「Förster共鳴エネルギー移動」の版間の差分

<font size="+1">[http://researchmap.jp/read0068001 上田 善文]</font><br>

DOI [[XXXX]]/XXXX　原稿受付日：2013年9月18日　原稿完成日：2013年月日<br>

{{box|text=　二つの[[wj:蛍光|蛍光]]分子がごく近接して存在する場合、一つの蛍光分子からもう一つの蛍光分子へエネルギーが移行する。これをFörster共鳴エネルギー移動（FRET）という<ref><pubmed>22352636</pubmed></ref>。FRETの効率は２つの蛍光分子の[[wj:スペクトル|スペクトル]]の重なりの大きさ、距離と角度により左右されるため、FRETを測定する事により蛍光分子間の空間配置を間接的に測定する事が可能である。特に近年の[[GFP]]ならびにその類縁タンパク質を用いた遺伝子にコードされるFRETプローブが作成され、タンパク質相互作用、生化学反応や細胞内シグナル伝達を可視化する事が出来るようになった。}}

　二つの蛍光分子がごく近接して存在する場合、一つの蛍光分子からもう一つの蛍光分子へ、エネルギーが移行する事が知られている（図1）。この現象は、1946年[[w:Theodor Förster|Theodor Förster]]によって報告されたことから、Förster共鳴エネルギー移動（FRET）という<ref>'''Förster, T.'''<br>Energiewanderung und Fluorescenz<br>''Naturwissenscaft''. 1946, 33:166–175</ref><ref><pubmed>22352636</pubmed></ref>。かつてFRETは、fluorescence resonance energy transferの略称として用いたが、実際には蛍光を伴わないエネルギー移動であることから、現在ではFörster resonance energy transferと呼ぶ事がIUPACにより推奨されている。

　''κ''はドナーとアクセプターの相互分子配向である。多くの場合、正確に求める事は困難であるため、しばしば''κ''² =2/3 と仮定される。この値は、両方の色素が自由に回転しており、励起状態の間は等方的に配向していると考えられる場合に得られる。色素が固定されている場合や自由に回転することができないような場合、''κ''² =2/3 とは仮定できない。''Q₀''はアクセプターが無い場合のドナーの蛍光[[wj:量子収率|量子収率]]、''n''は媒体の[[wj:屈折率|屈折率]]（水、25 °Cの場合、1.3342）、''N_A''は[[wj:アボガドロ数|アボガドロ数]]である。これらの定数を当てはめると、''κ''より前の部分は、8.786 x 10¹¹ mol L^-1 cm nm²となる<ref><pubmed> 10964438</pubmed>但しこの論文にはミスプリが有り、p. 439で''κ''² とすべき所を、''κ''としている。</ref>。

　この原理は、FRETプローブの最も初期に導入されたデザインである(図5A)。プロテアーゼによって分解される配列の両端にドナーとアクセプターを連結する。プロテアーゼによって、この配列が分解されるとドナーとアクセプターの間に起きていたFRETが解消されることによって、プロテアーゼの活性を評価する。例として、[[wj:第X因子|第X因子]]、[[wikipedia:ja:カスパーゼ|カスパーゼ]]などの[[wikipedia:ja:プロテアーゼ|プロテアーゼ]]活性のプローブが挙げられる<ref><pubmed>8707050</pubmed></ref><ref><pubmed>9518501</pubmed></ref><ref><pubmed>12409609</pubmed></ref><ref><pubmed>21637712</pubmed></ref><ref><pubmed>17946841</pubmed></ref>。このプローブのデザインの短所としては、反応が不可逆的であるために、一つの実験系で何度も測定することが困難であることである。

　また、タンパク質相互作用はポリマーでも良い。これを利用して[[アクチン]]の重合状態の測定にも用いられた<ref name=ref15361876><pubmed>15361876</pubmed></ref>(図5C)。

　興味のあるタンパク質が、活性化の際に構造変化を誘起することが知られている場合には構造変化を利用することができる(図5D)。タンパク質のC末およびN末にドナーおよびアクセプターを連結する。あるいは構造変化が起こすドメインの方が、FRETは起こりやすい可能性もある。この手法は、[[CaMKII]]<ref><pubmed>15788767</pubmed></ref>、[[カルシニューリン]]<ref><pubmed>18493642</pubmed></ref>、[[raf]]<ref><pubmed>15711535</pubmed></ref><ref><pubmed>16858395</pubmed></ref>、[[膜電位]]測定<ref><pubmed>18622396</pubmed></ref>、などに用いられている。

　例えば[[カルシウム]]FRETプローブ、カメレオンはこの原理を利用している<ref><pubmed>9278050</pubmed></ref>。 この場合、ドナー、[[カルモジュリン]]、カルモジュリン結合配列であるM13ペプチド、アクセプターを１つの分子に融合する。カルモジュリンがCa²⁺と結合すると、M13ペプチドと結合し、蛍光強度が変化する。

　また、[[低分子量Gタンパク質]]の活性化プローブは、低分子量Gタンパク質、シグナル伝達下流の結合タンパク質の結合ドメインをドナーとアクセプターで挟んだ形状をしている(図5E)。低分子Gタンパク質が[[GDP]]から[[GTP]]結合型になり活性化すると、結合ドメインと相互作用によりFRETが生じる<ref><pubmed>16429133</pubmed></ref>。

　このプローブは、[[キナーゼ]]の活性化を測定するために使用される<ref><pubmed>11875431</pubmed></ref><ref><pubmed>11752449</pubmed></ref>。この場合、キナーゼの基質となるタンパク質に[[14-3-3タンパク質]]のような[[リン酸化]]タンパク質を認識するドメインを融合し、その結合に伴うタンパク質構造変化を、両端に結合させたドナーとアクセプター間のFRETで測定する。

　このプローブは、主に、[[wj:脂質|脂質]]分子に応用されてきた(図5G)。ドナー、脂質結合ドメイン、アクセプターがヘリックス構造で連結され、[[グリシン]]-グリシン配列をその途中に導入することで、そこを中心に一方の蛍光タンパク質が回転することができる。膜結合ドメインを用いて、プローブを結合させる。脂質分子が増えた際に、脂質結合ドメインが脂質分子を認識し、構造変化が起き、ドナーとアクセプターの距離が縮まりFRETが生じる。[[ジアシルグリセロール]]<ref><pubmed>16990811</pubmed></ref>、[[ホスファチジルイノシトール|イノシトールリン脂質]]群<ref><pubmed>14528311</pubmed></ref><ref><pubmed>18685081</pubmed></ref><ref><pubmed>18685081</pubmed></ref><ref><pubmed>18685081</pubmed></ref>を測定するために用いられている。

|rowspan="21" | 生体内小分子|| [[カルシウム]] ||Cameleon|| 1997 || E || <ref><pubmed>9278050</pubmed></ref>

|[[サイクリックGMP]] ([[cGMP]]) ||CGY, Cygnet, pGES-DE2, cGi|| 2000, 2001, 2006 ||D || <ref><pubmed>11140757</pubmed></ref><ref><pubmed>11226257</pubmed></ref><ref><pubmed>16369548</pubmed></ref><ref><pubmed>23801067</pubmed></ref>   

|rowspan="25" | タンパク質リン酸化酵素 || [[カルシウム/カルモジュリン依存性タンパク質リン酸化酵素II]] ([[CaMKII]]) ||Camui α, green-Camui α, Camk2a reporter|| 2005, 2009, 2011, 2013 || D || <ref><pubmed>15788767</pubmed></ref><ref><pubmed> 19295602</pubmed></ref><ref name=ref23602566><pubmed> 23602566</pubmed></ref><ref name=ref21506563><pubmed> 21506563</pubmed></ref>

| [[Src]] ||Srcus|| 2005, 2005, 2007 || F || <ref name=ref11752449><pubmed>11752449</pubmed></ref><ref><pubmed> 15846350</pubmed></ref><ref><pubmed> 17284441</pubmed></ref>

| [[Abl]] ||Picchu|| 2001 || F || <ref name=ref11752449 />

| [[c-Raf]] ||Prin-cRaf|| 2005 || D || <ref><pubmed>15711535</pubmed></ref>

| [[B-raf]] ||Prin-Braf|| 2006 || D || <ref><pubmed>16858395</pubmed></ref>

| [[インシュリン受容体]] ||Phocus|| 2002 || F || <ref><pubmed>11875431</pubmed></ref>

| [[上皮成長因子受容体]] ([[EGFR]]) || ||2001 || F || <ref name=ref11752449 />

| [[細胞死関連タンパク質キナーゼ]] ([[death associated protein kinase 1]], [[DAPK1]]) ||DAPK1(334)-F40|| 2011 || D || <ref name=ref21506563 />

| [[ホスファターゼ]] || [[カルシニューリン]] ||CaNAR1|| 2008, 2013 || D || <ref name=ref23602566 /><ref><pubmed> 18493642</pubmed></ref>

|rowspan="8" | [[低分子量Gタンパク質]] || [[Ras]] ||Raichu-Ras, Fras|| 2001, 2006 || B, E || <ref><pubmed>16429133</pubmed></ref><ref name=ref11429608><pubmed> 11429608</pubmed></ref>

| [[Rab5]] ||Raichu-Rab5|| 2008 || E || <ref><pubmed>18385674</pubmed></ref>

| [[Rho]] ||Raichu-RhoA|| 2003, 2011 || B, E || <ref name=ref21423166><pubmed>21423166</pubmed></ref><ref><pubmed> 12860967</pubmed></ref>

|rowspan="6" | [[脂質]] || [[ホスファチジルイノシトール-3,4,5-三リン酸]] ([[PIP3|PIP₃]]) ||Fllip, FLIMPA|| 2003 || G || <ref><pubmed>14528311</pubmed></ref>

| [[ホスファチジルイノシトール-4,5-二リン酸]] ([[PIP2|PI(4,5)P₂]]) ||Pippi-PI(4,5)P₂|| 2008 || G || <ref name=ref18685081><pubmed>18685081</pubmed></ref>

| [[ジアシルグリセロール]] (DAG) ||Daglas, DIGDA|| 2006, 2008 || G || <ref name=ref18685081 /><ref><pubmed> 16990811</pubmed></ref>

|rowspan="6" | タンパク質相互作用 || [[アクチン]] || ||2004, 2008 || C || <ref><pubmed>15361876</pubmed></ref><ref><pubmed> 18512154</pubmed></ref>

|rowspan="8" | [[プロテアーゼ]] || [[カスパーゼ-3]] ||EGFP-DEVD-EBFP|| 1998 || A || <ref><pubmed>9518501</pubmed></ref>

| [[カスパーゼ-8]] ||CFP-c3-YFP-c6-mRFP|| 2002 || A || <ref><pubmed>12409609</pubmed></ref>

| [[カスパーゼ-9]] ||SCAT9|| 2011 || A || <ref><pubmed>21637712</pubmed></ref>

| [[カスパーゼ-7]] ||VDEVDc|| 2006 || A || <ref><pubmed>17946841</pubmed></ref>

| [[wj:第Xa因子|第Xa因子]] || ||1996 || A || <ref><pubmed>8707050</pubmed></ref>

| [[膜電位]] ||VSFP, Mermaid, ArcLight, VSFP-Butterfly|| 2001, 2008, 2012 || D || <ref><pubmed>11454036</pubmed></ref><ref><pubmed> 18622396</pubmed></ref><ref><pubmed> 22958819</pubmed></ref><ref><pubmed> 23868559</pubmed></ref>

　蛍光強度比イメージングの場合は、GFPの色彩変異体であるシアン色蛍光タンパク質CFPと黄色蛍光タンパク質YFPのFRETペアがよく用いられている。CFPの中でも、Ceruleanが明るい蛍光を示すためこれを用いるべきである。YFPの変異体の中では、Venus、Ypetがよい。いずれも若干の凝集傾向が有り、これはタンパク質表面にある三つのアラニン残基のメチル基によるものとされており、それを変異させたmonomeric GFP (A206K変異体)で凝集を避ける事が出来る<ref name=ref11988576><pubmed>11988576</pubmed></ref><ref name=ref18512154><pubmed>18512154</pubmed></ref>。一方で、プロテアーゼプローブなどでは、FRETダイナミックレンジが改善するという報告もある<ref name=ref15696158><pubmed>15696158</pubmed></ref>

　一方、蛍光寿命イメージングとしてはドナーとしてmGFP、アクセプターとしてmRFPもしくはmCherryが用いられる。この場合、アクセプターの蛍光強度は問題ではないので蛍光を発しないREACh, darkVenus, superREAChなども用いられる<ref name=ref16537489><pubmed>16537489</pubmed></ref><ref name=ref18512154><pubmed>18512154</pubmed></ref><ref name=ref18302935><pubmed>18302935</pubmed></ref>。

　しかし、最近intrabodyなどと呼ばれる希望するタンパク質と特異的に結合するタンパク質配列をデザインする方法が開発されつつある<ref name=ref23836932 ><pubmed> 23836932 </pubmed></ref>

<ref name=ref23791193><pubmed> 23791193 </pubmed></ref><ref name=ref24005308 ><pubmed> 24005308 </pubmed></ref>。これを用いると、任意の分子に結合する、抗体よりも小型で、かつ遺伝子によってコードされる蛍光ラベルが可能となるであろう。このような方法を用いる事により、GFP融合タンパクによらない、内在性のタンパク質の相互作用を検出できる可能性がある。

　1997年、宮脇らによって、CFPおよびYFPを利用した、細胞内[[カルシウム]] プローブ、カメレオンが開発され<ref><pubmed>9278050</pubmed></ref>、さらに、cAMP<ref><pubmed>10620803</pubmed></ref>, cGMP<ref><pubmed>11140757</pubmed></ref>、 リン酸化<ref><pubmed>11752449</pubmed></ref>を初めとした主要な細胞内シグナル伝達分子のFRETプローブが次々と作製され、分子のリアルタイムな活性および局在の活性の解明に大きく貢献した。  

　2000年初期に記憶の形成に必須なシグナル分子、Ca²⁺/カルモデュリン依存性タンパク質キナーゼII (CaMKII)の活性化を評価するためのFRETプローブ、 Camuiが開発された<ref><pubmed>15788767</pubmed></ref>。CaMKIIはそれまでは、一旦活性化されたらその活性が自己リン酸化により持続する事で、長期に亘る記憶に必要なシナプス反応の増強を維持すると考えられてきたが、実際にはCaMKIIの活性化は一過性である事が示された<ref name=ref19295602><pubmed>19295602</pubmed></ref>。

　一方、[[樹状突起]][[スパイン]]）の形態を制御する[[アクチン]]の重合を可視化するためのFRETプローブが開発され、アクチンの重合が長期増強現象に伴い引き起こされる事、またそれが長期間維持される事が示された<ref><pubmed>15361876</pubmed></ref>。その調節の上流にある[[Rho族低分子量Gタンパク質]][[Cdc42]]、[[RhoA]]の活性も同様に維持される事が判った <ref><pubmed>19295602</pubmed></ref><ref><pubmed>18556515</pubmed></ref><ref><pubmed>21423166</pubmed></ref>。  

　個体においてもFRET測定法が導入されている。神経回路ネットワークにおける[[シナプス]]の役割を解明する目的で、[[フェレット]]の[[大脳皮質]][[視覚野]]にCaMKIIプローブを発現し、[[片眼剥奪]]によって、神経回路ネットワークに変化を起こした時のCaMKIIの活性化の変化を観測している<ref><pubmed>22160721</pubmed></ref>。また、神経活動をモニターする膜電位プローブを開発し[[マウス]]の[[洞毛]]刺激の投射先である[[体性感覚野]][[バレル皮質]]での入力特異的な神経の活性化を観察している<ref><pubmed>20622860</pubmed></ref>。

　Homo-FRETも応用されている。CaMKIIは12量体を形成しているが、異方性の変化を基に、その構造中に二量体の単位が存在し、活性化に伴う二量体同士の位置関係が変化することが明らかにされている<ref><pubmed>19339497</pubmed></ref>。