「In situハイブリダイゼーション法」の版間の差分

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[[Image:''In situ''ハイブリダイゼーション法1A.png|thumb|300px|'''図1A.ISHの実験例'''<br>組織切片ISH(トリ胚網膜、opsin 5、青い点状のシグナルがmRNA発現細胞、右はセンスプローブによる陰性コントロール)<br>発色基質:NBT, BCIP]]
[[Image:In situハイブリダイゼーション法1A.png|thumb|300px|'''図1A.ISHの実験例'''<br>組織切片ISH(トリ胚網膜、opsin 5、青い点状のシグナルがmRNA発現細胞、右はセンスプローブによる陰性コントロール)<br>発色基質:NBT, BCIP]]


[[Image:''In situ''ハイブリダイゼーション法1B.png|thumb|300px|'''図1B.ISHの実験例'''<br>ホールマウントISH (WISH)<br>
[[Image:In situハイブリダイゼーション法1B.png|thumb|300px|'''図1B.ISHの実験例'''<br>ホールマウントISH (WISH)<br>
マウス胚WISHとWISH後の切片化(Wnt1、青線で切片化、シグナルは矢印[脊索]、凍結切片、未封入)]]
マウス胚WISHとWISH後の切片化(Wnt1、青線で切片化、シグナルは矢印[脊索]、凍結切片、未封入)]]


[[Image:''In situ''ハイブリダイゼーション法1C.png|thumb|300px|'''図1C.ISHの実験例'''<br>組織切片蛍光ISH+抗体染色<br>トリ胚網膜、opsin 5 mRNA (緑)、Islet1タンパク質(マゼンダCy3、上)・GAD65/67タンパク質(マゼンタCy3、下)、核(DAPI)[青])<br>ISHはFluorescein-tyramide法]]
[[Image:In situハイブリダイゼーション法1C.png|thumb|300px|'''図1C.ISHの実験例'''<br>組織切片蛍光ISH+抗体染色<br>トリ胚網膜、opsin 5 mRNA (緑)、Islet1タンパク質(マゼンダCy3、上)・GAD65/67タンパク質(マゼンタCy3、下)、核(DAPI)[青])<br>ISHはFluorescein-tyramide法]]


[[Image:''In situ''ハイブリダイゼーション法1D.png|thumb|300px|'''図1D.ISHの実験例'''<br>マイクロRNAのWISH(マウス胚、miR-1)<br>発色基質: NBT, BCIP]]
[[Image:In situハイブリダイゼーション法1D.png|thumb|300px|'''図1D.ISHの実験例'''<br>マイクロRNAのWISH(マウス胚、miR-1)<br>発色基質: NBT, BCIP]]


[[Image:''In situ''ハイブリダイゼーション法2.png|thumb|300px|'''図2.組織切片を用いた''in situ''ハイブリダイゼーション法の工程''']]
[[Image:In situハイブリダイゼーション法2.png|thumb|300px|'''図2.組織切片を用いた''in situ''ハイブリダイゼーション法の工程''']]


 ''In situ''とは”原位置で”という意味で、''in situ''ハイブリダイゼーション(''in situ'' hybridization: ISH)とは原位置でのハイブリダイゼーション(後述)ということである。ISH法には、[[wikipedia:ja:染色体|染色体]]ISHと組織切片ISH、ホールマウントISH (whole-mount ISH: WISH) がある。染色体ISH法は、染色体における目的遺伝子の[[wikipedia:ja:遺伝子座|遺伝子座]]を明らかにし、染色体異常を検出することができる。組織ISH法は、組織切片を用いて遺伝子発現の第一段階である[[wikipedia:ja:mRNA|mRNA]]の局在を細胞レベルで明らかにする。[[wikipedia:ja:病理|病理]]組織から[[wikipedia:ja:ウイルス|ウイルス]][[wikipedia:ja:ゲノム|ゲノム]]を検出し、ウイルス感染の診断に用いられることもある。また、胚や器官の一部などを丸ごと用いるISH法を、ホールマウントISH(WISH)という。実験例を図1に示す。遺伝子発現部位の三次元的な情報を得た後で、細胞レベルで遺伝子発現部位を同定しなければならない場合は、WISH後の胚などの組織切片を作製する。図2に、組織切片を用いた''in situ''ハイブリダイゼーション法の工程を模式的に示す。ISHは、細胞内mRNAの局在を明らかにする実験であるので、分解されやすいRNAをいかに分解させずに実験を行うかが重要である。
 ''In situ''とは”原位置で”という意味で、''in situ''ハイブリダイゼーション(''in situ'' hybridization: ISH)とは原位置でのハイブリダイゼーション(後述)ということである。ISH法には、[[wikipedia:ja:染色体|染色体]]ISHと組織切片ISH、ホールマウントISH (whole-mount ISH: WISH) がある。染色体ISH法は、染色体における目的遺伝子の[[wikipedia:ja:遺伝子座|遺伝子座]]を明らかにし、染色体異常を検出することができる。組織ISH法は、組織切片を用いて遺伝子発現の第一段階である[[wikipedia:ja:mRNA|mRNA]]の局在を細胞レベルで明らかにする。[[wikipedia:ja:病理|病理]]組織から[[wikipedia:ja:ウイルス|ウイルス]][[wikipedia:ja:ゲノム|ゲノム]]を検出し、ウイルス感染の診断に用いられることもある。また、胚や器官の一部などを丸ごと用いるISH法を、ホールマウントISH(WISH)という。実験例を図1に示す。遺伝子発現部位の三次元的な情報を得た後で、細胞レベルで遺伝子発現部位を同定しなければならない場合は、WISH後の胚などの組織切片を作製する。図2に、組織切片を用いた''in situ''ハイブリダイゼーション法の工程を模式的に示す。ISHは、細胞内mRNAの局在を明らかにする実験であるので、分解されやすいRNAをいかに分解させずに実験を行うかが重要である。
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の3種類がよく用いられている。DNAオリゴプローブは、DNA合成装置で合成する。B, Cにおいては、プローブ合成のための[[wikipedia:ja:鋳型|鋳型]]DNAが必要である。RNA-RNAハイブリッドが3者の中で最も安定であり、現在RNAプローブを用いる方法が一般的である。合成したRNAが分解されないように細心の注意を払う。他に[[wikipedia:ja:locked nucleic acid|locked nucleic acid]] (LNA)(後述)や[[wikipedia:ja:ペプチド核酸|ペプチド核酸]]をプローブとして用いる方法がある。プローブを可視化のために標識する方法には主に次の2つの方法がある。
の3種類がよく用いられている。DNAオリゴプローブは、DNA合成装置で合成する。B, Cにおいては、プローブ合成のための[[wikipedia:ja:鋳型|鋳型]]DNAが必要である。RNA-RNAハイブリッドが3者の中で最も安定であり、現在RNAプローブを用いる方法が一般的である。合成したRNAが分解されないように細心の注意を払う。他に[[wikipedia:ja:locked nucleic acid|locked nucleic acid]] (LNA)(後述)や[[wikipedia:ja:ペプチド核酸|ペプチド核酸]]をプローブとして用いる方法がある。プローブを可視化のために標識する方法には主に次の2つの方法がある。


# [[wikipedia:ja:酵素抗体法|酵素抗体法]]または[[wikipedia:ja:蛍光抗体法|蛍光抗体法]:適当な[[wikipedia:ja:抗原|抗原]]([[wikipedia:ja:ジゴキシゲニン|ジゴキシゲニン]]digoxigenin [DIG], [[wikipedia:ja:フルオレセイン|フルオレセイン]] fluorescein, [[wikipedia:ja:ビオチン|ビオチン]] biotinなど)の結合した[[wikipedia:ja:ヌクレオチド|ヌクレオチド]]を用いてプローブを標識し、その抗原に対する[[wikipedia:ja:抗体|抗体]]を用いて発色または蛍光により可視化する。<br>
# [[wikipedia:ja:酵素抗体法|酵素抗体法]]または[[wikipedia:ja:蛍光抗体法|蛍光抗体法]:適当な[[wikipedia:ja:抗原|抗原]]([[wikipedia:ja:ジゴキシゲニン|ジゴキシゲニン]] digoxigenin [DIG], [[wikipedia:ja:フルオレセイン|フルオレセイン]] fluorescein, [[wikipedia:ja:ビオチン|ビオチン]] biotinなど)の結合した[[wikipedia:ja:ヌクレオチド|ヌクレオチド]]を用いてプローブを標識し、その抗原に対する[[wikipedia:ja:抗体|抗体]]を用いて発色または蛍光により可視化する。<br>
# [[wikipedia:ja:放射性同位元素|放射性同位元素]](radioisotope: RI)を用いて、[[wikipedia:ja:オートラジオグラフィー|オートラジオグラフィー]]法により可視化する。
# [[wikipedia:ja:放射性同位元素|放射性同位元素]](radioisotope: RI)を用いて、[[wikipedia:ja:オートラジオグラフィー|オートラジオグラフィー]]法により可視化する。


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[[image:''In situ''ハイブリダイゼーション法3.png|thumb|300px|'''図3.アルカリフォスファッターゼによる発色反応'''<br>BCIPがAPにより加水分解されてまず中間産物となり、さらに2量体になって青色色素を産生する。2量体化するときに、2個の水素イオンによりNBTは還元されて不溶性のNBTホルマザンを形成する。(tautomerism:ケト・エノール互変異性)<br>一方、Fast Red TRは、ナフトールAS-MXリン酸の存在下でAPにより赤色の沈殿物を生じる。Fast Red TRを蛍光性のAP基質であるHNPP (2-hydroxy-3-naphtoic acid-2’-phenylanilide phosphate)と共に用いると、還元されてできるHNPの組織への沈着が増し、HNPの蛍光がさらに長波長側シフトして (565~620nm) 強い橙蛍光を発する。<ref>[http://www.piercenet.com/browse.cfm?fldID=5A423056-5056-8A76-4E25-1E5F9C0596B2 発色反応、発色基質全般]</ref>]]
[[image:''In situ''ハイブリダイゼーション法3.png|thumb|300px|'''図3.アルカリフォスファッターゼによる発色反応'''<br>BCIPがAPにより加水分解されてまず中間産物となり、さらに2量体になって青色色素を産生する。2量体化するときに、2個の水素イオンによりNBTは還元されて不溶性のNBTホルマザンを形成する。(tautomerism:ケト・エノール互変異性)<br>一方、Fast Red TRは、ナフトールAS-MXリン酸の存在下でAPにより赤色の沈殿物を生じる。Fast Red TRを蛍光性のAP基質であるHNPP (2-hydroxy-3-naphtoic acid-2’-phenylanilide phosphate)と共に用いると、還元されてできるHNPの組織への沈着が増し、HNPの蛍光がさらに長波長側シフトして (565~620nm) 強い橙蛍光を発する。<ref>[http://www.piercenet.com/browse.cfm?fldID=5A423056-5056-8A76-4E25-1E5F9C0596B2 発色反応、発色基質全般]</ref>]]


 標識プローブのみでは発色することができないので、プローブの中に取り込まれている抗原に対する抗体を用いプローブの検出を行う.プローブをDIGで標識した場合、DIGに特異的に結合する一次抗体を用いて検出する。検出に用いる一次抗体には通常の抗体とは異なり、[[wikipedia:ja:アルカリフォスファターゼ|アルカリフォスファターゼ]](alkaline phosphatase: AP)または[[wikipedia:ja:西洋ワサビペルオキシダーゼ|西洋ワサビペルオキシダーゼ]](horseradish peroxidase: HRP)などの酵素が結合(conjugate)している.例えば、抗体に結合されたAPの基質として、BCIP (X-リン酸と呼ぶ)(5-Bromo-4-Chloro-3'-Indolylphosphate p-Toluidine salt)およびNBT(nitro-blue tetrazolium chloride)を用いた場合は、酵素がXの結合を切断し、Xが遊離すると発色する(図3)。一方、抗体に蛍光色素が結合している場合には、蛍光顕微鏡や共焦点レーザー走査顕微鏡で検出する。
 標識プローブのみでは発色することができないので、プローブの中に取り込まれている抗原に対する抗体を用いプローブの検出を行う.プローブをDIGで標識した場合、DIGに特異的に結合する一次抗体を用いて検出する。検出に用いる一次抗体には通常の抗体とは異なり、[[wikipedia:ja:アルカリフォスファターゼ|アルカリフォスファターゼ]](alkaline phosphatase: AP)または[[wikipedia:ja:西洋ワサビペルオキシダーゼ|西洋ワサビペルオキシダーゼ]](horseradish peroxidase: HRP)などの酵素が結合(conjugate)している.例えば、抗体に結合されたAPの基質として、5-Bromo-4-Chloro-3'-Indolylphosphate p-Toluidine salt (BCIP, X-リン酸と呼ぶ)およびnitro-blue tetrazolium chloride (NBT)を用いた場合は、酵素がXの結合を切断し、Xが遊離すると発色する(図3)。一方、抗体に蛍光色素が結合している場合には、[[wikipedia:ja:蛍光顕微鏡|蛍光顕微鏡]]や[[共焦点レーザー走査顕微鏡]]で検出する。


====放射性同位元素を用いる方法====
====放射性同位元素を用いる方法====
 放射性同位元素(RI)として35S標識された核酸を用いてプローブを合成する。写真用フイルムまたはオートラジオグラフィー用の乳剤を用いてRIの放出するβ線を検出する。
 放射性同位元素(RI)として<sup>35</sup>S標識された核酸を用いてプローブを合成する。写真用フイルムまたはオートラジオグラフィー用の[[wikipedia:ja:乳剤|乳剤]]を用いてRIの放出する[[wikipedia:ja:β線|β線]]を検出する。


===観察と記録===
===観察と記録===
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== ISHデータベース ==
== ISHデータベース ==


 Allen Brain Atlasは、[[wikipedia:ja:マイクロソフト社|マイクロソフト社]]創設者の一人である[[wikipedia:ja:Paul G. Allen|Paul G. Allen]]の出資によって2003年に設立された[[wikipedia:ja:Allen Institute for Brain Science|Allen Institute for Brain Science]]のISHデータベースである。2006年12月発表のNature の記事によると、まず約2万の遺伝子のマウス成体脳における組織切片ISHのデータが公開された<ref><pubmed>    17151600</pubmed></ref>。現在、[[マウス]][[脳]]に加えて、[[wikipedia:ja:ヒト脳|ヒト脳]]、発生期マウス脳、発生期ヒト脳、マウス脳神経回路、ヒト以外の[[wikipedia:ja:霊長類|霊長類]]脳、マウス[[脊髄]]、ヒト[[神経膠芽腫]]に関するISHデータベースが公開されている。
 Allen Brain Atlasは、[[wikipedia:ja:マイクロソフト社|マイクロソフト社]]創設者の一人である[[wikipedia:Paul G. Allen|Paul G. Allen]]の出資によって2003年に設立された[[wikipedia:ja:Allen Institute for Brain Science|Allen Institute for Brain Science]]のISHデータベースである。2006年12月発表のNature の記事によると、まず約2万の遺伝子のマウス成体脳における組織切片ISHのデータが公開された<ref><pubmed>    17151600</pubmed></ref>。現在、[[マウス]][[脳]]に加えて、[[wikipedia:ja:ヒト脳|ヒト脳]]、発生期マウス脳、発生期ヒト脳、マウス脳神経回路、ヒト以外の[[wikipedia:ja:霊長類|霊長類]]脳、マウス[[脊髄]]、ヒト[[神経膠芽腫]]に関するISHデータベースが公開されている。


== 外部リンク ==
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