「FM1-43」の版間の差分

[[Image:Takahashinoriko fig 1.jpg|thumb|250px|'''図1．（タイトル：FM 色素による還流と細胞膜の蛍光標識）'''　説明：FM 色素液で細胞を還流すると細胞外膜が蛍光を発する。]] 　Molecular Probe 社の Fei Mao は William J Betz らとともに、細胞膜を染める一連のスチリル色素を合成した。これらを FM (Fei Mao)色素と呼び、FM1-43 はその代表格である。[[シナプス前終末]]の機能解析や、分泌小胞の動態解析に広く用いられる。

[[Image:Takahashinoriko fig 2.jpg|thumb|250px|'''図2．（タイトル：FM 色素群の分子構造）'''　説明：二重結合の数は色調に、炭素鎖の数は細胞膜との親和性や蛍光強度に関連する]] 　構造は、[[wikipedia:ja:親水性|親水性]]領域、[[wikipedia:ja:二重結合|二重結合]]領域、[[wikipedia:ja:疎水性|疎水性]]炭素鎖領域に分けられる。  

　疎水性炭素鎖の長さは細胞膜の染め方に関連し、長いものほど明るく、一旦膜に組み込まれると離脱しがたい<ref><pubmed> 10202529 </pubmed></ref>。 FM1-43 の炭素鎖数は4であり、解離時定数τ_dissは8 msを示す。より短いFM2-10(炭素鎖数 2)は、比較的離脱しやすい(τ_diss=6.4 ms)。逆に、より長い FM1-84（炭素鎖数 5）は離脱に時間がかかる(τ_diss=36 ms)<ref><pubmed> 19580748 </pubmed></ref>。  

　FM1-43の[[wikipedia:ja:励起状態|励起]]には1光子では波長480 nm光、2光子では波長840 nm光が頻用される。  

　極大蛍光波長は[[wikipedia:ja:リポソーム|リポソーム]]中にて580 nmである。

　波長480nm光の高出力励起（～150 μW）にて[[wikipedia:3,3'-Diaminobenzidine|ジアミノベンチジン]]（DAB）の光変換（photoconversion） を起こす。そのため、[[wikipedia:ja:アルデヒド|アルデヒド]]で固定可能な色素であるFM1-43FX と DABを細胞に与え光変換させると、共局在部位で電子密度の高い産物が作られ、[[電子顕微鏡]]観察が可能となる。FM1-43を取り込んだ小胞が、高い電子密度で描出され、微細構造解析に活用されている。  

 

 

[[Image:Takahashinoriko fig 3.jpg|thumb|250px|'''図3．（タイトル：開口放出に伴う FM 蛍光の変化'''　説明：膜融合時、細胞外色素の有無により蛍光変化の様式が異なる）]]  

 

　シナプスを刺激した時にミリ秒で起きる伝達物質放出は、活性帯にドックした小胞が開口放出すると仮想されている。この仮想的な小胞群を即時性放出プール[[Readily releasable pool]]（RRP）という。[[シナプス小胞]]は開口放出後30-60秒で細胞内部に[[エンドサイトーシス]]で取り込まれる(図 3左）。更に、シナプス終末内でシナプス小胞に再生されて即時性放出プールに再び至る。これをリサイクリングと呼び、これに関係する小胞の全体をリサイクリングプール(recycling pool)という。

　細胞外を FM1-43 で還流中に、長い放出刺激（例 20 Hz、900 発）を与え[[開口放出]]([[エクソサイトーシス]]）した小胞の膜を染めた後、細胞外を色素を含まない溶液で還流し、細胞外膜に結合した色素を wash out すると、リサイクリングプール(放出可能プール、TRP)の全体が染まる。一方、ちょうどRRPにある小胞を枯渇させる程度の短い放出刺激（例 20 Hz、30 発）を与えて負荷後にwash outをするとRRPが選択的に染まる。この様な解析から、RRPはリサイクリングプールの10-30%でないかと推定されており<ref><pubmed>　15044806 </pubmed></ref>、TRPが40程度の小さなシナプスではRRPの小胞数は4-12個となる。

　次に、リサイクリングプールを染めた小胞に刺激を与えると、シナプス小胞は細胞膜と融合し、FM1-43が細胞外液へ拡散することにより神経終末の蛍光は減弱する脱染色（destaining 図3右）。このdestainingの時間経過は、小胞の開口放出確率が大きい程速い。定量的には、RRPにある小胞の数を[RRP]、その放出確率をPvとすると、一回の刺激で放出される小胞の数は平均[RRP]*Pvとなる。一方、TRPにある小胞の数を[TRP]、一回の刺激によるTRPの蛍光の減弱率をkとすると、一回の刺激で放出される小胞の数は[TRP]*kとなる。よって、[RRP]*Pv = [TRP]*k となり、これからPv=k*[RRP]/[TRP] という関係式が得られ、終末ごとにRRPにある小胞の放出確率を求めることができる <ref><pubmed>23049481 </pubmed></ref>。<math>Pr=1-(1-Pv)**[RRP]ここに数式を挿入</math>

 

　開口放出した顆粒は[[Active zone]]の周辺から内部に取り込まれ（[[エンドサイトーシス]]）、再び放出可能となる（[[リサイクル]]）。このリサイクルにかかる時間は、[[海馬]]培養標本では 20-30秒、神経筋接合部では 60秒と見積もられた。そこで[[Recycling pool]]（= RRP + Reserve pool）の測定は、RRP 測定時よりも長い時間電気刺激を与え、色素をロードする事により達成できる（例 10Hz 900 発）。リサイクルされた小胞は、元来小胞があった領域のほぼ全域に拡散し、core(中央部）への拡散のみが軽度に少なかった。また、リサイクルした小胞は、初めて刺激を受けたプール同様の放出確率を持つことが報告された<ref><pubmed> 1553547 </pubmed></ref> 。  

　また、[[下垂体]][[前葉細胞]] (lactotrophs) や[[wikipedia:ja:膵島|膵島]]細胞においても、[[ホルモン]]を含む大型[[有芯小胞]]の[[膜融合]]に伴い、開口放出部位においてFM1-43蛍光強度の上昇が報告された <ref><pubmed> 10953007 </pubmed></ref><ref><pubmed>12193788 </pubmed></ref>。  

　水溶性色素（赤色[[wikipedia:ja:スルホローダミンB|スルホローダミンB]], SRB）とFM1-43を細胞外液に同時に与え、開口放出を誘発すると、水溶性色素は小胞内部に進入し、FM1-43は細胞外膜から小胞内膜へ拡散するため、開口放出した小胞が両色素で描出される。この際 [[２光子レーザー走査顕微鏡]]で画像を取得し、双方の色素の増加分の比を求めると小胞直径が計算される（直径＝6 ΔSRB/ΔFM1-43）。本法は色素濃度やレンズ特性（[[wikipedia:ja:点拡がり関数|点拡がり関数]]）によらず、シナプス小胞のような光学[[wikipedia:ja:解像度|解像度]]以下の器官の計測にも応用可能である。  

*[[wikipedia:ja:分泌|分泌]]