「電気穿孔法」の版間の差分

[[Image:図1−電気穿孔法.jpg|thumb|right|250px|<b>図1．生体内電気穿孔法</b><br />子宮をピンセット型電極で挟み、マウス胎仔脳へ電気パルスを与える<span class=]]&lt;pubmed&gt;11784059&lt;/pubmed&gt;。" class="fck_mw_frame fck_mw_right" /&gt;

[[Image:図2−電気穿孔法.jpg|thumb|right|400px|<b>図2．マウス脳の電気穿孔の例</b><br />生後5日の大脳皮質。A 胎生13.5日に<i>DsRed-mito</i>を導入、B 胎生15.5日に<i>EYFP</i>を導入、C 胎生13.5日に<i>Ds-Red-mito</i>と胎生15.5日に<i>EYFP</i>の2回の電気穿孔で遺伝子導入<span class=]]&lt;pubmed&gt;15750183&lt;/pubmed&gt;。" class="fck_mw_frame fck_mw_right" /&gt;

　電気穿孔法とは、電気パルスで[[細胞膜]]の透過性を上げることにより、[[wikipedia:ja:DNA|DNA]]などの分子を[[wikipedia:ja:真核生物|真核生物]]や[[wikipedia:ja:原核生物|原核生物]]の[[wikipedia:ja:細胞|細胞]]に導入する方法である。高い導入効率が容易に得られるため、多くの種類の細胞に用いられる。[[培養細胞]]のみならず、[[マウス]]などの胎仔に利用できる生体内電気穿孔法（''in vivo'' electroporation）が確立され、[[wikipedia:ja:遺伝子|遺伝子]]の解析が個体レベルで飛躍的に進んでいる。  

　電気穿孔の端緒は、1950年代に[[膜電位]]の測定法が研究されていた時期、あるレベル以上の電気パルスを[[ランビエ絞輪]]に与えると膜電位が失われる発見に遡る<ref name="ref3"><pubmed>13461864</pubmed></ref>。ほぼ10年後、強い電気パルスが[[wikipedia:ja:大腸菌|大腸菌]]を殺し、菌から[[wikipedia:ja:β−ガラクトシダーゼ|β−ガラクトシダーゼ]]を溶出させることが観察され、電気パルスは細胞膜を破壊できると考えられるようになった<ref name="ref4">'''W A Hamilton, A J H Sale'''<br>Effects of high electric fields on microorganisms. 2. Mechanism of action of the lethal effect. ''Biochim. Biophys. Acta'': 1967, 148;789-800</ref>。その後、電気パルスで[[wikipedia:ja:赤血球|赤血球]]から[[wikipedia:ja:ヘモグロビン|ヘモグロビン]]を溶出させる実験などが進み、適切な条件下では細胞膜は一度壊れた後でも機能を回復できることがわかった<ref name="ref5"><pubmed>13222</pubmed></ref>。さらに、電気パルスを与えた赤血球に外から[[wikipedia:ja:スクロース|スクロース]]などを入れることに成功し、電気パルスは細胞膜に穴（pore）を空け、穴が閉じることにより元に戻るとの概念が登場した<ref name="ref6"><pubmed>895849</pubmed></ref>。また、赤血球にDNAや[[wikipedia:ja:RNA|RNA]]を入れる実験なども行われた<ref name="ref7"><pubmed>184398</pubmed></ref>。実際に細胞膜に穴が空いた像は、低[[wikipedia:ja:浸透圧|浸透圧]]の条件下、赤血球を用いて電子顕微鏡で観察された<ref name="ref8"><pubmed>2383626</pubmed></ref>。しかし、等張液でも同様の穴が空くのかには疑問が呈されている<ref name="ref9"><pubmed>19016008</pubmed></ref>。  

　1982年、Neumannらは電気パルスを用い、培養細胞のマウスL細胞に[[wikipedia:ja:チミジンキナーゼ|チミジンキナーゼ]]遺伝子を導入することに成功した<ref name="ref10"><pubmed>6329708</pubmed></ref>。続いて、他の研究者が[[wikipedia:ja:植物|植物]]の[[wikipedia:ja:プロトプラスト|プロトプラスト]]<ref name="ref11"><pubmed>3862099</pubmed></ref>や大腸菌<ref name="ref12"><pubmed>3286620</pubmed></ref>にも遺伝子導入できることを示した。初期には、温度や電圧、パルスの幅や回数に加え、[[wikipedia:ja:減衰波|減衰波]]や[[wikipedia:ja:矩形波|矩形波]]のパルスなどいろいろと試されたが、減衰波のパルスを生む装置は比較的簡単に作れることもあり、減衰波パルスが主流となった。[[ES細胞]]など培養細胞への遺伝子導入には、過去のデータが集積しているなどの理由で、減衰波パルスが用いられることが多い。  

　DNAやRNAなどの[[wikipedia:ja:核酸|核酸]]を培養細胞や胎仔内の細胞など広く様々な細胞に導入するために使われる。実験系は、導入される細胞が培養細胞などの単離された細胞か生体内もしくは組織内の細胞かで2つに大別される。膜を透過できない[[wikipedia:ja:抗がん剤|抗がん剤]]などの薬剤を細胞へ入れる方法としても検討されている。電気パルスは[[wikipedia:ja:細胞融合|細胞融合]]にも用いられる。　  

　培養皿や生体組織などから単離した細胞の懸濁液を核酸とともに[[wikipedia:ja:キュベット|キュベット]]に入れ、浮遊状態で電気パルスを与える。通常、高電圧で単一の減衰波パルスを用い、[[wikipedia:Bio-Rad|Bio-Rad社]]のジーンパルサーなどの装置が使われる。過去の多くのデータがあり、業者のプロトコールに従い、遺伝子導入を容易に行えるのが利点である。高い導入効率を得ようとすると、細胞の生存率が下がる点が欠点となる。  

　動物細胞は500 &amp;micro;F, 240 Vなど、大腸菌では25 &amp;micro;F, 2000 Vなどの条件が用いられる。  

　最も単純なパルス作製装置は、[[wikipedia:ja:コンデンサー|コンデンサー]]に蓄電した電気をスィッチの切替でキュベット内に放出させる仕組みであり<ref name="ref10"><pubmed>21963197</pubmed></ref>、初期には研究室で自作された。  

　子宮内のマウス胎仔やニワトリ胚、体外培養胚などの細胞に関しては、核酸を注入後、ピンセット型電極やニードル電極などで胎仔や組織を挟み、低電圧で長時間の矩形波パルスを複数回与える。例えば、胎生13.5日のマウス胎仔には40 V, 50 msecの矩形波パルスを1秒に1回ずつ5回与えるなどの条件が使われ、至適電圧は胎仔の発生のステージで異なる<ref name="ref1"><pubmed>11784059</pubmed></ref><ref name="ref16"><pubmed>17406448</pubmed></ref>。ほとんど全てのマウス胎仔に遺伝子導入できる条件でも、電気穿孔で細胞死が増加しないことが確認されている<ref name="ref2"><pubmed>15750183</pubmed></ref><ref name="ref16"><pubmed>17406448</pubmed></ref>。電極と遺伝子導入される細胞が近接している必要はなく、子宮の外側から電気パルスを与えても脳内などへの遺伝子導入が可能である。パルス作製装置にはBEX社のCUY21などが用いられる。[[wikipedia:ja:siRNA|siRNA]]などのRNAを導入することにより、標的タンパク質の発現を生体内で効率よく抑えることにも用いられる<ref name="ref17"><pubmed>18723012</pubmed></ref>。  

　生体内の細胞への電気穿孔は生体内電気穿孔法と呼ばれる。生体組織を取り出し体外培養の前などに行われる電気穿孔は生体外電気穿孔法（''ex vivo'' electroporation）と呼ばれることもある。マウス胎仔の生体内電気穿孔法では、子宮の外からDNAなどを注入し、子宮の外側を電極で挟むことで電気穿孔する子宮内電気穿孔法（''in utero'' electroporation）が一般的である。子宮内電気穿孔法を行った胎仔は子宮とともに母体に戻せば、生育でき出産も可能である<ref name="ref1"><pubmed>21963197</pubmed></ref>。一方、胎生12.5日以前では子宮の外から胎仔が見にくいなどの理由により、子宮壁を切開後にDNAなどを注入し、胎仔の入った卵黄囊を電極で挟み電気穿孔する子宮外電気穿孔法（''exo utero'' electroporation）も用いられる<ref name="ref1"><pubmed>11784059</pubmed></ref><ref name="ref18"><pubmed>12657654</pubmed></ref>。子宮外電気穿孔法を施した胎仔は子宮壁を縫わずに母体に戻すことで生育可能であるが、出産後の仔マウスが必要な場合、母マウスは自力で出産できないため出産期に[[wikipedia:ja:帝王切開|帝王切開]]を要する。  

　脳室に注入された分子は、[[脳室]]から漏れ出なければ拡散による希釈が限定的であるため、脳室の周囲の細胞への導入は比較的容易である。胎生期の[[神経幹細胞]]は脳室に接しており、遺伝子導入の格好の標的となる。[[大脳]]などでは、発生の時期により神経幹細胞から生み出される神経細胞の種類が異なるため、時期を選ぶことにより特定の種類の神経細胞のみで遺伝子を発現することが可能となる<ref name="ref1"><pubmed>21963197</pubmed></ref><ref name="ref2"><pubmed>21963197</pubmed></ref>。同一の胎仔に異なる時期で2回電気穿孔することもできる<ref name="ref2"><pubmed>15750183</pubmed></ref>。生体内電気穿孔法で導入された遺伝子の発現は神経細胞で長期間続き<ref name="ref1"><pubmed>11784059</pubmed></ref>、遺伝子導入のほぼ4ヶ月後でも発現している<ref name="ref16"><pubmed>17406448</pubmed></ref>。  

　電極には、マウス胎仔で多用されるピンセット型電極<ref name="ref1"><pubmed>11784059</pubmed></ref><ref name="ref15">'''Tetsuichiro Saito'''<br>Analysis of mammalian neuronal diversity using in vivo electroporation. ''The 607th National Institute of Genetics Colloquium, Mishima, Japan'':1999</ref><ref name="ref19"><pubmed>11301197</pubmed></ref>、ニワトリ胚などで使われるニードル電極<ref name="ref14"><pubmed>9016787</pubmed></ref>、導入部位を限定させるために核酸の注入針と電極を組み合わせた電極<ref name="ref20"><pubmed>12147134</pubmed></ref>などがある。  

　ニワトリやマウス以外にも[[アフリカツメガエル]]<ref name="ref20"><pubmed>12147134</pubmed></ref>など多くの動物に応用されており、[[大脳皮質]]の他にも[[間脳]]<ref name="ref1"><pubmed>21963197</pubmed></ref>や[[中脳]]<ref name="ref1"><pubmed>21963197</pubmed></ref>、[[脊髄]]<ref name="ref18"><pubmed>12657654</pubmed></ref>、[[小脳]]<ref name="ref17"><pubmed>18723012</pubmed></ref>、[[網膜]]<ref name="ref21"><pubmed>14603031</pubmed></ref>、[[wikipedia:ja:筋肉|筋肉]]<ref name="ref22"><pubmed>9743122</pubmed></ref>、[[wikipedia:ja:精巣|精巣]]<ref name="ref23"><pubmed>11150518</pubmed></ref>など多くの組織で生体内電気穿孔法を用いた遺伝子導入に成功している。  

<br> （執筆者：斎藤哲一郎　担当編集委員：村上富士夫）