「Förster共鳴エネルギー移動」の版間の差分

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=== ドナーとアクセプターの蛍光強度比を測定する方法  ===
=== ドナーとアクセプターの蛍光強度比を測定する方法  ===
ドナーおよびアクセプターの蛍光を取得後、ドナーとアクセプターの蛍光強度比が計算される。FRETが起きると、ドナーの蛍光強度が減少し、アクセプターの蛍光強度が増加する。現在、最も広く使用されている手法である。データを取得、解釈する際に注意しなければいけないポイントがある。
ドナーおよびアクセプターの蛍光を取得後、ドナーとアクセプターの蛍光強度比が計算される。FRETが起きると、ドナーの蛍光強度が減少し、アクセプターの蛍光強度が増加する。現在、最も広く使用されている手法であるが、データを取得、解釈する際に注意しなければいけないポイントがある。
まず、ドナーの蛍光のアクセプターチャンネルへの漏れ込みである。これによって、SN比の減少の原因となる。改善点としては漏れ込みを極力抑える適切なバンドパスフィルターを用いることである。次に、ドナーおよびアクセプターのバックグラウンドは、FRET変化に影響を与えるため、サブトラクションすることで、より正しいFRET効率が得られる。次に、2分子間FRETで起きることであるが、ドナーとアクセプターの局在の違いは疑似FRETを生じる。リンカーで連結し1分子にすること、局在しているアクセプターの蛍光強度を計算することで修正することが可能である。
まず、ドナーの蛍光のアクセプターチャンネルへの漏れ込みである。これによって、SN比の減少の原因となる。改善点としては漏れ込みを極力抑える適切なバンドパスフィルターを用いることである。次に、ドナーおよびアクセプターのバックグラウンドは、FRET変化に影響を与えるため、サブトラクションすることで、より正しいFRET効率が得られる。次に、2分子間FRETで起きることであるが、ドナーとアクセプターの局在の違いは疑似FRETを生じる。リンカーで連結し1分子にすること、局在しているアクセプターの蛍光強度を計算することで修正することが可能である。


 
=== アクセプターブリーチング法 ===
測定の際には蛍光強度の変化を測定することになるが、細胞などの試料においては、細胞の形状変化に伴う蛍光強度変化などが起きることから、実際にはドナーとアクセプターの蛍光強度の変化を取得することによって、これらのファクターを除外する。
適切な波長によって、アクセプターを退色させることでFRETを解消することができる。この解消度合いよりFRET効率を算出する。この手法は不可逆的であるために経時的変化を追うことは困難である。


=== ドナーの蛍光寿命を測定する方法  ===
=== ドナーの蛍光寿命を測定する方法  ===
近年、データ処理速度の向上により、メガヘルツオーダーのパルス励起光によって励起された一つ一つの光子を、迅速に検出する時間相関単一光子計数法が発展してきた。励起光によって発生した一つ一つの光子の発生時間の確率分布が減衰曲線を形成するため、蛍光寿命を得ることができる。蛍光寿命は、蛍光の減衰曲線の速度定数<math>k \ </math>と逆数の関係にある。 蛍光寿命は、GFPは2.5nsec、その色彩変異体,黄色蛍光タンパク質YFPでは2.9nsec、mCherryでは1.5nsecの値を取る。FRETが起きるとドナーの蛍光寿命が減少する(図4)。Double exponetial fittingによって、FRETの起きている割合が算出できる。蛍光寿命は、蛍光強度比測定法に比べて、蛍光の漏れ込み、アクセプターとの局在の違いなどによって生じる疑似FRETを回避できる。FRETデータ取得において、より理想的であると考えられる。


近年、データ処理速度の向上により、メガヘルツオーダーのパルス励起光によって励起された一つ一つの光子を、迅速に検出する時間相関単一光子計数法が発展してきた。励起光によって発生した一つ一つの光子の発生時間の確率分布が減衰曲線を形成するため、蛍光寿命を得ることができる。蛍光寿命は、蛍光の減衰曲線の速度定数<math>k \ </math>と逆数の関係にある。 蛍光寿命は、GFPは2.5nsec、その色彩変異体,黄色蛍光タンパク質YFPでは2.9nsec、mCherryでは1.5nsecの値を取る。FRETが起きるとドナーの蛍光寿命が減少する(図4)。これを基にタンパク質の活性化、相互作用を観察する。


=== 異方性を測定する方法  ===
=== 異方性を測定する方法  ===
一つの蛍光団のストークスシフトが小さい場合、励起スペクトルと蛍光スペクトルの重なりが大きい。このような蛍光団では、同一の蛍光団同士で、Homo-FRETが生じる。Homo-FRETは、蛍光強度および蛍光寿命は変化しないが、異方性が変わる。この原理を用いて、一般的には、分子同士のクラスターの度合いなどに応用されている。  
一つの蛍光団のストークスシフトが小さい場合、励起スペクトルと蛍光スペクトルの重なりが大きい。このような蛍光団では、同一の蛍光団同士で、Homo-FRETが生じる。Homo-FRETは、蛍光強度および蛍光寿命は変化しないが、異方性が変わる。この原理を用いて、一般的には、分子同士のクラスターの度合いなどに応用されている。  


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== プローブのデザイン ==
神経科学分野を始めとして、様々な細胞生物学の分野において、様々なFRETプローブが使用されている。これらのプローブを分類すると、以下のように分類される。
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1.プローブの分解に伴うFRETの変化を検出するプローブ
この原理は、FRETプローブの最も初期に導入されたデザインである。例として、Factor Xなどのプロテアーゼによって分解される配列の両端にドナーとアクセプターを連結する。プロテアーゼによって、この配列が分解されるとドナーとアクセプターの間に起きていたFRETが解消されることによって、プロテアーゼの活性を評価する。カスパーゼなどの活性を測定するためにも使用されている。このプローブのデザインの短所としては、反応が不可逆的であるために、一つの実験系で何度も測定することが困難であることである。
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2.2分子間相互作用を利用したFRETプローブ
興味のあるタンパク質同士の相互作用を測定する際に、この原理が用いられる。一方にドナー、他方にアクセプターを連結する。タンパク質同士が結合していないときにはFRETは起きていないが、結合することによってFRETを生じる。応用例としては蛍光寿命を基にしたGタンパク質の活性化の測定に用いられている。また、アクチンの重合度を測定するために、アクチンにドナー、アクセプターを連結して測定している例もある。距離のファクターを生かせるために、比較的大きなシグナルが得られる一方、内在性のタンパク質が反応に参加するために、その分FRET応答が減少する。ドナーとアクセプターの発現量の差によるFRETの応答の変化も問題になる。特に、アクセプターと結合しないドナーが多量に存在するとFRET応答が小さくなる。一般にアクセプターが多い系が、使用に適している。
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3.一分子内FRETプローブ
この原理は、一分子内にドナーとアクセプターを連結し、これらの配向および距離の変化を利用する。2分子間FRETに生じるような発現量の違いやドナーとアクセプターの局在の変化によって生じるアーチファクトなどを考慮する必要がない。さらに活性に伴うタンパク質の構造変化などを利用するために、比較的容易に応答するプローブが作製できるが、ドナーとアクセプターを適切な位置に配置するなどの検討が必要である。
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3-1.タンパク質の構造変化を基にしたFRETプローブ
興味のあるタンパク質が、活性化の際に構造変化を誘起することが知られている場合には構造変化を利用することができる。タンパク質のC末およびN末にドナーおよびアクセプターを連結する。この手法は、CaMKII、Calcinulin, raf, 膜電位測定などに用いられている。
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3-2.タンパク質結合に伴う構造変化を基にしたFRETプローブ
ある種のタンパク質は活性化、非活性化に伴い、下流のタンパク質と結合する。このような相互作用を利用してタンパク質の活性化、非活性化を測定することができる。低分子G-proteinの活性化を測定するためにも用いられている。カルシウムFRETプローブ、カメレオンはこの原理を利用している。また、G-proteinの活性化プローブは、ドナー、アクセプター、G-protein、シグナル伝達下流の結合タンパク質の結合ドメインからなる。G-proteinがGDPからGTP結合型になり活性化すると、結合ドメインと相互作用をしFRETが生じる。
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3-3. 共有結合修飾によって生じる構造変化を測定するプローブ
このプローブは、ドナー、アクセプター、共有結合修飾を受けるドメイン、これを認識するドメインからなる。プローブが共有結合修飾を受けると、認識するドメインが結合し、ドナーとアクセプターの距離が縮まりFRETが起きる。このプローブは、キナーゼおよびホスファターゼの活性化を測定するために使用される。
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3-4.生体膜上の小分子を測定するFRETプローブ
このプローブは、主に、脂質分子に応用されてきた。ドナー、脂質結合ドメイン、アクセプターが堅いヘリックス構造で連結され、グリシングリシン配列をその途中に導入することで、そこを中心に一方の蛍光タンパク質が回転することができる。膜結合ドメインを用いて、プローブを結合させる。脂質分子が増えた際に、脂質結合ドメインが脂質分子を認識し、構造変化が起き、ドナートアクセプターの距離が縮まりFRETが生じる。ジアシルグリセロール、イノシトールリン脂質群を測定するために用いられている。
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2013年9月16日 (月) 19:58時点における版

フェルスター共鳴エネルギー移動(FRET) 英:Förster resonance energy transfer 英略称:FRET、独:Förster-Resonanzenergietransfer 仏:transfert d'énergie entre molécules fluorescentes


FRETは、1946年、Theodor Försterによって報告され、ドナーとなる蛍光体の蛍光スペクトルとアクセプターとなる蛍光体の励起スペクトルに重なりがあるときに、ドナーからアクセプターへのエネルギー移動が起きる現象である[1]。蛍光を伴わないエネルギー移動であることから、FRETは、一般的にFluorescence resonance energy transferとして用いられるがFörster resonance energy transferが正しい。緑色蛍光タンパク質(Green fluorescent protein:GFP)の改良に伴うバイオイメージングの発展によって、FRETを基にした細胞内シグナル伝達分子の可視化検出に用いられ、脳神経研究においても、神経細胞、脳スライスなどの組織および個体レベルで応用されている。


図1:蛍光体が蛍光を発する過程を示したヤブロンスキーダイヤグラム。青色で示した励起光によって、蛍光体の電子が励起状態に到達する。励起された電子は、回転および振動エネルギーを失いながら励起状態の最低準位に行き着く。この電子は緑色で示した蛍光を発して励起状態から基底状態に戻る。実際は、最低準位に行き着く前に基底状態に戻ることもあり、これが蛍光波長の幅に反映される。
図2:励起光によって励起された電子が基底状態に戻る際の減衰曲線。緑の太い線がFRETが起きていない時の減衰曲線。FRETの速度定数が加わることにより速度定数が大きくなり細い緑の線のように減衰曲線の傾斜が大きくなる。
図3:ドナーの蛍光スペクトルとアクセプターの励起スペクトルに重なりがあるときに、FRETが起きる。黒破線で囲まれたスペクトルは、励起スペクトルを示す。緑色のタンパク質がドナー、赤色タンパク質がアクセプターを示す。
図4:海馬スライスCA1錐体細胞に発現させたGFPのFLIMイメージおよび減衰曲線(横軸は時間、縦軸は光子数)をBecker&Hickl社software、SPC imageにて取得した。実際には、20秒で数千個オーダーの光子を取得する。これらの光子の発生確率分布が減衰曲線を形成し、近似曲線をフィッティングさせることで蛍光寿命を取得する。


原理

図1のヤブロンスキーダイヤグラムのように、ドナーの蛍光団の電子が、励起光により基底状態から励起状態に励起される。励起された電子は、回転エネルギーや振動エネルギーを失いながら、励起状態の底まで行き着く。その後、基底状態に戻る際に、蛍光としてエネルギーを放出する。蛍光の減衰曲線は、速度定数をとして、図2のように表すことができる。は励起光によって励起された電子の数、は励起状態にある電子が基底状態に戻る速度定数であり、蛍光として基底状態に戻る際の速度定数、熱を発して基底状態に戻るなどの無放射遷移の速度定数の和として表される。今、ドナーの近傍(数nmオーダー)に、ドナーの蛍光スペクトルと重なる励起スペクトルを持ったアクセプターが存在すると、FRETが起きる(図3)。FRETによって電子が起きる速度をとすると、ドナーの励起された電子が基底状態に戻る速度定数はとなり、蛍光寿命の減少、ドナーの蛍光強度の減少、アクセプターの蛍光の増加などが観察される。
FRETの速度定数は、以下の式で規定される。



ここで、はドナーの蛍光の速度定数、はドナーの蛍光の量子収率、はドナーとアクセプターの双極子モーメントの配向、はドナーとアクセプターの距離、はアボガドロ数、は溶媒の屈折率、は規格化したドナーの発光強度、はアクセプターのモル吸光係数。


実際に、変数となりうるのは以下の性質である。
1.距離。式が示すように距離の6乗に反比例する。FRET効率が50%になるときの距離を、フェルスター距離(Förster distance)という。
2.ドナーの蛍光の遷移双極子モーメントとアクセプターの励起光の遷移双極子モーメントの配向。フルオレセインなど、等方的に蛍光の放射が起きる場合には、=であるが、GFPをはじめとした配向の定まった蛍光タンパク質などは各々の値を取る。


検出


ドナーとアクセプターの蛍光強度比を測定する方法

ドナーおよびアクセプターの蛍光を取得後、ドナーとアクセプターの蛍光強度比が計算される。FRETが起きると、ドナーの蛍光強度が減少し、アクセプターの蛍光強度が増加する。現在、最も広く使用されている手法であるが、データを取得、解釈する際に注意しなければいけないポイントがある。 まず、ドナーの蛍光のアクセプターチャンネルへの漏れ込みである。これによって、SN比の減少の原因となる。改善点としては漏れ込みを極力抑える適切なバンドパスフィルターを用いることである。次に、ドナーおよびアクセプターのバックグラウンドは、FRET変化に影響を与えるため、サブトラクションすることで、より正しいFRET効率が得られる。次に、2分子間FRETで起きることであるが、ドナーとアクセプターの局在の違いは疑似FRETを生じる。リンカーで連結し1分子にすること、局在しているアクセプターの蛍光強度を計算することで修正することが可能である。

アクセプターブリーチング法

適切な波長によって、アクセプターを退色させることでFRETを解消することができる。この解消度合いよりFRET効率を算出する。この手法は不可逆的であるために経時的変化を追うことは困難である。

ドナーの蛍光寿命を測定する方法

近年、データ処理速度の向上により、メガヘルツオーダーのパルス励起光によって励起された一つ一つの光子を、迅速に検出する時間相関単一光子計数法が発展してきた。励起光によって発生した一つ一つの光子の発生時間の確率分布が減衰曲線を形成するため、蛍光寿命を得ることができる。蛍光寿命は、蛍光の減衰曲線の速度定数と逆数の関係にある。 蛍光寿命は、GFPは2.5nsec、その色彩変異体,黄色蛍光タンパク質YFPでは2.9nsec、mCherryでは1.5nsecの値を取る。FRETが起きるとドナーの蛍光寿命が減少する(図4)。Double exponetial fittingによって、FRETの起きている割合が算出できる。蛍光寿命は、蛍光強度比測定法に比べて、蛍光の漏れ込み、アクセプターとの局在の違いなどによって生じる疑似FRETを回避できる。FRETデータ取得において、より理想的であると考えられる。


異方性を測定する方法

一つの蛍光団のストークスシフトが小さい場合、励起スペクトルと蛍光スペクトルの重なりが大きい。このような蛍光団では、同一の蛍光団同士で、Homo-FRETが生じる。Homo-FRETは、蛍光強度および蛍光寿命は変化しないが、異方性が変わる。この原理を用いて、一般的には、分子同士のクラスターの度合いなどに応用されている。



プローブのデザイン

神経科学分野を始めとして、様々な細胞生物学の分野において、様々なFRETプローブが使用されている。これらのプローブを分類すると、以下のように分類される。
1.プローブの分解に伴うFRETの変化を検出するプローブ この原理は、FRETプローブの最も初期に導入されたデザインである。例として、Factor Xなどのプロテアーゼによって分解される配列の両端にドナーとアクセプターを連結する。プロテアーゼによって、この配列が分解されるとドナーとアクセプターの間に起きていたFRETが解消されることによって、プロテアーゼの活性を評価する。カスパーゼなどの活性を測定するためにも使用されている。このプローブのデザインの短所としては、反応が不可逆的であるために、一つの実験系で何度も測定することが困難であることである。
2.2分子間相互作用を利用したFRETプローブ 興味のあるタンパク質同士の相互作用を測定する際に、この原理が用いられる。一方にドナー、他方にアクセプターを連結する。タンパク質同士が結合していないときにはFRETは起きていないが、結合することによってFRETを生じる。応用例としては蛍光寿命を基にしたGタンパク質の活性化の測定に用いられている。また、アクチンの重合度を測定するために、アクチンにドナー、アクセプターを連結して測定している例もある。距離のファクターを生かせるために、比較的大きなシグナルが得られる一方、内在性のタンパク質が反応に参加するために、その分FRET応答が減少する。ドナーとアクセプターの発現量の差によるFRETの応答の変化も問題になる。特に、アクセプターと結合しないドナーが多量に存在するとFRET応答が小さくなる。一般にアクセプターが多い系が、使用に適している。
3.一分子内FRETプローブ この原理は、一分子内にドナーとアクセプターを連結し、これらの配向および距離の変化を利用する。2分子間FRETに生じるような発現量の違いやドナーとアクセプターの局在の変化によって生じるアーチファクトなどを考慮する必要がない。さらに活性に伴うタンパク質の構造変化などを利用するために、比較的容易に応答するプローブが作製できるが、ドナーとアクセプターを適切な位置に配置するなどの検討が必要である。
3-1.タンパク質の構造変化を基にしたFRETプローブ 興味のあるタンパク質が、活性化の際に構造変化を誘起することが知られている場合には構造変化を利用することができる。タンパク質のC末およびN末にドナーおよびアクセプターを連結する。この手法は、CaMKII、Calcinulin, raf, 膜電位測定などに用いられている。
3-2.タンパク質結合に伴う構造変化を基にしたFRETプローブ ある種のタンパク質は活性化、非活性化に伴い、下流のタンパク質と結合する。このような相互作用を利用してタンパク質の活性化、非活性化を測定することができる。低分子G-proteinの活性化を測定するためにも用いられている。カルシウムFRETプローブ、カメレオンはこの原理を利用している。また、G-proteinの活性化プローブは、ドナー、アクセプター、G-protein、シグナル伝達下流の結合タンパク質の結合ドメインからなる。G-proteinがGDPからGTP結合型になり活性化すると、結合ドメインと相互作用をしFRETが生じる。
3-3. 共有結合修飾によって生じる構造変化を測定するプローブ このプローブは、ドナー、アクセプター、共有結合修飾を受けるドメイン、これを認識するドメインからなる。プローブが共有結合修飾を受けると、認識するドメインが結合し、ドナーとアクセプターの距離が縮まりFRETが起きる。このプローブは、キナーゼおよびホスファターゼの活性化を測定するために使用される。
3-4.生体膜上の小分子を測定するFRETプローブ このプローブは、主に、脂質分子に応用されてきた。ドナー、脂質結合ドメイン、アクセプターが堅いヘリックス構造で連結され、グリシングリシン配列をその途中に導入することで、そこを中心に一方の蛍光タンパク質が回転することができる。膜結合ドメインを用いて、プローブを結合させる。脂質分子が増えた際に、脂質結合ドメインが脂質分子を認識し、構造変化が起き、ドナートアクセプターの距離が縮まりFRETが生じる。ジアシルグリセロール、イノシトールリン脂質群を測定するために用いられている。



神経科学分野への応用


1992年、GFPのクローニングにより[2]、生きた細胞において、細胞内のオルガネラ、タンパク質などの蛍光標識が容易になった。青色蛍光タンパク質CFP、YFPなどの色彩変異体の開発も進み、FRETプローブを作製する土壌ができあがった。 1997年、宮脇、Tsienらによって、CFPおよびYFPを利用した、Calcium indicator, Cameleonが開発され[3]、さらに、cAMP[4], cGMP[5], リン酸化[6]を初めとした主要な細胞内シグナル伝達分子のFRETプローブが次々と作製され、分子のリアルタイムな活性および局在のの活性の解明に大きく貢献した。

脳神経分野においては、林らが、2000年初期に記憶の形成に必須なシグナル分子、カルシウムカルモデュリンキナーゼII (CaMKII)の活性化を評価するためのFRETプローブ開発し分散培養系にてCaMkIIの可視化に成功した[7]。1990年代後半、Svobodaらによって、2光子顕微鏡が脳神経科学に導入され、神経回路ネットワークを保持したスライスおよび個体の生きた脳の神経活動を観察可能になった。林らは、神経細胞の連結部位、シナプスのシナプス後膜(スパイン)において、その形態を制御するactinの重合を可視化するためのFRETプローブを開発した[8]。一方、脳のスライスにおいては、波長依存的な蛍光の吸収が生じるため、ドナーとアクセプターの2波長を測定する蛍光強度比を測定するよりも、蛍光の散乱、吸収によって変化しない蛍光寿命測定法が導入された。安田、Svobodaらは、蛍光寿命測定を基に、スパインの構造的変化を誘導する低分子量Gタンパク質(Ras,cdc42,RhoA)などのシグナル伝達分子の活性化の変化を観察することに成功している[9][10][11]

個体においてもFRET測定法が導入されている。神経回路ネットワークにおけるシナプスの役割を解明する目的で、フェレットの大脳皮質視覚野にCaMKIIプローブを発現し、片眼剥奪によって、神経回路ネットワークに変化を起こした時のCaMKIIの活性化の変化を観測している[12]。また、神経活動をモニターする目的で、Knöpfelらは、膜電位プローブを開発しマウスのヒゲ刺激の入力先である体性感覚野barrel cortexでの入力特異的な神経の活性化を観察している[13]

病態との関係では、神経細胞内のカルシウム濃度を測定するために、オレゴングリーンの蛍光寿命の変化から、カルシウム濃度を測定し、アストロサイトでのカルシウム濃度が、アルツハイマー様マウスと正常マウスで違うことが報告されている[14]

Homo-FRETも応用されている。CaMKIIは12量体を形成しているが、異方性の変化を基に、その構造中にdimerの単位が存在し、活性化に伴うdimer同士の位置関係が変化することをVogelらが明らかにしている[15]


将来展望

脳研究は、生きたままの状態の脳の神経細胞の活動を、広範囲で、より深部で観察したり、逆に神経細胞内の超微細構造を観察する方向に移るであろう。現在、FRETを基にしたin vivoイメージングは、応答の低さ、蛍光の弱さなどの難点はあるものの、蛍光タンパク質の蛍光強度や顕微鏡の性能の改良は日進月歩であり改善されていくであろう。また、神経活動に必要なシグナル伝達を同時に観察するために、マルチカラーイメージングの試みもなされるであろう。その際には、2つの波長を必要とする蛍光強度比変化を基にするFRET測定よりも、蛍光寿命を観察するFLIM測定が適している。



参考文献

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    Energy migration and fluorescence. 1946. Journal of biomedical optics, 17(1), 011002. [PubMed:22352636] [WorldCat] [DOI]
  2. Prasher, D.C., Eckenrode, V.K., Ward, W.W., Prendergast, F.G., & Cormier, M.J. (1992).
    Primary structure of the Aequorea victoria green-fluorescent protein. Gene, 111(2), 229-33. [PubMed:1347277] [WorldCat] [DOI]
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