「ディファレンシャルディスプレイ」の版間の差分

英語名：differential display　英語略名：DDRT-PCR, DD-PCR &nbsp;ディファレンシャルディスプレイdifferential display(DD法)（別名、ディファレンシャルディスプレイRT-PCR (DDRT-PCR, DD-PCR)）とは、遺伝子発現の量の差異(difference)をPCR法により解析する方法の一種である。ここで、ディスプレイ(display)とは、目的遺伝子をゲル上で視覚的に表示するとの意であり、多数のRNA試料を同時に比較して、様々な発現パターンを示すcDNAを包括的に同定しその発現量を比較できることから、ゲノム科学における遺伝子発現解析 (gene expression profiling)に有力な手法である<ref><pubmed>1354393</pubmed></ref><ref><pubmed>12188186</pubmed></ref>[3]。  

遺伝子から転写されたRNAの量は、遺伝子機能の量的な面を反映していると考えられるため、遺伝子の発現量から機能を推測しようというのが、この遺伝子発現解析の基本的な概念である。本技法は、1992年に、LiangとPardeeにより、mRNAレベルで真核細胞の試料間で、遺伝子発現の同定比較を行うことできる技術として発表された<ref><pubmed>1354393</pubmed></ref><ref><pubmed>12188186</pubmed></ref>。形態的、遺伝学的、または実験的処置等に異なる試料間で、どの遺伝子発現に変化•差異があるかを見出すことができる。例えば、物質Aの添加により遺伝子Bの発現の増加/減少が見出された場合、この遺伝子Bの発現が物質Aにより誘導/抑制されていると考えられ、防御タンパクや阻害作用の解析などに多くの適応が考えられる。脳•神経科学領域では、ある学習課題が成立した動物個体としていない動物個体の脳神経細胞間で、発現に差のある遺伝子を同定することで、その学習に関与する遺伝子群が同定された適応例がある<ref><pubmed>10531455</pubmed></ref>, 。比較的感度が良く、実験操作も簡便に行うことができ、また必要に応じて、2対以上の試料間での比較に拡張することも可能である。原法では、検出方法としてRIを用いていた(RI-DD法)が<ref><pubmed>1354393</pubmed></ref>、その後、蛍光標識されたプライマーを用いて検出する蛍光differential display (FDD) 法が開発され、検出感度、操作性や再現性が高められた<ref><pubmed>7521850</pubmed></ref>, 6。 <br>  

細胞中で発現したmRNAすべて（total RNA）を逆転写しtotal cDNAを得た後、これを鋳型にして複数のプライマーミックスを用いたPCRを行う。ここで、特異性を持たせずできるだけ多くの種類の遺伝子を増幅するよう設定した複数のプライマーを用いることにより、非常に多数のバンドが得られる。 得られたバンドの強弱を遺伝子発現の強度の指標とし、特定の物質添加の有無などさまざまな操作•環境の違いによりその細胞のどの遺伝子が変化しているかを見出す。以下に手順を記述する (図)。 <br> &nbsp;  

① アンカープライマーによるmRNAの選択的逆転写（第1鎖合成） 比較したい２種類（またはそれ以上）の細胞からそれぞれ抽出したmRNAを、ポリ(A)鎖と結合するアンカープライマー(anchor primer)と逆転写酵素を用いた逆転写反応によってcDNAに変換する。アンカープライマーとしはT(チミジン)12個からなるオリゴヌクレオチドの3’端に１個の任意の塩基を付加したものを用いる。１つの細胞で発現する約15,000種類の遺伝子すべての発現を網羅して探索するために、4種類のアンカープライマーと20種類の混成プライマー(10mer)を用いてPCRを行う。 <br>  

② 任意プライマーによるmRNAの選択的第2鎖合成とPCRによる増幅 次に、合成されたcDNAを鋳型に、アンカープライマーと任意の混成塩基配列を持つ（通常10merの）オリゴヌクレオチド群をプライマーとしてPCRを行う。これによって任意の共通塩基配列をもつ複数のcDNA断片を、同時にPCR増幅する。この結果、両端をアンカープライマーと任意プライマーの配列で置換された分子が生じる。サイクルを繰り返すことにより、分子が指数関数的に増幅する。 <br>  

③ 電気泳動(もしくは蛍光イメージアナライザー等)による発現の分類 反応生成物をポリアクリルアミド電気泳動で展開すると、複数のcDNA断片からなるフィンガープリントが得られる。この中から、強度に変化のある、または特異的な泳動パターンを示すバンドの切り出しを行う。 <br>  

④ バンドの再増幅およびクローン化 ゲルからサンプルを回収し、それを基質としてPCRを繰り返し行い、再現性を高めて、cDNAクローンを回収する。 <br>  

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