J. R. Sheppard'''<br>Theory and Practice of Scanning Optical Microscopy<br>''Academic Press''（1984）
</ref>。


== 種類 ==
===励起光の走査===
[[image:共焦点レーザー顕微鏡3.png|thumb|300px|'''図3．XYに走査（スキャン）する方法の概念図''']]


　一点を走査するタイプと多点を走査するタイプがある。
　共焦点レーザー顕微鏡は、点状に集光した[[wikipedia:ja:レーザー|レーザー]]励起光（レーザースポット）をサンプル上を移動（これを走査[scan]という）させながらサンプルの蛍光を検出することによって像をつくる。光源にレーザーが採用されている理由は、レーザーが点光源に近いのでサンプルに点状に投影できるという理由による<ref name=ref1 /> <ref name=ref2 /> <ref name=ref3 /> <ref name=ref4 />。


===1点走査型===
　また、一般に複数の波長の異なるレーザーが搭載され、[[wikipedia:ja:音響光学素子|音響光学素子]]によって波長ごとに高速にレーザーのOn/Offができる。


　高速で振動するガルバノミラーを制御してその1点のレーザースポットを走査する。
＊線状の光を走査する方式の共焦点顕微鏡もある。


　検出器には光電子増倍管を用いる。ガルバノミラーを振りながら光電子増倍管に入ってきた光子を増倍し、電気信号に変えてデジタル化し、画素を並べて画像を作る。したがってレーザースポットによって励起された蛍光の光量をデジタル化して画素として配置した人工的な画像であり、顕微鏡を接眼レンズで見る場合の結像された像とは異なるものである。
==種類==
　一点を走査するタイプと多点を走査するタイプがある。
 
===一点走査型===
[[image:共焦点レーザー顕微鏡4.png|thumb|300px|'''図4．1点走査型の概念図''']]
 
　高速で駆動する[[wikipedia:ja:ガルバノミラー|ガルバノミラー]]を制御して一点のレーザースポットを走査する。
 
　検出器には[[wikipedia:ja:光電子増倍管|光電子増倍管]]を用いる。ガルバノミラーを振りながら光電子増倍管によって光を電気信号に変えてデジタル化し、デジタル化された値を画素として並べて画像を作る<ref name=ref1 /> <ref name=ref2 /> <ref name=ref3 /> <ref name=ref4 />。


　一点走査式の共焦点レーザー顕微鏡は、落射蛍光顕微鏡にはないいくつかの特徴がある。
　一点走査式の共焦点レーザー顕微鏡は、落射蛍光顕微鏡にはないいくつかの特徴がある。


　画素をそのままにしてガルバノミラーの振り幅を小さくすることによるズーム機能、斜め方向にスキャンすることによる画像回転機能、また特定の部分のみに光を当てる光刺激の実験も可能である。
:'''スキャンによるズーム機能'''：ガルバノミラーの振り幅を小さくすることによって、サンプルの特定の箇所を集中的に走査し、その部分を拡大して見せる機能。
 
:'''スキャンによる画像回転機能'''：スキャンする方向をＸ方向またはＹ方向だけではなく、斜め方向にスキャンすることによってあたかもサンプルが回転したかのように見える機能。画像内でサンプルの向きを調節することができる。


　音響光学素子によって、2つの波長のレーザーと2つのディテクタを高速で切り替えることができ、GFPとDsRedなど2種類の色素を使っている場合に、青色レーザーで励起している時は緑色のディテクタのみで検出するという具合に2つの蛍光色素のクロストークを最小化することができる。（もちろん、干渉フィルターを用いた他の画像取得方法でも可能できるが、機械的にフィルターを交換する時間がかかる）
:'''光刺激機能'''：特定の部分のみに光を照射する機能。細胞の一部に光を照射しその後の時間的経過を調べるたり、サンプルの一部分の蛍光を褪色させてその後周囲からの蛍光物質の流入を調べたりすることができる<ref name=ref5><pubmed>26077909</pubmed></ref>。


　1点のみの走査なので、像をつくるのに時間がかかるという欠点がある。したがって時間的な変化があるサンプルの場合、像の上部と下部では取得時刻に時間差があり、同じ画面内で同じ現象が映っていても全体が同時に起きているとは言えない。速く撮ろうとすると画素を少なくするなど工夫しなければならない。（最近、共振ガルバノミラーという高速で振動するミラーがあり、1秒に30枚程度の画像を取得することができるようになった。）
:'''シーケンシャルスキャン機能'''：2つの波長のレーザーと2つの検出器を電気的に高速で切り替えることができ、2色の蛍光色素を用いている場合に互いの蛍光波長の重複（クロストーク）を最小化することができる。例えば[[GFP]]と[[DsRed]]の2種類の蛍光タンパクを使っている場合、青色レーザーでGFPを励起し、緑色の蛍光波長のみを第1の検出器で検出し、緑色レーザーでDsRedを励起し赤色の波長のみを第2の検出器で検出するという具合に行なう。（落射蛍光顕微鏡とカメラの組み合わせの場合、機械的にフィルターを交換する時間がかかり、共焦点レーザー顕微鏡ほど早く制御できない。）


　また、光電子増倍管の中ではっせいする熱電子がノイズとなり、十分な蛍光シグナルが得られない場合は画面がザラついた感じになる。（最近はガリウム砒素リン光電子増倍管（名称これでよい？）があり、検出器を冷やしてノイズ発生を抑えている）
　一点のみの走査なので、像をつくるのに時間がかかるという欠点がある。したがって時間的な変化があるサンプルの場合、像の上部と下部では取得時刻に時間差があり、同じ画面内で同じ現象が映っていても全体が同時に起きているとは言えない。速く撮ろうとすると画素を少なくするなど工夫しなければならない。（最近、[[wikipedia:ja:共振ガルバノミラー|共振ガルバノミラー]]という高速で振動するミラーがあり、1秒に30枚程度の画像を取得することができるようになった。）
 
　また、十分な蛍光シグナルが得られない場合、光電子増倍管による信号の増幅率を高くすると、光電子増倍管の中で発生する熱電子によるノイズが顕著に現れ、画像がザラついた感じになる。このような場合、走査する速度を遅くして信号強度を増やす、複数枚の画像の平均処理を行うなどして、画像の改善を行う。（最近は[[wikipedia:ja:ガリウム砒素リン光電子増倍管|ガリウム砒素リン光電子増倍管]]など、より高感度な検出器も登場している。）


===多点走査型===
===多点走査型===
[[image:共焦点レーザー顕微鏡5.png|thumb|300px|'''図5．多点走査型の概念図''']]
　多数のピンホールを渦巻状に配置した円板（ニポウディスク）を利用し、励起光をこのピンホールを通してサンプル上に投影することで、多数の点状の励起を同時に行う。1画面上には約1000個の点状投影があり、円板を高速で回転させることで、点が万遍なくサンプルを覆うように移動して走査する。


　多数のピンホールを渦巻状に配置した回転円板（ニポウディスク）を利用し、これを回転させて点状の光をサンプル上に投影してこれを走査する。1画面上には約1000個の点状投影があり、それが万遍なくサンプルを覆うように移動して走査する。
　サンプルから発せられた蛍光もピンホールを通り、前後のぼけた像を取り除く。検出器は高感度[[wikipedia:ja:CCDカメラ|CCDカメラ]]または[[wikipedia:ja:CMOSカメラ|CMOSカメラ]]等の2次元検出器を使用する。1点走査式の共焦点レーザー顕微鏡と違い、落射蛍光顕微鏡と同じように画面内での時間差はほぼ無い。逆に、一点走査式共焦点顕微鏡は、1画素をつくる時間が非常に短い（ナノ秒～マイクロ秒）が、多点走査型は1画素をつくる時間がCCDカメラの露光時間に等しい（通常はミリ秒）<ref name=ref1 /> <ref name=ref2 /> <ref name=ref3 /> <ref name=ref4 />。


　検出器には高感度ＣＣＤカメラを使用する。1点走査式の共焦点レーザー顕微鏡と違い、ＣＣＤに既に画素のデバイスが物理的に存在し、そこにレーザースポットで励起された蛍光が入ってくる。一方1点走査式共焦点顕微鏡は、1画素をつくる時間が非常に短い（ナノ秒～マイクロ秒））が、多点走査型は1画素をつくる時間がCCDカメラの露光時間に等しい（通常はミリ秒）。
　特徴としては、走査速度が非常に速いことである。現在製品として世に出ている多点共焦点顕微鏡では、1秒間に最大2000枚像を取得することができる。実質的には、電子増倍型の高感度CCDを用いての[[培養細胞]]などの蛍光画像取得では、1秒間に数百フレームの速度で撮ることができる<ref name=ref6><pubmed>21971847</pubmed></ref>。


　特徴としては、走査速度が非常に速いことである。現在製品として世に出ている多点共焦点顕微鏡では、1秒間に最大2000回走査することができる。実質的には、光電子増倍型の高感度CCDを用いての培養細胞などの蛍光画像取得では、1秒間に数百フレームの速度で撮ることができる。
==関連項目==
* [[蛍光顕微鏡]]
* [[二光子レーザー走査顕微鏡]]
* [[超高解像度顕微鏡]]
==参考文献==
<references />
「https://bsd.neuroinf.jp/wiki/特別:携帯機器差分/19653...32434」から取得

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