「高速液体クロマトグラフィー」の版間の差分

　高速液体クロマトグラフィーとは、物質が固定相（[[wikipedia:JA:カラムクロマトグラフィー|カラム]]の担体）とこれに接して流れる移動相（液体）との親和力の違いから一定の比率で分布し、その比率が物質によって異なる事を利用して分離する方法である。移動相を高圧で流すことで高い分離および感度を得ることができ、固定相、移動相、検出器の組み合わせにより様々な物質の分析を行うことが可能である。脳科学分野においても各種[[神経伝達物質]]や[[wikipedia:JA:タンパク質|タンパク質]]、[[wikipedia:JA:ペプチド|ペプチド]]の分析など、幅広く利用されている。

高速液体クロマトグラフィーは、古くから脳内のタンパク質の精製・分取、神経伝達物質やペプチドなど生理活性物質の分析など多岐にわたり用いられてきた手法である。なぜなら、これらの物質に対して親和力が働く固定相(カラムの担体)と移動相（溶媒、緩衝液など）を適切に選択することにより、目的物質を妨害物質から分離し、分取・分析できるからである。固定相には疎水性相互作用、イオン性結合など分子間で相互作用する弱い親和力や分子ふるいなどを利用するものがあり、目的物質の性質を考えて選択する。一方、物質群を分離する上で親和力の調節も重要であり、溶媒や緩衝液などの移動相は物質の固定相に対する親和力の強弱を調節する役割を持つ。そこで、物質を固定相から溶出するにあたり、固定相に対する親和力がほどよくなるようにあらかじめ混合した移動相や、固定相に対して親和力が異なる2液以上の溶媒や緩衝液を装置内で比率を変えながら混合した移動相を選択するところに工夫や経験が必要である。高速液体クロマトグラフは、このように選択肢が豊富にある固定相および移動相を組み合わせることにより高い分離を達成することが可能な装置である。そこで本稿では脳科学分野で生理活性物質の分析に必要な装置（高速液体クロマトグラフ）の基本構成とグルタミン酸を始めとするアミノ酸の分析、カテコールアミンやインドールアミンとその代謝物の一斉分析などに焦点を絞り解説する。

　高速液体クロマトグラフィーとは、物質が固定相（カラムの担体）とこれに接して流れる移動相（液体）との親和力の違いから一定の比率で分布し、その比率が物質によって異なる事を利用して分離する方法である。現在では、物質の精製や分析には欠かせない存在となっている。高速液体クロマトグラフィーには、[[wikipedia:JA:イオン交換|イオン交換]]、[[wikipedia:Reversed-phase chromatography|逆相]]、[[wikipedia:High-performance_liquid_chromatography#Normal-phase_chromatography|順相]]、[[wikipedia:High-performance_liquid_chromatography#Size-exclusion_chromatography|サイズ排除]]([[ゲル濾過]])、[[wikipedia:JA:アフィニティークロマトグラフィー|アフィニティー]]など様々な方法がある<ref name=ref1> '''入江　照四''' <br />高速液体クロマトグラフ 科学機器入門[増補改訂版]<br />''東京科学機器協会'', 2010, 180-181</ref>。

　カラムは、分析する物質の性質を考慮して種類を選択しなければならない。カラムの種類には、主にイオン交換、逆相、順相、サイズ排除（ゲル濾過）そして[[wikipedia:JA:光学異性体|光学異性体]]分離カラムがある。

:　イオン交換カラムには、[[wikipedia:JA:陽イオン|陽イオン]]、[[wikipedia:JA:陰イオン|陰イオン]]、両イオン型の3つのタイプがある。これらは、[[wikipedia:JA:金属|金属]]イオン、[[wikipedia:JA:無機酸|無機酸]]、[[wikipedia:JA:アミノ酸|アミノ酸]]、[[wikipedia:JA:ペプチド|ペプチド]]やタンパク質の分析・分取に用いられる。

:　逆相カラムは、最も種類が多く様々なカラムが開発されている。特に低分子の分析に用いられることが多く神経伝達物質、誘導化したアミノ酸、医薬品、[[wikipedia:JA:ホルモン|ホルモン]]、ペプチドの分析などに用いられている。

:　サイズ排除カラムは、タンパク質を分子量ごとに分画または会合体としてモノマー、ダイマー、トリマーの分析・分取に用いられる。

　様々な検出器が開発されており[[wikipedia:ja:紫外線|紫外線]]（UV）検出器、[[蛍光]]検出器、電気化学検出器、[[質量分析器]]、蒸発光散乱検出器などが用いられている。HPLCにおいて、最も汎用的な検出器はUV 検出器であり、次いで蛍光検出器、電気化学検出器の順である。

　図3-Aに示したHPLCの構成で、アイソクラティック法を用いて脳組織のホモジネートを分析した。<br />移動相は2種類あり、移動相Aに[[wikipedia:JA:クエン酸|クエン酸]]−リン酸緩衝液 pH 5.8, 12%アセトニトリル、移動相Bにクエン酸−リン酸緩衝液 pH 6.2, 25%アセトニトリルを用い15分間で1分析を行った。スイッチングバルブは、インジェクションから1分30秒で切り替わり、12分後に元の流路に戻るセッティングをした。蛍光誘導化試薬は、OPA試薬5 mgをメタノール200 μlで溶解した後、2メルカプトエタノール5 μl、0.1 M　Na₂CO₃溶液800 μl加え、調製した。試料の前処理は、測定例（1）と同様に行い、上清を1200倍に希釈して15 μlをHPLCサンプルにした。蛍光誘導化のため、オートサンプラーのサンプルラックを12 ℃に冷却、蛍光誘導化試薬15 μl、サンプル15 μlを加え30 ℃で2分間インキュベートし、誘導体化されたサンプル10 μlをインジェクションした。

===アセチルコリンおよびコリン（電気化学検出法）===

[[ファイル:HPLC 図4_横.jpg|thumb|600px|'''図 4. (A) ドーパミンの酸化反応.　 (B) 標準物質の分析; 10-100 pg の範囲で定量性がある.　 (C) マウス線条体抽出物の分析; ドーパミン作動性ニューロンが多いことが分かる.　 (D) マウス小脳抽出物の分析; 線条体と全く異なる溶出パターンをすることが分かる.'''<br />[分析条件] 装置:エイコム社製システム（デガッサー：DG-300, ポンプ：EP-300, カラムオーブン：ATC-300, 検出器：ECD-300, EICOM), カラム : EICOMPAK SC-50DS (3.0ID &times; 150 mm, EICOM), 移動相: 83% 0.1 M 酢酸-クエン酸緩衝液(pH 3.5)/17% メタノール(190 mg/L SOS, 5 mg/L EDTA•2Na を含む), 流速:0.5 mL/min, 作用電極: グラファイト電極(WE-3G, EICOM), 印加電圧:+750 mV vs. Ag/AgCl(RE-100, EICOM), 注入量:10 μl, 温度: 25℃,<br />

===モノアミンおよびその代謝物（電気化学検出法）===

　HPLCにおける各成分の分離はアイソクラティック法で行われ、移動相に用いる有機溶媒の種類および濃度、イオンペア試薬の濃度、 pH が大きな影響を及ぼす。有機溶媒には主にメタノールおよびアセトニトリルが用いられるが、濃度を上げることでアミンとその代謝物の溶出時間は早くなり、イオンペア試薬の濃度を上げることでアミンの溶出時間のみ遅くなる。またpH を上げると、[[ジオキシフェニル酢酸]]（DOPAC）や[[ホモバニリン酸]]（HVA）など酸性の代謝物の溶出時間は早くなる。最適な印加電圧、移動相条件、カラムの種類を選択することで、脳組織中のモノアミンとその代謝物の一斉分析や、脳透析液中のドーパミンおよびセロトニンの短時間での高感度同時分析も可能である。

　[[wikipedia:jp:%E3%82%B8%E3%83%A7%E3%83%B3%E3%83%BB%E3%83%95%E3%82%A7%E3%83%B3|Fenn]]らによって質量分析のイオン化法である[[wikipedia:JA:エレクトロスプレーイオン化|エレクトロスプレーイオン化]]（ESI）法が開発されてから、HPLCの検出器として質量分析計が多様の物質測定に利用できるようになった。このシステムでは、極微量の試料を高感度に検出することが可能であり、同時に多くの物質の分子量・構造情報を得ることができるため、特に[[wikipedia:JA:プロテオミクス|プロテオミクス]]の分野で急速に発展した。しかし、[[wikipedia:JA:質量分析計|質量分析計]]を用いた物質の検出は、測定対象がイオン化することが前提であり、試料の調製やHPLC移動相の選択などに制約がある。そこで、他のHPLC検出器で得られた分析条件を用いることが難しく、新たな基礎検討を必要とすることが多い。その中、近年では内径0.075ID &times; 0.1 mm のカラムを用い、50～500 nl/min 程度の低流速で送液を行うナノフローHPLCを用いることで、ペプチドやタンパク質消化物においてはamol レベルの検出が可能となっている。脳科学の分野でも、このLC-MSを用いたプロテオーム解析が盛んに行われている。