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[[Image: | [[Image:In situハイブリダイゼーション法1A.png|thumb|300px|'''図1A．ISHの実験例'''<br>組織切片ISH（トリ胚網膜、opsin 5、青い点状のシグナルがmRNA発現細胞、右はセンスプローブによる陰性コントロール）<br>発色基質：NBT, BCIP]] | ||
[[Image: | [[Image:In situハイブリダイゼーション法1B.png|thumb|300px|'''図1B．ISHの実験例'''<br>ホールマウントISH (WISH)<br> | ||
マウス胚WISHとWISH後の切片化（Wnt1、青線で切片化、シグナルは矢印[脊索]、凍結切片、未封入）]] | マウス胚WISHとWISH後の切片化（Wnt1、青線で切片化、シグナルは矢印[脊索]、凍結切片、未封入）]] | ||
[[Image: | [[Image:In situハイブリダイゼーション法1C.png|thumb|300px|'''図1C．ISHの実験例'''<br>組織切片蛍光ISH＋抗体染色<br>トリ胚網膜、opsin 5 mRNA （緑）、Islet1タンパク質（マゼンダCy3、上）・GAD65/67タンパク質（マゼンタCy3、下）、核(DAPI)[青]）<br>ISHはFluorescein-tyramide法]] | ||
[[Image: | [[Image:In situハイブリダイゼーション法1D.png|thumb|300px|'''図1D．ISHの実験例'''<br>マイクロRNAのWISH（マウス胚、miR-1）<br>発色基質: NBT, BCIP]] | ||
[[Image: | [[Image:In situハイブリダイゼーション法2.png|thumb|300px|'''図2．組織切片を用いた''in situ''ハイブリダイゼーション法の工程''']] | ||
''In situ''とは”原位置で”という意味で、''in situ''ハイブリダイゼーション(''in situ'' hybridization: ISH)とは原位置でのハイブリダイゼーション（後述）ということである。ISH法には、[[wikipedia:ja:染色体|染色体]]ISHと組織切片ISH、ホールマウントISH (whole-mount ISH: WISH) がある。染色体ISH法は、染色体における目的遺伝子の[[wikipedia:ja:遺伝子座|遺伝子座]]を明らかにし、染色体異常を検出することができる。組織ISH法は、組織切片を用いて遺伝子発現の第一段階である[[wikipedia:ja:mRNA|mRNA]]の局在を細胞レベルで明らかにする。[[wikipedia:ja:病理|病理]]組織から[[wikipedia:ja:ウイルス|ウイルス]][[wikipedia:ja:ゲノム|ゲノム]]を検出し、ウイルス感染の診断に用いられることもある。また、胚や器官の一部などを丸ごと用いるISH法を、ホールマウントISH（WISH）という。実験例を図1に示す。遺伝子発現部位の三次元的な情報を得た後で、細胞レベルで遺伝子発現部位を同定しなければならない場合は、WISH後の胚などの組織切片を作製する。図2に、組織切片を用いた''in situ''ハイブリダイゼーション法の工程を模式的に示す。ISHは、細胞内mRNAの局在を明らかにする実験であるので、分解されやすいRNAをいかに分解させずに実験を行うかが重要である。 | ''In situ''とは”原位置で”という意味で、''in situ''ハイブリダイゼーション(''in situ'' hybridization: ISH)とは原位置でのハイブリダイゼーション（後述）ということである。ISH法には、[[wikipedia:ja:染色体|染色体]]ISHと組織切片ISH、ホールマウントISH (whole-mount ISH: WISH) がある。染色体ISH法は、染色体における目的遺伝子の[[wikipedia:ja:遺伝子座|遺伝子座]]を明らかにし、染色体異常を検出することができる。組織ISH法は、組織切片を用いて遺伝子発現の第一段階である[[wikipedia:ja:mRNA|mRNA]]の局在を細胞レベルで明らかにする。[[wikipedia:ja:病理|病理]]組織から[[wikipedia:ja:ウイルス|ウイルス]][[wikipedia:ja:ゲノム|ゲノム]]を検出し、ウイルス感染の診断に用いられることもある。また、胚や器官の一部などを丸ごと用いるISH法を、ホールマウントISH（WISH）という。実験例を図1に示す。遺伝子発現部位の三次元的な情報を得た後で、細胞レベルで遺伝子発現部位を同定しなければならない場合は、WISH後の胚などの組織切片を作製する。図2に、組織切片を用いた''in situ''ハイブリダイゼーション法の工程を模式的に示す。ISHは、細胞内mRNAの局在を明らかにする実験であるので、分解されやすいRNAをいかに分解させずに実験を行うかが重要である。 | ||
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の3種類がよく用いられている。DNAオリゴプローブは、DNA合成装置で合成する。B, Cにおいては、プローブ合成のための[[wikipedia:ja:鋳型|鋳型]]DNAが必要である。RNA-RNAハイブリッドが3者の中で最も安定であり、現在RNAプローブを用いる方法が一般的である。合成したRNAが分解されないように細心の注意を払う。他に[[wikipedia:ja:locked nucleic acid|locked nucleic acid]] (LNA)（後述）や[[wikipedia:ja:ペプチド核酸|ペプチド核酸]]をプローブとして用いる方法がある。プローブを可視化のために標識する方法には主に次の2つの方法がある。 | の3種類がよく用いられている。DNAオリゴプローブは、DNA合成装置で合成する。B, Cにおいては、プローブ合成のための[[wikipedia:ja:鋳型|鋳型]]DNAが必要である。RNA-RNAハイブリッドが3者の中で最も安定であり、現在RNAプローブを用いる方法が一般的である。合成したRNAが分解されないように細心の注意を払う。他に[[wikipedia:ja:locked nucleic acid|locked nucleic acid]] (LNA)（後述）や[[wikipedia:ja:ペプチド核酸|ペプチド核酸]]をプローブとして用いる方法がある。プローブを可視化のために標識する方法には主に次の2つの方法がある。 | ||
# [[wikipedia:ja:酵素抗体法|酵素抗体法]]または[[wikipedia:ja:蛍光抗体法|蛍光抗体法]：適当な[[wikipedia:ja:抗原|抗原]]（[[wikipedia:ja:ジゴキシゲニン|ジゴキシゲニン]]digoxigenin [DIG], [[wikipedia:ja:フルオレセイン|フルオレセイン]] fluorescein, [[wikipedia:ja:ビオチン|ビオチン]] biotinなど）の結合した[[wikipedia:ja:ヌクレオチド|ヌクレオチド]]を用いてプローブを標識し、その抗原に対する[[wikipedia:ja:抗体|抗体]]を用いて発色または蛍光により可視化する。<br> | # [[wikipedia:ja:酵素抗体法|酵素抗体法]]または[[wikipedia:ja:蛍光抗体法|蛍光抗体法]：適当な[[wikipedia:ja:抗原|抗原]]（[[wikipedia:ja:ジゴキシゲニン|ジゴキシゲニン]] digoxigenin [DIG], [[wikipedia:ja:フルオレセイン|フルオレセイン]] fluorescein, [[wikipedia:ja:ビオチン|ビオチン]] biotinなど）の結合した[[wikipedia:ja:ヌクレオチド|ヌクレオチド]]を用いてプローブを標識し、その抗原に対する[[wikipedia:ja:抗体|抗体]]を用いて発色または蛍光により可視化する。<br> | ||
# [[wikipedia:ja:放射性同位元素|放射性同位元素]]（radioisotope: RI）を用いて、[[wikipedia:ja:オートラジオグラフィー|オートラジオグラフィー]]法により可視化する。 | # [[wikipedia:ja:放射性同位元素|放射性同位元素]]（radioisotope: RI）を用いて、[[wikipedia:ja:オートラジオグラフィー|オートラジオグラフィー]]法により可視化する。 | ||
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[[image:''In situ''ハイブリダイゼーション法3.png|thumb|300px|'''図3．アルカリフォスファッターゼによる発色反応'''<br>BCIPがAPにより加水分解されてまず中間産物となり、さらに2量体になって青色色素を産生する。2量体化するときに、2個の水素イオンによりNBTは還元されて不溶性のNBTホルマザンを形成する。(tautomerism:ケト・エノール互変異性)<br>一方、Fast Red TRは、ナフトールAS-MXリン酸の存在下でAPにより赤色の沈殿物を生じる。Fast Red TRを蛍光性のAP基質であるHNPP (2-hydroxy-3-naphtoic acid-2’-phenylanilide phosphate)と共に用いると、還元されてできるHNPの組織への沈着が増し、HNPの蛍光がさらに長波長側シフトして (565~620nm) 強い橙蛍光を発する。<ref>[http://www.piercenet.com/browse.cfm?fldID=5A423056-5056-8A76-4E25-1E5F9C0596B2 発色反応、発色基質全般]</ref>]] | [[image:''In situ''ハイブリダイゼーション法3.png|thumb|300px|'''図3．アルカリフォスファッターゼによる発色反応'''<br>BCIPがAPにより加水分解されてまず中間産物となり、さらに2量体になって青色色素を産生する。2量体化するときに、2個の水素イオンによりNBTは還元されて不溶性のNBTホルマザンを形成する。(tautomerism:ケト・エノール互変異性)<br>一方、Fast Red TRは、ナフトールAS-MXリン酸の存在下でAPにより赤色の沈殿物を生じる。Fast Red TRを蛍光性のAP基質であるHNPP (2-hydroxy-3-naphtoic acid-2’-phenylanilide phosphate)と共に用いると、還元されてできるHNPの組織への沈着が増し、HNPの蛍光がさらに長波長側シフトして (565~620nm) 強い橙蛍光を発する。<ref>[http://www.piercenet.com/browse.cfm?fldID=5A423056-5056-8A76-4E25-1E5F9C0596B2 発色反応、発色基質全般]</ref>]] | ||
標識プローブのみでは発色することができないので、プローブの中に取り込まれている抗原に対する抗体を用いプローブの検出を行う．プローブをDIGで標識した場合、DIGに特異的に結合する一次抗体を用いて検出する。検出に用いる一次抗体には通常の抗体とは異なり、[[wikipedia:ja:アルカリフォスファターゼ|アルカリフォスファターゼ]]（alkaline phosphatase: AP）または[[wikipedia:ja:西洋ワサビペルオキシダーゼ|西洋ワサビペルオキシダーゼ]]（horseradish peroxidase: | 標識プローブのみでは発色することができないので、プローブの中に取り込まれている抗原に対する抗体を用いプローブの検出を行う．プローブをDIGで標識した場合、DIGに特異的に結合する一次抗体を用いて検出する。検出に用いる一次抗体には通常の抗体とは異なり、[[wikipedia:ja:アルカリフォスファターゼ|アルカリフォスファターゼ]]（alkaline phosphatase: AP）または[[wikipedia:ja:西洋ワサビペルオキシダーゼ|西洋ワサビペルオキシダーゼ]]（horseradish peroxidase: HRP）などの酵素が結合（conjugate）している．例えば、抗体に結合されたAPの基質として、5-Bromo-4-Chloro-3'-Indolylphosphate p-Toluidine salt (BCIP, X-リン酸と呼ぶ）およびnitro-blue tetrazolium chloride (NBT)を用いた場合は、酵素がXの結合を切断し、Xが遊離すると発色する（図3）。一方、抗体に蛍光色素が結合している場合には、[[wikipedia:ja:蛍光顕微鏡|蛍光顕微鏡]]や[[共焦点レーザー走査顕微鏡]]で検出する。 | ||
====放射性同位元素を用いる方法==== | ====放射性同位元素を用いる方法==== | ||
放射性同位元素（RI）として<sup>35</sup>S標識された核酸を用いてプローブを合成する。写真用フイルムまたはオートラジオグラフィー用の[[wikipedia:ja:乳剤|乳剤]]を用いてRIの放出する[[wikipedia:ja:β線|β線]]を検出する。 | |||
===観察と記録=== | ===観察と記録=== | ||
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== ISHデータベース == | == ISHデータベース == | ||
Allen Brain Atlasは、[[wikipedia:ja:マイクロソフト社|マイクロソフト社]]創設者の一人である[[wikipedia | Allen Brain Atlasは、[[wikipedia:ja:マイクロソフト社|マイクロソフト社]]創設者の一人である[[wikipedia:Paul G. Allen|Paul G. Allen]]の出資によって2003年に設立された[[wikipedia:ja:Allen Institute for Brain Science|Allen Institute for Brain Science]]のISHデータベースである。2006年12月発表のNature の記事によると、まず約2万の遺伝子のマウス成体脳における組織切片ISHのデータが公開された<ref><pubmed> 17151600</pubmed></ref>。現在、[[マウス]][[脳]]に加えて、[[wikipedia:ja:ヒト脳|ヒト脳]]、発生期マウス脳、発生期ヒト脳、マウス脳神経回路、ヒト以外の[[wikipedia:ja:霊長類|霊長類]]脳、マウス[[脊髄]]、ヒト[[神経膠芽腫]]に関するISHデータベースが公開されている。 | ||
== 外部リンク == | == 外部リンク == | ||